一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂及制备方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂及制备方法。


背景技术：

2.高寒草甸是我国重要的生态保护区，该地区海拔高、常年低温、气候条件恶劣，加上不合理放牧等一系列人类活动，使高寒草甸生态系统受到破坏。草地作为发展畜牧业的基础和重要的生态屏障，其退化不仅改变了植物群落结构，还影响土壤固碳、水土保持等生态服务功能。因此，加强高寒地区草地生态的保护，探寻促进草地植物生长和恢复的有效措施势在必行。
3.近年来，国内外研究表明，植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,pgpr)是对植物生长具有促进作用的一大类有益菌，能在植物根际定殖，并通过固氮、溶磷、分泌激素等功能来促进植物生长，利用pgpr研制微生物菌肥或菌剂，能够修复土壤结构，改善土壤养分供应状况，持续效果好且对环境无污染，为高寒地区牧草生长和土壤修复提供新思路。
4.目前，关于pgpr的研究主要集中于单一菌株，但单一菌株往往效果不佳，市场接受度低，已不能满足现代农业发展的需要。微生物复合接种剂一般是指在培养液中混合两种或两种以上的细菌，充分发挥菌群的相互作用，获得比单一接种剂促生能力更强、更稳定的微生物制剂。微生物复合接种剂具有较强的适应性、根际定殖能力和广谱效应。因此，开发可为植物生长提供多种营养的微生物复合接种剂尤为重要，利用植物根际促生菌研制微生物复合接种剂对农业可持续发展具有重要意义。
5.混播是指两种或两种以上牧草栽培在同一块土地上，通常混播比单播可提高产草量14％左右，目前大量用于天然退化草地或人工建植草地。目前最常见的混播是根据退化高寒草甸免耕补播技术标准(地方标准db63_t 1442-2015)，利用3种草种(垂穗披碱草(elymus nutans griseb)、中华羊茅(festuca sinensis)、草地早熟禾(poa pretensis))进行混播，充分利用空间，二氧化碳和土壤水分及养分，能延长利用时间，提高牧草品质。
6.垂穗披碱草为禾本科披碱草属多年生草本植物，具有抗性强、营养品质高和适口性好等特性，是青藏高原等高寒牧区主要优质牧草品种之一。垂穗披碱草对次生环境存在高度适应性，并且种子繁殖能力强，是高寒地区天然退化草地补播和建植人工草地的首选草种。
7.中华羊茅是禾本科羊茅属多年生草本植物，是我国西北、华北和青藏高原等地的常见牧草，具有营养价值高、再生性和抗逆性强等优点。此外，中华羊茅适口性较好，为牲畜所喜食，这些都为中华羊茅能够成为高寒地区优良牧草的种质资源提供有利条件。
8.草地早熟禾属于禾本科早熟禾属的多年生冷季型禾草，其广泛分布于欧亚大陆温带和寒带地区，适宜在湿度较大、气候冷凉的地区生长。草地早熟禾不但繁殖能力强且生长年限长，同时还具备较强的抗寒及耐践踏能力，是高寒草甸的优势牧草。
9.因此，亟待利用分离自高寒草甸的植物根际促生菌利用发酵技术制备微生物复合接种剂，对于高寒草甸天然退化草地植被生长与土壤改良具有重要意义。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂及制备方法，以解决现有技术中单一菌株效果不佳，市场接受度低，已不能满足现代农业发展需要的问题。
11.为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体步骤如下：
12.一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂，所述的微生物复合接种剂包括：醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)的细菌培养液；
13.所述的醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年09月09日，保藏编号为：cctcc m20221406，所述假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年09月09日，保藏编号为cctcc m20221407。
14.本发明还公开了一种微生物复合接种剂的制备方法，包括以下步骤：
15.s1.选取菌株：对从高寒草甸获得的植物根际促生菌进行筛选，通过植酸钙有机磷培养基与nbrip无机磷培养基结合以及结合钼蓝比色法筛选优良溶磷菌，选出2株植物根际促生菌，随后通过培养基对选出的2株植物根际促生菌进行培养；
16.s2.制备单一菌悬液：分别将优良溶磷菌进行培养，得到单一菌悬液；
17.s3.制备微生物复合接种剂：根据不同比例进行试验，最终确定最佳菌剂配比，得到所述的微生物复合接种剂。
18.进一步地，步骤s1中，选择出2的株植物根际促生菌，分别为醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)。
19.进一步地，所述醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)的培养方法为：通过划线法将醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)接种于lb液体培养基中，并放置于15℃培养箱培养7d，即可长出新鲜菌落。
20.进一步地，步骤s2中，所述单一菌悬液的制备方法为：挑取2株单菌落分别接种于装有100ml lb液体培养基的300ml三角瓶，于15℃、180r
·
min-1
摇床培养48h，使得所述液体菌剂活菌浓度大于109cfu/ml，用无菌水调节2株单一菌悬液od
600
值一致。
21.优选地，所述步骤s3中，将醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)单一菌悬液以体积比1:0、3:7、1:1、7:3、0:1的比例接种至新的300ml三角瓶中保存备用，得到5种微生物复合接种剂，确定最佳菌剂配比为3:7，得到所述的微生物复合接种剂。
22.进一步地，所述天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂适宜于天然退化草地补播使用，可直接喷洒使用，使用量为5.0kg-6.0kg/亩，使用方法为将制备的微生物复合接种剂装入喷雾器或洒壶，均匀喷洒到天然草地。
23.且综上所述，由于采用了上述技术方案，发明的有益技术效果是：
24.本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本微生物复合接种剂中2株细菌均不会引起牧草病害，不仅具有固氮、溶磷等促生能力，对土壤结构具有改善作用，而且使用安全，经济效益高，不会对生态环境造成威胁。本微生物复合接种剂所用的2株细菌均来源于高寒草甸，于15℃条件下筛选所得，在4℃低温下仍能存活，具有良好的高寒草甸生态适应性，利用本发明制备的微生物复合接种剂能够提高牧草产量，提高土壤有机质含量及土壤酶活性，改善土壤质量。
附图说明
25.图1是本发明的方法流程图；
具体实施方式
26.为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释发明，并不用于限定发明。
27.植物根际促生菌(pgpr)是指定殖于植物根际，促进植物生长并改善土壤结构的一大类有益菌。此类菌株具有固氮、溶磷、分泌植物激素等作用，而且这些菌株来源于自然界、通过发酵将其制备成的微生物菌剂对环境友好，无污染物残留。
28.微生物复合接种剂是指由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种制成的活菌制剂，相比单一菌剂促生效果更强，生态适应性更广。
29.一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂，所述的微生物复合接种剂包括：醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)的细菌培养液；
30.所述的醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年09月09日，保藏编号为：cctcc m20221406，所述假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年09月09日，保藏编号为cctcc m20221407。
31.目前对于高寒草甸微生物菌种资源的研究相对较少，但高寒草甸是我国草地生态系统重要组成部分，由于特殊的地理特征和恶劣的环境条件，使高寒草甸生态系统脆弱、抗干扰能力差，草甸退化尤为突出。筛选高寒草甸优良菌种资源，将其研制微生物菌剂并用于天然退化草地，对改良高寒草地土壤结构、修复生态系统具有重要意义。
32.实施例一
33.为详细说明本发明的技术内容、所实现的目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
34.一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂及其制备方法，参见图1，该方法包括以下步骤：
35.步骤(1)、分别将保藏的具有优良溶磷能力的醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和具有优良固氮能力的假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)通过划线法接种于lb固体培养基，并放置于15℃培养箱中培养7d。
36.需要说明的是，平板划线法是指把混杂在一起的不同种微生物的不同个体或同一
种的不同细胞，通过接种环在培养基表面做多次划线，得到较多的独立分布的单个细胞，经培养后即成单菌落。其原理是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的不同区域。
37.步骤(2)：制备菌株单一培养液，挑选单菌落接种于装有100ml lb液体培养基的300ml三角瓶，于15℃、180r
·
min-1
的摇床培养48h，得到所述菌株单一培养液。
38.需要说明的是，所得单一液体菌剂活菌浓度大于109cfu/ml，用无菌水调节2株单一菌悬液od
600
值一致。目的是保证各培养液中活菌数目相同，具有实践性和重复性。
39.步骤(3)：制备微生物复合接种剂，将醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)单一菌悬液以体积比1:0、3:7、1:1、7:3、0:1的比例接种至新的300ml三角瓶中保存备用，得到5种微生物复合接种剂。
40.需要说明的是，本发明通过滤纸片法和十字交叉划线法同时证明醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)相互之间没有拮抗作用，可混合作为微生物复合接种剂。
41.需要进一步说明的是，该微生物复合接种剂结合了2株植物根际促生菌的优点，同时具有固氮、溶磷作用，操作便捷，效果好，可直接喷洒施用。
42.实施例二
43.本实施例将以一种天然退化草地补播所用混播草为例对本发明的微生物复合接种剂进行盆栽试验验证。
44.实验例：实施例一中制备的5种微生物复合接种剂。
45.对照组：以灭菌lb培养基为对照。
46.实验方法：根据退化高寒草甸免耕补播技术标准(地方标准db63_t1442-2015)，以垂穗披碱草：中华羊茅：草地早熟禾＝2:2:3进行混播(种子萌发率均》90％)。选择相同尺寸的花盆，每盆填入相同土壤500g，每盆加入无菌水300ml和微生物复合接种剂5ml(相当于基肥)，待生长30d收获第一茬后再加入微生物复合接种剂5ml(相当于追肥)。
47.实验时间：实验开始于2021年10月15日，第一茬在植株生长30d后收获，留茬高度3cm。第二茬在植株生长60d后全部收获，测定植物和土壤指标。在此期间，每两天浇50ml蒸馏水，可根据干湿度适当调节。
48.实验地点：盆栽试验在甘肃农业大学草业学院人工气候室(宁波江南仪器厂，中国宁波市)进行，25℃光照(16h)和20℃暗(8h)循环(光照350μe m-2s-1)，湿度70-80％。
49.实验方式及结果：将实施例二的一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂进行盆栽实验，分别测定实施例二的微生物复合接种剂处理组和对照组混播草的株高、生物量以及土壤ph、有机质、速效磷、铵态氮、硝态氮、土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶活性，以验证本发明实施例一的一种天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂的使用效果，结果如下表：
[0050] 对照1:03:71:17:30:1草层高度(cm)12.24
±
0.0913.3
±
0.3214.31
±
0.2413.56
±
0.4613.32
±
0.1713.55
±
0.30鲜重生物量(g)5.23
±
0.505.59
±
0.906.15
±
0.105.54
±
0.305.93
±
0.236.10
±
0.26干重生物量(g)1.69
±
0.101.83
±
0.192.06
±
0.051.88
±
0.031.95
±
0.051.85
±
0.07土壤ph8.15
±
0.028.08
±
0.078.06
±
0.038.1
±
0.068.11
±
0.038.12
±
0.03有机碳(g/kg)76.12
±
5.0074.74
±
2.0381.9
±
3.6685.25
±
4.2058.03
±
5.3180.34
±
2.96
速效磷(mg/kg)8.56
±
0.9611.01
±
1.0510.22
±
0.4812.23
±
1.1010.20
±
0.1310.69
±
0.16铵态氮(mg/kg)12.62
±
0.2013.31
±
0.1516.17
±
0.1714.02
±
0.1714.45
±
0.3414.38
±
0.06硝态氮(mg/kg)2.51
±
0.012.53
±
0.012.54
±
0.012.53
±
0.002.53
±
0.012.54
±
0.00脲酶(mg/g)6.82
±
0.017.20
±
0.148.15
±
0.837.00
±
0.136.73
±
0.457.10
±
0.24蔗糖酶(mg/g/g)20.31
±
3.1720.70
±
3.3224.80
±
0.2622.04
±
3.0624.25
±
0.7322.35
±
2.88碱性磷酸酶(mg/g/g)8.35
±
0.367.01
±
1.2311.23
±
0.348.61
±
1.668.73
±
0.729.18
±
2.09过氧化氢酶(g/kg)1.55
±
0.021.62
±
0.021.58
±
0.001.63
±
0.021.54
±
0.021.62
±
0.02
[0051]
由上表可见，施用本发明实施例一的天然退化草地补播专用的微生物复合接种剂，可以活化土壤中难溶性磷素、固定空气中的氮素，为土壤根系提供氮磷等养分，通过降低土壤ph，有效促进混播草生长、提高混播草生物量，提高土壤速效养分含量及土壤酶活性。
[0052]
对上述表2中数据进行分析整理，得到不同微生物复合接种剂对混播草效果排序。具体灰色关联度分析参见下表3
[0053]
表3结果表明，通过灰色关联度综合分析，发现醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus hmaj1)和假节杆菌(pseudarthrobacter sp.ncz1)单一菌悬液以体积比3:7的比例接种时，对混播草生长和土壤改善效果最好，由此可见，微生物复合接种剂既可以提高植物产量，又可以活化土壤，改善土壤质量。
[0054]
以上所述为发明的较佳实施例，并不用以限制发明，凡在发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。