一种负载富血小板血浆水凝胶及其制备方法

1.本发明涉及生物工程材料领域，具体涉及一种负载富血小板血浆水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病是常见病、多发病，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题，至2021年统计全球糖尿病患者达到5.37亿。而由糖尿病引起的慢性伤口造成患者极大负担，是当下最棘手的临床难题。慢性伤口由于血液循环不畅导致氧气和营养供应不足以及成纤维细胞增殖能力低下以及胶原蛋白生成减少而难以愈合。因此，寻找开发一种可加速慢性伤口愈合的安全有效治疗策略迫在眉睫。富含血小板血浆(prp)由于是从患者自身血液获取，具有安全、简便和性价比高等优势，近年在临床上应用方面备受关注。prp作为自体生长因子的来源，富含血小板衍生生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子-β(tgf-β)和表皮生长因子(egf)等多种生长因子，在组织愈合中扮演了关键角色，尤其是对于糖尿病慢性伤口的治疗具有显著的效果。
3.目前对prp的应用主要是通过凝血酶或氯化钙激活prp以获得prp水凝胶，然而单纯的prp水凝胶机械性能差且不稳定，容易导致生长因子的爆发释放。此外，大量的prp直接在皮肤上使用，有可能诱发皮肤纤维化。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种负载富血小板血浆水凝胶及其制备方法，用以解决目前prp水凝胶机械性能不稳定、生长因子释放不稳定的技术问题。
5.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
6.一种负载富血小板血浆水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将壳聚糖季铵盐加入到富血小板血浆和pbs缓冲液的混合溶液中，搅拌至完全溶解，得到qcs/prp混合溶液；
8.(2)将醛基pluronic f127溶于溶剂，得到af127溶液；将所述af127的溶液滴加到qcs/prp混合溶液中，搅拌混合均匀，室温条件下凝胶化即得所述负载富血小板血浆水凝胶。
9.上述技术方案的设计思路在于，生理条件下，醛基pluronic f127(af127)两边段亲水，中间段疏水，在室温下的水溶液中醛基pluronic f127的疏水中间段会因为疏水作用聚集从而自组装为表面具有醛基的胶束，本技术方案正是通过上述醛基与壳聚糖季铵盐(qcs)的氨基之间的化学反应生成动态亚胺键，并通过af127胶束自组装作用形成了水凝胶三维网络，动态亚胺键和疏水聚集作用赋予了水凝胶合适的机械性能，使其具有良好的组织匹配度，且qcs/prp/af127复合结构的水凝胶网络中束缚了prp中的各种物质，使prp中的生长因子的释放达到持久性，通过调节水凝胶中qcsheaf127的质量比例调节水凝胶的机械性能，从而使生长因子的释放具有可控性，克服了prp在临床上使用时爆发释放和对皮肤产
生副作用等问题，优化了prp在临床上的应用。本技术方案所使用的prp富含多种生长因子，有利于加速慢性伤口愈合，所使用的壳聚糖季铵盐作为壳聚糖的衍生物，在保持了壳聚糖优良生物性能的同时具备了更强的抗菌性，二者均利用自身性质对水凝胶的效用起到了积极效果。
10.作为上述技术方案的进一步优选，步骤(1)中，所述qcs/prp混合溶液中，壳聚糖季铵盐的质量浓度为2～4％；所述富血小板血浆和pbs缓冲液的混合溶液中，富血小板血浆的体积分数为10～75％。壳聚糖季铵盐质量浓度过低则难以形成凝胶体系，过高则凝胶难以混合均匀。
11.作为上述技术方案的进一步优选，步骤(2)中，所述af127溶液中醛基pluronic f127的质量浓度为1～4％，所述af127溶液与qcs/prp混合溶液的体积比为1：(1～3)。pluronic f127质量浓度过低则难以形成凝胶体系，过高则凝胶难以混合均匀。
12.作为上述技术方案的进一步优选，所述壳聚糖季铵盐的制备方法为：将壳聚糖粉末加入到水中，搅拌得到分散液后滴加冰乙酸使壳聚糖溶解，得到壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液加热并滴加2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的溶液进行反应，反应完成后离心得到上清液，将上清液在丙酮和乙醇混合溶液中沉淀，将所得沉淀物干燥即得所述壳聚糖季铵盐粉末。
13.作为上述技术方案的进一步优选，所述冰乙酸的添加量为所述分散液体积的0.2～1.0％。
14.作为上述技术方案的进一步优选，所述2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与壳聚糖的质量比为(1.4～7)：(1～5)。
15.作为上述技术方案的进一步优选，所述富血小板血浆的制备方法为：取全血离心处理得到上层血清，将所述上层血清继续离心处理至分层，预留部分上清液，取下层沉积物，吹散后加入少量预留的上清液，混合均匀即得到所述富血小板血浆。本优选方案的prp制备方法过程简单易于操作，可自体获得。
16.作为上述技术方案的进一步优选，所述富血小板血浆中血小板计数为900～1100
×
109/l。
17.作为上述技术方案的进一步优选，所述醛基pluronic f127的制备方法为：将pluronic f127溶解于二氯甲烷中，冰水浴搅拌下加入dess-martin试剂粉末，25～40℃反应12～24h，过滤得到滤液，将所述滤液旋转蒸发浓缩后采用冰乙醚沉淀，将得到的沉淀物真空干燥即得所述醛基pluronic f127。反应温度太低则反应较慢，温度过高则将影响最终产物，上述反应时间可确保反应的完全进行，如反应时间较短无法保证醛基化程度。
18.作为上述技术方案的进一步优选，所述pluronic f127与dess-martin试剂的质量比为(1～8)：(0.134～1.072)。
19.基于同一技术构思，本发明还提供一种负载富血小板血浆水凝胶，该水凝胶采用上述的制备方法制得。
20.与现有技术相比，本发明的优点在于：
21.通过本发明方法制备得到的水凝胶材料具有合适的机械性能一级良好的组织匹配度，实现了prp中的生长因子的释放的持久性和可控性，克服了prp在临床上使用时爆发释放和对皮肤产生副作用等问题，优化了prp在临床上的应用。
附图说明
22.图1为实施例1的水凝胶的制备及应用示意图；
23.图2为实施例1的qcs的制备流程图；
24.图3为实施例1的qcs的红外光谱图；
25.图4为实施例1的qcs的核磁氢谱图；
26.图5为实施例1的af127的制备流程图；
27.图6为实施例1的af127的红外光谱图；
28.图7为实施例1的af127的核磁氢谱图；
29.图8为实施例1的不同组合的水凝胶的应变扫描图；
30.图9为实施例2的prp的制备流程图；
31.图10为实施例2的负载富血小板血浆水凝胶的结构示意图；
32.图11为对比例1的水凝胶的内部结构的sem图
33.图12为实施例2的水凝胶的内部结构的sem图；
34.图13为对比例1的水凝胶的动态粘弹性测试结果；
35.图14为实施例2的水凝胶的动态粘弹性测试结果；
36.图15为实施例2的水凝胶的剪切变稀特性测试结果；
37.图16为实施例2的负载富血小板血浆水凝胶中生长因子的累积释放曲线；
38.图17为对比例1和实施例2的水凝胶的细胞毒性测试结果；
39.图18为对比例1和实施例2的水凝胶对糖尿病伤口愈合的评估方法示意图；
40.图19为对比例1和实施例2的水凝胶对糖尿病伤口愈合的评估外观表现；
41.图20为对比例1和实施例2的水凝胶对糖尿病伤口愈合的评估结果。
具体实施方式
42.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
43.实施例1：
44.本实施例的不同组合的水凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
45.(1)取1g壳聚糖粉末分散于40ml超纯水中，搅拌下将0.2ml冰乙酸加入到分散液中；使用恒温水浴锅加热到60℃，搅拌30min；将1.4g 2,3-氯化缩水甘油三甲基铵(gtmac)少量多次加入到壳聚糖的乙酸溶液中，在60℃搅拌反应24h；9000rpm离心20min，取上清抽滤除去杂质，在400ml丙酮和乙醇(v/v＝1)的混合溶液中沉淀，烘箱干燥至恒重，研磨，获得壳聚糖季铵盐(qcs)淡黄色粉末；qcs的制备方案与表征结果如图2-图4所示，图2为qcs的制备方案示意图，图3为红外光谱，qcs在1477cm-1
处出现了新的特征吸收，归属于三甲基铵基团的三个甲基的不对称弯曲振动；对应于cs的伯胺基团(1591cm-1
)的特征峰消失，出现了对应于qcs的仲胺基团(1563cm-1
)的特征峰，揭示了壳聚糖骨架上由于三甲基铵基团的接枝导致的伯胺到仲胺的结构变化；图4为核磁氢谱，化学位移3.13ppm处呈现出的质子峰归属于三甲基铵的质子；3.32ppm位移处的特征峰归属于与三甲基铵基团相连的亚甲基的质子，以上证据均可证明季铵盐基团被成功引入壳聚糖的分子链上；
46.(2)将2g pluronic f127粉末加入到50ml无水二氯甲烷中，搅拌至完全溶解，冰水浴搅拌(600rpm)下加入0.268g dess-martin试剂粉末；水浴加热到40℃，保持转速反应
24h，真空抽滤除去不溶的还原产物，收集滤液，旋转蒸发得到粘稠状透明液体，100ml冰乙醚剧烈搅拌沉淀，冰水浴搅拌1h；抽滤，收集沉淀，40℃真空干燥24h，得到af127白色粉末；醛基pluronic f127(af127)的制备方案与表征结果如图5-图7所示，图5为醛基pluronic f127(af127)的制备方案示意图，图6为红外光谱，1730cm-1
处出现了新的特征峰，此峰归属于醛基c＝o伸缩振动；图7为核磁氢谱，9.58ppm位移处的特征峰归属于af127上的醛基质子，4.20ppm处的特征峰归属于与醛基相连的亚甲基上的质子，以上证据均可证明af127中生成了醛基；
47.(3)分别称取40mg、60mg、60mg、60mg、80mg qcs粉末于五个5ml玻璃样品瓶中，标记为q2、q3、q3、q3、q4，然后向每个样品瓶中加入1ml pbs(0.01m，ph＝7.4)，搅拌至完全溶解，获得qcs溶液；
48.(4)分别称取40mg、60mg、60mg、60mg、80mg af127粉末于五个5ml玻璃样品瓶中，标记为a2、a3、a3、a3、a4，然后向每个样品瓶中加入1ml pbs(0.01m，ph＝7.4)，放置于4℃直至完全溶解，获得af127溶液；
49.(5)在冰水浴，200rpm搅拌下将玻璃样品瓶中的af127溶液缓慢滴加到qcs溶液的玻璃样品瓶中，溶液混合组合为q2a3、q3a2、q3a3、q3a4、q4a3，混合均匀后室温继续反应10min获得不同组合的水凝胶；
50.使用流变仪测试本实施例中制备获的不同组合的水凝胶的动态粘弹性，结果如图8所示。
51.具体测试步骤为：
52.动态应变扫描：将负载富血小板血浆水凝胶放置于流变仪样品台上，选择动态应变扫描模式，设置温度为37℃，应变为0.1-1000％，角频率为6.28rad/s。
53.如图8所示，在测定范围内不同组合的样品测定结果均表现出储能模量(g
′
)高于损耗模量(g
″
)，说明形成了稳定的弹性水凝胶。随着qcs的质量浓度的增加，水凝胶的g
′
和g
″
均表现出增强；随着af127的质量浓度的增加，水凝胶的g
′
和g
″
同样表现出增强；说明调节qsc和af127的质量浓度可以调控水凝胶的机械性能，本实施例的水凝胶的制备及应用示意图如图1所示。
54.实施例2：
55.本实施例的负载富血小板血浆的水凝胶(qcs/prp/af127)的制备方法，具体包括如下步骤：
56.(1)抽取健康志愿者全血40ml，分装至15ml离心管中，每管10ml，在510g离心10min；离心管内血液分三层，取出最上层血清至新的15ml离心管中；再2220g离心20min；分两层，取出上清标记ppp，留下下层血小板；敲散下层血小板后加入少量预留上清，混匀，标记prp，计数，plt约为1000
×
109/l；保存在-80℃备用；prp的制备方案如图9所示，prp中含有高浓度的血小板，血小板被激活后会释放大量的生长因子；
57.(2)将1ml prp与0.5ml pbs(0.01m，ph＝7.4)混合，加入实施例1(1)中获得的60mg qcs，200rpm搅拌至完全溶解，3000rpm离心5min除去气泡，获得qcs/prp混合溶液；
58.(3)将实施例1(2)中获得的60mg af127加入到0.5ml pbs(0.01m，ph＝7.4)中，放置于4℃直至完全溶解，获得af127溶液；
59.(4)在冰水浴，200rpm搅拌下将0.5ml af127溶液缓慢滴加到1.5ml qcs/prp混合
溶液中，混合均匀，室温继续反应10min获得负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)。
60.对比例1：
61.本对比例的水凝胶(qcs/af127)的制备方法，具体包括如下步骤：
62.(1)将实施例1(1)中获得的60mg qcs加入到1.5ml pbs(0.01m，ph＝7.4)中，搅拌至完全溶解，获得qcs溶液；
63.(2)将实施例1(2)中获得的60mg af127加入到0.5mlpbs(0.01m，ph＝7.4)中，放置于4℃直至完全溶解，获得af127溶液；
64.(3)在冰水浴，200rpm搅拌下将0.5mlaf127溶液缓慢滴加到1.5ml qcs/溶液中，混合均匀，室温继续反应10min获得水凝胶(qcs/af127)。
65.实施例2中负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)的形成结构示意图如图10所示，qcs溶解于prp中形成均匀混合的溶液，prp中的各种物质，包括血小板、纤维蛋白、各种生长因子等，均匀分布于qcs/prp混合溶液中；af127溶解于pbs中，由于疏水聚集作用af127的疏水中间段在溶液中聚集，自组装为胶束，两端的醛基暴露在胶束表面；将两种溶液混合后af127的醛基与qcs的氨基发生席夫碱反应生成亚胺键，水凝胶的聚合物三维网络形成，prp中的各种物质被束缚在水凝胶网络中，从而控制生长因子从水凝胶中缓慢释放。通过扫描电子显微镜获得实施例和2对比例1的水凝胶的内部微观形貌，如图11和图12所示，表现为疏松多孔结构，孔径约为20-200μm。
66.用流变仪测试实施例2和对比例1的水凝胶的动态粘弹性及实施例2水凝胶的剪切变稀特性，结果如图13-15所示。
67.具体测试步骤为：
68.(1)：动态频率扫描。将水凝胶放置于流变仪样品台上，选择动态频率扫描模式，设置温度为37℃，应变为1％，角频率为1-100rad/s。
69.(2)：动态应变扫描。将水凝胶放置于流变仪样品台上，选择动态应变扫描模式，设置温度为37℃，应变为0.1-1000％，角频率为6.28rad/s。
70.(3)：粘度扫描。将负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)放置于流变仪样品台上，选择稳态粘度扫描模式，设置剪切速率为1-100s-1。
71.如图13所示在测定范围内储能模量(g
′
)一直都高于损耗模量(g
″
)，材料主要表现出弹性特性，说明形成了稳定的弹性水凝胶。随着角频率的增加，储能模量和损耗模量呈现上升的趋势，表明水凝胶具有频率依赖性，频率依赖性的出现归因于水凝胶的交联方式为动态化学键—亚胺键。
72.如图14所示，在应变0.1-200％范围内负载富血小板血浆水凝胶处于线性粘弹区，储能模量在70-100pa之间，具有良好的组织匹配度。应变800％左右时，交点出现，水凝胶内部网络被破坏，不再保持凝胶状态。
73.如图15所示，粘度随剪切速率的增加而明显下降，表明样品具有剪切稀化行为。
74.通过酶联免疫吸附试验(elisa)检测实施例2负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)中生长因子的体外释放，结果如图9所示。
75.具体检测步骤如下：
76.(1)在5ml玻璃样品瓶中制备2ml的实施例2中的负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)，然后加入相同体积的pbs(0.01m，ph＝7.4)作为缓释液，将整个缓释体系置于
37
±
0.5℃的恒温摇床中(100rpm)。
77.(2)在预定的时间点(2，4，8，12，24，48，72，96，120，144h)取出400μl缓释液，再加入400μl新鲜的pbs继续缓释。
78.(3)取出的缓释液以3000rpm，4℃离心15min，收集上清，分装三份后于-80℃保存。
79.(4)通过elisa试剂盒测量上清液中生长因子的浓度来确水凝胶中tgf-β和pdgf-ab累积释放情况。
80.如图16所示，在6天内，负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)中的tgf-β近似线性缓释，而pdgf-ab呈现缓慢释放趋势，在第五天达到缓释平衡，第六天的下降可能是因为生长因子的失效导致的。这些结果表明，制备的水凝胶对prp中的生长因子具有良好的缓释效果。
81.对实施例2和对比例1的水凝胶的进行细胞毒性评估，结果图10所示。
82.具体评估步骤如下：
83.(1)水凝胶浸提液的准备。分别准备0.5ml实施例2(1)中的prp、1ml对比例1中的水凝胶(qcs/af127)、1ml实施例2中的负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)三种样本，首先在超净工作台上对样本进行30min紫外灭菌，然后将三种样本分别完全浸泡在5.5ml、5ml、5ml含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)双抗的1640培养基中。在37℃孵育24h，然后3000rpm离心15min取上清，使用0.22μm膜过滤，获得样本浸提液。
84.(2)cck-8法检测细胞毒性。提前一天进行细胞铺板(6000/孔)，过夜贴壁后加入不同稀释倍数的prp、qcs/af127水凝胶、qcs/prp/af127水凝胶的提取液(相应qcs/prp/af127水凝胶的提取浓度为：0.02％，0.1％，0.4％，0.8％，v/v)，同时设立不加提取液的空白对照组。在培养箱中培养24h后，每孔加入10μl的cck-8溶液。在培养箱中培养2h后，用酶标仪在波长λ＝450nm下测量吸光度。
85.如图17所示使用各组浸提液培养huvecs 24h后，prp、qcs/af127水凝胶和qcs/prp/af127水凝胶均显示出高于85％的相对细胞存活率，表明它们具有良好的生物相容性。
86.实施例2的负载富血小板血浆水凝胶(qcs/prp/af127)的应用，将该水凝胶用于促进糖尿病小鼠慢性伤口愈合，并对愈合效果进行评估，评估方法如图18所示，结果如图19和图20所示。
87.具体评估步骤如下：
88.(1)构建小鼠i型糖尿病模型。糖尿病小鼠通过注射链脲佐菌素(stz)获得。小鼠由中科院动物所提供，c57bl/6，雄，体重20-22g。链脲佐菌素(stz)由懋康生物提供。
89.(2)糖尿病小鼠全层皮肤伤口模型的建立。取构建成功的糖尿病小鼠40只，小鼠背部剃毛消毒后，利用打孔器切取直径0.6cm的圆形全层创面。
90.(3)糖尿病小鼠伤口处理。将造模成功的小鼠分为四组，用不同的方式处理。第一组：正常对照(空白)组，在伤口上敷上无菌纱布，无菌棉签轻压使其贴上。第二组：prp组，在小鼠背部伤口上敷上浸润了10μlprp的无菌纱布。第三组：qcs/af127水凝胶组，在伤口部位敷上20μl的qcs/af127水凝胶，水凝胶上再贴上无菌纱布。第四组：负载富血小板血浆水凝胶组。在伤口部位敷上约20μl的负载富血小板血浆水凝胶，水凝胶上再贴上无菌纱布。每2天换药一次，连续8天。
91.(4)伤口愈合过程的观察、计算与处理。在治疗的第2，4，6，8天用拍摄照片记录伤
口愈合情况，使用image j软件处理照片，记录每个时间点的伤口面积。使用如下公式计算伤口愈合率：伤口愈合率＝(初始伤口面积-治疗时间点伤口面积)/初始伤口面积*100％，评估伤口愈合效果。
92.如图19所示在所有组中，观察到伤口面积减少且没有明显的感染。如图20所示水凝胶敷料qcs/prp/af127组在治疗的第2天表现出最好的伤口闭合效果；在治疗的第8天表现出最高的伤口愈合率。此外在整个愈合过程中，prp组相比于qcs/af127组表现出更好的促进作用。我们制备的负载富血小板血浆水凝胶对stz诱导小鼠i型糖尿病小鼠慢性伤口的治疗具有显著的效果。
93.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所得到的改进和变换也应视为本发明的保护范围。