一种用于治疗皮肤肿瘤的小干扰核酸药物组合物及制剂的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗皮肤肿瘤的小干扰核酸药物组合物及制剂。


背景技术：

2.皮肤癌包括非黑色素瘤皮肤癌(nmsc)和黑色素瘤(melanoma)。
3.非黑色素瘤皮肤癌(nmsc)是白种人中最常见的一种癌症，近些年来在其他各种人群中发病率都逐步升高，我国也有大量的nmsc病患。在nmsc病例中，基底细胞癌(bcc)占75％，这是一种生长较为缓慢，扩散率低于0.1％的局部侵袭性表皮肿瘤。皮肤鳞状皮肤癌(scc)占nmsc剩余病例的大多数，起源于表皮角化细胞的发育不良。与bcc相比，scc呈现显著的转移率(0.3-3.7％)，其中大部分发生在高风险的scc的亚群。
4.nmsc发病率每年显著增加10％，目前全球每年有2到3百万nmsc新病例被诊断出。2011年，仅英国就有超过10万人被诊断未nmsc，其中75％为bcc。大多数国家没有nmsc癌症登记，所报告数据很可能被低估。越接近赤道nmsc发病率越高，报告率最高是澳大利亚的北部地区。近期有研究证实，2007-2011年，全球平均每年用于治疗nmsc的费用为48亿美元，超过黑色素瘤的诊疗费用(33亿美元)。
5.非黑色素癌样基底细胞癌(bcc)往往出现在皮肤的最表层即表皮细胞，因为该部位最易接受日光和其他形式紫外线(uv)的照射。患癌部位大多出现是头部和颈部，最常见的部位是鼻子，意味着患者很有可能会因此毁容。靶向治疗对此无效，但是接受手术或者放疗等措施又会使患者形象受损，影响患者自尊。因此，目前急需开发新型药物来治疗这一类发病率高、影响广泛的疾病。
6.黑色素瘤是由皮肤以及其他器官中的黑素细胞产生的肿瘤，主要包括皮肤黑色素瘤、肢端黑色素瘤、黏膜黑色素瘤以及眼部葡萄膜黑色素瘤四种类型。近年来黑色素瘤的发病率逐年上升，仅皮肤黑色素瘤一种类型在2018年就新发超过28万例，死亡超6万例。恶性黑色素瘤过去一直以手术切除和药物化疗为主要治疗手段，预后不佳。随着高通量基因测序技术的发展和对肿瘤分子机制认识的加深，人们发现肿瘤异质性和肿瘤微环境多样性影响了肿瘤的形成、耐药和治疗选择，导致了黑色素瘤患者对同种治疗方法的反应和获益不同。
7.大量研究证实，tgf-β和cox-2均与癌症的发生发展及恶化有关。转化生长因子β1(tgf-β1)是tuker等在1984年发现的一种与多种上皮性肿瘤生长有关的多肽性细胞生长负调控因子，广泛参与体内各种病理生理过程，与炎症、创伤、器官纤维化等多种疾病的发生、发展关系密切，尤其是在肿瘤的发生、发展中的调节作用，可以促进肿瘤细胞转移和侵袭，对肿瘤的研究具有极其深远的意义。
8.环氧化酶(cox)又称为前列腺素内超氧化物合酶，催化花生四烯酸转化为前列腺素样物质。大量研究表明，cox与nmsc的发病相关。cox有两种不同的单体，cox-1和cox-2。在慢性uvb(中波紫外线)刺激的皮肤或者uvb诱导的scc中，cox-2过表达。cox-2也可增加对
scc的敏感性。用药物阻断cox-2的表达可阻止nmsc的进程，是有效的nmsc的化疗药物。
9.tgf-β在许多类型的肿瘤中表达水平会上调，并包括不同类型的非黑色素皮肤癌肿瘤和黑色素皮肤癌，如皮肤鳞状细胞癌(scc)和基底细胞癌(bcc)等，在刺激癌症相关成纤维细胞增殖中发挥作用。cox-2的上调在诱导炎症以及将活性t细胞转化为非活性t-reg细胞方面起着负向作用。前期研究表明，将两种分别靶向tgf-β1和cox-2的sirna结合，与赖氨酸-组氨酸多肽聚合物混合形成一种纳米颗粒药物，如通过不同给药途径(局部或全身)可将两种sirna靶向递送到同一个细胞内，并能同时沉默两个靶标而发挥抗肿瘤活性。这个改进优化的药物制剂可通过局部给药进行肿瘤治疗，包括多种但不限于皮肤病灶，如皮肤癌，肝癌，膀胱癌，食道癌，头颈部癌和前列腺癌等。
10.目前高质量、精心设计的、以证据为基础的研究5年随访数据较少，对各种药物治疗效果的评价数据也不多。nmsc治疗方式的选择取决于肿瘤的危险等级、病人的偏好或适用性及本地服务的可用性。高风险肿瘤复发的风险更大，需要更积极的治疗。治疗高危bcc和scc黄金标准方案是莫氏手术(mms)。如果mms不可用，宽边径切除或放疗可能被考虑。局部治疗通常是用于低风险患者bcc的治疗。但从总体来看，目前依然缺乏有效应对nmsc的药物，给临床治疗这一疾病带来困难。因此，急需开发更为有效的药物，来满足目前未被满足的临床需求。


技术实现要素：

11.本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于治疗多种皮肤肿瘤的小干扰核酸药物组合物及制剂。
12.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
13.本发明第一方面提供一种用于治疗皮肤肿瘤的小干扰核酸药物组合物，所述小干扰核酸药物组合物包含以tgf-β1mrna为靶向的能够抑制tgf-β1活性的sirna分子和以cox-2mrna为靶向的能够抑制cox-2活性的sirna分子。
14.优选地，所述能够抑制tgf-β1活性的sirna分子的序列为：
15.正义链：5
’‑
cccaagggcuaccaugccaacuucu-3’(seq id no.1)，
16.反义链：5
’‑
agaaguuggcaugguagcccuuggg-3’(seq id no.2)，
17.和/或，
18.正义链：5
’‑
aacuauugcuucagcuccadtdt-3’(seq id no.3)，
19.反义链：5
’‑
uggagcugaagcaauaguudtdt-3’(seq id no.4)，
20.和/或，
21.正义链：5
’‑
cggcagcuguacauugacudtdt-3’(seq id no.5)，
22.反义链：5
’‑
agucaauguacagcugccgdtdt-3’(seq id no.6)，
23.所述能够抑制cox-2活性的sirna分子的序列为：
24.正义链：5
’‑
ggucuggugccuggucugaugaugu-3’(seq id no.7)，
25.反义链：5
’‑
acaucaucagaccaggcaccagacc-3’(seq id no.8)。
26.优选地，对sirna分子的特定碱基进行特定修饰。
27.选择性地对以tgf-β1mrna为靶向的能够抑制tgf-β1活性的sirna分子和以cox-2mrna为靶向的能够抑制cox-2活性的sirna分子进行碱基修饰可以有效提供药物的有效性
和稳定性。
28.根据一些实施方式，对能够抑制tgf-β1活性的sirna分子的序列做如下修饰：
29.正义链：
[0030]5’‑
mamamcmumamufufgfcmumumcmamgmcmumcmcmadtdt-3’，
[0031]
反义链：
[0032]5’‑
pmufgmgmamgmcmumgmamamgmcmafamumamgmumudtdt-3’，
[0033]
和/或，
[0034]
正义链：
[0035]5’‑
mcmgmgmcmamgfcfufgmumamcmamumumgmamcmudtdt-3’，
[0036]
反义链：
[0037]5’‑
pmafgmumcmamamumgmumamcmamgfcmumgmcmcmgdtdt-3’，
[0038]
其中，m表示该碱基2’位进行了甲氧基修饰，f表示该碱基2’位进行了氟修饰，p表示为5’端的磷酸化修饰。
[0039]
本发明第二方面提供一种小干扰核酸药物制剂，所述小干扰核酸药物制剂包括所述的小干扰核酸药物组合物、以及用于将sirna分子递送到预期病灶部位的阳离子多肽纳米导入载体或其相应的制剂辅料。
[0040]
优选地，所述阳离子多肽纳米导入载体为组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物。
[0041]
进一步优选地，所述组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物为h3k4b或h3k( h)4b。
[0042]
组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物，如hkp(h3k4b)有四个分枝(r)：r＝khhhkhhhkhhhkhhhk；和/或hkp h(h3k( h)4b)有四个分枝(r1)：r1＝khhhkhhhkhhhhkhhhk。
[0043]
进一步优选地，当所述组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物为h3k4b时，所述h3k4b和sirna分子的n/p质量比为4/1～3/1。
[0044]
进一步优选地，当所述组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物为h3k( h)4b时，所述h3k( h)4b和sirna分子的n/p质量比为3/1～2/1。
[0045]
进一步优选地，当所述组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物为其他类型的hkp时，所述组氨酸-赖氨酸分支状多肽和sirna分子的n/p质量比为3/1～2/1。
[0046]
优选地，所述小干扰核酸药物制剂为纳米药物制剂。
[0047]
进一步优选地，所述纳米药物制剂为冻干制剂。
[0048]
更优选地，所述冻干制剂通过注射用水复溶后，通过肿瘤病灶局部注射或静脉系统给药。
[0049]
本发明第三方面还提供一种所述的小干扰核酸药物制剂的制备方法，将能够抑制tgf-β1活性的sirna分子、能够抑制cox-2活性的sirna分子、以及阳离子多肽纳米导入载体或其相应的制剂辅料通过特定混合工艺混合形成。
[0050]
优选地，采用微流控仪器通过流量控制系统将能够抑制tgf-β1活性的sirna分子、能够抑制cox-2活性的sirna分子、以及所述阳离子多肽纳米导入载体或其相应的制剂辅料分别引流到微量混合装置进行混合，再通过装瓶冻干程序得到所述小干扰核酸药物制剂。
[0051]
进一步优选地，将含有阳离子多肽纳米导入载体或其相应的制剂辅料的水溶液、sirna水溶液在优化后的流速以及其他控制条件下完成纳米颗粒制剂制作，所述sirna水溶液中能够抑制tgf-β1活性的sirna分子和能够抑制cox-2活性的sirna分子的比例为1：1。
[0052]
优选地，所述皮肤肿瘤包括原位鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素皮肤癌中的一种或多种。
[0053]
优选地，所述小干扰核酸药物制剂还包括免疫检查点抑制剂。
[0054]
进一步优选地，所述免疫检查点抑制剂是结合或抑制特定靶标的抗体或其他试剂，这些靶标包括pd-1、pd-l1、gag3、im3和ctla-4/b7中的一种或多种。
[0055]
进一步优选地，所述免疫检查点抑制剂为pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、淋巴细胞激活基因-3(lag-3)抑制剂中的一种或多种。
[0056]
具体地，所述pd-1抑制剂包括pembrolizumab(帕博利珠单抗，keytruda)、nivolumab(纳武利尤单抗，opdivo)或cemiplimab(西米普利单抗，libtayo)中的一种或多种。
[0057]
具体地，所述pd-l1抑制剂包括atezolizumab(阿替利珠单抗，tecentriq)、avelumab(阿维鲁单抗，bavencio)和durvalumab(度伐鲁单抗，imfinzi)中的一种或多种。
[0058]
具体地，所述ctla-4抑制剂为ipilimumab(伊匹单抗，yervoy)。
[0059]
具体地，所述lag-3抑制剂为bms-986016。
[0060]
优选地，所述免疫检查点抑制剂包括t淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(tim-3)、t细胞免疫球蛋白和itim结构域(tigit)、t细胞活化的v结构域免疫抑制因子(vista)、b7同源物3蛋白(b7-h3)或b和t淋巴细胞衰减因子(btla)的免疫检查点抑制剂中的一种或多种。
[0061]
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0062]
本发明采用核酸干扰技术，采用与靶标基因转录出来的mrna完全匹配的sirna分子，同时抑制tgf-β和cox-2这两个与皮肤癌发生发展紧密相关的重要靶标基因的表达，激活皮肤癌内肿瘤微环境中的免疫活性，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制皮肤癌的发生发展。
附图说明
[0063]
图1.药物组合物分子构成。组合物包含tgf-β1sirna和cox2 sirna两种sirna分子，这两种sirna根据人鼠同源的原则进行设计。
[0064]
图2.tgf-β1sirna和cox2 sirna结合后组成的药物组合物(stp705)对靶标基因的抑制作用。可以看出，经过stp705处理后，靶标基因表达下降，同时纤维化标志物——α-sma(α-平滑肌肌动蛋白)、胶原蛋白(一型和三型胶原)表达显著下降。
[0065]
图3.实时荧光定量pcr方法检测不同hkp/sirna比例形成的所述组合物复合物在体外对细胞靶基因(tgf-β1)mrna表达水平的影响情况。细胞转染实验中细胞系为hela细胞，每个比例各设三个作用浓度(25nm、50nm、100nm)，同时设有空白对照(blank)，阳性对照(pc，即tgf-β1sirna-lipofectamine 2000)以及阴性对照组(nc，nc sirna-lipofectamine 2000)，细胞转染20-24小时后，对各组细胞进行总rna的抽提，最后通过实时荧光定量pcr方法来检测各组细胞内靶基因tgfβ1的相对mrna表达情况。其中用β肌动蛋白(β-actin)基因作为参比基因，每个样品均设有三个重复孔，图中表示为均数
±
标准差。
[0066]
图4.实时荧光定量pcr方法检测不同sirna比例形成的所述组合物复合物在体外对细胞靶基因(tgf-β1，cox-2)mrna表达水平的影响情况。细胞转染实验中细胞系为hela细胞，每个比例各设2-3个作用浓度(25nm，50nm，100nm)，同时设有空白对照(blank)，阳性对
照(pc，即100nm tgfβ1sirna-lip2000)以及阴性对照组(nc，100nm nc sirna-lip2000)，细胞转染20-24小时后，对各组细胞进行总rna的抽提，最后通过荧光实时定量pcr方法来检测各组细胞内靶基因tgfβ1的相对mrna表达情况。其中用β肌动蛋白(β-actin)基因作为参比基因，每个样品均设有三个重复孔，图中表示为均数
±
标准差，t1：c1表示tgf-β1/cox-2＝1，t2：c1表示tgf-β1/cox-2＝2，t1：c2表示tgf-β1/cox-2＝1/2。
[0067]
图5.实时荧光定量pcr方法检测针对25mer tgf-β1sirna序列修饰前后的靶基因敲低效果。细胞转染实验中细胞系为hucct细胞，采用lip2000进行sirna的转染，其中sirna作用浓度为50nm，同时设有空白对照(blank)，及阴性对照组(nc，100nm nc sirna-lip2000)，细胞转染20-24小时后，对各组细胞进行总rna的抽提，最后通过荧光实时定量pcr方法来检测各组细胞内靶基因tgfβ1的相对mrna表达情况。其中用β肌动蛋白(β-actin)基因作为参比基因，每个样品均设有三个重复孔，图中表示为均数
±
标准差。
[0068]
图6.实时荧光定量pcr方法检测针对21个核苷酸长度tgf-β1sirna序列修饰前后的靶基因敲低效果(ec
50
数据)。细胞转染实验中，采用lip2000针对梯度稀释的sirna进行细胞转染，转染20-24小时后，对各组细胞进行总rna的抽提，最后通过荧光实时定量pcr方法来检测各组细胞内靶基因tgf-β1的相对mrna表达情况，最后试用prism软件进行曲线作图并计算出相应ec
50
数值。其中用β肌动蛋白(β-actin)基因作为参比基因，每个样品均设有三个重复孔，图中表示为均数
±
标准差。
[0069]
图7.小鼠创伤伤口面积相对值比较柱状图。实验组分为三个不同小干扰核酸比例组，即不同小干扰核酸比例的sirna tgf-β1/cox-2(1:1，2:1，1:2)与hkp形成的复合物溶液，同时设两组对照组，阴性对照(negative control
–
nc，吉玛基因)和空白对照(blank)。药物处理从伤口(直径为5mm)造成后即开始，每天敷药一次，连续5天。此后每天拍照，持续观察伤口的变化，愈合的进展。图中表示创面形成第6和12天时，各组伤口创面面积的变化情况。根据目前做好的体内实验结果，我们基本确定两个活性小干扰核酸序列的比例为1：1。
[0070]
图8.伤口愈合后局部组织切片的masson氏三色染色。伤口模型制备、组织切片的制作及染色过程均如文中描述。不同组织伤口的处理如图所示。图片放大倍数从
×
40到
×
100。根据组织学观察结果，两个活性小干扰核酸序列配比为1：1。
[0071]
图9.肿瘤体积变化图。显示所述组合物高剂量组、所述组合物低剂量组、ddp治疗组和对照组a431异种移植小鼠肿瘤模型研究过程(治疗15天)中的平均肿瘤体积(
±
sem)。
[0072]
图10.小鼠体重变化曲线。不同组小鼠经过治疗后，体重随时间的变化情况。
[0073]
图11.荷瘤小鼠分组显示肿瘤大小。可以看出，与对照组动物相比，所述组合物治疗组动物的肿瘤体积更小。在所述组合物治疗组和顺铂治疗组动物之间没有明显的观察差异。
[0074]
图12.分离后的肿瘤组织。与荷瘤照片大体观察相似，与对照组相比，所述组合物治疗组和顺铂治疗组的离体肿瘤明显缩小。
[0075]
图13.肿瘤重量变化情况。在a431异种移植小鼠肿瘤模型中所述组合物高剂量、所述组合物低剂量、ddp和对照组给药后第15天平均肿瘤重量(
±
sem)。与对照组相比，经所述组合物治疗的动物肿瘤平均重量显著降低(表明肿瘤生长减缓)。
[0076]
图14.所述组合物的制备工艺流程图(蠕动泵法)。tgf-β1sirna和cox2 sirna两种
sirna分子溶解于一个容器，hkp溶解与另一个容器，然后通过特定的混合过程，形成纳米药物制剂。
[0077]
图15.药物组合物制剂(stp705)治疗使tgf-β1表达下降。临床试验中，经过stp705治疗的病人，肿瘤组织内tgf-β1表达水平显著下降。
[0078]
图16.stp705治疗使cox-2表达下降。临床试验中，经过stp705治疗的病人，肿瘤组织内cox-2表达水平显著下降。
[0079]
图17.stp705治疗导致进入肿瘤的t细胞增加。临床试验中，经过stp705治疗的病人，肿瘤组织内t细胞浸润显著增加。
[0080]
图18.stp705治疗可抑制细胞增殖。临床试验中，经过stp705治疗的病人，肿瘤组织细胞增殖标志物ki-67表达显著下降。
[0081]
图19.stp705治疗可抑制肿瘤自噬过程。临床试验中，经过stp705治疗的病人，细胞自噬过程受到抑制。
[0082]
图20.stp705治疗可抑制nf-kb的表达。肿瘤组织内nf-kb的表达显著下降。
[0083]
图21.stp705治疗可抑制β-连环蛋白(β-catenin)的表达。临床试验中，经过stp705治疗的病人，肿瘤转移标志物β-catenin表达降低。
[0084]
图22.stp705治疗以剂量依赖性抑制β-catenin表达。临床试验中，stp705不同剂量治疗组，β-catenin表达呈现剂量依赖性。
[0085]
图23.stp705治疗以剂量依赖性清除肿瘤细胞。stp705不同剂量治疗，可以实现大部分患者的肿瘤组织学清除，无治疗相关不良反应。
具体实施方式
[0086]
下面将更详细地描述本发明的这些内容和其他方面的内容。
[0087]
核酸干扰作为特异性治疗技术的特性
[0088]
核酸干扰(rnai)是一种调节基因表达的方法，它无所不在、非常普遍。这一调节过程是通过一种小干扰分子双链rna(sirna)实现的，这种sirna一般只有大概21个核苷酸，可以与胞质内的rna诱导沉默复合体(rna-induced silencing complex，risc)结合后，一条正义链被移除，留下了另一条反义链(引导链)，引导risc与跟sirna序列完全互补的信使核糖核酸(messenger rna，mrna)配对结合。risc在捕捉到靶标mrna后通过酶的作用，促使mrna降解，使之不能翻译成蛋白质，从而实现对特定基因表达的抑制。
[0089]
核酸干扰用于肿瘤治疗具有高特异性的基因沉默、适应症广泛、靶点明确、成本低等优势。癌基因、肿瘤抑制基因突变和其他参与肿瘤恶化的基因是基于核酸干扰疗法的良好的靶点，可用于各种细胞的多种基因途径参与的肿瘤恶化。多个基因的同时抑制是一种治疗肿瘤有效的方法来，并可降低多个化疗药物治疗产生的耐药性的可能性。核酸干扰疗法可用于靶向于功能性致癌分子，抗肿瘤化疗和放疗导致的耐药等，便于开发出基于基因组个性化药物，更有效的控制肿瘤的生长。
[0090]
核酸干扰药物活性成分为小干扰核酸，是25个碱基对长度的rna双链分子，与其他核酸分子一样，在溶液中表现为带负电荷的多元酸(磷酸基团的酸性超过碱基的弱碱性)，可以与带正电荷的分子结合形成复合物。此外，核酸分子中的碱基具有共轭双键，在紫外光谱的260nm处有特异吸收峰，可以利用该特点对其进行含量测定，而且可以通过计算a260/
a280的比值来确定样品的纯度。核酸分子的化学稳定性除了会因酸、碱或有机溶剂的作用而改变之外，与其它小分子化药不同之处是，小干扰核酸分子在体内体外都容易被rna酶所降解。
[0091]
赖氨酸-组氨酸多肽(hkp)的理化性质和与活性成分小干扰核酸相互作用
[0092]
已有大量的研究工作和成功的临床应用证实，sirna正在成为具有突破性的一类新药物。研究结果充分显示，sirna在体内外都能有效地抑制靶基因的表达水平。但是裸露的小干扰核酸极易被降解。目前解决的方法分两个方面：一个途径就是直接对介导rnai作用的dna或rna分子进行化学改造，使之能够抵抗dna酶或rna酶的降解作用。另一个途径是利用高分子材料来保护核酸分子，也就是所谓的药物载运系统(drug delivery system，dds)。不同的研究小组往往根据自身的技术特长，利用核酸分子的某项物理化学特性来选择独特的材料。合适的运载手段不但可以保护核酸分子不被降解，而且还可以延长药物在血循环中的半衰期、或者靶向运载药物使其在病变局部富集，从而降低用药的剂量和延长给药间隔。
[0093]
在多年科研结果的基础上，发明人筛选出一个在体外和体内都能有效运载小干扰核酸的多肽分子hkp，它是由组氨酸和赖氨酸按照一定排列顺序缩合而成的。通过氢键和静电吸引作用，hkp多肽分子与sirna分子可以在水溶液中自动结合形成一定大小的纳米颗粒-多肽核酸纳米颗粒(pnp，polypeptide nano-particles)，进而有效地完成小干扰核酸分子的体内运载任务。两者的相对结合比例、混合过程、以及制剂工艺和冻干手段会影响所形成复合物的纳米颗粒大小以及表面的zeta-电位，进而影响复合物制备质量，冻干粉的复溶效率，以及进入细胞的效率。现有的多肽核酸纳米(pnp)药物的临床前和临床试验数据表明pnp的体内导入技术的临床应用前景广泛。
[0094]
发明人分别在各种动物模型上对这类pnp纳米药物进行了药效检测，包括系统给药的各种裸鼠人移植瘤模型；肺气管给药的小鼠实验模型在预防和治疗sars病毒的应用，在治疗肝的和肺的纤维化小鼠模型上的应用；以及本项目在小鼠和猪模型进行的一系列药效学试验数据进一步证明这个候选药物可以成为治疗皮肤疤痕的新型pnp药物。
[0095]
作为新型药物辅料的多肽载体，大量的试验数据显示其在动物实验中具有充分的安全性，临床前毒理学试验结果也进一步证实了hkp或sirna-hkp的pnp药物在动物体内的安全性。
[0096]
本发明所述组合物中的药物活性成分sirna是双链rna分子，其分子量均为15971da(tgf-β1sirna和cox-2sirna的分子量相同)。rna分子的特点之一是容易被rna酶降解。因此采用药物载体在保护小干扰核酸分子不被降解的前提下，还可以使sirna在体内达到药用浓度和临床可行的半衰期。经过实验研究结果筛选出hkp作为sirna药物体内应用载体。hkp是由组氨酸和赖氨酸组成，带有正电荷的分枝状多肽分子，分子量为9542kd。hkp与sirna可以在水溶液中自发形成复合物微粒。所形成的微粒复合物不仅可以使sirna分子得到保护，同时还可以促进sirna分子进入细胞。所述组合物的另外一个显著特点是具有生物可降解性。sirna和hkp皆为生物大分子，体内广泛存在将之降解的生物学机制。sirna在体内易于被降解成为组成rna分子的磷酸、戊糖和碱基等，同时hkp的最终降解产物将是赖氨酸残基和组氨酸残基。
[0097]
治疗多种皮肤癌的药物组合物和药物制剂
[0098]
本发明的药物组合物包含至少一种抑制tgf-β1活性的sirna和至少一种抑制cox2的sirna。小干扰核酸药物制剂包括所述的药物组合物、以及用于将sirna分子递送到预期病灶部位的阳离子多肽纳米导入载体或其相应的制剂辅料。所述药物制剂的活性药物成分为小干扰核酸，其药物作用机理是敲低靶基因mrna表达水平。同时，作为小干扰核酸分子载体的hkp多肽分子，在水溶液中能够与小干扰核酸分子形成复合物，从而保护小干扰核酸分子免遭核酸酶(rnase)的降解并增进小干扰核酸分子进入细胞的效率。由于所述组合物的理化特性与小干扰核酸分子和hkp分子相结合的比例直接相关，所以首先需要确定小干扰核酸分子与hkp分子混合的最佳比例。其次，所述组合物中的小干扰核酸分子由分别靶向tgf-β1和cox-2的两种序列组成。尽管两种序列具有相同的化学性质，但是仍然要对两种小干扰核酸分子在不同比例的相对活性进行比较。
[0099]
之前的研究已经表明，由组氨酸-赖氨酸分支状聚合物与tgf-β1sirna和cox2 sirna结合后组成的多肽纳米颗粒，在治疗伤口以及解决增生性瘢痕方面显示了良好的协同作用(周等，肿瘤靶标和治疗，2017；8:80651-80665.)。我们证明了两种sirna同时给药可沉默tgfβ1和cox2，从而使人的成纤维细胞凋亡(周等，肿瘤靶标和治疗，2017；8:80651-80665.)。此外，hkp(组氨酸赖氨酸分支状聚合物)与sirna形成纳米颗粒，可保护sirna体内给药时发生降解，并且可实现同时将2种sirna摄入到同一细胞内。结果表明，hkp介导的sirna递送到人类增生性瘢痕中，使增生性瘢痕显著减小。此外，在人类皮肤移殖小鼠模型中，这一药物组合物也显著减小了移植物的大小。其机理是通过在皮肤样品中的抗纤维化机制发挥作用。
[0100]
药物组合物的使用方法
[0101]
所述组合物的处方确定经过一系列的优化筛选工作。首先对小干扰核酸与hkp混合形成的复合物的粒径和表面电位等理化数据进行检测，通过比较靶基因敲低效率，来确定小干扰核酸与hkp的比例在1：4时，复合物颗粒的粒径稳定在100-300nm之间，而且靶基因的敲低效率比较好(大于50％)。其次，对两种小干扰核酸分子的相互比例进行了筛选。虽然从体外结果看，tgf-β1：cox-2的比例在1：1时对靶基因的敲低功效不及其他比例时的功效，但是其在体内试验时的治疗功效较其他比例的更好或无区别。综合上述结果，我们将所述组合物处方中的抗tgf-β1和抗cox-2的两种小干扰核酸的相互比例固定在1：1。
[0102]
所述组合物的制备工艺直接简单。在质量控制标准范围内，所述组合物的颗粒大小对药效并无明显的影响。根据目前已得到的药物稳定性测试数据判断，所述组合物冻干粉在4℃保存至少在12个月以上，其理化性质(粒径和电位等)和生物学活性(qrt-pcr)均保持良好的状态。
[0103]
所述组合物的适应症在这里是多种皮肤癌指症的治疗，包括皮肤鳞状细胞癌，皮肤基底细胞癌，皮肤黑色素细胞癌和其他皮肤癌症。所述组合物拟采用的剂型为冻干粉剂，复溶后用于肿瘤病灶的直接注射。采用这一剂型有下述考虑。首先，药品在冻干粉状态不仅可以保存比较长的时间，而且方便运输和储藏。其次，经过一系列检测数据证实，所述组合物经冷冻干燥后仍可复溶于水，且复溶后的一系列理化特性与冻干之前无明显差别。而且，根据现有药效学试验的结果，冻干粉复溶水溶液制剂即可以直接注射入皮肤癌病灶中进行治疗。临床前的一系列试验数据还证实冻干粉所述组合物未见引起明显毒性反应，具有较好的安全性。
[0104]
应用多肽核酸纳米创新药治疗皮肤癌
[0105]
本发明提供了一种用于治疗原位鳞状细胞癌(isscc)和/或基底细胞癌(bcc)的组合物和方法。所述组合物包含至少一种抑制tgf-β1活性的sirna分子和至少一种抑制cox2的sirna分子。优选的，所述制剂是纳米颗粒制剂，其包含比组氨酸-赖氨酸多肽聚合物类分子，如hkp和/或hkp( h)。该制剂可通过肿瘤内注射或通过静脉注射(系统)给药。所述制剂可与免疫检查点抑制剂同时给药。优选的，所述免疫检查点抑制剂是抗体或其他试剂，可以结合或抑制包括但不限于下列靶标：pd-1、pdl1、lag3，tim3和ctla-4/b7。在具体实施过程中，免疫检查点抑制剂可以是：pd-1抑制剂，如pembrolizumab(帕博利珠单抗，keytruda)、nivolumab(纳武利尤单抗，opdivo)或cemiplimab(西米普利单抗，libtayo)；pd-l1抑制剂，如atezolizumab(阿替利珠单抗，tecentriq)、avelumab(阿维鲁单抗，bavencio)和durvalumab(度伐鲁单抗，imfinzi)；ctla-4抑制剂，如ipilimumab(伊匹单抗，yervoy)；淋巴细胞激活基因-3(lag-3)抑制剂，如bms-986016；或可以是靶向t淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(tim-3)、t细胞免疫球蛋白和itim结构域(tigit)、t细胞活化的v结构域免疫抑制因子(vista)、b7同源物3蛋白(b7-h3)或b和t淋巴细胞衰减因子(btla)的免疫检查点抑制剂。
[0106]
具体实施例：
[0107]
实施例1.处方筛选的依据、方法，内容和结果简述
[0108]
(1)药物组合物分子构成
[0109]
如图1所示，靶向tgf-β1和cox2mrnad的sirna，是根据人、小鼠、猴子和猪的同源基因序列设计的，其正义链序如下图所示。sirna序列与人类、小鼠和猴子的基因蓄力保持一致。cox2 sirna与猪的基因序列保持一致；除了有一个核苷酸(c-u)不同，tgf-β1sirna与猪基因序列一致。
[0110]
我们已经证明了由多肽hkp和sirna组成的小干扰核酸纳米颗粒制剂给药后，可观察到靶基因沉默和对包括α-sma(α-平滑肌肌动蛋白)、col1a1(一型胶原蛋白)和col3a1(三型胶原单边)基因靶标产生的抑制作用，如图2所示。该制剂组合物在下文简称为所述组合物。
[0111]
(2)多肽辅料与小干扰核酸活性药物比例
[0112]
所述组合物是经由多肽药物载体运载的小干扰核酸新药，因此优化载体与小干扰核酸的制备比例是药物制备的首要任务之一。优化载体与小干扰核酸比例的目的，是在保证药效的前提下，降低药物载体的用量，既提高了药物的使用效率，避免辅料过量的副作用，也可减低药物成本。为了对载体与小干扰核酸不同配比比例进行比较，我们首先用琼脂糖凝胶(gel shifting)电泳试验进行了初步筛选，将hkp与sirna按照不同比例进行混合，室温孵育30分钟，然后加样到1％的琼脂糖凝胶进行电泳，未结合的游离sirna将迅速泳动进入胶中，经过溴化乙锭染色后，游离的sirna将着色发出荧光。通过与对照品进行比较，可以得到半定量数据。胶泳动阻抑检验试验结果显示当比例在3/1时，hkp与小干扰核酸的结合已经明显，当比例达到6/1时，已经难以见到游离小干扰核酸。粒径检测的结果显示hkp/sirna比例在3/1,4/1和5/1左右，游离小干扰核酸较少，且颗粒的粒径稳定在80-180nm左右。
[0113]
接着采用荧光实时定量核酸扩增技术(real-time-pcr)对体外培养细胞进行了靶基因敲低效率的检测。实时荧光定量核酸扩增技术是指在pcr反应体系中加入荧光信号基
团，通过荧光信号的累积对pcr反应过程进行实时监控，最终可以达到对初始模板进行相对定量的目的。该技术相对于传统的pcr定量方法具有重复性好、灵敏度高以及误差小等优点。由于所述组合物药物中主要作用分子是两个小干扰核酸，其作用机制为靶向并下调相应靶基因的mrna表达水平，所以实时荧光定量pcr方法是所述组合物处方筛选中最理想的检测方法。其次，通过构建皮肤创伤和人增生性瘢痕小鼠的动物模型，给予所述组合物药物治疗，之后对创面伤口和增生性瘢痕的恢复情况进行观察，对组织切片进行病理学情况分析，以及处理组织同样利用实时荧光定量pcr技术对组织水平上的靶基因mrna表达情况进行分析。
[0114]
图3为荧光实时荧光定量pcr的检测数据，可以看出，在比较宽的比例范围(3/1、4/1、5/1、6/1)内，靶基因tgf-β1的mrna表达水平都能被药物活性成分小干扰核酸显著地敲低。最后综合粒径等理化检测数据和生物学活性数据，选定比例为4/1或3/1的hkp/sirna复合物进行后续的筛选检测工作。
[0115]
(3)两个活性药物间的比例筛选
[0116]
由于所述组合物的有效药物成分由两个小干扰核酸分子组成，接着对两个小干扰核酸的相对含量进行了比较。利用已建立的体外筛选体系，通过细胞转染试验对含有不同比例小干扰核酸的所述组合物的靶基因敲低功能进行对比。图4为测定的结果。检测结果显示，对比空白组，所有比例组都有明显的敲低作用。其中对于tgf-β1靶基因，在t2：c1处理组为100nm的敲低作用最明显，对于cox2靶基因，在t2：c1处理组和t1：c2处理组都具有较好的敲低效果，但最终的比例选择还需要通过动物的体内效果来进一步确认。
[0117]
处方筛选的方法和结果汇总如下：
[0118]
首先确定小干扰核酸：hkp在体外混合时的相对比例。(2)然后确定作为药品活性成分的两种小干扰核酸相互之间比例的改变是否会影响药物敲低靶基因的效率。(3)最后在体内实验对所有体外制剂筛选的结果进行验证。
[0119]
实施例2. 25个核苷酸长度和21个核苷酸长度的sirna序列修饰前后的数据比较(细胞水平，检测靶点为tgf-β1)
[0120]
本发明针对8条25个核苷酸长度(25mer)的sirna序列在细胞水平进行修饰前后生物学活性数据的比较。其中第五条(即25-hm5#)即为目前所述组合物所用序列，结果显示针对25mer的sirna序列，修饰后的生物学活性明显不如修饰前(图5)。
[0121]
此外，针对2条已筛选出的21个核苷酸长度(21mer)的sirna序列也进行了修饰(表1)，并在细胞水平对修饰前后的抑制效果进行比较，结果显示修饰后生物学活性明显强于未修饰序列(图6，表2)。
[0122]
表1.tgf-β1sirna序列表(21mer修饰前后)
[0123][0124]
注：2'f(f)为，2'ome(m)，p代表磷酸phosphorylation(denoted by p).
[0125]
表2.ec
50
数据汇总表(21mer修饰前后)
[0126][0127]
实施例3.通过动物实验测定组合物对皮肤癌的抑制效果
[0128]
(1)所述组合物对皮肤伤口纤维化疤痕的抑瘤效果
[0129]
所述组合物在抑制皮肤纤维化导致的疤痕方面显示了很好的效果。在猪表皮制造伤口后，采用本发明所述组合物进行治疗，分析两种sirna分子之间不同比例组合的效果。图7可以看出，tgf-β1/cox-2以1:1的比例配制的组合物，对伤口导致的疤痕治疗效果最好。图8表明，tgf-β1/cox-2以1:1的比例配制的组合物，治疗纤维化导致的疤痕后的组织结构更接近正常皮肤结构。
[0130]
(2)所述组合物对a431异种移植小鼠肿瘤模型的抑瘤效果
[0131]
a431是一种人鳞状细胞癌细胞系，已被广泛用于评价各种治疗性化合物的抗癌作用。异种移植小鼠肿瘤模型被广泛应用于体内治疗研究。在这个模型中，一定大小的肿瘤被移植到免疫缺陷小鼠皮下，这种小鼠不会排斥人类细胞。肿瘤生长到一定大小开始药物干预，肿瘤体积变化可以反映药物在体内的抑制效果。
[0132]
肿瘤体积数据汇总
[0133]
每隔一天测量一次肿瘤体积(供试品给药后)。使用卡尺测量，并按照下面公式计算肿瘤体积。dmax为测得的肿瘤最大直径，dmin是研究过程中每个时间点(即每个给药时间点)所测得的肿瘤最小直径。
[0134]
肿瘤体积(v)＝1/2
×
dmax
×
(dmin)^2
[0135]
表3.平均肿瘤体积数据
[0136][0137]
注：对照组的两个异常值和ddp组的一个异常值不包括在计算中。
[0138]
与对照组动物相比，低剂量所述组合物治疗组(所述组合物-l)动物在给药后9天、11天、13天和15天的肿瘤体积显著减少。在所有其他时间点(治疗后5天和7天)，所述组合物低剂量治疗组动物的肿瘤体积值均低于对照组动物，但无显著差异。与对照组动物相比，所
述组合物-h治疗组动物在给药后13天和15天的肿瘤体积显著减少。在所有其他时间点(治疗后5天、7天、9天和11天)，所述组合物高剂量治疗组动物的肿瘤体积值均低于对照组动物，但无显著差异。与对照组动物相比，顺铂治疗组动物在治疗后11天、13天和15天的肿瘤体积也显著减少。在所有其他时间点(治疗后5天、7天和9天)，ddp治疗组动物的肿瘤体积值均低于对照组动物，但无显著差异。
[0139]
图9显示所述组合物高剂量组、所述组合物低剂量组、ddp治疗组和对照组a431异种移植小鼠肿瘤模型研究过程(治疗15天)中的平均肿瘤体积(
±
sem)。与对照组相比，所述组合物治疗组的肿瘤体积显著降低(肿瘤生长减少)。表中显示了对照组与所述组合物高、所述组合物低和顺铂治疗组相比的p值。
[0140]
肿瘤生长抑制指数
[0141]
计算公式：肿瘤生长抑制指数＝(1-(治疗组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积))*100％。该指数表示与对照组相比肿瘤生长抑制的百分比。
[0142]
肿瘤生长抑制指数汇总
[0143]
汇总数据显示，与高剂量所述组合物(所述组合物-h)和顺铂相比，低剂量所述组合物(所述组合物-l)治疗的动物在所有时间点的肿瘤生长抑制指数都较高。此外，低剂量所述组合物治疗的动物在治疗后11天与ddp治疗后15天的肿瘤生长抑制指数相似。这表明与顺铂治疗相比，所述组合物加速了肿瘤生长的抑制。
[0144]
表4.肿瘤生长抑制指数
[0145][0146][0147]
肿瘤体积比(t/c)
[0148]
计算公式：肿瘤体积比(t/c)＝治疗组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积。这个比率代表了治疗对肿瘤生长的影响
[0149]
肿瘤体积比(t/c)汇总
[0150]
表中数据显示，与所述组合物高剂量(所述组合物-h)和ddp相比，所述组合物低剂量(所述组合物-l)组在所有时间点的t/c都较低。此外，所述组合物低剂量(所述组合物-l)组在给药后11天与ddp给药后15天的t/c相似。这说明所述组合物对肿瘤生长的抑制作用比ddp更有效。
[0151]
表中数据显示，与所述组合物高剂量(所述组合物-h)和ddp相比，所述组合物低剂量(所述组合物-l)组在所有时间点的t/c都较低。此外，所述组合物低剂量(所述组合物-l)组在给药后11天与ddp给药后15天的t/c相似。这说明所述组合物对肿瘤生长的抑制作用比
ddp更有效。
[0152]
表5.肿瘤体积比(t/c)
[0153] stp705-hstp705-lddp治疗后3天0.960.840.91治疗后5天0.740.700.76治疗后7天0.820.740.88治疗后9天0.800.660.85治疗后11天0.770.640.73治疗后13天0.710.610.73治疗后15天0.660.640.64
[0154]
图10小鼠在实验开始后每次给药前测量体重(q2d)。结果表明，对照组和所述组合物治疗组的动物平均体重保持不变，没有显著变化。对照组在给药开始时的平均体重为18克，研究结束时的平均体重为18.5克。所述组合物高剂量组在给药开始时的平均体重为18.5克，研究结束时的平均体重为18.5克。所述组合物低剂量组在给药开始时的平均体重为18克，研究结束时的平均体重为18克。然而，从治疗后第9天到研究结束，ddp处理组的动物体重一直下降。ddp治疗的动物在给药开始时的平均体重为18克，研究结束时的平均体重为15.5克。研究结束时，与对照组(18.5克)、所述组合物高剂量组(18.5克)和所述组合物低剂量组(18克)相比，ddp处理组动物的体重(15.5克)显著下降。
[0155]
肿瘤重量
[0156]
在研究结束(第15天)和小鼠安乐死后称量肿瘤重量。图13显示数据为瘤重平均值和sem。与对照组相比，所述组合物低剂量和所述组合物高剂量组动物的瘤重平均值显著降低。同样，与对照组相比，ddp组瘤重平均值也是显著降低。而所述组合物组和ddp组之间则没有显著差异。这表明所述组合物可以明显抑制肿瘤生长。
[0157]
实施例4.制备制剂前sirna、hkp及其准备
[0158]
(2)原料药sirna1(tgf-β1)工作液制备方法
[0159]
使用电子天平称取一定量的sirna1(tgf-β1)干粉，置于洁净离心管内，添加一定量灭菌注射用水后涡旋至干粉全部溶解检测uv值，通过uv值计算sirna1(tgf-β1)总量后补充灭菌注射用水涡旋后检测uv值，uv值在1.00
±
10％mg/ml。
[0160]
(3)原料药sirna2(cox-2)工作液制备方法
[0161]
使用电子天平称取一定量的sirna2(cox-2)干粉，置于洁净离心管内，添加一定量灭菌注射用水后涡旋至干粉全部溶解检测uv值，通过uv值计算sirna2(cox-2)总量后补充灭菌注射用水涡旋后检测uv值，uv值在1.00
±
10％mg/ml。
[0162]
(4)原料药sirna1和sirna2混合工作液制备方法
[0163]
将sirna1(tgf-β1)工作液和sirna2(cox-2)工作液按照等体积混合涡旋后检测uv值，uv值范围在1.00
±
10％mg/ml。使用0.45um及0.22um滤芯过滤工作液。
[0164]
(5)辅料hkp工作液制备方法
[0165]
先根据hkp( h)的肽含量及实验设计np(4/1或3/1)比计算应该称取的hkp干粉重量，使用电子天平精确称取hkp干粉置于洁净离心管内，添加灭菌注射用水后涡旋至干粉全部溶解，工作液浓度在4.00
±
10％mg/ml或3.00
±
10％mg/ml范围内，使用0.45um及0.22um
滤芯过滤工作液。
[0166]
(6)运用微流控仪器制备药物样品的方法
[0167]
①
、先使用灭菌注射用水清洗芯片并调试设备各个参数:np比3/1，或4/1,或2.5/1等的样品
[0168]
②
、使用注射器分别吸取sirna(sirna1和sirna2)混合工作液、hkp工作液，并设置微流控设备参数分别为，流速14ml/min，体积比1/1，前废液0.2ml，后废液0.15ml。
[0169]
③
、收集样品后孵化30分钟。
[0170]
④
、灌装使用移液枪分别取1ml灌装至冻干小瓶内，灌装后放入冻干机内，准备冻干。
[0171]
(7)运用蠕动泵制备药物样品的方法
[0172]
①
、将蠕动泵以及混合器(mixer)使用硅胶管(3.2mm)连接并设置流速为450ml/分钟。硅胶管通过y型三通连接，使用灭菌注射用水调试设备参数。
[0173]
②
、将硅胶管分别放入sirna(sirna1和sirna2)混合工作液和hkp工作液，开启蠕动泵制备样品。(注：硅胶管防止吸附在离心管底部)。
[0174]
③
、收集样品后孵化30分钟，np比3/1，或4/1,或2.5/1的样品加入等体积5％葡聚糖继续搅拌30分钟，最后冻干体积为2ml，复溶体积为1ml。
[0175]
④
、灌装使用移液枪分别取2ml灌装至冻干小瓶内，灌装后放入冻干机内，准备冻干。
[0176]
实施例5.制备工艺的依据、工艺过程，工艺验证的内容和结果简述
[0177]
制备工艺的依据：任何药物的最终制剂形式应当方便应用和储存。因此冻干粉制剂自然成为最佳选择之一。我们对本品的设想是在使用前，所述组合物是以冻干粉形式储存，加入注射用水后能充分水化形成澄清水溶液，作为皮肤涂抹用或局部注射用。冻干粉能延长药物的保存期，方便运输和储存。稳定性试验数据充分证实所述组合物的药物活性能够在冻干粉状态保存比较长的时间。
[0178]
工艺过程：所述组合物的制备工艺过程在组分混合阶段分为蠕动泵法混合和微流控法混合两种方法。从原料储存液制备，到各个组分按比例混合，到最后制成冻干粉制剂，都经过优化测试。尤其是微流控法的流速优化对纳米颗粒形成和大小至关重要。冻干过程中关键参数也必须进行重点调试优化，例如药品预冻的方式和时间、升华干燥的时间和温度上升的速率等等。工艺流程图见下图14。
[0179]
上述工艺过程简述为：
[0180]
(1)工作液0分别是浓度均为80μg/ml的sirna#1(tgf-β1)和sirna#2(cox-2)溶液，以及浓度为320μg/ml的hkp溶液。
[0181]
(2)将上述工作液0通过0.22μm的滤膜进行过滤，得到无菌的工作液1。
[0182]
(3)将上述工作液1通过匀速蠕动泵(1ml/秒)进行混合，室温下孵育20-30分钟后，得到所述组合物溶液。
[0183]
(4)将所述组合物溶液进行分装入20毫升西林瓶，放入冻干室进行冷冻干燥，制成冻干粉制剂。
[0184]
所述组合物的制备工艺过程的优化研究是对冻干过程中关键参数进行调试优化，例如药品预冻的方式和时间、升华干燥的时间和温度上升的速率等等。将不同参数下制备
出的所述组合物样品按照质量标准中的检测指标进行测试对比，筛选出结果最佳的工艺条件，并进行小试放大。所述组合物的制备工艺流程中的条件参数及方法见下列表格，对工艺条件中的关键参数进行筛选和优化过程见下表6。
[0185]
表6.所述组合物的制备工艺流程中的条件参数及方法
[0186][0187]
表7.工艺条件中关键参数的筛选和优化
[0188]
[0189][0190]
实施例6.制剂的质量控制与放行、保质标准
[0191]
按照优化的制备工艺对生产工艺进行了中试生产测试。对每批产品分别进行了质量指标的测试，项目包括粒径、电位、生物学活性、复溶澄清度、游离sirna含量检测。具体结果列于下列表格。检测三个批次，表8中列出一个批次的结果作为代表。
[0192]
表8.工艺验证项目、检测标准、检测方法和检测结果(2ml复溶)
[0193][0194]
工艺评价：上述所述组合物的制备工艺过程简单直接，容易根据需要扩大生产规模。从所得到的检测结果分析，各个批次样品均能达到拟定的质量标准。
[0195]
下列表9以及相应的规格文件所列出的是目前的规格项目。作为核酸干扰药物制剂的规格请见下表。
[0196]
表9.注射用冻干粉制剂的放行暂行标准
[0197][0198]
下表10为多肽核酸干扰药物冻干粉注射剂的暂行保质标准：
[0199]
表10.注射用冻干粉制剂的保质暂行标准
[0200]
[0201][0202]
实施例6.所述组合物的临床验证
[0203]
在本发明所述的一项临床试验中，采用新型的纳米颗粒制剂治疗患有原位皮肤鳞状细胞癌(isscc)患者。给药方式为直接肿瘤内注射，给药剂量为10、20、30、60或120μg每周一次，连续给药6周。在开始治疗后的第7周，将肿瘤治疗过的区域通过外科手术取样进行组织学分析。组织学分析观察如果肿瘤细胞完全清除，则到达临床试验的主要终点。该试验的临床结果表明，该疗法在减少肿瘤体积和清楚肿瘤细胞数量上呈现显著的剂量依赖性。在所有25个临床治疗病患中有19个病患到达主要临床终点，即76％的病患到达主要终点。在最佳剂量组中(30μg和60μg剂量组)10个临床治疗病患中有9个病患到达主要终点，即90％的病患到达主要临床终点。整个试验中没有观察到皮肤局部反应，而治疗组的皮肤外观还有所改善。
[0204]
组合物给药后的肿瘤活检样品经免疫组化(ihc)染色表明，同时给药tgf-β1和cox2 sirna可提高疗效的机理是通过将cd4 和cd8 t细胞募集到实体瘤微环境中实现的。这种作用通过敲低肿瘤周围微环境内的tgf-β和cox-2蛋白表达可以增强这些t细胞在肿瘤微环境中的浸润。已经证明在肿瘤微环境中的tgf-β高表达可抑制t细胞渗透到肿瘤中(丹尼尔等，自然，2018；554:538-546；玛里亚塔桑等，自然，2018；554:544-548.)。升高的cox2还会抑制活性t细胞募集到肿瘤中发挥作用(高等，消化，2009；79:169-76.)。抑制肿瘤微环境中cox2的表达可抑制活性t细胞向tregs的转化——从而增强募集的t细胞活性。因此，联合治疗在募集t细胞并维持其对抗非自身细胞(肿瘤细胞)的作用上具有惊人而显著的效果。
[0205]
如图15所示，向原位皮肤鳞状细胞癌(isscc)患者给予局部注射所述组合物治疗，会导致tgf-β1和cox-2蛋白表达显著降低。组织样品来自于受试者(所述组合物给药剂量为10～30μg)。应用免疫组织化学技术对患者组织样品中的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。
[0206]
如图16所示，向isscc患者给予所述组合物治疗会导致cox-2蛋白表达降低。组织样品来自于受试者(所述组合物给药剂量为10～30μg)。应用免疫组织化学技术对患者组织样品中的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。
[0207]
如图17所示，所述组合物给药导致进入肿瘤的t细胞增加。上图(左)显示，在研究结束时，与治疗前比，治疗组患者残留肿瘤内cd4 t细胞的摄入增加。此外(左下图)，所述组合物给药后，后治疗组cd8 t细胞在肿瘤中摄入也增加了。
[0208]
如图18所示，所述组合物可进一步抑制细胞增殖。向isscc患者给予所述组合物治疗可引起ki-67细胞增殖蛋白的表达降低。组织样品来自于受试者(所述组合物给药剂量为
10～30μg)。应用免疫组织化学技术对患者组织样品中的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。采用ki67染色测定增殖细胞水平，结果表明在所有所述组合物治疗患者中均观察到了ki67的显著降低。
[0209]
如图19所示，所述组合物治疗还可抑制肿瘤自噬过程。向isscc患者给予所述组合物治疗可引起lc3b自噬标记物表达显著降低。组织样品来自于受试者(所述组合物给药剂量为10～30μg)。应用免疫组织化学技术对患者组织样品中的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。以lc3b作为自噬标志物，与治疗前比，治疗后该标志物在所有受试者(10～30μg剂量)中均显著降低。治疗后和治疗前之间作比较，p《0.031。
[0210]
所述组合物对nf-kb水平的影响。向isscc患者给予所述组合物治疗，会使nf-kb蛋白表达降低，如图20所示。组织样品来自于受试者(所述组合物给药剂量为10～30μg)。应用免疫组织化学技术对患者组织样品中的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。从图中可以看出，tp705治疗可减少肿瘤内nf-kb的含量。治疗后和治疗前之间p＝0.022。
[0211]
所述组合物对肿瘤内β-连环蛋白(β-catenin)水平的影响。向isscc患者给予所述组合物治疗引起β-连环蛋白的表达下降，如图21所示。组织样品来自于受试者(所述组合物给药剂量为10～30μg)。应用免疫组织化学技术对患者组织样品中的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。
[0212]
在所述组合物治疗组中，所有受试者肿瘤区域内β-连环蛋白水平降低(10～30μg剂量)，且呈现剂量依赖性，如图22所示。
[0213]
如图23所示，对isscc患者瘤内注射所述组合物进行治疗，结果证实病变中肿瘤细胞的清除表现出剂量依赖性。此外，给药治疗基本不会在患者皮肤上留下疤痕。这一点非常重要，因为这类病变经常发生在如面部/颈部这样的外露部位，当前治疗方案(手术或刮除术和电烧法)经常导致这些部位产生疤痕。
[0214]
这些数据表明，将两种靶向tgfβ1和cox-2的sirna组合放在一种纳米导入系统内，可同时将两种sirna共同递送至一个细胞中，并显示出对原位鳞状细胞癌(isscc)强有力的抑制效果。该组合物和给药方法也可用于治疗基底细胞癌。
[0215]
尽管本公开描述了所述组合物和方法的某些实施例，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些组合物和方法易受其他实施例的影响，并且某些细节在不脱离本公开的基本原理的情况下，可以对本文中描述的实施方式进行改变。