包含山柰酚糖苷化合物的皮肤保护用组合物的制作方法

1.本发明公开了一种皮肤保护用组合物，该组合物包含对人体安全且具有优异的皮肤保护效果的山柰酚糖苷化合物。


背景技术：

2.皮肤是人体的第一道防御屏障，其保护体内各器官免受温度及湿度变化、紫外线和污染物等外部环境的刺激，而且在体温调节等的维持身体稳态方面也起着重要作用。
3.然而，由于过度的物理和化学刺激和压力、营养缺乏等外部因素以及年龄增长，皮肤的正常功能下降，并且会促进弹性损失、角质化、皱纹生成等现象。为了防止这种现象并维持更健康且有弹性的皮肤，已经致力于通过使用生理活性物质得到强化的化妆品来维持皮肤的固有功能并激活皮肤细胞以有效地促进皮肤再生。
4.然而，现有的化妆品原料大部分存在效果不佳或者在效果较强的情况下会造成皮肤副作用等各种问题。因此，对皮肤安全且能够有效地促进皮肤再生和调节皮肤角质生成周期的成分正在日益受到关注。
5.【现有技术文献】
6.【专利文献】
7.(专利文献1)b.-c.liau等人、工业原料作物与制品(industrial crops and products)95(2017)296-304。


技术实现要素：

8.技术问题
9.在一方面，本发明旨在提供一种组合物，该组合物包含作为有效成分的山柰酚糖苷化合物，因副作用小而对人体安全，并且皮肤保护效果优异。
10.在另一方面，本发明旨在提供一种皮肤保护用组合物，该组合物包含提取自山茶籽油粕(camellia japonica seed cake)的山柰酚糖苷化合物作为有效成分，利用了提取山茶籽油后丢弃的废物资源。
11.在另一方面，本发明旨在提供一种改善皮肤皱纹或促进皮肤再生的组合物。
12.在另一方面，本发明旨在提供抑制基质金属蛋白酶-1(matrix matallloprotease-1,mmp-1)表达的组合物。
13.在另一方面，本发明旨在提供一种用于改善特应性皮肤的组合物。
14.在另一方面，本发明旨在提供一种调节皮肤角质生成周期、调节皮肤角质、促进皮肤角质更新、或使皮肤角质更新周期正常化的组合物。
15.在另一方面，本发明旨在提供一种通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoino sitide-dependent kinase 1，pdk1)的活性来改善特应性皮肤或者改善、预防或治疗特应性皮炎的组合物。
16.在另一方面，本发明旨在提供一种通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)
的活性来调节皮肤角质生成周期、调节皮肤角质、促进皮肤角质更新、或使皮肤角质更新周期正常化的组合物。
17.技术方案
18.本说明书提供一种皮肤保护用组合物，所述皮肤保护用组合物包含作为有效成分的山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至4中任一项表示。
19.[化学式1]
[0020][0021]
[化学式2]
[0022][0023]
[化学式3]
[0024][0025]
[化学式4]
[0026][0027]
有益效果
[0028]
在一方面，本说明书公开的皮肤保护用组合物包含作为有效成分的山柰酚糖苷化合物，特别是山柰酚4-糖苷化合物，从而抑制基质金属蛋白酶-1(mmp-1)表达，由此可以改善皮肤皱纹并促进皮肤再生。
[0029]
在另一方面，本说明书公开的皮肤保护用组合物包含作为有效成分的山柰酚4-糖苷化合物，从而抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性，由此可以改善特应性皮肤或者改善、预防或治疗特应性皮炎，并且调节皮肤角质生成周期。
附图说明
[0030]
图1示出了根据本发明一实施例的衰老标志物sa-β-gal表达的观察结果。
[0031]
图2a和图2b示出了显示根据本发明一实施例的组合物对3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)活性的抑制效果的图表。
[0032]
图3示出了显示根据本发明一实施例的组合物对基质金属蛋白酶-1(mmp-1)表达的抑制效果的图表。
[0033]
图4示出了显示根据本发明一实施例的组合物对h&e、ki-67、krt10、flg和inv产生的效果的图表。
[0034]
图5a至图5b示出了根据本发明一实施例的组合物对表皮厚度和ki-67产生效果的结果。
[0035]
图6a至图6c示出了根据本发明一实施例的组合物对krt10、flg和invd产生效果的结果。
[0036]
图7示出了由化学式1至4表示的山柰酚糖苷化合物的信息。
[0037]
图8a至图8b示出了关于pdk1被抑制时再生能力是否恢复的实验示意图。
[0038]
图9a至图9b示出了显示通过抑制pdk1使皮肤细胞功能恢复的结果。
[0039]
图10a至图10b示出了显示pdk1影响皮肤再生的结果。
[0040]
图11a至图11b示出了显示pdk1抑制在皮肤等效物中抑制sasp的图表。
具体实施方式
[0041]
在本说明书中，当某部分“包含”某个组成要素时，除非有特别说明，则是指该部分还可以包含其他组成要素，而不是将其他组成要素排除在外。
[0042]
下文将详细地描述本发明。
[0043]
本发明的示例性实施例提供一种皮肤保护用组合物，所述皮肤保护用组合物包含作为有效成分的山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至4中任一项表示。
[0044]
[化学式1]
[0045][0046]
[化学式2]
[0047][0048]
[化学式3]
[0049][0050]
[化学式4]
[0051][0052]
在本说明书中，术语“异构体”具体不仅包括光学异构体(optical isomers)(例
如，基本上纯的对映异构体(essentially pure enantiomers)、基本上纯的非对映异构体(essentially pure d iastereomers)或其混合物)，还包括构象异构体(conformation isomers)(即，异构体仅在一个或多个化学键的角度上不同)、位置异构体(position isomers)(尤其是互变异构体(tautomers))或几何异构体(geometric isomers)(例如，顺-反式异构体)。
[0053]
在本说明书中，“基本上纯的(essentially pure)”是指，例如当使用相关的对映异构体或非对映异构体时，以对映异构体或非对映异构体为例的具体化合物所占的量约为90％(w/w)或以上，优选约为95％(w/w)或以上，较优选约为97％(w/w)或以上、或98％(w/w)或以上，更优选约为99％(w/w)或以上，甚至更优选约为99.5％(w/w)或以上。
[0054]
本说明书中的“药学上可接受”，是指在使用常规的医药学服用量(medicinal dosage)时，通过避免显著的毒性作用，从而可以获得或获得政府或同等级监管机构的可用于动物的批准，更具体为可用于人类的批准，或被认定为在药典中被公开，或被记载于其他的一般药典中。
[0055]
在本说明书中，“药学上可接受的盐”是指根据本发明的一个方面的盐，其是药学上可接受的，并且具有母体化合物(parent compound)所需的药理活性的盐。所述盐可以包括，(1)由例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的；或由例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2,2,2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等的有机酸形成的酸加成盐(acid addition salt)；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被取代而形成的盐。
[0056]
本说明书中的“水合物(hydrate)”是指与水结合的化合物，其以广义使用，包括在水和化合物之间缺少化学键的包合化合物。
[0057]
本说明书中的“溶剂化物”是指溶质的分子或离子与溶剂的分子或离子之间形成的高阶化合物。
[0058]
由化学式1表示的山柰酚糖苷化合物的iupac名称为山柰酚-3-o-β-d-吡喃木糖基-(1
→
3)-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
6)-o-β-d-吡喃木糖基-(1
→
2)-o-β-d-吡喃半乳糖苷(kaempferol-3-o-β-d-xylopyranosyl-(1
→
3)-o-α-l-rhamnopyranosyl-(1
→
6)-o-β-d-xylopyranosyl-(1
→
2)-o-β-d-galactopyranoside)，其在常温下可以淡黄色粉末的形式存在。
[0059]
关于由化学式1表示的山柰酚糖苷化合物的信息如下。
[0060]
淡黄色粉末；uv(hplc-pda)λ
max 266,347nm；[α]
22d-57.4(c 0.10)；esi-q-tof-ms:m/z 859.2503[m h]

(c
37h47o23
的计算值,859.2508),881.2329[m na]

(c
37h46o23
na

的计算值,859.2327)；1h-(cd3od,500mhz)和
13
c-nmr(cd3od,125mhz)(参见图7)。
[0061]
由化学式2表示的山柰酚糖苷化合物的iupac名称为山柰酚-3-o-β-d-吡喃木糖基-(1
→
3)-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
6)-o-β-d-吡喃木糖基-(1
→
2)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(kaempferol-3-o-β-d-xylopyranosyl-(1
→
3)-o-α-l-rhamnopyranosyl-(1
→
6)-o-β-d-xylopyranosyl-(1
→
2)-o-β-d-glucopyranoside)，其在常温下可以淡黄色粉末的形式
存在。
[0062]
关于由化学式2表示的山柰酚糖苷化合物的信息如下。
[0063]
淡黄色粉末；uv(hplc-pda)λ
max 266,347nm；[α]
22d-63.7(c 0.10)；esi-q-tof-ms:m/z 859.2505[m h]

(c
37h47o23
的计算值,859.2508),881.2325[m na]

(c
37h46o23
na

的计算值,859.2327)；1h-(cd3od,500mhz)和
13
c-nmr(cd3od,125mhz)(参见图7)。
[0064]
由化学式3表示的山柰酚糖苷化合物的iupac名称为山柰酚-3-o-β-d-吡喃木糖基-(1
→
3)-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
6)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-o-β-d-吡喃半乳糖苷(kaempferol-3-o-β-d-xylopyranosyl-(1
→
3)-o-α-l-rhamnopyranosyl-(1
→
6)-o-β-d-glucopyranosyl-(1
→
2)-o-β-d-galactopyranoside)，其在常温下可以淡黄色粉末的形式存在。
[0065]
关于由化学式3表示的山柰酚糖苷化合物的信息如下。
[0066]
淡黄色粉末；uv(hplc-pda)λ
max 266,347nm；[α]
22d-72.5(c 0.2)；esi-q-tof-ms:m/z 889.2616[m h]

(c
38h49o23
的计算值,889.2613)和911.2432[m na]

(c
38h48o24
na

的计算值,859.2327)；1h-(cd3od,500mhz)和
13
c-nmr(cd3od,125mhz)(参见图7)。
[0067]
由化学式4表示的山柰酚糖苷化合物的iupac名称为山柰酚-3-o-β-d-吡喃木糖基-(1
→
3)-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
6)-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(kaempferol-3-o-β-d-xylopyranosyl-(1
→
3)-o-α-l-rhamnopyranosyl-(1
→
6)-o-β-d-glucopyranosyl-(1
→
2)-o-β-d-gluctopyranoside)，其在常温下可以淡黄色粉末的形式存在。
[0068]
关于由化学式4表示的山柰酚糖苷化合物的信息如下。
[0069]
淡黄色粉末；uv(hplc-pda)λ
max 266,347nm；[α]
22d-45.1(c 0.10)；esi-q-tof-ms:m/z 889.2613[m h]

(c
38h49o23
的计算值,889.2613)和911.2423[m na]

(c
38h48o24
na

的计算值,859.2327)；1h-(cd3od,500mhz)和
13
c-nmr(cd3od,125mhz)(参见图7)。
[0070]
根据本发明的一个方面的组合物包含从山茶籽中提取油后丢弃的山茶籽油粕中提取的山柰酚四糖苷化合物作为有效成分，与现有的包含山柰酚糖苷化合物作为有效成分的组合物相比，可以显示出显著优异的改善皮肤皱纹、皮肤再生、改善、预防或治疗特应性皮炎、调节皮肤角质生成周期的效果。
[0071]
山茶籽油粕提取物由萜烯糖苷、类黄酮糖苷、糖和蛋白质组成。特别地，山茶籽油粕的类黄酮糖苷由山柰酚的四糖苷(化学式1、2、3、4)和三糖苷(化学式5、6、7、8)组成，本发明人确认了源自山茶籽油粕的山柰酚糖苷中4种四糖苷(化学式1、2、3、4)具有卓越的皮肤保护效果。
[0072]
[化学式5]
[0073][0074]
[化学式6]
[0075][0076]
[化学式7]
[0077][0078]
[化学式8]
[0079][0080]
在一个实施例中，所述山柰酚糖苷化合物可从山茶籽油粕中提取。
[0081]
具体地，所述山柰酚糖苷化合物可通过如下获得：通过压榨法从山茶籽生产出油后得到山茶籽油粕，然后使用70％乙醇从山茶籽油粕中提取山柰酚糖苷化合物。
[0082]
在一个实施例中，基于所述组合物的总重量，所述有效成分的浓度可以为0.01μm至100μm，例如，可以为0.01μm或以上、0.1μm或以上、0.5μm或以上、1μm或以上、1.5μm或以上、2μm或以上、或2.5μm或以上，且100μm或以下、50μm或以下、10μm或以下、8μm或以下、6μm或以下、或4μm或以下。
[0083]
当该浓度小于0.01μm时，促进皮肤再生、改善特应性皮炎或调节皮肤角质生成周期等皮肤保护效果可能甚微，而当浓度大于100μm时，可能会显示出细胞毒性。
[0084]
在一个实施例中，所述组合物可以用于改善皮肤皱纹。
[0085]
在一个实施例中，所述组合物可以用于促进皮肤再生。
[0086]
在一个实施例中，所述组合物可以抑制基质金属蛋白酶-1(mmp-1)的表达。
[0087]
在另一个实施例中，所述组合物可以用于通过抑制基质金属蛋白酶-1(mmp-1)的表达来改善皮肤皱纹。
[0088]
在另一个实施例中，所述组合物可以用于通过抑制基质金属蛋白酶-1(mmp-1)的表达来促进皮肤再生。
[0089]
在一个实施例中，所述组合物可以用于改善特应性皮肤。
[0090]
在一个实施例中，所述组合物可以用于调节皮肤角质生成周期。
[0091]
所述皮肤角质生成周期也可称为表皮细胞的更新(turn-over)周期，意指角质形成细胞(keratinocyte)从皮肤表皮底部到皮肤表面退化为角质细胞(corneocytes)的周期。
[0092]
皮肤细胞的更新周期可以由两个因素决定，一个是通过维持表皮细胞的生长潜力(potential)来测定集落(colony)形成效率，另一个是通过促进表皮细胞的分化来维持屏障增强以测定分化程度。根据本发明的一个方面，所述组合物包含作为有效成分的山柰酚四糖苷化合物，从而能够促进表皮细胞的集落形成，并促进分化，进而可缩短皮肤角质生成周期或表皮细胞更新周期。
[0093]
在另一个实施例中，所述组合物可用于调节皮肤角质，或用于促进皮肤角质更新，或用于使皮肤角质更新周期正常化。
[0094]
在一个实施例中，所述组合物可以抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性。
[0095]
当通过使用包含由所述化学式1至化学式4中任一个化学式表示的山柰酚糖苷化合物的组合物来抑制pdk1活性时，因衰老而生长受到抑制的细胞可以重新生长，并且受损的细胞可以得到恢复。
[0096]
换句话说，在衰老的人真皮成纤维细胞中抑制pdk1可消除衰老特征且抑制nf-κb和mtor信号传递，从而恢复细胞生成周期，进而能够恢复或促进皮肤再生能力。
[0097]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来改善皮肤皱纹。
[0098]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来促进皮肤再生。
[0099]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来改善特应性皮肤，或改善、预防或治疗特应性皮炎。
[0100]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来调节皮肤角质生成周期。
[0101]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来调节皮肤角质。
[0102]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来促进皮肤角质更新。
[0103]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性来使皮肤角质更新周期正常化。
[0104]
在另一个实施例中，所述组合物可用于通过抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1
(pdk1)的活性来改善皮肤屏障。
[0105]
在一个实施例中，所述组合物可为化妆品组合物。
[0106]
根据本发明的一个实施例的化妆品组合物的外观可以包含化妆品学或皮肤病学可接受的介质或基质。其可以为适合于局部施用的所有剂型，例如，可以制备为溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物、通过将油相分散在水相中获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微小颗粒球、或离子型(脂质体)和非离子型囊泡分散剂的形式，或霜、爽肤水、乳液、粉末、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形式。这些组合物可以通过本领域的常规方法制备。根据本发明的组合物还可以以泡沫(foam)的形式、或以进一步包含压缩推进剂的气溶胶组合物的形式进行使用。
[0107]
根据本发明的一个实施例的所述化妆品组合物的剂型没有特别限制，例如，可制备为柔肤化妆水、收敛化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、眼部精华、洁面霜、洁面泡沫、洁面水、面膜、粉末、身体乳、身体霜、身体油和身体精华等的化妆品。
[0108]
当根据本发明的一个实施例的剂型为糊剂、霜剂或凝胶剂时，作为载体成分可使用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
[0109]
当根据本发明的一个实施例的剂型为粉末或喷雾剂时，作为载体成分可使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，尤其，当剂型为喷雾剂时，可进一步包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。
[0110]
当根据本发明的一个实施例的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分使用溶剂、溶剂化剂或乳浊化剂，例如为水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。
[0111]
当根据本发明的一个实施例的剂型为悬浮液时，作为载体成分可使用如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。
[0112]
当根据本发明的一个实施例的剂型为含有表面活性剂的洁面剂时，作为载体成分可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
[0113]
在根据本发明的一个实施例的化妆品组合物中，除了包含所述有效成分以外，还可以包含功能性添加剂和通常的化妆品组合物中所包含的成分。所述功能性添加剂可包含选自水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多糖、鞘脂和海藻提取物中的成分。
[0114]
此外，在根据本发明一个实施例的化妆品组合物中，除了所述功能性添加剂外，还可以根据需要搭配通常化妆品组合物中所包含的成分。除此之外，包含的调配成分可为油脂成分、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机颜料和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、ph调节剂、醇、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。
[0115]
此外，根据本发明的一个实施例的组合物可为皮肤外用剂，并且所述皮肤外用剂为包括涂抹于皮肤外部的任何剂型的总称，其中包括各种剂型的化妆品和医药品。
[0116]
在一个实施例中，所述组合物可为用于改善、预防或治疗特应性皮炎的药物组合
物。
[0117]
根据本发明的一个实施例的药物组合物可进一步包含防腐剂、稳定剂、可湿性粉剂或乳化剂、如盐和/或缓冲剂等的用于控制渗透压的药物辅助剂，以及其它对治疗有用的物质，并且可根据常规方法配制成各种口服剂型或肠胃外剂型。
[0118]
所述口服剂型例如可包括片剂、丸剂、硬胶囊和软胶囊、液体、悬浮液、乳剂、糖浆、粉剂、散剂、细粒剂、颗粒剂和微丸剂等，而这些剂型除了包含有效成分以外，还可以包含表面活性剂、稀释剂(例：乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例：二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐、以及聚乙二醇)。此外，片剂还可包含如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮的粘合剂，并根据具体情况还可包含如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐等的崩解剂、吸收剂、着色剂、调味剂、以及甜味剂等的药物添加剂。所述片剂可以通过常规的混合、制粒或包衣方法进行制备。此外，所述肠胃外剂型可为经皮给药剂型，例如可为注射剂、滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、霜剂、喷雾剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂等剂型，但不限于此。
[0119]
根据本发明的一个实施例的药物组合物可通过肠胃外、直肠、局部、经皮、皮下等途径进行给药。
[0120]
本领域技术人员基于其认知水平能够确定所述有效成分的给药剂量。尽管药物的每日给药剂量根据待给药对象的疾病进展程度、发病时间、年龄、健康状态、并发症等多种因素而有所不同，但一般而言，在以成人为基准的情况下，所述组合物的给药剂量可以为0.01mg/kg/天至100mg/kg/天，例如可以为0.01mg/kg/天或以上、0.1mg/kg/天或以上、0.5mg/kg/天或以上、1mg/kg/天或以上、1.3mg/kg/天或以上、1.5mg/kg/天或以上、1.7mg/kg/天或以上、2mg/kg/天或以上、或2.2mg/kg/天或以上，且100mg/kg/天或以下、50mg/kg/天或以下、10mg/kg/天或以下、7mg/kg/天或以下、5mg/kg/天或以下、3mg/kg/天或以下、或2.5mg/kg/或以下，优选地，可将1mg/kg至5mg/kg分为1至3次每天给药，并且该给药剂量不以任何方式限制本发明的范围。
[0121]
在一个实施例中，所述组合物可为食品组合物。
[0122]
根据本发明的一个实施例的食品组合物可为液相或固体状态的剂型，可为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、颗粒剂、饮料(饮剂)、减肥棒、巧克力、焦糖剂型或饼干类剂型，其剂型没有特别限制。本发明的食品组合物除了包含所述有效成分之外，根据需要还可适量包含赋形剂、糖类、香料、色素、油脂类、蛋白质等。
[0123]
在本发明的另一个示例性实施例中，提供一种保护皮肤的方法，所述方法包括将有效剂量的组合物给药于所需受试者，所述组合物包含作为有效成分的山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至化学式4中任一项表示。
[0124]
[化学式1]
[0125][0126]
[化学式2]
[0127][0128]
[化学式3]
[0129][0130]
[化学式4]
[0131][0132]
在本发明的另一个示例性实施例中，提供山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物在制备皮肤保护用组合物中的用途，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至化学式4中任一项表示。
[0133]
[化学式1]
[0134][0135]
[化学式2]
[0136][0137]
[化学式3]
[0138][0139]
[化学式4]
[0140][0141]
在本发明的另一个示例性实施例中，提供山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上
可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的用于保护皮肤的非治疗性用途，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至化学式4中任一项表示。
[0142]
[化学式1]
[0143][0144]
[化学式2]
[0145][0146]
[化学式3]
[0147][0148]
[化学式4]
[0149][0150]
在本发明的另一个示例性实施例中，提供用于改善、预防或治疗特应性皮炎的山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至4中任一项表示。
[0151]
[化学式1]
[0152][0153]
[化学式2]
[0154][0155]
[化学式3]
[0156][0157]
[化学式4]
[0158][0159]
以下，将通过如下的实施例更详细地描述本发明。然而，提供以下实施例的目的仅在于帮助理解本发明，本发明的范畴和范围并不限于此。
[0160]
实施例
[0161]
实验所用的山茶籽油粕是由济州岛山茶村的山茶籽通过压榨法生产油后得到的。通过使用70％乙醇从山茶籽油粕制备出提取物，并确认了山茶籽油粕提取物由萜烯糖苷、类黄酮糖苷、糖和蛋白质组成。特别地，山茶籽油粕的类黄酮糖苷由山柰酚的四糖苷(化学式1、2、3、4)和三糖苷(化学式5、6、7、8)组成，本说明书中确认了在山茶籽油粕山柰酚糖苷中4种四糖苷(化学式1、2、3、4)具有卓越的皮肤抗衰老和再生效果。
[0162]
1)山茶籽油粕的山柰酚糖苷馏分的纯化
[0163]
将8kg的70％乙醇添加到1kg的经低温榨油后脱油的山茶籽油粕中，使用加热提取器在60℃下提取8小时。在50℃至60℃下用旋转减压浓缩器对经压滤器过滤而获得的提取物进行减压浓缩，直至固体含量为约50％，从而获得200g浓缩液。用纯净水将该浓缩液稀释至固体含量为10％。
[0164]
将该溶液加载到装有2l离子交换树脂(hp-20)的玻璃管柱后，用10l纯净水进行洗涤以除去杂质和糖成分。然后使10l的30％乙醇依次流过，对洗脱液进行减压浓缩、冻干，从而获得约20g山茶山柰酚糖苷馏分粉末。
[0165]
2)山茶籽油粕的山柰酚四糖苷和三糖苷的纯化
[0166]
山茶山柰酚糖苷馏分的各成分在hplc结果中洗脱时间差很小，因此使用制备型hplc进行分离。溶剂条件为使用水和乙腈、甲醇的混合溶剂，并使用这些溶剂的浓度梯度或恒定比例的混合物，其结果分离出化学式1至化学式4(四糖苷)和化学式5至化学式8(三糖苷)的山柰酚糖苷化合物成分。
[0167]
实验实施例
[0168]
统计
[0169]
以下所有实验的分析中，样品之间的统计学显著性利用student t检验，p值为0.05或以下的情况被认为是统计学显著的。(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)
[0170]
实验实施例1：衰老标志物sa-β-gal表达程度的确认
[0171]
*细胞系和培养
[0172]
(1)老年皮肤细胞的培养
[0173]
在含有10％胎牛血清的dmem培养基(杜氏改良伊格尔培养基,gibco 1210-0038)中对作为人真皮成纤维细胞的正常人真皮成纤维细胞(normal human dermal fibroblast，nhdf；lonza公司，瑞士)进行培养，培养均在37℃、5％ co2的培养箱中进行。将传代数为6-9代的细胞作为年轻细胞，将其以1:5进行传代培养，传代37次，得到衰老的真皮成纤维细胞。
[0174]
(2)衰老标志物sa-β-gal表达活性的分析
[0175]
将上述(1)中的老年皮肤细胞分别用3μm的dmso、由化学式1、2、3、4、5、6、7、8表示的化合物和由以下化学式9、10表示的山柰酚3-o-β-芸香糖苷(化学式9)、山柰酚7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(化学式10)处理7天。
[0176]
[化学式9]
[0177][0178]
[化学式10]
[0179][0180]
在第8天，用pbs洗涤，并用细胞衰老分析试剂盒(cellular senescence assay kit)(cell biolabs公司,美国加州圣地亚哥)提供的固定液和染料在37℃下进行16小时的染色。次日，用pbs洗涤，用20％甘油溶液覆盖，用显微镜测定被染色为绿色的细胞数，然后评估衰老标志物sa-β-gal的表达程度，其结果示于下表1和图1中。
[0181]
【表1】
[0182][0183]
*细胞存活力的分析
[0184]
1.将hdf(人真皮成纤维细胞)细胞以1x104个细胞/孔的浓度分株在96孔板中，并在细胞培养条件下培养48小时。
[0185]
2.在不含fbs的dmem培养基中以各种浓度稀释实验物质后，处理在细胞中并培养48小时。
[0186]
3.用dpbs(杜氏磷酸盐缓冲液)洗涤后，替换为含10％ ez-cytox溶液的培养基，并在细胞培养条件下培养1小时，然后用elisa酶标仪(tecan infinite m200 pro)在450nm处测定吸光度。
[0187]
参见上表1，可以确认，与对照组或比较例化合物(化学式5至化学式8)相比，本发明的化学式1至化学式4的化合物将衰老标志物sa-β的表达抑制在约50％的水平。
[0188]
此外，参见图1，在本发明的化学式1至化学式4的化合物下培养的细胞中，可以用肉眼确认到衰老标志物sa-β-gal显著减少。
[0189]
实验实施例2：pdk1分析
[0190]
通过使用重组纯化的pdk1酶与adp-glo pdk1激酶酶系统(pdk1 kinase enzyme system；promega公司，美国威斯康星州麦迪逊)来测定3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pdk1)的活性。在分株底物、atp、缓冲液混合物后，将实验物质(1μm、3μm、10μm)分株到每个孔中。然后，立即分株pdk1并反应60分钟。反应后，添加adp-glo并在常温下孵育(incubation)40分钟后，添加激酶检测缓冲液并反应30分钟后，用发光读数仪(luminescence reader；wallac victor2，perkin elmer公司)进行测定。其结果如图2a和图2b所示。
[0191]
参照图2a和图2b，可以确认，与作为比较例的化学式5至化学式8的化合物(2a)相比，本发明的化学式1至化学式4的化合物(2b)的pdk活性抑制效果更优异。具体地，参照图2a，与对照组的dmso相比，化学式5至化学式8的化合物完全没有抑制pdk1活性，反而表现出促进pdk1活性的倾向，而参照图2b，可以确认，与对照组的dmso相比，本发明的化学式1至化学式4的化合物显著抑制pdk1活性。此外，可以确认，在山柰酚四糖苷化合物(化学式1至化学式4)中，连接的oh越多在相同浓度下表现出更高的效果。
[0192]
实验实施例3：mmp-1的elisa分析
[0193]
将hdf细胞以2.5x104个细胞/孔的浓度分株到24孔板中，并在细胞培养条件下培养24小时。然后，在不含fbs的dmem培养基中稀释实验物质后，处理在细胞中并培养48小时。用dpbs洗涤后，在加有dpbs的状态下以15mj/cm2的光强度进行uvb照射，然后，替换为稀释有实验物质(2μm或3μm)的dmem培养基并培养48小时。然后，收集上清液并使用人总mmp-1elisa(r&d systems)测定mmp-1的量。其结果如图3所示。
[0194]
参照图3，可以确认，与山柰酚三糖苷化合物(化学式5和化学式7)和视黄酸(ra)等对照组相比，本发明的山柰酚四糖苷化合物(化学式1、化学式3和化学式4)对mmp-1表达的抑制更优异。
[0195]
实验实施例4：皮肤屏障改善的确认
[0196]
1)3d器官型皮肤表皮
[0197]
分别购买对应于年轻人(21岁，表示为21y)和老年人(58岁，表示为58y)的人表皮模型(epiderm
tm
epi-201；mattek公司，美国马萨诸塞州阿什兰)，用3μm的由化学式1表示的山柰酚四糖苷在对应于老年人的人表皮模型中进行4天的处理。用10％中性缓冲福尔马林进行固定后，制备石蜡块。
[0198]
2)皮肤屏障标志物的确认
[0199]
使用抗krt10(biolegend公司,美国加州圣地亚哥)、抗flg(novus biologicals公司,美国科罗拉多州森特尼尔)、抗外皮蛋白和抗ki67(abcam公司)抗体进行反应后，在显微镜下分析每种抗体的表达。具体地，对来自年轻供体(年轻21y)的表皮组织和来自老年供体(老年58y)的表皮组织进行药物处理，然后用上述的抗体进行染色并进行定量化。其结果如图4、图5a至图5b和图6a至图6c所示，图5a至图5b和图6a至图6c是对图4的结果进行定量化。
[0200]
据此确认到，与年轻表皮组织相比，老年表皮组织的表皮厚度减少(图5a)，屏障功能(krt10-图6a，flg-图6b，inv-图6c)减弱，再生能力标志物(ki67-图5b)的表达降低。然而，当用由化学式1表示的化合物处理老年表皮组织时，在所有项目中表皮厚度、屏障功能和再生能力标志物表达效果均恢复到与年轻表皮组织相似的程度。
[0201]
实验实施例5：pdk1受抑制时再生能力的恢复
[0202]
通过分析调节信号网络，预测出pdk1是能够将衰老的成纤维细胞转化为静止成纤维细胞(quiescent fibroblasts)的抑制剂靶点(图8a)。为了验证这一预测，用暴露于pdk1抑制剂的nhdf(正常人真皮成纤维细胞)(图8b)进行实验，并且确认了细胞衰老特征被去除以及响应于生长因子使细胞的增殖得到恢复，还确认了在二维培养和三维皮肤等效模型中皮肤再生能力得到恢复。
[0203]
总的来说，确认了pdk1受抑制时作为维持衰老表型的关键过程的细胞生长和sasp均减少，并且由pdk1、akt、ikbkb和pten组成的与细胞生长相关的主要正反馈回路会失活。信号传递的结果性变化使静止表型(quiescence phenotype)得到复原。
[0204]
在以下实验中，在含有10％胎牛血清的dmem培养基(gibco 1210-0038)中对作为人真皮成纤维细胞的正常人真皮成纤维细胞(nhdf；lonza公司，瑞士)进行培养，培养均在37℃、5％ co2的培养箱中进行。将传代数为6-9代的细胞作为年轻细胞，将其以1:5进行传代培养，传代37次，得到衰老的真皮成纤维细胞。
[0205]
1)通过伤口愈合分析来分析pdk1抑制对皮肤细胞的功能性恢复
[0206]
首先，为了确认通过pdk1抑制或mtor和nf-κb双重抑制不但减少衰老特征而且实现真正的再生能力，调查逆转的细胞对于二维伤口愈合和三维皮肤再生的能力。
[0207]
具体的实验方法如下。
[0208]
年轻nhdf没有接受衰老条件或药物治疗。当培养在pdl 12下达到约80％汇合时，对年轻nhdf进行分析。将其余nhdf暴露于多柔比星(doxorubicin)(100ng/ml)和igf-1(100ng/ml)7天，以诱导老化。对于药物处理条件，将衰老细胞用dmso、雷帕霉素(100nm)、雷帕霉素和jsh(2.5μm)或bx795(100nm)进一步处理7天。对于条件培养基处理(bx795 cm(条件培养基))，使细胞在多柔比星和igf-1存在的条件下生长7天，然后在多柔比星、igf-1和bx795存在的条件下传代培养7天，然后，与从衰老细胞中提取的调节培养基一起再培养3
天。
[0209]
参照图9a至图9b，分别如下：(9a)显示了创伤后0小时和96小时的代表性图像，虚线表示伤口部位。比例尺＝200μm。(9b)划痕伤口试验中迁移区域的定量分析。平均值
±
sd(n＝3)，根据单因素方差分析，与dmso对照组衰老细胞相比，***p《0.001。
[0210]
调查结果为，pdk1抑制或mtor和nf-κb双重抑制(不是mtor单一抑制)促进了nhdf单层划痕伤口的愈合(图9a至图9b)。
[0211]
2)pdk1对皮肤再生的效果
[0212]
3d皮肤模型(皮肤等效物)的制备使用年轻nhdf(pdl 12)或通过多柔比星和igf-1或反复镀层处理(复制衰老，pdl 57)而诱导衰老的衰老nhdf，并将它们暴露于dmso或bx795。各处理含量如下：多柔比星(100mg/ml)、igf-1(100ng/ml)、bx-795(100nm)。
[0213]
参照图10a至图10b，分别如下：(10a)皮肤等效模型切片通过用苏木精和伊红(haematoxylin and eosin，h&e)或masson三色染色(masson's trichrome)进行染色，以检测胶原纤维。通过免疫组织化学来检测标记的蛋白质。结果获得自三个代表性实验。比例尺＝50μm。
[0214]
具体地，实验方法如下。
[0215]
将石蜡样品在二甲苯中脱蜡，并通过递减乙醇进行再水化(每种溶液3分钟)。使用柠檬酸盐缓冲液ph 6.0抗原修复锅(64142；electron microscopy sciences公司,宾西法尼亚洲哈特菲尔德)在121℃下进行10分钟的表位修复，并在pbs/0.05％吐温20中洗涤3次之前冷却载玻片。然后，将切片用水/1％ h2o2培养30分钟以阻断内源性过氧化物酶，并用水和pbs/0.05％吐温20漂洗5分钟，在4℃下暴露于一抗过夜之前用pbs/10％山羊血清(dako公司，丹麦格洛斯楚普)培养20分钟。一抗如下：抗krt10(biolegend公司,加州圣地亚哥)、抗flg(abcam公司)、抗mmp-1(abcam公司)、抗ki67(abcam公司)。
[0216]
将样品用水彻底洗涤10分钟，然后用pbs/0.05％吐温20彻底洗涤5分钟，然后与envision system-辣根过氧化物酶标记聚合抗小鼠抗体(k4001；dako公司,加州卡平特里亚)一起培养30分钟。然后，将样品在用液体dab 底物色原系统(k3468；dako公司)进行培养之前用水和pbs洗涤3至5分钟。用自来水漂洗以终止上述反应，将切片在梅式苏木精(mayer's hematoxylin)中复染3至5分钟并在自来水中漂洗1分钟，然后在scott蓝化液中漂洗2分钟。
[0217]
最后，将切片在指定等级的乙醇中脱水，在二甲苯中已被去除，并在cytoseal 60(thermoscientific公司,马萨诸塞州沃尔瑟姆)中封固。使用市售的试剂盒(bbc biochemical公司,美国华盛顿州西雅图)进行masson三色染色。为了免疫荧光染色，通过将载玻片在dako靶标修复溶液(dako公司)中煮沸20分钟来进行抗原修复。通过用含有10％驴血清和0.05％triton x-100的pbs进行30分钟的培养来阻断非特异性染色。将组织切片在dako荧光封固介质(dako公司)中与col17a1(abcam公司)和层粘连蛋白5(laminin 5；santa cruz biotechnology公司)一起在4℃下培养并过夜，然后与偶联于alexa fluor 488(invitrogen-molecular probes公司)的适当的二抗一起在室温下培养2小时。用pbs洗涤后，添加4',6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐(dapi，invitrogen-molecular probes公司)以进行核复染。使用荧光封固介质(thermo electron公司)将盖玻片封固在载玻片上。
[0218]
(10b)在图10b中从左上角依次是，使用imagej软件对皮肤厚度的定量化/mmp1的
定量化/通过masson三色染色检测的对泛胶原(pan-collagen)纤维的定量化/对ki-67阳性细胞的定量化/使用imagej软件对表皮厚度的定量化/对角蛋白10的定量化/对丝聚蛋白的定量化/对col17a1的定量化/对层粘连蛋白5的定量化/通过elisa定量化的对分泌到培养基中的i型原胶原蛋白的定量化。b中的数据用获得自三个独立样本的三个独立视野的平均值
±
sd表示。根据单因素方差分析，与dmso对照组衰老细胞相比，***p《0.001。
[0219]
pdk1抑制逆转了以mmp1增加、胶原纤维减少和原胶原分泌减少为证据的与复制衰老和化学诱导衰老相关的真皮衰老(图10a至图10b)。在表皮稳态的情况下，角质细胞增殖和分化之间的平衡由真皮成纤维细胞调节。
[0220]
因此，调查了通过pdk1抑制来逆转衰老真皮成纤维细胞是否会影响角质细胞的增殖和分化。bx-795是一种强效的pdk1抑制剂，其在肿瘤细胞中阻断pdk1/akt信号传递，并在培养或诱导的细胞凋亡中抑制各种肿瘤细胞系的贴壁依赖性生长。调查结果为，在用众所周知的pdk1抑制剂bx795处理的皮肤等效物(图10a至图10b)的表皮中ki-67增殖标志物显著升高，表明在被诱导衰老的ndhf的皮肤等效物中保持表皮厚度的角质形成细胞的增殖能力增加(图10a至图10b)。
[0221]
此外，对角质细胞分化标志物(角蛋白10和丝聚蛋白)和真皮-表皮连接处的基底膜标志物(col17a1和层粘连蛋白5)的染色强度进行比较，其结果显示pdk1抑制使衰老nhdf的皮肤等效物中会发现的丰度降低的这些角质形成细胞分化标志物和真皮-表皮连接成分得以恢复(图10a)。
[0222]
与二维衰老nhdf的观察结果(图9a至图9b)相似地，在提取自通过用bx795处理的两种类型的衰老nhdf制备的皮肤等效物的条件培养基中，使gro、groα、il-6、il-8、mcp-1至3和rantes的含量少于提取自载体(vehicle)处理的皮肤等效物的条件培养基中的含量(图11a至图11b)。
[0223]
具体地，实验方法如下。
[0224]
pdk1抑制在皮肤等效物中会抑制sasp。3d皮肤模型(皮肤等效物)的制备使用年轻nhdf(pdl 12)或通过多柔比星和igf-1或反复镀层处理(复制衰老，pdl 57)而诱导衰老的衰老nhdf，并将它们暴露于dmso或bx795。各处理含量如下：多柔比星(100mg/ml)、igf-1(100ng/ml)、bx-795(100nm)。
[0225]
用细胞因子抗体阵列测定来自使用或未使用bx795处理的化学诱导的或复制衰老的nhdf的皮肤等效物的条件培养基(cm)，并用各膜的内部阳性对照组进行标准化。(11a)使用或未使用bx795处理的化学诱导的nhdf在皮肤等效物的细胞因子阵列中被测得的分泌蛋白。(11b)用或未用bx795处理的复制衰老的nhdf在皮肤等效物的细胞因子阵列中被测得的分泌蛋白。根据单因素方差分析，与dmso对照组衰老细胞相比，平均
±
sd(n＝3)，***p《0.001。
[0226]
总之，这些发现表明pdk1抑制将衰老真皮成纤维细胞转化为静止成纤维细胞，从而增强表皮再生并保持皮肤厚度，进而限制与衰老相关的皮肤劣化。
[0227]
具体示例
[0228]
具体示例1：山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物在制备皮肤保护用组合物中的用途，所述山柰酚糖苷化合物由以下化学式1至化学式4中任一项表示：
[0229]
[化学式1]
[0230][0231]
[化学式2]
[0232][0233]
[化学式3]
[0234]
[0235]
[化学式4]
[0236][0237]
具体示例2：根据具体示例1所述的用途，其中，所述山柰酚糖苷化合物从山茶籽油粕中提取。
[0238]
具体示例3：根据具体示例1或2所述的用途，其中，基于所述组合物的总重量，所述山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的浓度为0.01μm至100μm。
[0239]
具体示例4：根据具体示例1至3中任一项所述的用途，其中，所述皮肤保护是组合物改善皮肤皱纹；促进皮肤再生；抑制基质金属蛋白酶-1(mmp-1)的表达；改善、预防或治疗特应性皮肤；调节皮肤角质生成周期；或抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1的活性。
[0240]
具体示例5：根据具体示例1至4中任一项所述的用途，其中，所述组合物是化妆品组合物。
[0241]
具体示例6：根据具体示例1至4中任一项所述的用途，其中，所述组合物是用于改善、预防或治疗特应性皮炎的药物组合物。
[0242]
具体示例7：根据具体示例6所述的用途，其中，所述山柰酚糖苷化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的给药剂量为0.01mg/kg/天至100mg/kg/天。
[0243]
具体示例8：根据具体示例1至4中任一项所述的用途，其中，所述组合物是食品组合物。