一种基于内毒素去除的尿激酶生产方法与流程

1.本发明涉及生物工程及化学工程领域，具体涉及一种基于内毒素去除的尿激酶生产方法。


背景技术：

2.尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力，所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它无抗原性问题，可长时间使用。
3.尿激酶作为注射药物，成品对内毒素有着严格要求，药典中对于尿激酶成品中内毒素的含量有明确要求(《1eu/1万单位)，因此在尿激酶原料生产过程中必须有效去除内毒素。但目前为止，大多数的技术仍是将内毒素的去除和尿激酶的纯化工艺分离，从而增加了生产成本。
4.中国专利cn104031901b公开了一种纯化尿激酶的方法，该发明将尿激酶粗品中2个主要分子量区域的蛋白分开处理，通过调节ph值等手段进一步去除粗品中的杂质、热源和细胞内毒素，得到了尿激酶精品。但该发明的方法较为复杂，同时该方法中主要使用超滤膜进行超滤，由于超滤膜大部分不能进行化学处理，因此使用寿命较短，在更换层面会增加成本。
5.目前，尿激酶纯化普遍存在成本偏高的问题，因此，亟需寻找一种可有效去除尿激酶中内毒素的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于内毒素去除的尿激酶生产方法，通过对吸附材料的优化，在有效去除尿激酶中内毒素的同时，降低了生产成本。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种基于内毒素去除的尿激酶生产方法，包括以下步骤：
9.(1)样品预处理：调节尿激酶粗品溶液的ph值和电导，得到预处理液；
10.(2)层析柱制备与装柱：向复合微球中加水，得到悬混液，装柱，得到层析柱；所述复合微球由纳米四氧化三铁、聚苯乙烯和聚赖氨酸组成；
11.(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；
12.(4)上样处理：使用平衡缓冲液平衡层析柱，待紫外、电导和ph稳定后上样，所述上样的样品为步骤(1)得到的预处理液；当检测到流穿峰紫外吸收》50mau时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收《50mau，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。
13.优选地，步骤(1)中所述ph值为9。
14.优选地，步骤(1)中所述电导为3-6ms/cm；最优选为4.5ms/cm。
15.优选地，步骤(2)中所述层析柱中复合微球和水的高度比为1:0.8-1.2；最优选为1:1.1。
16.优选地，所述复合微球的制备方法，包括以下步骤：
17.s1、将纳米四氧化三铁、磷酸钙分散在水中，得到分散液；
18.s2、将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰混合，得到油相；
19.s3、将油相滴加到水相中，控制搅拌速度100-150rpm，温度45-60℃，调节ph为8-12；升温至80-100℃后反应2-4h，抽滤，洗涤，得到纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球；
20.s4、将纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球置于聚赖氨酸溶液中，调节ph至9.0，于50-55℃振荡反应过夜，反应完毕后过滤，再洗涤至中性并干燥，得到所述复合微球。
21.进一步优选地，步骤s1中所述纳米四氧化三铁的粒径为10-50nm。
22.进一步优选地，所述分散液的质量分数为8-12％。
23.进一步优选地，步骤s1中所述分散为：100-200w超声2-4min。
24.进一步优选地，所述纳米四氧化三铁、磷酸钙的质量比为0.5-1:1。
25.优选地，步骤s2中所述苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰的质量比为25-28:2-4:2-4:0.2-0.4；最优选为27:3:4:0.2。
26.优选地，步骤s4中所述聚赖氨酸溶液的浓度为5-6g/ml，所述聚赖氨酸的溶剂为质量分数2-5％的碳酸钠水溶液。
27.优选地，步骤(4)中所述层析柱的层析流动为70-90cm/h；进一步优选为80cm/h。
28.优选地，步骤(4)中所述平衡缓冲液为包括磷酸盐缓冲液。
29.优选地，步骤(4)中所述平衡的条件为紫外水平线上下偏差《0.1mau，ph为9.0，电导为3-6ms/cm。
30.本发明还提供了上述复合微球在吸附内毒素中的应用。
31.本发明的有益效果为：
32.(1)本发明制备由纳米四氧化三铁、聚苯乙烯和聚赖氨酸组成的复合微球，可实现对内毒素的快速吸附，且吸附量较高。
33.(2)相比常规的吸附填料，本发明的复合微球的制备方法简单，且成本低。
34.(3)本发明利用纳米四氧化三铁、聚苯乙烯和聚赖氨酸组成的复合微球实现了内毒素的快速、高效吸附，有效去除了尿激酶中的内毒素，相比现有技术，本发明的生产成本更低，满足了产业化需求满足了产业化需求。
具体实施方式
35.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
36.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体
实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
37.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
38.本发明对所采用原料的来源不作限定，如无特殊说明，本发明所采用的原料均为本技术领域普通市售品。
39.实施例1复合微球及其制备方法
40.一种复合微球的制备方法，包括以下步骤：
41.s1、按0.5:1的质量比，将粒径为10nm的四氧化三铁、磷酸钙加入水中，在100w下超声分散4min，得到质量分数为8％的分散液；
42.s2、按25:2:2:0.2的质量比，将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰混合，得到油相；
43.s3、将油相滴加到水相中，控制搅拌速度100rpm，温度45℃，调节ph为9；升温至80℃后反应4h，抽滤，洗涤，得到纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球；
44.s4、将纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球置于5g/ml的聚赖氨酸溶液(溶剂为质量分数3.5％的碳酸钠水溶液)中，调节ph至9.0，于50℃振荡反应过夜，反应完毕后过滤，再洗涤至中性并干燥，得到所述复合微球。
45.实施例2复合微球及其制备方法
46.一种复合微球的制备方法，包括以下步骤：
47.s1、按1:1的质量比，将粒径为50nm的四氧化三铁、磷酸钙加入水中，在200w下超声分散2min，得到质量分数为12％的分散液；
48.s2、按20:1:1:0.1的质量比，将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰混合，得到油相；
49.s3、将油相滴加到水相中，控制搅拌速度150rpm，温度60℃，调节ph为9；升温至100℃后反应2h，抽滤，洗涤，得到纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球；
50.s4、将纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球置于6g/ml的聚赖氨酸溶液(溶剂为质量分数3.5％的碳酸钠水溶液)中，调节ph至9.0，于50℃振荡反应过夜，反应完毕后过滤，再洗涤至中性并干燥，得到所述复合微球。
51.实施例3复合微球及其制备方法
52.一种复合微球的制备方法，包括以下步骤：
53.s1、按0.8:1的质量比，将粒径为20nm的四氧化三铁、磷酸钙加入水中，在150w下超声分散3min，得到质量分数为10％的分散液；
54.s2、按27:3:4:0.2的质量比，将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰混合，得到油相；
55.s3、将油相滴加到水相中，控制搅拌速度120rpm，温度50℃，调节ph为9；升温至90℃后反应3h，抽滤，洗涤，得到纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球；
56.s4、将纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球置于5.5g/ml的聚赖氨酸溶液(溶剂为质量分数3.5％的碳酸钠水溶液)中，调节ph至9.0，于50℃振荡反应过夜，反应完毕后过滤，再洗涤至中性并干燥，得到所述复合微球。
57.对比例1复合微球及其制备方法
58.一种复合微球的制备方法，包括以下步骤：
59.s1、按1.2:1的质量比，将粒径为20nm的四氧化三铁、磷酸钙加入水中，在150w下超声分散3min，得到质量分数为10％的分散液；
60.s2、按27:3:4:0.2的质量比，将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰混合，得到油相；
61.s3、将油相滴加到水相中，控制搅拌速度180rpm，温度50℃，调节ph为8.5；升温至90℃后反应3h，抽滤，洗涤，得到纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球；
62.s4、将纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球置于5.5g/ml的聚赖氨酸溶液(溶剂为质量分数3.5％的碳酸钠水溶液)中，调节ph至8.5，于50℃振荡反应过夜，反应完毕后过滤，再洗涤至中性并干燥，得到所述复合微球。
63.对比例2复合微球及其制备方法
64.一种复合微球的制备方法，包括以下步骤：
65.s1、按0.4:1的质量比，将粒径为20nm的四氧化三铁、磷酸钙加入水中，在150w下超声分散3min，得到质量分数为10％的分散液；
66.s2、按30:3:6:0.3的质量比，将苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯基三甲氧基硅烷和过氧化二苯甲酰混合，得到油相；
67.s3、将油相滴加到水相中，控制搅拌速度80rpm，温度50℃，调节ph为9；升温至90℃后反应3h，抽滤，洗涤，得到纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球；
68.s4、将纳米四氧化三铁-聚苯乙烯微球置于5.5g/ml的聚赖氨酸溶液(溶剂为质量分数3.5％的碳酸钠水溶液)中，调节ph至9.5，于50℃振荡反应过夜，反应完毕后过滤，再洗涤至中性并干燥，得到所述复合微球。
69.复合微球的吸附量考察
70.取0.5mg复合微球，加入5ml的内毒素标准液(8eu/ml)中，室温下(25℃)以100rpm搅拌30min，利用鲎试剂终点显色法检测标准液中内毒素的浓度，利用公式q＝(c0-c30)*v/m，计算复合微球对内毒素的吸附量，其中，c0为内毒素标准液的起始浓度，c30为反应30min后内毒素标准液的浓度；v为内毒素标准液的体积，m为称取的复合微球的质量。结果如表1所示。
71.表1实施例和对比例复合微球的吸附量
[0072] 实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2吸附量eu/mg112.3110.7118.583.986.6
[0073]
由上可知本发明制备的复合微球对内毒素的吸附量大，且吸附速度快。
[0074]
为了进一步理解本发明的技术效果，下面结合具体案列进一步阐述上述复合微球在内毒素吸附方面的技术先进性。
[0075]
一种基于内毒素去除的尿激酶生产方法，包括以下步骤：
[0076]
(1)样品预处理：调节尿激酶粗品溶液的ph值为9，电导为3-6ms/cm，得到预处理液；
[0077]
(2)层析柱制备与装柱：向复合微球中加水，得到悬混液，装柱，得到层析柱；层析柱中复合微球和水的高度比为1:0.8-1.2；层析柱的层析流速为70-90cm/h；
[0078]
(3)消毒：对层析柱和层析系统消毒，检测内毒素，结果为阴性；
[0079]
(4)上样处理：使用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，平衡的条件为紫外水平线上下偏差《0.1mau，ph和电导与步骤(1)中的ph和电导相对应；待紫外、电导和ph稳定后上样，所述上样的样品为步骤(1)得到的预处理液；当检测到流穿峰紫外吸收》50mau时开始收集流穿液体，上样结束后，继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至系统检测到紫外吸收《50mau，停止收集，收集液即为去除内毒素的尿激酶原料溶液。
[0080]
取统一批次(20220518)人尿激酶粗品，考察对不同复合填料及不同工艺参数的优化对本发明基于内毒素去除的尿激酶生产方法的影响，结果如表2所示，检测方法参照中国药典(第二部)附录xi e细菌内毒素检法。
[0081]
表2不同复合填料及不同工艺参数对尿激酶生产方法的影响
[0082][0083]
以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。