用于增强树突细胞和t细胞激活以及用于诱导th-1免疫应答的体外方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年10月7日提交的美国临时申请号62/912,005的权益，其公开内容以其全文并入本文。
背景技术：
3.抗原呈递细胞(apc)在引发有效免疫应答方面具有重要性。它们不仅将抗原呈递至具有抗原特异性t细胞受体的t细胞，而且还提供t细胞激活所必需的信号。这些信号尚未完全确定，但涉及多种细胞表面分子以及细胞因子或生长因子。激活幼稚或非极化t细胞所需的因素可能与重新激活记忆t细胞所需的因素不同。apc呈递抗原和传递t细胞激活信号的能力通常称为辅助细胞功能。尽管单核细胞和b细胞已被证明是活性apc，但它们的抗原呈递能力似乎仅限于它们对先前致敏t细胞的激活。因此，它们无法直接激活功能性幼稚或静息t细胞群。
4.树突细胞(dc)是免疫系统的专门抗原呈递细胞，其被认为能够激活幼稚t细胞和记忆t细胞。树突细胞越来越多地离体制备用于免疫疗法，特别是癌症的免疫疗法。制备具有最佳免疫刺激特性的树突细胞需要了解和利用这些细胞的生物学来进行离体培养。已经描述了用于培养这些细胞的各种方案，每种方案各有优点。最近的方案包括使用无血清培养基，以及采用赋予培养细胞期望的免疫刺激特性的成熟条件。
5.树突细胞成熟是将与皮肤langerhans细胞表型相似的未成熟dc转化为可以迁移至淋巴结的成熟抗原呈递细胞的过程。该过程导致表征未成熟的树突细胞的强抗原摄取能力丧失，并导致共刺激细胞表面分子和各种细胞因子的表达上调。
6.许多已知的成熟方案基于dc被认为在暴露于抗原期间或之后遇到的体内环境。这种方法的最佳实例是使用单核细胞条件培养基(mcm)作为细胞培养基。mcm通过培养单核细胞在体外产生并用作成熟因子来源。有报道表明mcm中负责成熟的主要组分是(促)炎症细胞因子白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)和肿瘤坏死因子α(tnfα)。其他成熟因子包括前列腺素e2(pge2)、poly-didc、血管肠肽(vip)、细菌脂多糖(lps)、卡介苗(bcg)，以及其他分枝杆菌或分枝杆菌的组分，例如特定的细胞壁成分。
7.已报道通过将干扰素γ(ifnγ)与某些树突细胞成熟因子(例如细菌脂多糖(lps)、bcg和cd40l)组合来增强树突细胞的il-12产生。然而，lps、bcg和cd40l已知具有在成熟过程中诱导少量il-12的能力。此外，bcg已显示可诱导大量il-10，因此最初认为单独使用时可诱导th2免疫应答。现已表明，当添加至体外培养的未成熟的树突细胞中时，添加ifnγ与lps、bcg或cd40l组合时可增强il-12的产生。干扰素γ信号传导使用jak2-stat1通路，其包括stat1的第701位酪氨酸残基在其迁移至细胞核之前的酪氨酸磷酸化和继而发生的干扰素γ反应基因转录的增强。然而，关于人单核细胞来源的树突细胞中的信号转导通路仍知之甚少。这些细胞中ifnγ作用的机制尚未完全确定。
8.最近，已表明过度活跃的dc从细胞质(例如，il-1β)和生物合成途径(例如，tnfα)
分泌炎性细胞因子，同时保持活力。这些属性已通过多种微生物或宿主来源的产物(包括氧化磷脂(例如氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc))、其取代物和衍生物的混合物)实现。
9.白细胞介素-1(il-1)细胞因子家族，包括il-1和il-18，通常在t细胞生物学中发挥作用，特别是在记忆t细胞生成和cd8
t细胞的效应子功能中发挥作用。此外，il-1激活预先确定的t辅助(th)细胞谱系中的内在il-1受体(il-1r)信号传导，并充当增加t效应细胞因子产生的信号。已建议使用il-1作为弱疫苗或低效疫苗的佐剂，以增加疫苗接种保护活性。因此，炎症激活剂(例如氧化的磷脂)已被检查作为体内过度活跃的树突细胞的诱导剂，当将氧化的脂质施用于具有免疫原的患者时，其能够增强树突细胞的过度激活并诱导改善的抗原特异性免疫应答。
技术实现要素：
10.提供本发明内容以以简化形式介绍概念的选择，这些概念将在以下具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用作辅助确定所要求保护的主题的范围。
11.本发明提供了用于诱导未成熟的树突细胞(dc)体外或离体成熟以产生过度活跃的成熟的树突细胞的方法和组合物，与同时提供广泛免疫刺激的药剂(即，树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)与炎症激活脂质组合)组合，并用于引发这些细胞以增强免疫应答，包括增强t细胞应答、增强的th1应答和/或抗原特异性细胞毒性t细胞应答。
12.在一方面，提供了一种用于产生成熟的过度活跃的树突细胞群的方法，该方法包括提供未成熟的树突细胞；和在适合未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触以形成过度活跃的成熟的树突细胞群。与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，该成熟的过度活跃的树突细胞群产生水平增加的il-1(特别是il-1β)，效应t细胞和记忆t细胞的产生增加，以及cd4
和cd8
t细胞的终末分化和激活增加。类似地，与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(组合或未组合干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，过度激活的dc产生更多量的刺激th-1的细胞因子和更少量的刺激th-2的细胞因子。
13.在与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前、同时或之后，可以使未成熟的树突细胞与预定抗原在体外或离体接触。当预定抗原与成熟后的树突细胞接触时，或当抗原摄取已显著减少时，抗原可以通过已知的方法(例如渗透负载)被内化。
14.预定抗原可以是，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(例如肿瘤相关肿瘤抗原或肿瘤特异性抗原)的转化或转染细胞、细胞裂解物(例如细菌或肿瘤细胞裂解物)、细菌或肿瘤细胞膜制剂、重组产生的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原、肽抗原(例如，合成的肿瘤相关或肿瘤特异性肽相关或肿瘤特异性抗原)或分离的抗原(例如，分离的细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)。
15.在某些实施方案中，该方法可以任选地进一步包括分离或富集单核树突细胞前
体；和在存在树突细胞分化剂的情况下，体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞群。合适的树突细胞分化剂包括，例如，gm csf，或gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
16.在另一方面，提供了用于产生成熟的过度活跃的树突细胞群的体外或离体方法。该方法通常包括提供未成熟的树突细胞；和在适合未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效量的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触以形成成熟的过度活跃的树突细胞群。所得成熟的过度活跃的树突细胞群产生增强的免疫应答。增强的免疫应答可以是增强的1型免疫应答。在将未成熟的树突细胞与树突细胞成熟剂(组合或未组合干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前、同时或之后，使未成熟的树突细胞在体外或离体接触预定抗原。当抗原与完全成熟后的树突细胞接触时或当抗原摄取显著减少时，可以通过已知方式(例如渗透负载)将抗原转运至树突细胞中。
17.预定抗原可以是，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(例如肿瘤相关或肿瘤特异性抗原、细菌抗原或病毒抗原)的转染或转化细胞、细胞裂解物(例如肿瘤细胞或细菌细胞裂解物)、膜制剂(例如肿瘤或细菌细胞膜制剂)、重组产生的抗原，肽抗原(即合成的肽)或分离的抗原，其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
18.在某些实施方案中，体外或离体方法可以任选地进一步包括分离或提供富集单核树突细胞前体的细胞群；和在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞。合适的树突细胞分化剂包括例如gm-csf，或gm-csf与il-4、il-13或il-15的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
19.在又一方面，提供了用于激活t细胞的组合物。该组合物可以包括树突细胞群，在适合成熟的条件下，在体外或离体用有效浓度的树突细胞成熟剂，有或没有干扰素γ(ifnγ)，和炎症激活脂质；以及预定抗原使该树突细胞群成熟。与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，该树突细胞群可以产生水平增加的il-1(特别是il-1β)，增强的免疫应答，并且优选地th1应答增加，和更优选地效应t细胞和记忆t细胞的产生增加，以及cd4
和cd8
t细胞的终末分化和激活增加。
20.在另一方面，提供了一种组合物，其包含分离的未成熟的树突细胞群。该细胞群包括未成熟的单核树突细胞和有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质以诱导未成熟的树突细胞成熟。与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，所得成熟的过度活跃的树突细胞群产生水平增加的il-1(特别是il-1β)，效应t细胞和记忆t细胞的产生增加，以及cd4
和cd8
t细胞的终末分化和/或增加。细胞群可以任选地包括预定抗原和/或分离的t细胞，例如幼稚t细胞。t细胞可以任选地存在于分离的淋巴细胞的制剂中。
21.还提供了用于产生激活的t细胞的体外或离体方法。该方法通常包括提供未成熟的树突细胞；使未成熟的树突细胞在体外或体内与预定抗原接触；和在适合未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞与有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有有干扰素γ)和炎症激活脂质接触以形成成熟的过度活跃的树突细胞。该成熟的过度活跃的
树突细胞可以与幼稚t细胞接触以形成激活的t细胞，产生增强的ifnγ水平和/或极化以产生1型(th-1)应答。合适的抗原包括，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(例如细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)的转化或转染细胞、细胞裂解物(例如细菌或肿瘤细胞裂解物)、膜制剂(例如细菌或肿瘤细胞膜制剂)、重组产生的抗原、肽抗原(例如合成肽抗原)或分离的抗原，其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
22.未成熟的树突细胞可以与预定抗原、树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质同时接触，或者细胞可以在与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前与预定抗原接触。树突细胞也可以在完全成熟之后与抗原接触，并且使用已知方法(例如渗透负载)增强抗原摄取。在某些实施方案中，体外或离体方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体；和在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以诱导未成熟的树突细胞的形成。合适的树突细胞分化剂包括例如gm csf，或gm-csf与il-4、il-13或il-15的组合。单核树突细胞前体可以任选地分离自人受试者。在具体实施方案中，未成熟的树突细胞和t细胞彼此是自体的或异源的。
23.还提供了产生更多il-12的分离的成熟的过度活跃的树突细胞。成熟的树突细胞可以通过以下提供：在适合未成熟的树突细胞成熟的条件下，用包含有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质的组合物在体外或离体使未成熟的树突细胞成熟。分离的成熟的树突细胞可以任选地包括预定抗原。还提供了负载有预定抗原的分离的成熟的过度活跃的树突细胞。与在成熟过程中存在细菌、树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)而不存在炎症激活脂质的情况下培养的类似未成熟的树突细胞群相比，该树突细胞可以产生更多的白细胞介素12(il-12)和il-1β。
24.还提供了一种用于在动物中产生1型(th-1)免疫应答的方法。该方法通常包括提供未成熟的树突细胞；在适合未成熟树突成熟的体外或离体培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效量的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质以及预定抗原接触以形成成熟的过度活跃的树突细胞。成熟的过度活跃的树突细胞可以施用于动物，也可以在体外或离体与幼稚t细胞接触以形成激活的t细胞，其特征在于产生水平增加的干扰素γ(ifnγ)和/或肿瘤坏死因子α(tnfα)。激活的t细胞可以施用于需要刺激对特定抗原的细胞毒性t细胞应答的动物。
25.合适的抗原包括，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关或肿瘤特异性抗原)的转化或转染细胞、细胞裂解物(其中该细胞裂解物是细菌细胞裂解物或肿瘤细胞裂解物)、膜制剂(其中该膜制剂是细菌细胞或肿瘤细胞膜制剂)，或重组产生的抗原、肽抗原(例如，合成肽抗原)或分离的抗原，其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。未成熟的树突细胞可以同时与预定抗原、树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触，或者可以在随后使细胞与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前使未成熟的树突细胞与预定抗原接触。
26.在某些实施方案中，体外或离体方法可以进一步包括从动物分离单核树突细胞前体；和在存在树突细胞分化剂的情况下培养前体以形成未成熟的树突细胞。树突细胞分化剂可以是，例如，gm-csf，或gm-csf与il-4、il-13或il-15的组合。
27.未成熟的树突细胞和t细胞对于动物可以是自体的，或者对于动物是同种异体的。可选地，未成熟的树突细胞和t细胞可以具有与动物相同的mhc单倍型或共享mhc标志物。在某些实施方案中，动物可以是人，或可以是非人动物。
28.在另一个实施方案中，提供了一种用于产生成熟分离的过度激活的树突细胞的体外或离体方法，该成熟分离的过度激活的树突细胞可以摄取和加工抗原，并且在向个体施用之后可以诱导增强的抗肿瘤应答。该方法包括提供未激活的未成熟的树突细胞；在适合诱导未成熟的树突细胞成熟的体外或离体培养条件下，使未成熟的树突细胞与有效量的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触；和在完全成熟之前分离成熟树突细胞。
29.在上述方法的某些实施方案中，用于该方法的炎症激活脂质可以是以下项中的一种或更多种：氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-[5-氧代戊酰基]-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc)，以及oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))。该方法可以进一步包括在完全成熟之前将分离的成熟的树突细胞制剂，随后向个体施用成熟的树突细胞。该方法还可以任选地包括在制剂和施用之前冷冻保存成熟的树突细胞和解冻成熟的树突细胞。
[0030]
在另一个实施方案中，提供了一种用于产生成熟分离的过度激活的树突细胞的体外或离体方法，该成熟分离的过度激活的树突细胞可以摄取和加工抗原，并且在向个体施用之后可以诱导增强的抗肿瘤应答。该方法包括提供未激活的未成熟的树突细胞；在适合诱导未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效量的树突细胞成熟剂(组合或未组合干扰素γ)接触；和在完全成熟之前分离成熟树突细胞。将成熟树突细胞与炎症激活脂质一起制剂用于向个体(例如患有实体瘤的个体)施用。成熟树突细胞可以与炎症激活脂质组合在同一制剂中，也可以单独制剂。当单独制剂时，成熟树突细胞和炎症激活脂质可以同时或以任一顺序序贯施用。在某些实施方案中，可以将炎症激活脂质制剂用于局部施用，并且可以将其应用于例如皮肤或粘膜区域，经制剂的成熟树突细胞将被施用于该处。
[0031]
在上述体外或离体方法的某些实施方案中，树突细胞成熟剂是toll样受体激动剂，例如tlr3、tlr4、tlr7和/或tlr8、或tlr9的激动剂，例如细菌lps、bcg、咪唑喹啉化合物(例如咪唑喹啉-4-胺化合物，例如4-氨基-2-乙氧基甲基-α,α-二甲基-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-1-乙醇(r848)或1-(2-甲基丙基)-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺(837，咪喹莫特))及其衍生物、合成的双链多核糖核苷酸(例如poly i:c或其衍生物、poly[i]:poly[c(12)u]等)、含有已知诱导dc成熟的未甲基化的cpg基序的核酸序列等，或其任何组合。
[0032]
该方法可以使用氧化脂质作为炎症激活脂质，包括例如以下项中的一种或更多种：生物活性氧化磷脂，其可以含有多不饱和脂肪酸(pufa)的片段化产物，例如1-棕榈酰-2-氧代戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和2-溶血磷脂酰胆碱的9-酮-10-十二烷二酸酯(kodia-pc)。对通过1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)氧化形成的许多产物进
行色谱分离，鉴定出1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(povpc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5,6-环氧异丙烷e2)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(peipc)作为炎症的强脂质介质。在本公开的某些实施方案中，氧化脂质可以包括但不限于oxpapc，其是1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(povpc)的混合物，和oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))，以及rhodo lps(来自类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)的lps-rs或lps，先前已证明其可激活半胱天冬酶11依赖性炎性体)。
[0033]
用于本方法的预定抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组蛋白(其中该重组蛋白是细菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白)的转化或转染细胞、细菌或肿瘤细胞裂解物、细菌或肿瘤细胞膜制剂，以及重组产生的抗原、肽抗原或分离的抗原，其中该抗原、肽抗原或分离的抗原可以是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在某些实施方案中，重组产生的抗原、肽抗原或分离抗原是细菌的、病毒的、肿瘤相关的或肿瘤特异性抗原、肽抗原或分离抗原。在这些实施方案中，预定抗原均不旨在作为树突细胞成熟剂。
[0034]
在任选的实施方案中，该方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体；和在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞。当与高浓度的动物蛋白(例如，牛、山羊、马、猴、猿和/或人蛋白)单独使用时，特别是当与补充有高蛋白浓度的培养基组合使用时，树突细胞分化剂可以是gm-csf，或gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
[0035]
在又一个实施方案中，本公开提供了一种用于对抗原产生增强的th1免疫应答的体外方法。该方法包括：提供未成熟的树突细胞；在适合未成熟树突成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体接触有效量的树突细胞成熟剂(例如tlr激动剂，有或没有干扰素γ(ifnγ))和预定抗原细胞以形成成熟的树突细胞群；其中成熟树突细胞在成熟过程中摄取和加工抗原；将成熟的树突细胞制剂用于向个体施用；以及将成熟的树突细胞制剂与有效量的炎症激活脂质一起施用，与施用经制剂的树突细胞组合物而未施用炎症激活脂质相比，对预定抗原产生增强的th1免疫应答。
[0036]
在该实施方案中，树突细胞成熟剂可以是toll样受体(tlr)激动剂中的一种或组合，该tlr激动剂例如tlr-3、tlr-4、tlr-7和/或tlr-8、和tlr9的激动剂，例如但不限于，细菌lps、bcg、咪唑喹啉化合物(例如，咪唑喹啉-4-胺化合物，例如4-氨基-2-乙氧基甲基-α,α-二甲基-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-1-乙醇(r848)或1-(2-甲基丙基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(r837，咪喹莫特))及其衍生物、合成的双链多核糖核苷酸(例如poly i:c；或其衍生物poly[i]:poly[c(12)u])、含有已知诱导dc成熟的未甲基化的cpg基序的核酸序列(例如odn 2216(5'-gggggacga:tcgtcgggggg-3')和odn2336(5'-gggggacgac:gtcg tggggggg-3'))等，或其任何组合。
[0037]
可用于该方法的炎症激活脂质可以是生物活性磷脂，其可以含有多不饱和脂肪酸(pufa)的片段化产物，或pufa中的一种或更多种，例如1-棕榈酰-2-氧代戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和2-溶血磷脂酰胆碱的9-酮-10-十二烷二酸酯(kodia-pc)。对通过1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)氧化形成的许多产物进行色谱分离，鉴定出1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5,6-环氧异丙烷e2)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(peipc)作为炎症的强脂质介质。在本公开的某些实施方案中，氧化脂质可以包括但不限于oxpapc，其是1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc)的混合物，和oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))。
[0038]
此外，预定抗原可以是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、产生重组蛋白(其中该重组蛋白是细菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤特异性蛋白或肿瘤相关蛋白)的转化或转染细胞、细菌或肿瘤细胞裂解物、细菌或肿瘤细胞膜制剂、重组产生的抗原、肽抗原或分离的抗原。该重组产生的抗原、肽抗原或分离的抗原可以是细菌的、肿瘤相关的或肿瘤特异性抗原、肽抗原或分离的抗原。
[0039]
上述用于产生增强的免疫应答的体外或离体方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体并在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞。可用于该方法的树突细胞分化剂包括，例如，gm-csf，或gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
[0040]
在某些实施方案中，经制剂的成熟的树突细胞和炎症激活脂质同时或以任何顺序序贯施用。
[0041]
在另一个实施方案中，体外或离体方法包括使未成熟的树突细胞(dc)成熟并在不使用树突细胞成熟剂的情况下激活那些细胞。激活的dc可用于诱导抗原特异性t细胞应答。方法还可以包括添加定向成熟剂，例如干扰素γ(ifnγ)，以在获得的应答中诱导th-1和/或th-2偏向。与先前的方法不同，本公开的方法中未成熟的树突细胞的激活通过以下引发或触发：在适合树突细胞粘附至组织培养表面的条件下，使分离的未成熟的树突细胞与新的、清洁的和未使用的组织培养基质和树突细胞分化诱导剂接触。在本公开的典型方法中，在不添加成熟剂的情况下实现激活。从先前的培养基质或纯化培养基中去除未成熟的树突细胞并从先前的培养基中分离。然后对分离的未成熟的树突细胞进行计数并冷冻以供以后使用或与新鲜培养基组合，而无需在该过程的其余部分添加树突细胞成熟因子。
[0042]
在一种可选的方法中，可以在激活期间添加定向成熟剂以偏向树突细胞，从而它们可以使t细胞应答极化为th1或th-2应答。作为实例，但不作为对所公开方法的限制，使用的试剂是ifnγ，添加它以使t细胞应答偏向th-1应答。在体外或离体添加至单核树突细胞前体或未成熟dc的干扰素γ(ifnγ)本身不诱导dc分化和/或成熟。
[0043]
用于该实施方案的方法的组织培养基质可以包括组织培养孔、培养瓶、瓶子、袋子
或生物反应器中使用的任何基质，例如纤维、珠、板等。通常，组织培养基质包括塑料，例如聚苯乙烯、(聚四氟乙烯，ptfe)等。这些基质未包被蛋白或其他取代物以增加各种细胞与基底的结合。最常用于树突细胞离体培养用于免疫疗法的那些组织培养基质包括组织培养瓶、袋子或由多层塑料堆叠层组成的细胞级分等。
[0044]
完全成熟的树突细胞在质量和数量上与未成熟的dc不同。完全成熟的dc表达更高水平的mhc i类和ii类抗原，以及t细胞共刺激分子，即cd80和cd86。这些变化通常增加树突细胞激活t细胞的能力，例如，通过增加细胞表面上的抗原密度，以及通过t细胞上的共刺激分子对应物(例如，如cd28)的t细胞激活信号。此外，成熟的dc产生大量细胞因子，其刺激和指导t细胞应答。其中两种细胞因子是白细胞介素10(il-10)和白细胞介素12(il-12)。这些细胞因子对诱导的t细胞应答的方向具有相反作用。il-10产生导致诱导th-2型应答，而il-12产生导致th-1型应答。
[0045]
在一个实施方案中，通过任何上述方法产生的过度活跃的成熟的树突细胞用于产生用于治疗癌症(特别是实体瘤、细菌感染或病毒感染)的药物。药物可以是包含治疗有效量的细胞的过度活跃的成熟的树突细胞的制剂。制剂可以包含大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于10
10
个细胞、或甚至大于10
11
个细胞。组合物及其制剂的某些实施方案可以适于通过例如注射、输注、灌注或灌洗施用，并且可以更具体地包括通过一种或更多种方式施用，例如，静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴内、腹腔、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、囊内和/或皮下输注和/或推注。
[0046]
当参考以下具体实施方式时，本公开的这些和其他方面对于本领域普通技术人员将变得更加明显
具体实施方式
[0047]
本公开提供了用于诱导未成熟的树突细胞(dc)成熟和用于引发那些细胞产生增强的抗原特异性细胞毒性t细胞应答(th-1应答)的体外或离体方法。本公开还提供了可用于激活和制备极化以增强1型细胞因子(例如，ifnγ、tnfα、il-1β和/或il2)产生的t细胞群的树突细胞群。这种树突细胞群包括在体外或离体与toll样受体(tlr)激动剂(例如，细菌脂多糖，例如大肠杆菌lps、bcg、poly i:c及其毒性较小的衍生物，和/或r848或r837，有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触的未成熟单核树突细胞。任选地，dc还可以在合适的成熟条件下与预定抗原接触。未成熟的树突细胞可以在成熟的同时、之前或之后与抗原接触。在成熟后发生与预定抗原的接触或摄取抗原的能力已显著降低的情况下，可以使用已知方法(例如渗透负载)来增强抗原摄取。
[0048]
可选地，已经暴露于抗原(例如，在体内)的未成熟单核树突细胞可以在合适的成熟条件下与tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触。所得过度激活的成熟的树突细胞被引发以激活免疫应答，以及激活且可能将t细胞(例如，幼稚t细胞)极化为1型应答。1型应答包括产生1型细胞因子(例如，ifnγ和/或il-2)、产生更多il-12p70、细胞毒性t细胞应答、产生th-1细胞、效应t细胞和记忆t细胞增加、cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活增加，以及产生某些类型抗体。还可以增强il-1β和肿瘤坏死因子α(tnfα)的上调。相反，2型应答的特征在于产生il-4、il-5和il-10，产生比il-12p70更多的il-10，产生th-2细胞，
以及缺乏诱导ctl应答。
[0049]
在相关方面，提供了包含未成熟的树突细胞的组合物，例如cd34
造血干细胞或单核树突细胞前体的富集细胞群，其也可以引发那些树突细胞以增强1型应答。此类成熟的、引发的单核树突细胞可以增加预定抗原(即预定外源性抗原)的主要组织相容性复合体(mhc)i类呈递。抗原的mhc i类(mhc-i)呈递被期望诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)分化和刺激抗原特异性ctl介导的靶细胞裂解。此类组合物包括tlr激动剂，例如lps、bcg、poly i:c和r848，有或没有ifnγ，其可以与包含未成熟的树突细胞的细胞群混合，以使未成熟的树突细胞成熟，并在bcg的情况下，以转换或克服由未成熟的树突细胞与bcg接触诱导的il-10抑制。此外，此类组合物可以包含炎症激活脂质。与此类组合物接触的未成熟的树突细胞经历增强的成熟和激活，并且与与tlr激动剂(例如lps、bcg、poly i:c和/或r848，有或没有ifnγ)接触而未与炎症激活脂质接触的未成熟的树突细胞群相比，通常产生更大量的生物活性il-12、tnfα和/或il-1(例如il-1β)。
[0050]
在另一方面，获自受试者或供体的单核树突细胞前体可以与细胞因子(例如，单独的gm-csf与高浓度的例如动物蛋白(人血清白蛋白)，或gm-csf与例如il-4、il-7、il-13或il-15组合)以获得未成熟的树突细胞。然后可以使未成熟的树突细胞与预定抗原接触，或者与tlr激动剂组合；任选地有或没有干扰素γ；和炎症激活脂质单独，或与另外的细胞因子组合，以使树突细胞成熟并引发细胞以诱导t细胞产生增强的1型免疫应答。在某些实施方案中，刺激mhc i类抗原加工，这可用于引发针对展示预定抗原的细胞产生ctl应答。
[0051]
树突细胞是在各种淋巴和非淋巴组织中发现的多种抗原呈递细胞群。(参见liu,cell 106:259-62(2001)；steinman,ann.rev.immunol.9:271-96(1991))。树突细胞包括脾脏的淋巴树突细胞、表皮的langerhans细胞和血液循环中的隐蔽细胞。总体上，树突细胞基于其形态、高水平的表面mhc ii类表达以及在t细胞、b细胞、单核细胞和自然杀伤细胞上表达的某些其他表面标志物的缺失进行分类。特别地，单核细胞来源的树突细胞(也称为单核树突细胞)通常表达cd11a、cd80、cd86，并且是hla-dr
，而是cd14-。
[0052]
相反，单核树突细胞前体(典型的是单核细胞)通常为cd14
。单核树突细胞前体可以获自它们所在的任何组织，特别是淋巴组织，例如脾脏、骨髓、淋巴结和胸腺。单核树突细胞前体还可以从循环系统分离。外周血是单核树突细胞前体的容易获得的来源。脐带血是单核树突细胞前体的另一个来源。单核树突细胞前体可以从多种生物体富集或分离，在这些生物中可以引发免疫应答。此类生物体包括动物，例如，包括人，和非人动物，例如，灵长类动物、哺乳动物(包括犬、猫、小鼠和大鼠)、鸟类(包括鸡)，以及它们的转基因物种。
[0053]
在某些实施方案中，单核树突细胞前体和/或未成熟的树突细胞可以从健康受试者或需要免疫刺激的受试者富集或分离，例如，癌症患者或细胞免疫刺激对其有益或期望的其他受试者(即，患有细菌或病毒感染等的受试者)。树突细胞前体和/或未成熟的树突细胞还可以作为分离的或富集的细胞群从hla匹配的健康个体中获得，用于施用于需要免疫刺激的hla匹配的受试者。
[0054]
树突细胞前体和未成熟的树突细胞
[0055]
富集树突细胞前体、未成熟的树突细胞或甚至成熟的树突细胞的细胞群可以包含显著富集的细胞群，其包含大于95至98％或更多的期望细胞。而在其他实施方案中，富集的细胞群中期望的细胞仅比原始细胞群中的细胞数量增加5至10％。优选地，采用所用的方
法，富集的细胞群包含尽可能多的期望的细胞。
[0056]
从各种来源(包括血液和骨髓)获得富集树突细胞前体和未成熟的树突细胞的细胞群的方法是本领域已知的。例如，树突细胞前体和未成熟的树突细胞的富集细胞群可以通过收集肝素化血液、通过单采或白细胞分离、通过制备血沉棕黄层、玫瑰花结、离心、密度梯度离心(例如，使用ficoll(例如)、(涂有不可透析的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蔗糖等的胶体二氧化硅颗粒(直径15-30mm))、细胞的差异裂解、过滤等。在某些实施方案中，可以制备白细胞群，例如通过从受试者采集血液、去纤维蛋白以去除血小板和溶解红细胞。树突细胞前体和未成熟的树突细胞可以任选地通过例如通过梯度离心来富集单核树突细胞前体。
[0057]
树突细胞前体和未成熟的树突细胞的富集细胞群可以任选地在封闭的无菌系统中制备。如本文所用，术语“封闭的无菌系统”或“封闭系统”是指暴露于非灭菌、环境或循环空气或其他非无菌条件的系统被最小化或消除。用于分离富集树突细胞前体和未成熟的树突细胞的细胞群的封闭系统通常不包括在敞口管中的密度梯度离心、细胞的开放转移、在组织培养板或未密封的培养瓶中培养细胞等。在典型的实施方案中，封闭系统使得树突细胞前体和未成熟的树突细胞从初始收集容器无菌转移至可密封的组织培养容器而不暴露于非无菌空气。
[0058]
在某些实施方案中，通过粘附于单核细胞结合基质来分离富集单核树突细胞前体的细胞群，如wo 2003/010292中所公开的，其公开内容通过引用并入本文。例如，白细胞群(例如，通过白细胞分离术分离)可以与单核树突细胞前体粘附基质接触。当白细胞群与基底接触时，白细胞群中的单核树突细胞前体优先粘附至基质。其他白细胞(包括其他潜在的树突细胞前体)表现出与基质的结合亲和力降低，从而使得单核树突细胞前体优先富集在基质表面上。
[0059]
合适的基质包括，例如，具有大表面积与体积比的那些。此类基质可以是，例如，颗粒或纤维基质。合适的颗粒基质包括，例如，玻璃颗粒、塑料颗粒、玻璃包覆的塑料颗粒、玻璃包覆的聚苯乙烯颗粒和其他适合蛋白吸收的珠。合适的纤维基质包括微毛细管和微绒毛膜。颗粒状或纤维状基质通常使得粘附的单核树突细胞前体被洗脱，而不显著降低粘附细胞的活力。颗粒状或纤维状基质可以是基本上无孔的以促进单核树突细胞前体或树突细胞从基质洗脱。“基本上无孔的”基质包括其中存在于基质中的至少大部分孔小于细胞以最小化基质中截留细胞的基质。
[0060]
可以任选地通过添加结合培养基来增强单核树突细胞前体对基底的粘附。合适的结合培养基包括单独或与以下的任何组合补充的单核树突细胞前体培养基(例如，结合培养基包括单独或与以下的任何组合补充的单核树突细胞前体培养基(例如，rpmi 1640、dmem、xvivo等)，例如，细胞因子(例如，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，或白细胞介素13(il-13))、血浆、血清(例如，人血清，例如自体或同种异体血清)、纯化的蛋白(例如血清白蛋白)、二价阳离子(例如，钙和/或镁离子)以及有助于单核树突细胞前体特异性粘附至基质或防止非单核树突细胞前体粘附至基质的其他分子。在某些实施方案中，血浆或血清可以经热灭活。热灭活血浆对于白细胞可以是自体的或异源的。
[0061]
在单核树突细胞前体粘附至基质之后，非粘附的白细胞与单核树突细胞前体/基质复合体分离。可以使用任何合适的方法使非粘附细胞与复合体分离。例如，可以使未粘附的白细胞和复合体的混合物沉降，并且将未粘附的白细胞和培养基倾倒或排出。可选地，可
以将混合物离心，并将含有非粘附性白细胞的上清液从沉淀的复合体倾倒或排出。
[0062]
在另一个实施方案中，单核树突细胞前体的富集群可以通过切向流过滤获得。参见wo 2004/000444，其通过引用以其全文并入本文。使用这种方法，单核树突细胞前体未被激活，并且无需某些细胞因子(例如il-4)以在体外或离体培养过程中防止单核树突细胞前体分化成巨噬细胞。
[0063]
可以在体外或离体培养富集树突细胞前体的细胞群以进行分化、成熟和/或扩增。(如本文所用，分离的未成熟的树突细胞、树突细胞前体、t细胞和其他细胞是指通过人工在其天然环境之外存在的细胞，因此不是自然产物。分离的细胞可以以纯化形式、半纯化形式(例如富集的细胞群)或在非天然环境中存在。
[0064]
简言之，体外或离体分化通常涉及在存在一种或更多种分化剂的情况下培养树突细胞前体或具有树突细胞前体的细胞群。合适的分化剂可以是，例如，细胞生长因子(例如，细胞因子，例如(gm-csf)，以及gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合)。在某些实施方案中，单核树突细胞前体分化形成单核细胞来源的未成熟的树突细胞。
[0065]
树突细胞前体可以在合适的体外或离体培养条件下培养和分化。合适的组织培养基包括rpmi 1640、dmem、x vivo等。组织培养基可以补充有血清、氨基酸、维生素、细胞因子(例如gm-csf或gm-csf与il-4的组合)、二价阳离子等，以促进树突细胞前体分化。在某些实施方案中，树突细胞前体可以在无血清培养基中培养。这种培养条件可以任选地排除任何动物来源产物。典型树突细胞培养基中的典型细胞因子组合为gm-csf和il-4各约500单位/ml。
[0066]
树突细胞前体在分化形成未成熟的树突细胞时在表型上与皮肤langerhans细胞相似。未成熟的树突细胞通常是cd14-和cd11c
，表达低水平的cd86和cd83，并且可以通过专门的内吞作用捕获或摄取可溶性抗原。
[0067]
未成熟的树突细胞可以成熟以形成成熟的过度活跃的树突细胞。成熟的dc失去吸收抗原的能力，并显示出共刺激细胞表面分子和各种细胞因子的表达上调。具体地，成熟的树突细胞比未成熟的树突细胞表达更高水平的mhc i类和ii类抗原，并且成熟的树突细胞通常被鉴定为cd80
、cd83
、cd86
和cd14-。更高的mhc表达导致dc表面上的抗原密度增加，而共刺激分子cd80和cd86的上调通过共刺激分子的对应物(例如t细胞上的cd28)增强t细胞激活信号。
[0068]
本发明的成熟的过度活跃的树突细胞可以通过使未成熟的树突细胞与有效量或浓度的tlr激动剂(例如，细菌脂多糖，例如lps；完整卡介苗(bcg或其衍生物)、双链rna，例如poly i:c或其较低毒性的衍生物，例如poly i:c(12)u或r848，有或没有干扰素γ)接触，随后用用炎症激活脂质激活进行制备(即，成熟的)。有效量的tlr激动剂(例如细菌bcg)通常在每毫升组织培养基约105至107cfu的范围内。有效量的ifnγ通常在每毫升组织培养基约100-1000u的范围内。卡介苗(bcg)是牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)的无毒性菌株。如本文所用，bcg是指完整bcg以及细胞壁成分、bcg衍生的脂阿拉伯甘露聚糖和与2型免疫应答的诱导相关的其他bcg组分。细菌或细菌组分(例如bcg)任选地是灭活的，例如热灭活的bcg、福尔马林处理的bcg等。
[0069]
用tlr激动剂(有或没有干扰素γ)使未成熟的树突细胞成熟并用炎症激活脂质激
活促进过度活跃的dc的形成，这些dc可以产生更高水平的il-12和/或il-1，更具体地是il-1β，和减少或抑制il-10的产生，从而引发成熟的树突细胞以诱导1型(th 1)应答。
[0070]
未成熟dc通常与有效量的tlr激动剂(有或没有干扰素γ)接触约1小时至约24小时。随后可以添加炎症激活脂质。在典型的实施方案中，在诱导成熟后约3小时添加炎症激活脂质，尽管该时间可以延长至4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时和至多24小时或更长时间。未成熟的树突细胞可以在合适的成熟培养条件下培养和成熟。合适的组织培养基包括rpmi 1640、dmem、x-vivo等。组织培养基可以补充有氨基酸、维生素、细胞因子(例如gm-csf和/或il4、il13或il15)、二价阳离子等，以促进细胞成熟。典型的细胞因子组合是gm-csf和il4各约500单位/ml。
[0071]
在用于诱导未成熟的树突细胞形成的另一种体外或离体方法中，在存在gm-csf和il-4的情况下，富集前体的细胞群中的单核树突细胞前体分化以形成未成熟的树突细胞。在该实施方案中，从组织培养系统收集未成熟的树突细胞，洗涤、计数并在新的、干净的、未包被的组织培养容器中在体外或离体与预定抗原结合。未成熟的树突细胞可以在补充有gm-csf和il-4的典型树突细胞培养基中，在用于树突细胞维持的典型条件下，在预定的可溶性或颗粒抗原存在下培养。未添加树突细胞成熟剂至培养基中，并且应该注意，任何添加的预定抗原均不被认为是树突细胞成熟剂。可以使用本领域熟知的方法确定细胞成熟，包括确定成熟的树突细胞特征性的细胞表面标志物的存在。
[0072]
可以在本领域熟悉的测定(例如流式细胞术、免疫组化等)中检测细胞表面标志物。还可以监测细胞的细胞因子产生(例如，通过elisa、facs或其他免疫测定)。在根据本发明成熟的dc群中，il12水平高于由本公开的tlr激动剂，有或没有ifnγ，诱导而未用炎症激活脂质从未成熟的树突细胞成熟的成熟的树突细胞产生的il12水平，以促进增强的1型(th-1)应答。例如，成熟的过度活跃的dc可以产生增加量的生物活性il12、il-2、tnfα和/或il1(il-1β)；显示cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活增加，以及效应t细胞和记忆t细胞增加。成熟的dc也失去通过胞饮作用摄取抗原的能力，这可以通过本领域普通技术人员熟悉的摄取测定进行分析。
[0073]
具有抗原的树突细胞前体、未成熟的树突细胞和成熟的树突细胞，无论是已引发的还是未引发的，均可以冷冻保存以备后用。用于冷冻保存的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利号5,788,963，其通过引用以其全文并入本文。
[0074]
tlr激动剂
[0075]
本公开的激活剂包括那些刺激模式识别受体(prr)依赖性细胞应答的激活剂。模式识别受体包括toll样受体(tlr)、rig 1样受体(rlr)、nod样受体(nlr)和c型凝集素受体(clrs)。prr的作用是直接或间接检测广泛类别的微生物共有的分子。这些分子通常被称为病原体相关分子模式并且包括因子，例如细菌脂多糖(lps)、细菌鞭毛蛋白或病毒双链rna。如上所述，tlr是一类模式识别受体(prr)，其可检测微生物分子，通常称为病原体相关分子模式(pamp)。tlr免疫受体在白细胞(包括树突细胞)的膜上表达，并且tlr激动剂的结合触发可导致免疫应答和抗原特异性获得性免疫的分子事件。许多tlr激动剂还是如下所述的树突细胞成熟剂。细菌脂多糖(lps)是tlr4的强激动剂，具有增强对可溶性抗原的免疫应答的能力。lps通过识别常见pamp的tlr4通路刺激免疫系统细胞。其他tlr激动剂包括合成分子，例如结合tlr3的poly i:c、结合并激活tlr 2和tlr 6通路的pam2csk4(pam2)、结合并激
磷脂酰胆碱(peipc)作为炎症的强脂质介质。在本公开的某些实施方案中，氧化脂质可以包括但不限于oxpapc，其是1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(povpc)的混合物，和oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))，以及rhodo lps(来自类球红细菌的lps-rs或lps，先前已证明其可激活半胱天冬酶11依赖性炎性体)。
[0083]
可在诱导成熟后约3小时将炎症激活脂质添加至成熟的树突细胞中，尽管该时间可延长至约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约10小时，以及至多约24小时或更长时间。与炎症激活脂质的孵育可以是至少约5至约18小时和至多约48小时，或更长时间。通常，成熟的树突细胞与炎症激活脂质一起培养至少约5小时并且可以持续约18小时至约24小时或更长时间。脂质可以以至少1μg/ml和至多90μg/ml或更高的浓度使用。在某些实施方案中，炎症激活脂质以约1μg/ml、约3μg/ml、约10μg/ml、约25μg/ml、约30μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml或更多使用。
[0084]
抗原
[0085]
根据本发明的成熟的、过度激活的树突细胞可以将抗原呈递至t细胞。成熟的、过度激活的树突细胞可以通过在成熟之前、期间或之后在体外或离体使未成熟的树突细胞与预定抗原接触来形成。
[0086]
可选地，可以在体外或离体使已经与抗原接触的未成熟的树突细胞(例如，在体内，在分离之前)与包含tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质的组合物接触以形成被引发和过度激活以诱导增强的1型(th-1)应答的成熟的树突状细胞。
[0087]
合适的预定抗原可以包括任何t细胞激活期望的抗原。此类抗原可以包括，例如，细菌抗原、肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(例如，完整细菌或肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、从肿瘤中分离的抗原、融合蛋白、脂质体等)、病毒抗原和任何其他抗原或抗原片段，例如，包含肿瘤相关或肿瘤特异性表位的肽或多肽抗原。在某些实施方案中，抗原可以是，例如，但不限于肿瘤细胞裂解物、神经胶质瘤肿瘤抗原、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺酸性磷酸酶(pap)或前列腺特异性抗原(psa)。(参见，例如，pepsidero等人，cancer res.40:2428-32(1980)；mccormack等人，urology 45:729-44(1995))。抗原还可以是细菌细胞、细菌裂解物、肿瘤或细菌细胞或来自细胞裂解物的膜片段，或本领域已知的任何其他来源。抗原，例如肿瘤、细菌或病毒抗原，可以重组表达或产生，或甚至化学合成。重组抗原也可以在宿主细胞(例如，细菌、酵母、昆虫、脊椎动物或哺乳动物细胞)的表面上表达，可以存在于裂解物中，或者可以从裂解物中纯化。
[0088]
抗原也可以存在于来自受试者的样品中。例如，来自受试者的过度增殖或其他病况的组织样品可以用作抗原来源。例如，可以通过活组织检查或通过手术切除获得此类样品。这种抗原可以作为完整细胞、细胞裂解物、细胞膜制剂，或作为分离的抗原制剂使用。
[0089]
可选地，受试者(例如癌症患者)的细胞或已建立的细胞系(例如肿瘤细胞系)的膜制剂也可用作抗原或抗原来源。
[0090]
在示例性实施方案中，神经胶质瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤或其他肿瘤，或从手术标本中回收的其他肿瘤细胞可用作抗原来源。例如，在活检或手术切除时获得的癌症患者自身肿瘤样品可直接用于将抗原呈递至树突细胞或提供用于抗原呈递的细胞裂解物。可选地，可以使用癌症患者的肿瘤细胞的膜制剂。肿瘤细胞可以是前列腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、结肠肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、黑色素瘤细胞或任何其他类型的肿瘤细胞。可以通过本领域已知的方法从分离的肿瘤细胞制备裂解物和膜制剂。
[0091]
在另一个示例性实施方案中，可以将与单克隆抗体7e1 1-c.5特异性反应的纯化或半纯化的前列腺特异性膜抗原(psma，也称为psm抗原)用作抗原。(一般参见horoszewicz等人，prag.clin.biol.res.37:115-32(1983)，美国专利号5,162,504；美国专利号5,788,963；feng等人，proc.am.assoc.cancer res.32:(abs.1418)238(1991)；其公开内容通过引用并入本文)。在又一个示例性实施方案中，具有对应于psma的氨基酸残基4-12的氨基酸残基序列leu his glu thr asp ser ala val(seq id no:1)(称为psm p1)的抗原肽可以是用作抗原。可选地，具有对应于psma的氨基酸残基711-719的氨基酸残基序列ala leu phe asp ile glu ser lys val(seq id no:2)(称为psm-p2)的抗原肽可用作抗原。
[0092]
在具体实施方案中，具有氨基酸残基序列xaa leu(或met)xaa val(或leu)(称为psm-px)的抗原肽可以用作抗原，其中xaa代表任何氨基酸残基。该肽类似于hla a0201结合基序，即在hla-a2患者中发现的具有“锚定残基”、亮氨酸和缬氨酸的9-10个氨基酸残基的结合基序。(参见，例如，grey等人，cancer surveys 22:37-49(1995))。该肽可用作hla-a2 患者的抗原(参见central data analysis committee"allele frequencies",section 6.3,tsuji,k.等人(编辑)，tokyo university press,pp.1066-1077)。类似地，可以使用类似于其他hla结合基序的肽。
[0093]
在典型实施方案中，未成熟的树突细胞在均在tlr激动剂(有或没有干扰素γ)的情况下在体外或离体培养，并且在一段时间后在适合树突细胞成熟的条件下添加炎症激活脂质，如上所述。可以在tlr激动剂之前、一起或之后在合适的成熟条件下添加预定抗原。
[0094]
任选地，未成熟的树突细胞可以在没有gm-csf和il-4的典型树突细胞培养基中与预定抗原混合。在与抗原培养至少约10分钟至2天后，可以去除抗原，并在培养基中添加tlr激动剂(有或没有干扰素γ)。可以在适当的成熟期之后添加炎症激活脂质。例如，未成熟的树突细胞可以在添加炎症激活脂质之前成熟至少3小时。在添加炎症激活脂质之前的时间可以是4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时，和直至至少24小时。还可以添加细胞因子(例如，gm csf和il-4)至成熟培养基中。使树突细胞与抗原接触的方法在本领域中通常是已知的。(一般参见steel和nutman，j.immunol.160:351-360(1998)；tao等人，j.immunol.158:4237-4244(1997)；dozmorov和miller,cell.lmmunol.178:187-196(1997)；inaba等人，j.exp.med.166:182-194(1987)；macatonia等人，j.exp.med.169:1255-1264(1989)；de bruijn等人，eur.j immunol.22:3013-3020(1992)；其公开内容通过引用并入本文)。
[0095]
然后可以分离、洗涤和制剂所得到的呈递预定抗原的成熟、过度激活的树突细胞，以向个体施用。在任选的实施方案中，成熟的、过度激活的、抗原呈递树突细胞可以在体外或离体与t细胞例(例如幼稚t细胞)共孵育。从各种淋巴组织中获得的t细胞或t细胞亚群用
作应答细胞。此类组织包括但不限于脾脏、淋巴结和/或外周血。细胞可以作为混合的t细胞群或作为纯化的t细胞亚群与成熟的、引发的树突细胞共培养。t细胞纯化或富集可以通过阳性或阴性选择来实现，包括但不限于使用针对cd2、cd3、cd4、cd8等的抗体。
[0096]
通过在体外或离体使t细胞与成熟的抗原呈递、过度激活的树突细胞接触，提供抗原反应性或激活的极化t细胞或t淋巴细胞。如本文所用，术语“极化”是指产生高水平ifnγ或以其他方式引发用于诱导1型(th 1)应答的t细胞。此类方法通常包括使未成熟的树突细胞与细菌、细菌组分或细菌脂多糖(组合干扰素γ)和炎症激活脂质接触以制备成熟的、过度激活的抗原呈递树突细胞。在某些实施方案中，在适当条件下，未成熟的树突细胞可以在成熟的同时、之前或之后在体外或离体与预定抗原接触。
[0097]
在成熟期间，未成熟的树突细胞可以与t细胞(例如，幼稚t细胞)在体外或离体共培养，或在树突细胞成熟和过度激活后与t细胞(例如，幼稚t细胞)共培养以诱导增强的1型应答。未成熟的树突细胞或成熟的树突细胞可以在成熟前进一步富集。此外，在与树突细胞接触之前，可以从淋巴细胞群中富集t细胞。在具体实施方案中，使富集或纯化的cd4
或cd8
t细胞群与树突细胞接触。成熟的、引发的树突细胞与t细胞的共培养导致特定t细胞刺激，这些t细胞成熟为抗原反应性cd4
t细胞或抗原反应性cd8
t细胞。
[0098]
在另一方面，提供了用于体外再刺激t细胞的方法，通过在存在被引发诱导1型(th1)t细胞应答的成熟的过度活跃的树突细胞的情况下培养细胞。这种t细胞任选地可以在饲养细胞上培养。在与t细胞接触之前，可以任选地照射成熟的、引发的树突细胞。合适的培养条件可以包括一种或更多种细胞因子(例如，纯化的il-2、刀豆蛋白a刺激的脾细胞上清液或白细胞介素15(il-15))。通过添加未成熟的树突细胞、tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质以及预定抗原，体外或离体再刺激可用于促进t细胞群扩增。
[0099]
通过定期再刺激，可以在体外长期维持稳定的抗原特异性极化t细胞培养物或t细胞系。如此产生的t细胞培养物或t细胞系可以被储存，并且如果被保存(例如，通过用冷冻保存剂制剂和冷冻)，则用于以期望的间隔重新供应激活的、极化t细胞以供长期使用。
[0100]
在某些实施方案中，激活的cd8
或cd4
t细胞可以根据本公开的方法生成。通常，用于生成抗原反应性极化t细胞的成熟、引发的树突细胞对于它们将被施用的受试者是同源的(例如，获自受试者)。可选地，可以使用来自hla匹配供体的非癌细胞(例如，正常细胞)在体外制备具有与预期接受受试者相同的hla单倍型的树突细胞。在具体实施方案中，抗原反应性t细胞(包括细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和th1细胞)在体外作为免疫刺激的细胞来源进行扩增。
[0101]
细胞群的体内施用
[0102]
在本公开的另一方面，提供了用于施用上述细胞群的方法。对于需要免疫刺激的受试者，细胞群可以包括成熟的、过度激活的树突细胞或激活的、极化t细胞，或含有此类细胞的细胞群。此类细胞群可以包括成熟的、引发的树突细胞群和/或激活的、极化t细胞群。在某些实施方案中，此类方法通过以下进行：获得树突细胞前体或未成熟的树突细胞，在存在tlr激动剂(有或没有干扰素γ)、炎症激活脂质和预定抗原的情况下体外或离体分化和成熟这些细胞以形成成熟的过度激活的抗原呈递树突细胞群，其被引发诱导th1应答。在适当条件下，未成熟的树突细胞可以在成熟之前、同时或之后在体外或离体与抗原接触。此类成熟的、过度激活的抗原呈递树突细胞可以被分离并制剂用于直接施用于需要免疫刺激的
受试者。
[0103]
在相关的实施方案中，成熟的、引发的树突细胞可以在体外或离体与来自受试者的淋巴细胞接触以刺激淋巴细胞群内的t细胞。激活的极化淋巴细胞任选地随后在抗原反应性cd4
和/或cd8
t细胞的细胞培养物中进行克隆扩增，可以施用于需要免疫刺激的受试者。在某些实施方案中，激活的极化t细胞对于受试者是自体的。
[0104]
在另一个实施方案中，树突细胞、t细胞和接受受试者具有相同的mhc(hla)单倍型。确定受试者的hla单倍型的方法是本领域已知的。在相关的实施方案中，树突细胞和/或t细胞对接受受试者是同种异体的。例如，树突细胞对于具有相同mhc(hla)单倍型的t细胞和接受受试者是同种异体的。同种异体细胞通常与至少一个mhc等位基因匹配(例如，共享至少一个但不是所有mhc等位基因)。在不太典型的实施方案中，树突细胞、t细胞和接受受试者彼此均是同种异体的，但所有均具有至少一个共同的共同mhc等位基因。
[0105]
根据一个实施方案，t细胞从获得未成熟的树突细胞的同一受试者获得。在体外或离体成熟和极化后，将自体t细胞施用于受试者以激发和/或增强现有的免疫应答。例如，可以通过静脉内输注，例如，以约10
8-109个细胞/m2体表面积的剂量施用t细胞(参见，例如，ridell等人，science 257:238-241(1992)，其通过引用并入本文)。可以以期望的时间间隔重复输注，例如每月一次。可以在t细胞输注期间和之后监测接受者是否有任何不良反应的证据。
[0106]
在本公开的另一方面，未成熟的树突细胞可以通过本领域熟知的任何标准方法成熟，包括在不存在树突细胞成熟剂的情况下使未成熟的树突细胞与新的、清洁的、未使用的组织培养基质接触的方法。在成熟期间，可以使成熟树突细胞与预定抗原(例如肿瘤特异性或肿瘤相关抗原)接触。一旦成熟，可以将树突细胞制剂用于向个体施用，并且在施用时，成熟的树突细胞组合物与炎症激活脂质共同施用。
[0107]
如本文产生的过度激活的成熟的树突细胞和激活t细胞可以使用本领域技术人员熟知的方法和组合物与生理上可接受的载体、辅料、缓冲剂和/或稀释剂一起制剂。可以将树突细胞或t细胞组合物施用于需要免疫刺激的受试者。通常，将约102至约10
10
个细胞悬浮于药学上可接受的载体中。
[0108]
成熟的树突细胞和炎症激活脂质可以在统一制剂中施用或可以在单独的组合物中施用。当以单独的组合物施用时，成熟的树突细胞和炎症激活脂质可以同时施用或以任何顺序序贯施用。通常，成熟的树突细胞或成熟树突细胞直至未成熟的树突细胞与tlr激动剂，有或没有ifnγ，接触后至少3小时才与炎症激活脂质接触。在某些实施方案中，将炎症激活脂质局部施用至施用成熟的树突细胞的区域，例如通过注射。
[0109]
用本公开的组合物治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、预防性治疗和/或治疗性治疗的那些。
[0110]“有效量”是在受试者中产生期望的生理变化所必需的细胞数量。有效量通常用于研究目的。本文公开的有效量具有以下一项或多项作用：(i)诱导能够减少肿瘤或细菌细胞或病毒增殖或诱导肿瘤细菌细胞死亡或病毒破坏的th1免疫应答，以及(ii)具有抗癌或抗感染作用。
[0111]“预防性治疗”包括将本文所述的组合物施用于未表现出待治疗肿瘤的体征或症状或仅表现出待治疗肿瘤的早期体征或症状的受试者，使得所公开的组合物的施用的目的
是减少、预防或降低发生肿瘤或感染的风险。因此，预防性治疗起到针对病况的预防性治疗的作用。
[0112]“治疗性治疗”包括将本文所述的组合物施用于表现出病况的症状或体征的受试者并且施用于受试者以降低病况的严重程度或进展。
[0113]
施用于特定受试者的实际剂量和/或给予的剂量数可以由医师、兽医或研究人员在考虑参数(例如身体和生理因素，包括靶标；体重；病况类型；病况严重程度；即将发生的相关事件(如果已知)；既往或同时进行的治疗干预；受试者的特发性；和施用途径)后确定。此外，可以任选地采用体外和体内测定来帮助确定最佳剂量范围和/或剂量数。
[0114]
施用的治疗有效量可以包括大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于10
10
个细胞，甚至大于10
11
个细胞。
[0115]
如所指出的，本文公开的组合物和制剂可以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用，并且可以更具体地包括通过以下项中的一种或更多种：骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴内、腹腔、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、囊内和/或皮下输注和/或推注。
[0116]
成熟的过度活跃的树突细胞的施用
[0117]
根据另一个实施方案，树突细胞可以用树突细胞成熟剂，例如，tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和根据本公开的炎症激活脂质诱导在体外或离体开始成熟。在该实施方案中，树突细胞在施用之前未实现完全成熟。这些树突细胞(如未成熟的树突细胞)保留了摄取和加工抗原的能力，并且如完全成熟的树突细胞，在向个体施用后可以诱导增强的抗肿瘤应答。
[0118]
完全成熟的树突细胞在质量和数量上与未成熟的dc不同。一旦完全成熟，d表达更高水平的mhc i类和ii类抗原，以及更高水平的t细胞共刺激分子，例如cd80和cd86。这些变化增加树突细胞激活t细胞的能力，例如，通过增加细胞表面上的抗原密度以及通过t细胞上的共刺激分子对应物(例如，如cd28)的t细胞激活信号。此外，成熟的dc产生大量细胞因子，其刺激和极化t细胞应答。这些细胞因子包括与th1型免疫应答相关的白细胞介素12和与th2型免疫应答相关的白细胞介素-10和白细胞介素-4。通常，炎症激活脂质将与部分成熟的树突细胞一起施用或在部分成熟的树突细胞施用之后施用。
[0119]
通常，如上公开的用于离体dc产生的方法包括从受试者获得富集dc前体细胞的细胞群，然后在体外或离体分化dc前体细胞以形成未成熟的树突细胞并诱导未成熟的树突细胞成熟为完全成熟的dc。通常，在此过程中，成熟的dc在体外或离体与预定抗原接触，以在dc成熟时摄取和加工。有人认为dc必须是终末分化的，否则它们将去分化回单核细胞/巨噬细胞并失去大部分免疫增强能力。从单核细胞生成的dc的离体成熟已经用本领域熟知的方法和试剂成功地完成并如上进一步描述。在本实施方案中，成熟的树突细胞是优选的，因为成熟的树突细胞被施用于患者并在体内摄取和处理抗原，同时在施用后完全成熟并转移至淋巴结以与幼稚t细胞接触。
[0120]
使用本领域技术人员熟知的方法和组合物，可以使用生理学上可接受的载体、辅料、缓冲剂和/或稀释剂来制剂本文产生的成熟的树突细胞。成熟的树突细胞可以直接施用于需要免疫刺激的受试者。通常，约102至约10
10
个细胞悬浮于药学上可接受的载体中。将细
胞直接注射至肿瘤中或注射至靠近、邻近或与肿瘤或肿瘤床循环或淋巴接触的区域中，以确保细胞能够接触肿瘤抗原。
[0121]
例如但不限于，可以将细胞直接施用至肿瘤中、在手术切除或切除肿瘤之后施用至肿瘤床中、在肿瘤周围施用至与肿瘤直接接触的引流淋巴结中、施用至血管中或淋巴管通向或喂养肿瘤或受肿瘤折磨的器官，例如，门静脉或肺静脉或动脉等。成熟的树突细胞的施用可以与肿瘤的其他治疗同时或之后进行，例如当作为单独的组合物施用时施用炎症激活脂质、化疗或放疗。此外，成熟的树突细胞可以与另一种药剂共同施用，该药剂充当树突细胞成熟和/或肿瘤内或肿瘤附近或邻近区域内的抗原加工的佐剂，例如炎症激活脂质。此外，还可以将树突细胞制剂成或复合成缓释基质，以植入肿瘤或肿瘤床内或周围的区域，从而使细胞缓慢释放至肿瘤或肿瘤床内，以与肿瘤抗原接触。
[0122]
成熟树突细胞可以通过适合制剂和施用方式的任何方式施用。例如，可以将细胞与药学上可接受的载体组合并用注射器、导管、插管等施用。如上所述，细胞可以在缓释基质中制剂。当以这种方式施用时，制剂可以通过适合所用基质的方式施用。适用于本公开的其他施用方法和模式是本领域技术人员熟知的。
[0123]
在另一个实施方案中，成熟树突细胞和接受受试者具有相同的mhc(hla)单倍型。确定受试者的hla单倍型的方法是本领域已知的。在相关的实施方案中，成熟树突细胞对于接受受试者是同种异体的。同种异体细胞通常与至少一个mhc等位基因匹配(例如，共享至少一个但不是所有mhc等位基因)。在不太典型的实施方案中，成熟树突细胞和接受受试者彼此均是同种异体的，但所有均具有至少一个共同的mhc等位基因。
[0124]
在一个实施方案中，通过上述方法中的任一种产生的成熟树突细胞可以作为放疗、化疗或其组合的佐剂施用。例如，成熟的过度激活的树突细胞可以在放疗、化疗或其组合之前、同时或之后施用。
[0125]
在另一个实施方案中，提供了一种用于产生增强的抗肿瘤免疫应答和/或临床应答的方法，该方法包括施用包含富集人树突细胞的细胞群的组合物，该人树突细胞已被诱导开始成熟并在体外用tlr激动剂，有或没有干扰素γ(ifnγ)，和炎症激活脂质过度激活。分离成熟的过度激活的树突细胞并与药学上可接受的载体组合；其中将组合物施用于需要这种治疗的个体的肿瘤、瘤床或肿瘤周围的组织区域。
[0126]
在另一个实施方案中，用树突细胞成熟剂(例如热灭活的bcg)与ifnγ组合诱导未成熟的树突细胞开始成熟。在完全成熟之前，成熟的树突细胞被分离并制剂用于向个体施用。制剂可以包含炎症激活脂质或炎症激活脂质可以是与包含成熟的树突细胞的组合物共同施用的单独组合物。可以在施用成熟的树突细胞之前、同时或之后施用包含炎症激活脂质的组合物。在该实施方案中，炎症激活脂质在其向个体施用之后充当成熟的树突细胞的佐剂。抗原在施用后在体内或离体被激活的成熟的树突细胞吸收并加工以呈递至个体体内的t细胞。如上所述，可以将激活的成熟的树突细胞和炎症激活脂质施用于需要此类治疗的个体的肿瘤、瘤床或肿瘤周围的组织区域。
[0127]
在又一个实施方案中，未成熟的树突细胞可以通过本领域已知的任何方法与预定抗原一起成熟。例如，可以用tlr激动剂(例如bcg)和ifnγ与肿瘤裂解物的组合使未成熟的树突细胞成熟。成熟树突细胞在成熟过程中摄取和加工肿瘤抗原，该抗原可以在施用于切除肿瘤的个体时呈递至幼稚t细胞。一旦完全成熟，目前呈递抗原的树突细胞被分离并制剂
用于向个体施用。与单独施用时制剂的成熟的树突细胞相比，制剂的成熟的树突细胞可以与激活炎症的脂质(例如oxpapc)一起施用以诱导增强的肿瘤特异性th1免疫应答。在该实施方案中，炎症激活脂质可以与成熟的树突细胞一起制剂或可以在单独的组合物中制剂。当制剂为单独的组合物时，制剂的成熟的树突细胞和炎症激活脂质可以同时或以任何顺序序贯施用。在某些实施方案中，炎症激活脂质可以作为局部组合物施用至施用制剂的成熟的树突细胞的区域或皮肤或粘膜。与单独施用时制剂的成熟的树突细胞相比，制剂的成熟的树突细胞和激活炎症的脂质的组合可以诱导增强的针对预定抗原的抗原特异性免疫应答。
[0128]
上述所有组合物，包括过度活跃的成熟的树突细胞组合物、成熟树突细胞组合物和激活的t细胞组合物等，可以与任何其他治疗肿瘤的方法组合使用，或例如，本公开的方法和组合物可以与手术切除肿瘤、化疗(细胞毒性药物、凋亡剂、抗体等)、放疗、冷冻疗法、近距离放疗、免疫疗法(施用抗原特异性成熟的激活的树突细胞、nk细胞、肿瘤抗原特异性抗体等)等。所有上述方法也可以以任何组合使用。联合治疗可以是同时的或序贯的，并且可以按照治疗医师确定的任何顺序施用。
[0129]
实施例
[0130]
提供以下实施例仅用于说明本文所述的组合物和方法的各个方面，而不应解释为以任何方式限制本公开。
[0131]
实施例1：单核树突细胞前体的分化和成熟
[0132]
在第一项研究中，通过与树突细胞分化剂接触，诱导富集人单核树突细胞前体的细胞群在体外或离体分化成未成熟的树突细胞，然后通过使前体与如上定义的树突细胞成熟剂和炎症激活脂质接触诱导其成熟。在本实施例中，树突细胞分化剂是gm-csf与2％人血清白蛋白的组合。使用gm-csf与il-4、il-7、il-13或il-15的组合，可以实现类似的结果，即单核树突细胞前体分化为未成熟的树突细胞。在树突细胞分化后，未成熟的树突细胞的富集群体被诱导成熟并被树突细胞成熟剂和树突细胞过度激活剂(炎症激活脂质)过度激活，其中树突细胞成熟剂是toll样受体的激动剂。在本具体实施例中，使用toll样受体4(tlr4)激动剂lps并且还可以包含细菌、细菌产物或lps的组分，或另一种细菌lps。树突细胞的成熟倾向于通过添加干扰素γ(ifnγ)诱导th1应答。过度激活由炎症激活脂质(例如oxpapc)诱导。
[0133]
具体地，人单核树突细胞前体的富集细胞群与含2％人血清白蛋白的gm-csf一起培养以产生富集未成熟的树突细胞的细胞群。用lps诱导富集的未成熟的树突细胞群开始成熟和激活，并且同时或在1至12小时后添加炎症激活脂质以诱导完全成熟和过度激活。成熟的树突细胞的状态可以通过确定例如il-12、tnfα和/或il-1β的产生来确定。此外，成熟的过度激活的树突细胞诱导效应和记忆t细胞产生的能力，或cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活的能力可以通过已知方法确定。
[0134]
在另一个实施方案中，单核树突细胞前体在补充有gm-csf和il-4的细胞培养基中培养以诱导分化形成未成熟的树突细胞，随后未成熟的树突细胞在tlr激动剂(例如bcg或r848)组合或未组合ifnγ的情况下培养足以使树突细胞完全成熟的时间段。通过使成熟和激活树突细胞与炎症激活脂质同时或序贯与树突细胞成熟剂/tlr激动剂接触来诱导过度激活。炎症激活脂质可以与树突细胞成熟剂同时或在成熟开始后1至20小时或更长时间添
加至培养物中。
[0135]
在一个实施方案中，在使未成熟的树突细胞与tlr激动剂(例如细菌lps、r848或本文公开的另一种树突细胞成熟)接触之前、同时或之后使预定抗原与未成熟的树突细胞接触。tlr激动剂可以与ifnγ组合使用，也可以使用ifnγ组合或不组合炎症激活脂质。更具体地，在树突细胞分化和/或成熟期间将肿瘤细胞裂解物添加至培养物中。如果在成熟后添加，可以使用已知方法(例如渗透负载)来增强抗原摄取。
[0136]
在任选的实施方案中，单核树突细胞前体仅与树突细胞成熟剂和ifnγ接触，不包括炎症激活脂质。相反，当完全成熟时，成熟的树突细胞与药学上可接受的载体一起制剂，并与炎症激活脂质一起施用。炎症激活脂质可以与成熟的树突细胞组合在单一制剂中，或单独制剂合。任选地，将炎症激活脂质制剂成单独的组合物并且在施用成熟的树突细胞之前、同时或之后施用。
[0137]
il-12、il-2、tnfα和il-1β或其他炎性细胞因子的量可以通过使用可商购获得的检测(例如elisa或多重测定)进行确定。cd4
和cd8
t细胞的终末分化以及效应t细胞和记忆t细胞的水平可以通过本领域熟知的方法确定。
[0138]
实施例2：过度活跃的树突细胞的产生和成熟
[0139]
在本实施例中，通过本领域熟知的方法获得富集未成熟的树突细胞的细胞群。未成熟的树突细胞的富集细胞群与bcg或r848，有或没有ifnγ，和oxpapc的组合一起培养12至24小时，或直到未成熟的树突细胞完全成熟。然后测定完全成熟的树突细胞的il-2、il-12p70、tnfα和/或il-1β的产生。此外，完全成熟的树突细胞诱导cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活的能力以及效应t细胞和记忆t细胞的水平由本领域熟知的方法确定。
[0140]
在单独的研究中，将肿瘤细胞裂解物添加至成熟树突细胞中进行摄取和加工。培养成熟树突细胞直至它们完全成熟，然后如上所述检测成熟的过度激活的树突细胞样品。
[0141]
此外，还分离完全成熟的树突细胞并用例如pbs或新鲜培养基洗涤。然后可以将分离的过度激活的树突细胞制剂用于施用或冷冻保存以备后用。
[0142]
实施例3：从人外周血体外生成过度活跃的树突细胞
[0143]
在本实施例中，树突细胞(dc)从健康人供体的pbmc体外生成，并用toll样受体(tlr)的激动剂和炎症激活脂质诱导dc成熟和过度激活以生成过度活跃的成熟的树突细胞。本实施例中使用的炎症激活脂质是氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc)。在本实施例中检测了四种tlr激动剂，包括：细菌脂多糖(lps)(tlr4)、合成的二酰基脂肽pam2csk4(pam2；tlr2/tlr6)、合成的三酰基脂肽pam3csk4(pam3；tlr2/tlr1)和合成的双链rna类似物聚肌苷-聚胞苷酸(poly i:c)(tlr3)。用各种tlr激动剂激活dc，然后用正在检测的炎症激活脂质进行刺激，以确定导致这些细胞过度激活的原因。那些被过度激活的树突细胞有望更有效地治疗荷瘤动物和人。
[0144]
tlr是一类模式识别受体(prr)，其可检测微生物分子，通常称为病原体相关分子模式(pamp)。tlr免疫受体在白细胞(包括树突细胞)的膜上表达，并且tlr激动剂的结合触发可以导致免疫应答和抗原特异性获得性免疫的分子事件。细菌脂多糖(lps)是tlr4的强激动剂，具有增强对可溶性抗原的免疫应答的能力。lps通过识别常见pamp的tlr4通路刺激免疫系统细胞。pam2是合成的脂肽(lp)。这种脂肽模拟细菌脂蛋白，它们是强免疫调节剂，可在感染后激活早期先天宿主应答。pam2能够通过tlr2和tlr6通路诱导信号传导，也可以
depletion kit(miltenyi)富集谱系阴性祖细胞。将树突细胞前体铺板并均匀分布在6孔组织培养(tc)板的所有孔中，在孔中有以3ml/孔补充有gm-csf(10ng/ml)和il-4(10ng/ml)的rpmi 1640/10％胎牛血清(fbs)/青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺/2-巯基乙醇(2-me)。在培养的第2天，收获非贴壁细胞并重新铺板到新板中。在培养的第4天和第6天添加补充有gm-csf/il-4的另外的培养基。在第8天，收获未成熟的dc(仅悬浮和松散贴壁细胞)，并以2
×
105个细胞/孔重复三份铺板于96孔平底tc板中。用1μg/ml lps(sigma)、1μg/ml pam2(invivogen)、1μg/ml pam3(invivogen)或1μg/ml poly i:c hmw(invivogen)刺激dc 3小时。然后将以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml的滴定浓度的oxpapc(invivogen)添加至适当的样品中，并继续培养另外18小时。如果dc刺激导致激活的dc贴壁太紧而无法适当收获，则进行冷pbs孵育。
[0157]
进行流式细胞术分析以评估树突细胞表面标志物(cd11c、cd11b、cd80、cd83、cd69、cd86、cd40、mhc-i、mhc-ii、cd205)的表达，并确定活/死细胞的百分比。预期成熟的过度激活的树突细胞显示例如cd80、cd86、cd83、cd40、mhc-1和/或mhc-ii增加。
[0158]
使用luminex技术(可以同时检测单个样品中的多个靶标的免疫分析系统)，通过小鼠细胞因子和趋化因子组评估100μl培养基中的细胞因子产生，跨26种蛋白靶标(ifnγ；il12 p70；il13；il1β；il2；il4；il5；il6；tnfα；gm-csf；il18；il10；il17a；il22；il23；il27；il9；groα；ip10；mcp1；mcp3；mip1α；mip1β；mip2；rantes；和eotaxin)。预期用oxpapc和tlr激动剂进行刺激将上调至少多种炎性细胞因子，包括例如il1β、tnfα、il-2和/或il12 p70。
[0159]
讨论
[0160]
预期在本实施例中，用tlr激动剂成熟并用炎症激活脂质oxpapc过度激活的鼠源dc将产生诱导th1应答的细胞因子，最终导致上调效应t细胞(例如，cd8
细胞毒性t细胞)和记忆t细胞。
[0161]
在本实施例中，增加oxpapc的浓度导致il-12p70些许上调(在lps、pam2和pam3处理组中)。在较高的oxpapc浓度下，il-13的产生也有一些调节，特别是在lps和pam3处理组中，这也显示出il-10的一些下调。il-10下调通常导致th2应答抑制，这与il-12p70的产生增加相结合，可以表明免疫治疗的有利条件。
[0162]
实施例5：冷冻保存的富集鼠未成熟dc的体外研究
[0163]
在本实施例中，冷冻保存的c57bl/6和balb/c未成熟的dc在体外用toll样受体(tlr)激动剂和炎症激活脂质刺激以产生过度活跃的成熟的树突细胞。用四种tlr激动剂(包括细菌脂多糖(lps；tlr4)、热灭活的卡介苗(hbcg；tlr2/tlr4)、聚肌苷-聚胞苷酸(poly i:c；tlr3)和1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(r-848；tlr7/tlr8))刺激未成熟的dc。如前述实施例，包括pam 2(tlr2/tlr6)和pam3(tlr2/tlr1)未经处理且仅以最高炎症激活脂质浓度，用于跨研究比较。此外，如前述实施例，使用炎症激活脂质oxpapc，此外还包括1-棕榈酰-2-戊二酰磷脂酰胆碱(pgpc；cayman)，源自oxpapc的组分。预期用tlr激动剂激活鼠骨髓来源的未成熟的dc，然后用炎症激活脂质刺激导致这些细胞过度激活，并且这种过度激活的dc将更有效地治疗荷瘤动物和人。
[0164]
方法
[0165]
将未成熟的冷冻保存的c57bl/6和balb/c dc(cellero)于37℃下在水浴中快速解
冻，并将细胞重悬于10倍体积的rpmi 1640/10％fbs/青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺/2-me。使用完全培养基洗涤细胞两次。
[0166]
将解冻的细胞以2
×
105个细胞/孔重复三份铺板于96孔平底tc板中。用1μg/ml lps(sigma aldrich)、1:400稀释的hbcg(organon teknika/cognate)、1μg/ml r848(sigma aldrich)、1μg/ml pam2(invivogen)、1μg/ml pam3(invivogen)和25μg/ml poly i:c hmw(“高分子量”；invivogen)引发dc 3小时。将以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml滴定浓度的oxpapc(invivogen)或pgpc(cayman)添加至适当的样品中并另外培养48小时。
[0167]
如果激活的和成熟的dc在用tlr和炎症激活脂质刺激后紧密贴壁，则去除具有非贴壁细胞的上清液并将该悬浮液置于冰上。将冷pbs添加至孔中，并将板置于冰箱中30分钟以使贴壁细胞释放。用pbs收集贴壁和非贴壁细胞，并将其添加至先前收获的保存在冰上的细胞中。在流式细胞仪表型分析之前，将细胞用hbss或dpbs洗涤一次，将重复三份的孔合并用于流式细胞仪分析。
[0168]
用标记的单克隆抗体对dc进行染色，并进行流式细胞术分析以评估以下树突细胞表面标志物的表达：cd11b、cd11c、cd14、cd40、cd69、cd80、cd83、cd86、cd205、mhci、mhcii，并确定细胞是活细胞或死细胞。
[0169]
使用生产商的luminex多路复用技术，通过小鼠细胞因子和趋化因子组评估100μl培养基中的细胞因子产生，跨26种蛋白靶标(ifnγ；il12 p70；il13；il1β；il2；il4；il5；il6；tnfα；gm-csf；il18；il10；il17a；il22；il23；il27；il9；groα；ip10；mcp1；mcp3；mip1α；mip1β；mip2；rantes；和eotaxin)。xmap系统是以同时检测单个样品中的多个靶标的免疫分析系统。
[0170]
讨论
[0171]
在本实施例中，未成熟的鼠dc用tlr激动剂成熟，并用炎症激活脂质oxpapc或其组分脂质pgpc过度激活，以观察这些脂质是否如前述增强细胞因子的产生以产生th1应答。用增加浓度的oxpapc和pgpc处理的刺激的dc上调il-1β产生。il-1β的这种增加是dc过度激活的标志。
[0172]
实施例6：冷冻保存的人树突细胞前体的分化、成熟和过度激活的体外研究
[0173]
在本实施例中，使用冷冻的人pbmc在体外生成未成熟的dc的富集细胞群。获得的富集人未成熟dc的细胞群用各种toll样受体(tlr)的激动剂激活和成熟，随后用炎症激活脂质进一步激活以产生过度活跃的成熟的树突细胞。用实施例5中使用的四种tlr激动剂，即lps、热灭活的bcg、poly i:c和r848，诱导富集未成熟dc的细胞群成熟和激活。此外，如在实施例5中，用炎症激活脂质oxpapc和pgpc进一步刺激dc。
[0174]
方法
[0175]
将冷冻的人pbmc(hemacare,los angeles,ca)解冻并洗涤，然后在37℃下铺于t75 tc培养瓶(约2
×
106个细胞/ml)中至少2小时。在单核细胞贴壁至组织培养基质表面后，去除未贴壁的细胞，并用温热的完全培养基轻轻冲洗培养瓶。在补充有500u/ml重组人gm-csf和500u/ml重组人il-4的无酚红rpmi-1640/10％人热灭活ab血清中培养贴壁单核细胞7天。培养开始两天后，培养基中添加gm-csf/il-4。
[0176]
在第8天，通过收集悬浮液、贴壁细胞和非贴壁级分来收获富集未成熟的dc群，并将细胞以2
×
105个细胞/孔重复三份铺板于96孔平底tc板中。用各种tlr刺激富集的未成熟
dc：1μg/ml lps(sigma aldrich)、25g/ml poly i:c hmw(“高分子量”；invivogen)、1:400稀释的热灭活bcg(organon teknika/cognate)和1μg/ml r848(sigma aldrich)3小时。将以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml滴定浓度的炎症激活脂质oxpapc(invivogen)或pgpc(cayman)添加至适当的样品中，然后另外培养18小时。
[0177]
在用tlr和炎症激活脂质刺激后，如果激活的dc紧密贴壁于组织培养基质表面，则去除具有非贴壁细胞的上清液并将悬浮液置于冰上。向孔中加入冷pbs并将板放入冰箱中30分钟以使贴壁细胞从组织培养基质中释放。收集在pbs中收集的细胞并将其添加至先前收获的保存在冰上的细胞中。收集的细胞用hbss或dpbs洗涤一次，然后以重复三份制备孔组合，用于流式细胞仪表型和分析。
[0178]
对dc进行染色并进行流式细胞术分析以评估以下树突细胞表面标志物的表达：cd1c、cd11c、cd40、cd69、cd80、cd83、cd86、cd123、cd141、mhc-i、mhc-ii，以及活细胞和死细胞。
[0179]
如上所述，按照生产商的说明使用luminex免疫分析系统，通过小鼠细胞因子和趋化因子组评估100μl培养基中的细胞因子产生，跨34种蛋白靶标(eotaxin/ccl11；gm-csf；groα/cxcl1；ifnα；ifnγ；il1β；il1α；il1 ra；il2；il4；il5；il6；il7；il8/cxcl8；il9；il10；il12 p70；il13；il15；il17 a；il18；il21；il22；il23；il27；il31；ip10/cxcl10；mcp1/ccl2；mip1α/ccl3；mip1β/ccl4；rantes/ccl5；sdf1α/cxcl12；tnfα；tnfβ/lta)。luminex系统可以同时检测单个样品中的多个靶标。
[0180]
讨论
[0181]
人源dc用tlr激动剂成熟并用炎症激活脂质oxpapc及其组分脂质pgpc过度激活，将促进有助于诱导th1应答的细胞因子产生，从而导致效应t细胞(例如，cd8
细胞毒性t细胞)和记忆t细胞。通常与dc成熟和增强t细胞刺激的共刺激分子相关的细胞表面标志物将在这种环境中上调。il-1家族细胞因子(包括il-1β)和il-12的产生将与il-10抑制相一致，为t细胞介导的适应性免疫应答创造有利环境。
[0182]
实施例7：同基因肿瘤细胞-ct26、4t1、madison 109和a20与过度激活的树突细胞施用的体内研究
[0183]
在本实施例中，使用tlr、ifnγ(在一些情况下)和炎症激活脂质的各种组合在离体产生的负载肿瘤裂解物的成熟鼠dc以产生过度激活的dc，被施用于同系小鼠以确定何种过度活跃的dc在减缓荷瘤动物的肿瘤生长方面更有效。dc负载来自各种同系balb/c癌细胞系的肿瘤细胞裂解物，并进一步与tlr(加ifnγ)和炎症激活脂质组合，以生成过度活跃的dc，将其全身施用于雌性balb/c小鼠。使用的炎症激活脂质再次是氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(oxpapc；invivogen)和1-棕榈酰-2-戊二酰磷脂酰胆碱(pgpc；cayman)。本研究还包括1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc；cayman)。pgpc和povpc是衍生自oxpapc的组分。
[0184]
本实施例中用于诱导富集的未成熟的树突细胞成熟的三种tlr激动剂是细菌脂多糖(lps；tlr4)、聚肌苷-聚胞苷酸(poly i:c；tlr3)和1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(r848，sigma aldrich)。r848是tlr7/tlr8的强合成激动剂，通常增加tnf-α、il-6和ifn-α的细胞因子水平。因此，在本实施例中包含的三种不同tlr中，tlr3、tlr4和tlr7/tlr8被探索为可能影响dc成功成熟和过度激活过程从而诱导
增强免疫应答的途径。
[0185]
选择四(4)种不同的同系癌小鼠模型细胞系作为本实施例的肿瘤细胞裂解物的来源。同系小鼠模型利用具有源自原株的肿瘤的免疫活性小鼠。选择具有描述生长动力学和对护理标准剂(例如抗ctla4和pd-1检查点抑制剂)应答的可用数据的免疫原性小鼠模型，因为这些模型可以提供与已批准药物进行比较的更好来源。
[0186]
为了表明本公开的方法和组合物对不同的癌症具有广泛的适用性，本实施例包括代表多种肿瘤组织型和反应特征的小鼠模型。选择以下四种小鼠模型：madison 109(肺癌)、ct26(结肠癌)、4t-1(乳腺癌)和a20(淋巴瘤)。ct26和a20型号是“应答”模型，4t-1和madison 109型号是“难治”模型。所有这些模型均来自balb/c小鼠并与其同源。
[0187]
肿瘤细胞裂解物的制备
[0188]
在对数期收获每个细胞系(ct26、madison 109、4t-1和a20)至少2
×
109个肿瘤细胞。用versene(或等同物)细胞解离溶液收集贴壁细胞，避免使用酶促细胞解离方法。用冷dpbs冲洗细胞两次以从细胞中去除血清。
[0189]
每次洗涤后，细胞以400
×
g沉淀5分钟。离心后，去除洗涤上清液并弃去。将肿瘤沉淀重悬于适当体积的不含酚红的rpmi-1640中(150至3亿个细胞/ml)并转移至微量离心管中。然后将细胞悬浮管在-80℃下冷冻超过(》)一(1)小时，然后在室温下解冻。可选地，将肿瘤颗粒在液氮中速冻，并于37℃下在干浴中快速解冻(《5分钟)。
[0190]
冻融过程再重复五(5)次，总共六(6)个冻融循环，以有效裂解肿瘤细胞。由于能够在冻融过程的冷冻步骤中使材料保持冷冻状态，因此可以选择在较长时间内(长达几天)对肿瘤细胞进行处理。如果粘稠，裂解物在冰上超声处理30秒。在台式离心机上全速离心含有解冻、裂解的细胞悬液的试管三(3)分钟。将肿瘤裂解物(上清液)合并在无菌的50ml离心管中，并取样用于使用dc蛋白测定法测定蛋白浓度。通过0.2μm过滤器调整和过滤至多2mg/ml的总蛋白。过滤后的裂解液被分装到内螺纹、标记的冷冻管中，并盖紧。使用标准比色蛋白测定法(biorad)来验证过滤的裂解物的最终蛋白浓度。每个肿瘤细胞系的肿瘤裂解物储存在-80℃待用。
[0191]
从未成熟的dc制备树突细胞作为阳性对照
[0192]
未成熟的dc与由肿瘤裂解物组成的肿瘤裂解物培养基孵育，在补充有10％fbs、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素、0.1％0.1m 2-me和10ng/ml鼠重组gm-csf的rpmi-1640中以100μg/ml稀释。dc以1.0
×
106个细胞/ml重悬至1.5
×
106个细胞/ml。然后将肿瘤细胞裂解物培养基细胞悬液置于标记以反映这些添加物的新培养瓶中，并放回培养箱中十四(14)至二十(20)小时。在这个孵育期之后，收获贴壁和非贴壁细胞。
[0193]
除去由非贴壁细胞组成的上清液，将悬浮液置于冰上。将冷pbs添加至孔中，并将板置于冰箱中30分钟以使贴壁细胞释放。随意使用细胞刮刀以去除在冷pbs处理后仍黏住的细胞。收集具有pbs的细胞并添加至先前在冰上收获的细胞中。在重悬注射之前，用rpmi(无添加剂)洗涤细胞一次。
[0194]
dc的脉冲和冷冻保存
[0195]
将本实施例中每项研究的充分冷冻保存的balb/c dc(cellero)(冷冻保存的总数和冻结的时间因批次而异)解冻并用补充有10％fbs、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素和0.1％0.1m 2me的rpmi1640洗涤两次。将10ng/ml鼠重组gm-csf新鲜添加至培养基中以产
生未成熟的dc。细胞以400
×
g沉淀4分钟。进行流式细胞仪表型分析，观察活细胞％，以及以下细胞表面标志物：cd11b、cd11c、cd14、cd40、cd69、cd80、cd83、cd205、mhc i、mhc ii。然后用含有100μg/ml肿瘤裂解物并补充有gm-csf的dc培养基以1
×
106个细胞/ml重悬剩余的细胞。然后将细胞置于t225或t125组织培养瓶中，并在37℃下培养20至24小时。
[0196]
然后将tlr激动剂和ifnγ添加至每个孔中，如果合适，如表1中指定，持续3小时，此时将适当的炎症激活脂质直接添加至培养基中，浓度为120μm。轻摇培养瓶以混合并在37℃下再培养16至20小时。通过用培养基轻轻冲洗来收获非贴壁和松散贴壁的细胞。将细胞悬液置于冰上。然后将冷dpbs添加至培养瓶中，并将任何剩余的细胞在2至8℃下孵育30分钟。用细胞刮刀轻轻刮掉贴壁在板上的细胞。收集细胞并与非贴壁级分组合。用hbss冲洗细胞两次。吸出洗涤缓冲液以去除另外的缓冲液。如前所述，再次通过流式细胞术分析细胞。剩余的细胞以每毫升5
×
106个细胞的细胞密度重悬于冷冻培养基(biolife)中。将细胞冷冻保存在具有10％dsmo(cryostor)的冷冻保存培养基中，以供以后给药。
[0197]
表1：刺激条件，肿瘤裂解物脉冲过度激活的dc的全身施用
[0198]
处理组刺激条件1dc，无处理。(阴性对照)2dcs 肿瘤裂解物(阳性对照)3dcs lps oxpapc 肿瘤裂解物4dcs lps pgpc 肿瘤裂解物5dcs lps pov-pc 肿瘤裂解物6dcs lps pgpc 肿瘤裂解物 ifnγ7dcs lps pov-pc 肿瘤裂解物 ifnγ8dcs poly i:c oxpapc 肿瘤裂解物9dcs poly i:c pgpc 肿瘤裂解物10dcs poly i:c pov-pc 肿瘤裂解物11dcs r848 oxpapc 肿瘤裂解物12dcs r848 pgpc 肿瘤裂解物13dcs r848 pov-pc 肿瘤裂解物14dcs lps 肿瘤裂解物15dcs poly i:c 肿瘤裂解物16dcs r848 肿瘤裂解物
[0199]
研究程序
[0200]
将小鼠分为四项独立的研究，每项研究涉及不同的同系小鼠模型细胞系。在研究开始时，小鼠年龄匹配(8-12周)。生长动力学和预期摄取率影响注射至小鼠体内的肿瘤细胞数量，ct26小鼠接受0.1ml的中3
×
105个细胞的注射，而其他三项研究中的小鼠(即4t-1、a20、和madison 109)接受0.1ml的中1
×
106个肿瘤细胞的注射。所有肿瘤细胞注射均皮下注射至右侧。当肿瘤达到80至120mm3的平均大小时进行配对匹配，此时开始处理。每项研究包含16组(至多)8只雌性balb/c小鼠，其中两组被指定为阳性和阴性对照。
[0201]
在第1、8和15天，将来自表1中各组的冷冻保存的刺激dc解冻并重悬于rpmi-1640(无添加剂)中，每次单独治疗性注射的目标密度为1
×
106个细胞/50μl。小鼠在左侧腋下皮内注射，与注射肿瘤细胞的腋下相对，3
×
105至1
×
106个细胞(计数不同，取决于批次产量)使激活的dc成熟，体积为0.05ml/小鼠。前5天每天记录体重，然后每周记录两次，直至研究结束。每周两次用卡尺测量肿瘤直至研究结束。肿瘤生长延迟(tgd)是研究终点，当肿瘤达到预先指定的大小(即4t-1模型中为1,000mm3，ct-26、a20和madison 109中为2,000mm3)时或研究结束45天后，以先发生者为准。
[0202]
讨论
[0203]
这些研究可以表明，用同基因肿瘤细胞裂解物脉冲并在不同刺激条件下(即tlr激动剂和/或ifnγ和/或炎症激活脂质)成熟的balb/c dc处理的balb/c小鼠组将在达到肿瘤生长延迟(tgd)的研究终点方面产生不同的结果。用tlr激动剂和炎症激活脂质刺激dc应该能够将过度激活的dc递送至注射部位，其中dc将迁移至引流淋巴结并在原位持续分泌增加水平的促炎细胞因子(例如il-1β)，避免细胞焦亡，并产生增强的t细胞介导的炎症应答。在一些情况下，t细胞应答应该足够强以延迟和/或逆转肿瘤生长并延长生命。
[0204]
实施例8：体内瘤内研究-ct26、4t-1、madison 109、a20同基因肿瘤细胞系
[0205]
在本实施例中，balb/c小鼠dc用tlr和ifn-γ的各种组合进行离体刺激，然后用炎症激活脂质激活，以产生过度激活的dc。测量肿瘤的大小以确定dc是否可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长。
[0206]
如在上述实施例7中，在本实施例中探索了相同的三种tlr激动剂(即lps、poly i:c和r848)和相同的三种炎症激活脂质(即oxpapc、pgpc和pov-pc)。在balb/c小鼠中开始源自如上文选择的相同的四(4)个同系癌细胞系小鼠细胞系的肿瘤。
[0207]
与上述实施例7相比，本实施例包括使用不同的施用方式(肿瘤内相比于全身递送)，以及dc摄取和加工抗原的位置/部位(体内与离体)。在实施例7中，用肿瘤裂解物离体脉冲dc，用tlr组合ifnγ和炎症激活脂质进一步刺激，然后全身(皮内)注射。在本实施例中，dc在离体时对肿瘤细胞是幼稚的，其中它们被tlr组合ifnγ刺激，然后被炎症激活脂质激活。收集并制剂dc用于直接原位注射至肿瘤块中，其中抗原被呈递至dc，被摄取和加工，其中dc随后迁移至引流淋巴结以将抗原呈递至幼稚t细胞以固定抗原特异性免疫应答。
[0208]
在本实施例中，所有四项肿瘤内研究均使用“新鲜”的balb/c骨髓来源细胞作为dc前体细胞的起始材料进行。所有四项研究中的细胞均由cellero制备。在细胞刺激过程结束时，dc仅冷冻保存一次，随后进行7天的dc培养，随后用tlr和炎症激活脂质进行刺激，以供各种瘤内注射。
[0209]
本例中四项研究中的三项(即使用a20、madison 109和4t-1细胞系)的治疗性肿瘤内dc疫苗接种剂量将在肿瘤达到约60至80mm3时开始。ct26瘤内施用研究的起始肿瘤体积约为80-120mm3。
[0210]
方法
[0211]
如上所述，从balb/c骨髓(cellero)分离单核细胞并培养以产生未成熟的dc。对未成熟dc的样品进行流式细胞仪表型分析，观察以下标志物组：cd11b、cd11c、cd14、cd40、cd69、cd80、cd83、cd86、cd205、mhc-i、mhc-ii。将剩余的细胞以1
×
106/ml的浓度用添加gm-csf的dc培养基重悬，然后加入t225或t125组织培养瓶中，并在37℃下孵育20至24小时。
[0212]
将等体积的2
×
tlr激动剂和ifn-γ混合物(如果适用)直接添加至补充有gm-csf的dc培养基中，并轻摇培养瓶以混合。三(3)小时后，根据表2添加120μm的炎症激活脂质(如果适用)。轻摇培养瓶以混合并在37℃下再培养16至20小时。通过用培养基轻轻冲洗收集非贴壁和松散贴壁的细胞，并将细胞悬液置于冰上。将冷dpbs添加至培养瓶中并在2-8℃下孵育30分钟。用细胞刮刀轻轻刮除贴在板上的细胞，收集细胞并与非贴壁级分合并。用hbss冲洗细胞两次。吸出洗涤缓冲液以去除另外的缓冲液。如前所述，通过流式细胞术分析细胞。剩余的细胞以每毫升5
×
106个细胞的细胞密度重悬于冷冻培养基(biolife)中。将细胞冷冻保存在含有10％dsmo(cryostor)的冷冻保存培养基中，以待用于瘤内施用研究。
[0213]
表2：刺激条件，过度激活的dc的瘤内施用
[0214]
处理组刺激条件1dcs，无处理。(阴性对照)2dcs r848 ifnγ(阳性对照)3dcs lps oxpapc4dcs lps pgpc5dcs lps pov-pc6dcs lps pgpc ifnγ7dcs lps pov-pc ifnγ8dcs poly i:c oxpapc9dcs poly i:c pgpc10dcs poly i:c pov-pc11dcs r848 oxpapc12dcs r848 pgpc13dcs r848 pov-pc14dcs lps15dcs poly i:c16dcs r848
[0215]
阳性对照的制备
[0216]
将r848(1μg/ml)和ifnγ(至1,000u/ml)添加至balb/c dc细胞悬液中3小时，然后将细胞置于tc培养瓶中并孵育16至20小时。收获贴壁和非贴壁细胞。去除具有非贴壁细胞的上清液并将悬浮液置于冰上。将冷pbs添加至孔中，并将板置于冰箱中30分钟以释放任何剩余的贴壁细胞。细胞刮刀用于仍贴在板上的细胞。然后收集含有pbs的细胞悬液，并将其添加至先前收获的已保存在冰上的细胞中。在重悬注射之前，用rpmi或hbss洗涤总收集的细胞一次。
[0217]
如上所述，在刺激后进行流式细胞术分析。
[0218]
研究程序
[0219]
将小鼠分为四项独立的研究，每项研究涉及不同的同系小鼠模型细胞系。在研究开始时，小鼠年龄匹配(8-12周)。生长动力学和预期摄取率影响注射至小鼠体内的肿瘤细胞数量，ct26小鼠接受0.1ml的中3
×
105个细胞的注射，而其他三项研究中的小鼠
(即4t-1、a20、和madison 109)接受0.1ml的中1
×
106个肿瘤细胞的注射。所有肿瘤细胞注射均皮下注射至右侧。当肿瘤达到80至120mm3的平均大小时进行配对匹配，此时开始处理。每项研究包含16组(至多)8只雌性balb/c小鼠，其中两组被指定为阳性和阴性对照。
[0220]
每组小鼠的dc在注射前解冻，并且在解冻时，表y中的每组dc在注射前以1
×
106个细胞/50μl的目标密度重悬于rpmi-1640(不含添加剂)中。在第1天、第2天、第3天和第7天小鼠接受四次每剂50ml的dc疫苗接种。根据表2中的组特异性刺激条件，用这些dc向小鼠肿瘤内注射。
[0221]
前5天每天记录体重，然后每周记录两次，直至研究结束。每周两次用卡尺测量肿瘤直至研究结束。肿瘤生长延迟(tgd)是研究终点，当肿瘤达到预先指定的大小(4t-1研究中为约1,000mm3；其他三项研究中为约2,000mm3)或研究结束后45天时，以先发生者为准。
[0222]
结果
[0223]
这些研究表明，用已在不同刺激条件下(即tlr激动剂和/或ifnγ和/或炎症激活脂质)成熟的balb/c dc处理的balb/c小鼠组将在达到肿瘤生长延迟(tgd)的研究终点方面产生不同的结果。用tlr激动剂和炎症激活脂质刺激dc将使dc过度激活，这些dc将原位获取肿瘤特异性抗原，然后迁移至引流淋巴结，将抗原特异性信息递送至t细胞。在注射后及之后，这些过度活跃的、非焦亡的dc将在原位分泌增加水平的促炎细胞因子(例如，il-1β)，比未受炎症激活脂质刺激时可能的时间更长。炎症应答可能足够强，以至于在一些情况下出现肿瘤生长延迟和/或逆转，因此小鼠的存活时间更长。
[0224]
实施例9：抗原特异性t细胞的体外或离体刺激
[0225]
在本实施例中，在tlr激动剂存在下成熟的未成熟dc与ifnγ和在肿瘤裂解物存在下的炎症激活脂质组合显示可刺激抗原特异性t细胞产生的ifnγ水平提高。
[0226]
t细胞或者从例如外周血中分离，或者可以在不分离的情况下在血液成分的细胞群中被刺激。将t细胞与未成熟的dc共培养，用tlr激动剂(例如lps、bcg、poly i:c和/或r848)和ifnγ使dc成熟，或用tlr激动剂ifnγ和炎症激活脂质(例如oxpapc)使dc成熟。在适当的时间后，可以分离激活的t细胞并使用市售的elisa测定法测定ifnγ的产生。
[0227]
结果将表明，用tlr激动剂(例如lps或bcg与ifnγ组合)刺激并用炎症激活脂质(例如oxpapc)激活的dc是抗原特异性t细胞的优异刺激物。与未成熟的dc共培养的t细胞预期产生非常少的ifnγ，而与使用bcg与ifnγ组合成熟的dc共培养的t细胞预期产生ifnγ的中间产物。与使用tlr激动剂(例如bcg与ifnγ组合)并随后用炎症激活脂质(例如oxpapc)激活的dc共培养的t细胞预期产生最高水平的ifnγ。因此，用例如bcg与ifnγ组合成熟的dc以及随后用oxpapc激活是抗原特异性t细胞的更佳刺激物。
[0228]
通过该方法产生的激活的t细胞可以在制剂用于向个体施用的t细胞之前被分离和洗涤。t细胞也可以冷冻保存以备后用，并在施用前解冻。
[0229]
实施例10：抗原呈递成熟的树突细胞的施用
[0230]
未成熟的树突细胞可以通过任何已知的方法产生。例如，未成熟的树突细胞可以在体外或离体与作为成熟剂的bcg和ifnγ接触。未成熟的dc可以通过在添加1％人血浆的培养基(gibco-brl)的存在下使外周血单核细胞与塑料接触来制备。未结合的单核细胞和其他细胞可以通过洗涤去除。结合的单核细胞可以在例如x-vivo培养基中在
每毫升500u gm csf和500u il-4的存在下培养6天以形成未成熟的树突细胞。
[0231]
随后可以培养未成熟的树突细胞并用灭活的卡介苗与ifnγ组合使其成熟足够长的时间以使树突细胞完全成熟。在成熟期间，使成熟的树突细胞与肿瘤裂解物接触，例如，来自从患者分离的神经胶质瘤的裂解物，以形成呈递激活的成熟的树突细胞的肿瘤抗原。可以将呈递肿瘤抗原的激活成熟的树突细胞配制用于在有或没有炎症激活脂质(例如oxpapc)的情况下施用。当与例如oxpapc一起制剂时，组合物可以肠胃外施用，例如，通过静脉内、肌内、皮下或瘤内全身注射至肿瘤或周围的肿瘤床中。当制剂为单独的组合物时，包含呈递肿瘤抗原的激活成熟的树突细胞的组合物和包含oxpapc的组合物可以同时或以任何顺序序贯施用。在一种方法中，oxpapc可以在施用包含呈递激活成熟的树突细胞的肿瘤抗原的组合物之前首先局部应用于注射区域。例如，可以将包含oxpapc的组合物局部施用于树突细胞组合物的注射部位周围的区域。
[0232]
实施例11：有和没有oxpapc的成熟的树突细胞的施用
[0233]
在本实施例中，成熟树突细胞可以用卡介苗、ifnγ的组合(有或没有oxpapc)诱导成熟。在完全成熟之前，通常在培养6至20小时后，分离、洗涤和制剂树突细胞以向个体施用或制备冷冻保存在dmso和人血清或血浆中以供以后施用。当冷冻保存时，将组合物迅速解冻，必要时稀释至患者施用剂量。
[0234]
当被诊断患有实体瘤时，患者接受化疗、放疗、冷冻疗法或近距离放疗治疗，随后瘤内施用成熟的树突细胞组合物。当施用的组合物是其中在oxpapc存在下诱导树突细胞成熟的组合物时，施用可以直接进入肿瘤或肿瘤周围的肿瘤床中。其中包含成熟树突细胞的组合物，其中不使用oxpapc。oxpapc可以单独制剂，也可以与成熟树突细胞一起制剂。当单独制剂以向受试者施用时，两种组合物可以在相同或不同部位同时施用，或者组合物可以以任一顺序序贯施用。在一个实施方案中，其中oxpapc和成熟的树突细胞被制剂用于单独施用，oxpapc被制剂用于局部施用并且在施用之前被施用于成熟树突细胞的施用区域。
[0235]
提供前述实施例以说明而非限制要求保护的发明的范围。本发明的其他变体对于本领域的普通技术人员来说将是显而易见的并且涵盖在所附权利要求中。本文引用的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献也通过引用以其全文并入本文。
[0236]
尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以在其中做出各种改变。
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年10月7日提交的美国临时申请号62/912,005的权益，其公开内容以其全文并入本文。
背景技术：
3.抗原呈递细胞(apc)在引发有效免疫应答方面具有重要性。它们不仅将抗原呈递至具有抗原特异性t细胞受体的t细胞，而且还提供t细胞激活所必需的信号。这些信号尚未完全确定，但涉及多种细胞表面分子以及细胞因子或生长因子。激活幼稚或非极化t细胞所需的因素可能与重新激活记忆t细胞所需的因素不同。apc呈递抗原和传递t细胞激活信号的能力通常称为辅助细胞功能。尽管单核细胞和b细胞已被证明是活性apc，但它们的抗原呈递能力似乎仅限于它们对先前致敏t细胞的激活。因此，它们无法直接激活功能性幼稚或静息t细胞群。
4.树突细胞(dc)是免疫系统的专门抗原呈递细胞，其被认为能够激活幼稚t细胞和记忆t细胞。树突细胞越来越多地离体制备用于免疫疗法，特别是癌症的免疫疗法。制备具有最佳免疫刺激特性的树突细胞需要了解和利用这些细胞的生物学来进行离体培养。已经描述了用于培养这些细胞的各种方案，每种方案各有优点。最近的方案包括使用无血清培养基，以及采用赋予培养细胞期望的免疫刺激特性的成熟条件。
5.树突细胞成熟是将与皮肤langerhans细胞表型相似的未成熟dc转化为可以迁移至淋巴结的成熟抗原呈递细胞的过程。该过程导致表征未成熟的树突细胞的强抗原摄取能力丧失，并导致共刺激细胞表面分子和各种细胞因子的表达上调。
6.许多已知的成熟方案基于dc被认为在暴露于抗原期间或之后遇到的体内环境。这种方法的最佳实例是使用单核细胞条件培养基(mcm)作为细胞培养基。mcm通过培养单核细胞在体外产生并用作成熟因子来源。有报道表明mcm中负责成熟的主要组分是(促)炎症细胞因子白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)和肿瘤坏死因子α(tnfα)。其他成熟因子包括前列腺素e2(pge2)、poly-didc、血管肠肽(vip)、细菌脂多糖(lps)、卡介苗(bcg)，以及其他分枝杆菌或分枝杆菌的组分，例如特定的细胞壁成分。
7.已报道通过将干扰素γ(ifnγ)与某些树突细胞成熟因子(例如细菌脂多糖(lps)、bcg和cd40l)组合来增强树突细胞的il-12产生。然而，lps、bcg和cd40l已知具有在成熟过程中诱导少量il-12的能力。此外，bcg已显示可诱导大量il-10，因此最初认为单独使用时可诱导th2免疫应答。现已表明，当添加至体外培养的未成熟的树突细胞中时，添加ifnγ与lps、bcg或cd40l组合时可增强il-12的产生。干扰素γ信号传导使用jak2-stat1通路，其包括stat1的第701位酪氨酸残基在其迁移至细胞核之前的酪氨酸磷酸化和继而发生的干扰素γ反应基因转录的增强。然而，关于人单核细胞来源的树突细胞中的信号转导通路仍知之甚少。这些细胞中ifnγ作用的机制尚未完全确定。
8.最近，已表明过度活跃的dc从细胞质(例如，il-1β)和生物合成途径(例如，tnfα)
分泌炎性细胞因子，同时保持活力。这些属性已通过多种微生物或宿主来源的产物(包括氧化磷脂(例如氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc))、其取代物和衍生物的混合物)实现。
9.白细胞介素-1(il-1)细胞因子家族，包括il-1和il-18，通常在t细胞生物学中发挥作用，特别是在记忆t细胞生成和cd8
t细胞的效应子功能中发挥作用。此外，il-1激活预先确定的t辅助(th)细胞谱系中的内在il-1受体(il-1r)信号传导，并充当增加t效应细胞因子产生的信号。已建议使用il-1作为弱疫苗或低效疫苗的佐剂，以增加疫苗接种保护活性。因此，炎症激活剂(例如氧化的磷脂)已被检查作为体内过度活跃的树突细胞的诱导剂，当将氧化的脂质施用于具有免疫原的患者时，其能够增强树突细胞的过度激活并诱导改善的抗原特异性免疫应答。
技术实现要素：
10.提供本发明内容以以简化形式介绍概念的选择，这些概念将在以下具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用作辅助确定所要求保护的主题的范围。
11.本发明提供了用于诱导未成熟的树突细胞(dc)体外或离体成熟以产生过度活跃的成熟的树突细胞的方法和组合物，与同时提供广泛免疫刺激的药剂(即，树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)与炎症激活脂质组合)组合，并用于引发这些细胞以增强免疫应答，包括增强t细胞应答、增强的th1应答和/或抗原特异性细胞毒性t细胞应答。
12.在一方面，提供了一种用于产生成熟的过度活跃的树突细胞群的方法，该方法包括提供未成熟的树突细胞；和在适合未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触以形成过度活跃的成熟的树突细胞群。与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，该成熟的过度活跃的树突细胞群产生水平增加的il-1(特别是il-1β)，效应t细胞和记忆t细胞的产生增加，以及cd4
和cd8
t细胞的终末分化和激活增加。类似地，与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(组合或未组合干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，过度激活的dc产生更多量的刺激th-1的细胞因子和更少量的刺激th-2的细胞因子。
13.在与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前、同时或之后，可以使未成熟的树突细胞与预定抗原在体外或离体接触。当预定抗原与成熟后的树突细胞接触时，或当抗原摄取已显著减少时，抗原可以通过已知的方法(例如渗透负载)被内化。
14.预定抗原可以是，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(例如肿瘤相关肿瘤抗原或肿瘤特异性抗原)的转化或转染细胞、细胞裂解物(例如细菌或肿瘤细胞裂解物)、细菌或肿瘤细胞膜制剂、重组产生的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原、肽抗原(例如，合成的肿瘤相关或肿瘤特异性肽相关或肿瘤特异性抗原)或分离的抗原(例如，分离的细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)。
15.在某些实施方案中，该方法可以任选地进一步包括分离或富集单核树突细胞前
体；和在存在树突细胞分化剂的情况下，体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞群。合适的树突细胞分化剂包括，例如，gm csf，或gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
16.在另一方面，提供了用于产生成熟的过度活跃的树突细胞群的体外或离体方法。该方法通常包括提供未成熟的树突细胞；和在适合未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效量的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触以形成成熟的过度活跃的树突细胞群。所得成熟的过度活跃的树突细胞群产生增强的免疫应答。增强的免疫应答可以是增强的1型免疫应答。在将未成熟的树突细胞与树突细胞成熟剂(组合或未组合干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前、同时或之后，使未成熟的树突细胞在体外或离体接触预定抗原。当抗原与完全成熟后的树突细胞接触时或当抗原摄取显著减少时，可以通过已知方式(例如渗透负载)将抗原转运至树突细胞中。
17.预定抗原可以是，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(例如肿瘤相关或肿瘤特异性抗原、细菌抗原或病毒抗原)的转染或转化细胞、细胞裂解物(例如肿瘤细胞或细菌细胞裂解物)、膜制剂(例如肿瘤或细菌细胞膜制剂)、重组产生的抗原，肽抗原(即合成的肽)或分离的抗原，其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
18.在某些实施方案中，体外或离体方法可以任选地进一步包括分离或提供富集单核树突细胞前体的细胞群；和在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞。合适的树突细胞分化剂包括例如gm-csf，或gm-csf与il-4、il-13或il-15的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
19.在又一方面，提供了用于激活t细胞的组合物。该组合物可以包括树突细胞群，在适合成熟的条件下，在体外或离体用有效浓度的树突细胞成熟剂，有或没有干扰素γ(ifnγ)，和炎症激活脂质；以及预定抗原使该树突细胞群成熟。与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，该树突细胞群可以产生水平增加的il-1(特别是il-1β)，增强的免疫应答，并且优选地th1应答增加，和更优选地效应t细胞和记忆t细胞的产生增加，以及cd4
和cd8
t细胞的终末分化和激活增加。
20.在另一方面，提供了一种组合物，其包含分离的未成熟的树突细胞群。该细胞群包括未成熟的单核树突细胞和有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质以诱导未成熟的树突细胞成熟。与由成熟的树突细胞群在体外或离体仅与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)接触而不与炎症激活脂质接触诱导的相比，所得成熟的过度活跃的树突细胞群产生水平增加的il-1(特别是il-1β)，效应t细胞和记忆t细胞的产生增加，以及cd4
和cd8
t细胞的终末分化和/或增加。细胞群可以任选地包括预定抗原和/或分离的t细胞，例如幼稚t细胞。t细胞可以任选地存在于分离的淋巴细胞的制剂中。
21.还提供了用于产生激活的t细胞的体外或离体方法。该方法通常包括提供未成熟的树突细胞；使未成熟的树突细胞在体外或体内与预定抗原接触；和在适合未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞与有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有有干扰素γ)和炎症激活脂质接触以形成成熟的过度活跃的树突细胞。该成熟的过度活跃的
树突细胞可以与幼稚t细胞接触以形成激活的t细胞，产生增强的ifnγ水平和/或极化以产生1型(th-1)应答。合适的抗原包括，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(例如细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)的转化或转染细胞、细胞裂解物(例如细菌或肿瘤细胞裂解物)、膜制剂(例如细菌或肿瘤细胞膜制剂)、重组产生的抗原、肽抗原(例如合成肽抗原)或分离的抗原，其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
22.未成熟的树突细胞可以与预定抗原、树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质同时接触，或者细胞可以在与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前与预定抗原接触。树突细胞也可以在完全成熟之后与抗原接触，并且使用已知方法(例如渗透负载)增强抗原摄取。在某些实施方案中，体外或离体方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体；和在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以诱导未成熟的树突细胞的形成。合适的树突细胞分化剂包括例如gm csf，或gm-csf与il-4、il-13或il-15的组合。单核树突细胞前体可以任选地分离自人受试者。在具体实施方案中，未成熟的树突细胞和t细胞彼此是自体的或异源的。
23.还提供了产生更多il-12的分离的成熟的过度活跃的树突细胞。成熟的树突细胞可以通过以下提供：在适合未成熟的树突细胞成熟的条件下，用包含有效浓度的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质的组合物在体外或离体使未成熟的树突细胞成熟。分离的成熟的树突细胞可以任选地包括预定抗原。还提供了负载有预定抗原的分离的成熟的过度活跃的树突细胞。与在成熟过程中存在细菌、树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)而不存在炎症激活脂质的情况下培养的类似未成熟的树突细胞群相比，该树突细胞可以产生更多的白细胞介素12(il-12)和il-1β。
24.还提供了一种用于在动物中产生1型(th-1)免疫应答的方法。该方法通常包括提供未成熟的树突细胞；在适合未成熟树突成熟的体外或离体培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效量的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质以及预定抗原接触以形成成熟的过度活跃的树突细胞。成熟的过度活跃的树突细胞可以施用于动物，也可以在体外或离体与幼稚t细胞接触以形成激活的t细胞，其特征在于产生水平增加的干扰素γ(ifnγ)和/或肿瘤坏死因子α(tnfα)。激活的t细胞可以施用于需要刺激对特定抗原的细胞毒性t细胞应答的动物。
25.合适的抗原包括，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组抗原(其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关或肿瘤特异性抗原)的转化或转染细胞、细胞裂解物(其中该细胞裂解物是细菌细胞裂解物或肿瘤细胞裂解物)、膜制剂(其中该膜制剂是细菌细胞或肿瘤细胞膜制剂)，或重组产生的抗原、肽抗原(例如，合成肽抗原)或分离的抗原，其中该抗原是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。未成熟的树突细胞可以同时与预定抗原、树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触，或者可以在随后使细胞与树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触之前使未成熟的树突细胞与预定抗原接触。
26.在某些实施方案中，体外或离体方法可以进一步包括从动物分离单核树突细胞前体；和在存在树突细胞分化剂的情况下培养前体以形成未成熟的树突细胞。树突细胞分化剂可以是，例如，gm-csf，或gm-csf与il-4、il-13或il-15的组合。
27.未成熟的树突细胞和t细胞对于动物可以是自体的，或者对于动物是同种异体的。可选地，未成熟的树突细胞和t细胞可以具有与动物相同的mhc单倍型或共享mhc标志物。在某些实施方案中，动物可以是人，或可以是非人动物。
28.在另一个实施方案中，提供了一种用于产生成熟分离的过度激活的树突细胞的体外或离体方法，该成熟分离的过度激活的树突细胞可以摄取和加工抗原，并且在向个体施用之后可以诱导增强的抗肿瘤应答。该方法包括提供未激活的未成熟的树突细胞；在适合诱导未成熟的树突细胞成熟的体外或离体培养条件下，使未成熟的树突细胞与有效量的树突细胞成熟剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触；和在完全成熟之前分离成熟树突细胞。
29.在上述方法的某些实施方案中，用于该方法的炎症激活脂质可以是以下项中的一种或更多种：氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-[5-氧代戊酰基]-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc)，以及oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))。该方法可以进一步包括在完全成熟之前将分离的成熟的树突细胞制剂，随后向个体施用成熟的树突细胞。该方法还可以任选地包括在制剂和施用之前冷冻保存成熟的树突细胞和解冻成熟的树突细胞。
[0030]
在另一个实施方案中，提供了一种用于产生成熟分离的过度激活的树突细胞的体外或离体方法，该成熟分离的过度激活的树突细胞可以摄取和加工抗原，并且在向个体施用之后可以诱导增强的抗肿瘤应答。该方法包括提供未激活的未成熟的树突细胞；在适合诱导未成熟的树突细胞成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体与有效量的树突细胞成熟剂(组合或未组合干扰素γ)接触；和在完全成熟之前分离成熟树突细胞。将成熟树突细胞与炎症激活脂质一起制剂用于向个体(例如患有实体瘤的个体)施用。成熟树突细胞可以与炎症激活脂质组合在同一制剂中，也可以单独制剂。当单独制剂时，成熟树突细胞和炎症激活脂质可以同时或以任一顺序序贯施用。在某些实施方案中，可以将炎症激活脂质制剂用于局部施用，并且可以将其应用于例如皮肤或粘膜区域，经制剂的成熟树突细胞将被施用于该处。
[0031]
在上述体外或离体方法的某些实施方案中，树突细胞成熟剂是toll样受体激动剂，例如tlr3、tlr4、tlr7和/或tlr8、或tlr9的激动剂，例如细菌lps、bcg、咪唑喹啉化合物(例如咪唑喹啉-4-胺化合物，例如4-氨基-2-乙氧基甲基-α,α-二甲基-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-1-乙醇(r848)或1-(2-甲基丙基)-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺(837，咪喹莫特))及其衍生物、合成的双链多核糖核苷酸(例如poly i:c或其衍生物、poly[i]:poly[c(12)u]等)、含有已知诱导dc成熟的未甲基化的cpg基序的核酸序列等，或其任何组合。
[0032]
该方法可以使用氧化脂质作为炎症激活脂质，包括例如以下项中的一种或更多种：生物活性氧化磷脂，其可以含有多不饱和脂肪酸(pufa)的片段化产物，例如1-棕榈酰-2-氧代戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和2-溶血磷脂酰胆碱的9-酮-10-十二烷二酸酯(kodia-pc)。对通过1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)氧化形成的许多产物进
行色谱分离，鉴定出1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(povpc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5,6-环氧异丙烷e2)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(peipc)作为炎症的强脂质介质。在本公开的某些实施方案中，氧化脂质可以包括但不限于oxpapc，其是1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(povpc)的混合物，和oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))，以及rhodo lps(来自类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)的lps-rs或lps，先前已证明其可激活半胱天冬酶11依赖性炎性体)。
[0033]
用于本方法的预定抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达重组蛋白(其中该重组蛋白是细菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白)的转化或转染细胞、细菌或肿瘤细胞裂解物、细菌或肿瘤细胞膜制剂，以及重组产生的抗原、肽抗原或分离的抗原，其中该抗原、肽抗原或分离的抗原可以是细菌抗原、病毒抗原、肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在某些实施方案中，重组产生的抗原、肽抗原或分离抗原是细菌的、病毒的、肿瘤相关的或肿瘤特异性抗原、肽抗原或分离抗原。在这些实施方案中，预定抗原均不旨在作为树突细胞成熟剂。
[0034]
在任选的实施方案中，该方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体；和在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞。当与高浓度的动物蛋白(例如，牛、山羊、马、猴、猿和/或人蛋白)单独使用时，特别是当与补充有高蛋白浓度的培养基组合使用时，树突细胞分化剂可以是gm-csf，或gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
[0035]
在又一个实施方案中，本公开提供了一种用于对抗原产生增强的th1免疫应答的体外方法。该方法包括：提供未成熟的树突细胞；在适合未成熟树突成熟的培养条件下，使未成熟的树突细胞在体外或离体接触有效量的树突细胞成熟剂(例如tlr激动剂，有或没有干扰素γ(ifnγ))和预定抗原细胞以形成成熟的树突细胞群；其中成熟树突细胞在成熟过程中摄取和加工抗原；将成熟的树突细胞制剂用于向个体施用；以及将成熟的树突细胞制剂与有效量的炎症激活脂质一起施用，与施用经制剂的树突细胞组合物而未施用炎症激活脂质相比，对预定抗原产生增强的th1免疫应答。
[0036]
在该实施方案中，树突细胞成熟剂可以是toll样受体(tlr)激动剂中的一种或组合，该tlr激动剂例如tlr-3、tlr-4、tlr-7和/或tlr-8、和tlr9的激动剂，例如但不限于，细菌lps、bcg、咪唑喹啉化合物(例如，咪唑喹啉-4-胺化合物，例如4-氨基-2-乙氧基甲基-α,α-二甲基-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-1-乙醇(r848)或1-(2-甲基丙基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(r837，咪喹莫特))及其衍生物、合成的双链多核糖核苷酸(例如poly i:c；或其衍生物poly[i]:poly[c(12)u])、含有已知诱导dc成熟的未甲基化的cpg基序的核酸序列(例如odn 2216(5'-gggggacga:tcgtcgggggg-3')和odn2336(5'-gggggacgac:gtcg tggggggg-3'))等，或其任何组合。
[0037]
可用于该方法的炎症激活脂质可以是生物活性磷脂，其可以含有多不饱和脂肪酸(pufa)的片段化产物，或pufa中的一种或更多种，例如1-棕榈酰-2-氧代戊酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和2-溶血磷脂酰胆碱的9-酮-10-十二烷二酸酯(kodia-pc)。对通过1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)氧化形成的许多产物进行色谱分离，鉴定出1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5,6-环氧异丙烷e2)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(peipc)作为炎症的强脂质介质。在本公开的某些实施方案中，氧化脂质可以包括但不限于oxpapc，其是1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc)的混合物，和oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))。
[0038]
此外，预定抗原可以是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、产生重组蛋白(其中该重组蛋白是细菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤特异性蛋白或肿瘤相关蛋白)的转化或转染细胞、细菌或肿瘤细胞裂解物、细菌或肿瘤细胞膜制剂、重组产生的抗原、肽抗原或分离的抗原。该重组产生的抗原、肽抗原或分离的抗原可以是细菌的、肿瘤相关的或肿瘤特异性抗原、肽抗原或分离的抗原。
[0039]
上述用于产生增强的免疫应答的体外或离体方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体并在存在树突细胞分化剂的情况下体外或离体培养该前体以形成未成熟的树突细胞。可用于该方法的树突细胞分化剂包括，例如，gm-csf，或gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合。单核树突细胞前体可以分离自人受试者。
[0040]
在某些实施方案中，经制剂的成熟的树突细胞和炎症激活脂质同时或以任何顺序序贯施用。
[0041]
在另一个实施方案中，体外或离体方法包括使未成熟的树突细胞(dc)成熟并在不使用树突细胞成熟剂的情况下激活那些细胞。激活的dc可用于诱导抗原特异性t细胞应答。方法还可以包括添加定向成熟剂，例如干扰素γ(ifnγ)，以在获得的应答中诱导th-1和/或th-2偏向。与先前的方法不同，本公开的方法中未成熟的树突细胞的激活通过以下引发或触发：在适合树突细胞粘附至组织培养表面的条件下，使分离的未成熟的树突细胞与新的、清洁的和未使用的组织培养基质和树突细胞分化诱导剂接触。在本公开的典型方法中，在不添加成熟剂的情况下实现激活。从先前的培养基质或纯化培养基中去除未成熟的树突细胞并从先前的培养基中分离。然后对分离的未成熟的树突细胞进行计数并冷冻以供以后使用或与新鲜培养基组合，而无需在该过程的其余部分添加树突细胞成熟因子。
[0042]
在一种可选的方法中，可以在激活期间添加定向成熟剂以偏向树突细胞，从而它们可以使t细胞应答极化为th1或th-2应答。作为实例，但不作为对所公开方法的限制，使用的试剂是ifnγ，添加它以使t细胞应答偏向th-1应答。在体外或离体添加至单核树突细胞前体或未成熟dc的干扰素γ(ifnγ)本身不诱导dc分化和/或成熟。
[0043]
用于该实施方案的方法的组织培养基质可以包括组织培养孔、培养瓶、瓶子、袋子
或生物反应器中使用的任何基质，例如纤维、珠、板等。通常，组织培养基质包括塑料，例如聚苯乙烯、(聚四氟乙烯，ptfe)等。这些基质未包被蛋白或其他取代物以增加各种细胞与基底的结合。最常用于树突细胞离体培养用于免疫疗法的那些组织培养基质包括组织培养瓶、袋子或由多层塑料堆叠层组成的细胞级分等。
[0044]
完全成熟的树突细胞在质量和数量上与未成熟的dc不同。完全成熟的dc表达更高水平的mhc i类和ii类抗原，以及t细胞共刺激分子，即cd80和cd86。这些变化通常增加树突细胞激活t细胞的能力，例如，通过增加细胞表面上的抗原密度，以及通过t细胞上的共刺激分子对应物(例如，如cd28)的t细胞激活信号。此外，成熟的dc产生大量细胞因子，其刺激和指导t细胞应答。其中两种细胞因子是白细胞介素10(il-10)和白细胞介素12(il-12)。这些细胞因子对诱导的t细胞应答的方向具有相反作用。il-10产生导致诱导th-2型应答，而il-12产生导致th-1型应答。
[0045]
在一个实施方案中，通过任何上述方法产生的过度活跃的成熟的树突细胞用于产生用于治疗癌症(特别是实体瘤、细菌感染或病毒感染)的药物。药物可以是包含治疗有效量的细胞的过度活跃的成熟的树突细胞的制剂。制剂可以包含大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于10
10
个细胞、或甚至大于10
11
个细胞。组合物及其制剂的某些实施方案可以适于通过例如注射、输注、灌注或灌洗施用，并且可以更具体地包括通过一种或更多种方式施用，例如，静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴内、腹腔、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、囊内和/或皮下输注和/或推注。
[0046]
当参考以下具体实施方式时，本公开的这些和其他方面对于本领域普通技术人员将变得更加明显
具体实施方式
[0047]
本公开提供了用于诱导未成熟的树突细胞(dc)成熟和用于引发那些细胞产生增强的抗原特异性细胞毒性t细胞应答(th-1应答)的体外或离体方法。本公开还提供了可用于激活和制备极化以增强1型细胞因子(例如，ifnγ、tnfα、il-1β和/或il2)产生的t细胞群的树突细胞群。这种树突细胞群包括在体外或离体与toll样受体(tlr)激动剂(例如，细菌脂多糖，例如大肠杆菌lps、bcg、poly i:c及其毒性较小的衍生物，和/或r848或r837，有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触的未成熟单核树突细胞。任选地，dc还可以在合适的成熟条件下与预定抗原接触。未成熟的树突细胞可以在成熟的同时、之前或之后与抗原接触。在成熟后发生与预定抗原的接触或摄取抗原的能力已显著降低的情况下，可以使用已知方法(例如渗透负载)来增强抗原摄取。
[0048]
可选地，已经暴露于抗原(例如，在体内)的未成熟单核树突细胞可以在合适的成熟条件下与tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质接触。所得过度激活的成熟的树突细胞被引发以激活免疫应答，以及激活且可能将t细胞(例如，幼稚t细胞)极化为1型应答。1型应答包括产生1型细胞因子(例如，ifnγ和/或il-2)、产生更多il-12p70、细胞毒性t细胞应答、产生th-1细胞、效应t细胞和记忆t细胞增加、cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活增加，以及产生某些类型抗体。还可以增强il-1β和肿瘤坏死因子α(tnfα)的上调。相反，2型应答的特征在于产生il-4、il-5和il-10，产生比il-12p70更多的il-10，产生th-2细胞，
以及缺乏诱导ctl应答。
[0049]
在相关方面，提供了包含未成熟的树突细胞的组合物，例如cd34
造血干细胞或单核树突细胞前体的富集细胞群，其也可以引发那些树突细胞以增强1型应答。此类成熟的、引发的单核树突细胞可以增加预定抗原(即预定外源性抗原)的主要组织相容性复合体(mhc)i类呈递。抗原的mhc i类(mhc-i)呈递被期望诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)分化和刺激抗原特异性ctl介导的靶细胞裂解。此类组合物包括tlr激动剂，例如lps、bcg、poly i:c和r848，有或没有ifnγ，其可以与包含未成熟的树突细胞的细胞群混合，以使未成熟的树突细胞成熟，并在bcg的情况下，以转换或克服由未成熟的树突细胞与bcg接触诱导的il-10抑制。此外，此类组合物可以包含炎症激活脂质。与此类组合物接触的未成熟的树突细胞经历增强的成熟和激活，并且与与tlr激动剂(例如lps、bcg、poly i:c和/或r848，有或没有ifnγ)接触而未与炎症激活脂质接触的未成熟的树突细胞群相比，通常产生更大量的生物活性il-12、tnfα和/或il-1(例如il-1β)。
[0050]
在另一方面，获自受试者或供体的单核树突细胞前体可以与细胞因子(例如，单独的gm-csf与高浓度的例如动物蛋白(人血清白蛋白)，或gm-csf与例如il-4、il-7、il-13或il-15组合)以获得未成熟的树突细胞。然后可以使未成熟的树突细胞与预定抗原接触，或者与tlr激动剂组合；任选地有或没有干扰素γ；和炎症激活脂质单独，或与另外的细胞因子组合，以使树突细胞成熟并引发细胞以诱导t细胞产生增强的1型免疫应答。在某些实施方案中，刺激mhc i类抗原加工，这可用于引发针对展示预定抗原的细胞产生ctl应答。
[0051]
树突细胞是在各种淋巴和非淋巴组织中发现的多种抗原呈递细胞群。(参见liu,cell 106:259-62(2001)；steinman,ann.rev.immunol.9:271-96(1991))。树突细胞包括脾脏的淋巴树突细胞、表皮的langerhans细胞和血液循环中的隐蔽细胞。总体上，树突细胞基于其形态、高水平的表面mhc ii类表达以及在t细胞、b细胞、单核细胞和自然杀伤细胞上表达的某些其他表面标志物的缺失进行分类。特别地，单核细胞来源的树突细胞(也称为单核树突细胞)通常表达cd11a、cd80、cd86，并且是hla-dr
，而是cd14-。
[0052]
相反，单核树突细胞前体(典型的是单核细胞)通常为cd14
。单核树突细胞前体可以获自它们所在的任何组织，特别是淋巴组织，例如脾脏、骨髓、淋巴结和胸腺。单核树突细胞前体还可以从循环系统分离。外周血是单核树突细胞前体的容易获得的来源。脐带血是单核树突细胞前体的另一个来源。单核树突细胞前体可以从多种生物体富集或分离，在这些生物中可以引发免疫应答。此类生物体包括动物，例如，包括人，和非人动物，例如，灵长类动物、哺乳动物(包括犬、猫、小鼠和大鼠)、鸟类(包括鸡)，以及它们的转基因物种。
[0053]
在某些实施方案中，单核树突细胞前体和/或未成熟的树突细胞可以从健康受试者或需要免疫刺激的受试者富集或分离，例如，癌症患者或细胞免疫刺激对其有益或期望的其他受试者(即，患有细菌或病毒感染等的受试者)。树突细胞前体和/或未成熟的树突细胞还可以作为分离的或富集的细胞群从hla匹配的健康个体中获得，用于施用于需要免疫刺激的hla匹配的受试者。
[0054]
树突细胞前体和未成熟的树突细胞
[0055]
富集树突细胞前体、未成熟的树突细胞或甚至成熟的树突细胞的细胞群可以包含显著富集的细胞群，其包含大于95至98％或更多的期望细胞。而在其他实施方案中，富集的细胞群中期望的细胞仅比原始细胞群中的细胞数量增加5至10％。优选地，采用所用的方
法，富集的细胞群包含尽可能多的期望的细胞。
[0056]
从各种来源(包括血液和骨髓)获得富集树突细胞前体和未成熟的树突细胞的细胞群的方法是本领域已知的。例如，树突细胞前体和未成熟的树突细胞的富集细胞群可以通过收集肝素化血液、通过单采或白细胞分离、通过制备血沉棕黄层、玫瑰花结、离心、密度梯度离心(例如，使用ficoll(例如)、(涂有不可透析的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蔗糖等的胶体二氧化硅颗粒(直径15-30mm))、细胞的差异裂解、过滤等。在某些实施方案中，可以制备白细胞群，例如通过从受试者采集血液、去纤维蛋白以去除血小板和溶解红细胞。树突细胞前体和未成熟的树突细胞可以任选地通过例如通过梯度离心来富集单核树突细胞前体。
[0057]
树突细胞前体和未成熟的树突细胞的富集细胞群可以任选地在封闭的无菌系统中制备。如本文所用，术语“封闭的无菌系统”或“封闭系统”是指暴露于非灭菌、环境或循环空气或其他非无菌条件的系统被最小化或消除。用于分离富集树突细胞前体和未成熟的树突细胞的细胞群的封闭系统通常不包括在敞口管中的密度梯度离心、细胞的开放转移、在组织培养板或未密封的培养瓶中培养细胞等。在典型的实施方案中，封闭系统使得树突细胞前体和未成熟的树突细胞从初始收集容器无菌转移至可密封的组织培养容器而不暴露于非无菌空气。
[0058]
在某些实施方案中，通过粘附于单核细胞结合基质来分离富集单核树突细胞前体的细胞群，如wo 2003/010292中所公开的，其公开内容通过引用并入本文。例如，白细胞群(例如，通过白细胞分离术分离)可以与单核树突细胞前体粘附基质接触。当白细胞群与基底接触时，白细胞群中的单核树突细胞前体优先粘附至基质。其他白细胞(包括其他潜在的树突细胞前体)表现出与基质的结合亲和力降低，从而使得单核树突细胞前体优先富集在基质表面上。
[0059]
合适的基质包括，例如，具有大表面积与体积比的那些。此类基质可以是，例如，颗粒或纤维基质。合适的颗粒基质包括，例如，玻璃颗粒、塑料颗粒、玻璃包覆的塑料颗粒、玻璃包覆的聚苯乙烯颗粒和其他适合蛋白吸收的珠。合适的纤维基质包括微毛细管和微绒毛膜。颗粒状或纤维状基质通常使得粘附的单核树突细胞前体被洗脱，而不显著降低粘附细胞的活力。颗粒状或纤维状基质可以是基本上无孔的以促进单核树突细胞前体或树突细胞从基质洗脱。“基本上无孔的”基质包括其中存在于基质中的至少大部分孔小于细胞以最小化基质中截留细胞的基质。
[0060]
可以任选地通过添加结合培养基来增强单核树突细胞前体对基底的粘附。合适的结合培养基包括单独或与以下的任何组合补充的单核树突细胞前体培养基(例如，结合培养基包括单独或与以下的任何组合补充的单核树突细胞前体培养基(例如，rpmi 1640、dmem、xvivo等)，例如，细胞因子(例如，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，或白细胞介素13(il-13))、血浆、血清(例如，人血清，例如自体或同种异体血清)、纯化的蛋白(例如血清白蛋白)、二价阳离子(例如，钙和/或镁离子)以及有助于单核树突细胞前体特异性粘附至基质或防止非单核树突细胞前体粘附至基质的其他分子。在某些实施方案中，血浆或血清可以经热灭活。热灭活血浆对于白细胞可以是自体的或异源的。
[0061]
在单核树突细胞前体粘附至基质之后，非粘附的白细胞与单核树突细胞前体/基质复合体分离。可以使用任何合适的方法使非粘附细胞与复合体分离。例如，可以使未粘附的白细胞和复合体的混合物沉降，并且将未粘附的白细胞和培养基倾倒或排出。可选地，可
以将混合物离心，并将含有非粘附性白细胞的上清液从沉淀的复合体倾倒或排出。
[0062]
在另一个实施方案中，单核树突细胞前体的富集群可以通过切向流过滤获得。参见wo 2004/000444，其通过引用以其全文并入本文。使用这种方法，单核树突细胞前体未被激活，并且无需某些细胞因子(例如il-4)以在体外或离体培养过程中防止单核树突细胞前体分化成巨噬细胞。
[0063]
可以在体外或离体培养富集树突细胞前体的细胞群以进行分化、成熟和/或扩增。(如本文所用，分离的未成熟的树突细胞、树突细胞前体、t细胞和其他细胞是指通过人工在其天然环境之外存在的细胞，因此不是自然产物。分离的细胞可以以纯化形式、半纯化形式(例如富集的细胞群)或在非天然环境中存在。
[0064]
简言之，体外或离体分化通常涉及在存在一种或更多种分化剂的情况下培养树突细胞前体或具有树突细胞前体的细胞群。合适的分化剂可以是，例如，细胞生长因子(例如，细胞因子，例如(gm-csf)，以及gm-csf与白细胞介素4(il-4)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素13(il-13)或白细胞介素15(il-15)的组合)。在某些实施方案中，单核树突细胞前体分化形成单核细胞来源的未成熟的树突细胞。
[0065]
树突细胞前体可以在合适的体外或离体培养条件下培养和分化。合适的组织培养基包括rpmi 1640、dmem、x vivo等。组织培养基可以补充有血清、氨基酸、维生素、细胞因子(例如gm-csf或gm-csf与il-4的组合)、二价阳离子等，以促进树突细胞前体分化。在某些实施方案中，树突细胞前体可以在无血清培养基中培养。这种培养条件可以任选地排除任何动物来源产物。典型树突细胞培养基中的典型细胞因子组合为gm-csf和il-4各约500单位/ml。
[0066]
树突细胞前体在分化形成未成熟的树突细胞时在表型上与皮肤langerhans细胞相似。未成熟的树突细胞通常是cd14-和cd11c
，表达低水平的cd86和cd83，并且可以通过专门的内吞作用捕获或摄取可溶性抗原。
[0067]
未成熟的树突细胞可以成熟以形成成熟的过度活跃的树突细胞。成熟的dc失去吸收抗原的能力，并显示出共刺激细胞表面分子和各种细胞因子的表达上调。具体地，成熟的树突细胞比未成熟的树突细胞表达更高水平的mhc i类和ii类抗原，并且成熟的树突细胞通常被鉴定为cd80
、cd83
、cd86
和cd14-。更高的mhc表达导致dc表面上的抗原密度增加，而共刺激分子cd80和cd86的上调通过共刺激分子的对应物(例如t细胞上的cd28)增强t细胞激活信号。
[0068]
本发明的成熟的过度活跃的树突细胞可以通过使未成熟的树突细胞与有效量或浓度的tlr激动剂(例如，细菌脂多糖，例如lps；完整卡介苗(bcg或其衍生物)、双链rna，例如poly i:c或其较低毒性的衍生物，例如poly i:c(12)u或r848，有或没有干扰素γ)接触，随后用用炎症激活脂质激活进行制备(即，成熟的)。有效量的tlr激动剂(例如细菌bcg)通常在每毫升组织培养基约105至107cfu的范围内。有效量的ifnγ通常在每毫升组织培养基约100-1000u的范围内。卡介苗(bcg)是牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)的无毒性菌株。如本文所用，bcg是指完整bcg以及细胞壁成分、bcg衍生的脂阿拉伯甘露聚糖和与2型免疫应答的诱导相关的其他bcg组分。细菌或细菌组分(例如bcg)任选地是灭活的，例如热灭活的bcg、福尔马林处理的bcg等。
[0069]
用tlr激动剂(有或没有干扰素γ)使未成熟的树突细胞成熟并用炎症激活脂质激
活促进过度活跃的dc的形成，这些dc可以产生更高水平的il-12和/或il-1，更具体地是il-1β，和减少或抑制il-10的产生，从而引发成熟的树突细胞以诱导1型(th 1)应答。
[0070]
未成熟dc通常与有效量的tlr激动剂(有或没有干扰素γ)接触约1小时至约24小时。随后可以添加炎症激活脂质。在典型的实施方案中，在诱导成熟后约3小时添加炎症激活脂质，尽管该时间可以延长至4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时和至多24小时或更长时间。未成熟的树突细胞可以在合适的成熟培养条件下培养和成熟。合适的组织培养基包括rpmi 1640、dmem、x-vivo等。组织培养基可以补充有氨基酸、维生素、细胞因子(例如gm-csf和/或il4、il13或il15)、二价阳离子等，以促进细胞成熟。典型的细胞因子组合是gm-csf和il4各约500单位/ml。
[0071]
在用于诱导未成熟的树突细胞形成的另一种体外或离体方法中，在存在gm-csf和il-4的情况下，富集前体的细胞群中的单核树突细胞前体分化以形成未成熟的树突细胞。在该实施方案中，从组织培养系统收集未成熟的树突细胞，洗涤、计数并在新的、干净的、未包被的组织培养容器中在体外或离体与预定抗原结合。未成熟的树突细胞可以在补充有gm-csf和il-4的典型树突细胞培养基中，在用于树突细胞维持的典型条件下，在预定的可溶性或颗粒抗原存在下培养。未添加树突细胞成熟剂至培养基中，并且应该注意，任何添加的预定抗原均不被认为是树突细胞成熟剂。可以使用本领域熟知的方法确定细胞成熟，包括确定成熟的树突细胞特征性的细胞表面标志物的存在。
[0072]
可以在本领域熟悉的测定(例如流式细胞术、免疫组化等)中检测细胞表面标志物。还可以监测细胞的细胞因子产生(例如，通过elisa、facs或其他免疫测定)。在根据本发明成熟的dc群中，il12水平高于由本公开的tlr激动剂，有或没有ifnγ，诱导而未用炎症激活脂质从未成熟的树突细胞成熟的成熟的树突细胞产生的il12水平，以促进增强的1型(th-1)应答。例如，成熟的过度活跃的dc可以产生增加量的生物活性il12、il-2、tnfα和/或il1(il-1β)；显示cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活增加，以及效应t细胞和记忆t细胞增加。成熟的dc也失去通过胞饮作用摄取抗原的能力，这可以通过本领域普通技术人员熟悉的摄取测定进行分析。
[0073]
具有抗原的树突细胞前体、未成熟的树突细胞和成熟的树突细胞，无论是已引发的还是未引发的，均可以冷冻保存以备后用。用于冷冻保存的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利号5,788,963，其通过引用以其全文并入本文。
[0074]
tlr激动剂
[0075]
本公开的激活剂包括那些刺激模式识别受体(prr)依赖性细胞应答的激活剂。模式识别受体包括toll样受体(tlr)、rig 1样受体(rlr)、nod样受体(nlr)和c型凝集素受体(clrs)。prr的作用是直接或间接检测广泛类别的微生物共有的分子。这些分子通常被称为病原体相关分子模式并且包括因子，例如细菌脂多糖(lps)、细菌鞭毛蛋白或病毒双链rna。如上所述，tlr是一类模式识别受体(prr)，其可检测微生物分子，通常称为病原体相关分子模式(pamp)。tlr免疫受体在白细胞(包括树突细胞)的膜上表达，并且tlr激动剂的结合触发可导致免疫应答和抗原特异性获得性免疫的分子事件。许多tlr激动剂还是如下所述的树突细胞成熟剂。细菌脂多糖(lps)是tlr4的强激动剂，具有增强对可溶性抗原的免疫应答的能力。lps通过识别常见pamp的tlr4通路刺激免疫系统细胞。其他tlr激动剂包括合成分子，例如结合tlr3的poly i:c、结合并激活tlr 2和tlr 6通路的pam2csk4(pam2)、结合并激
磷脂酰胆碱(peipc)作为炎症的强脂质介质。在本公开的某些实施方案中，氧化脂质可以包括但不限于oxpapc，其是1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pgpc)和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(povpc)的混合物，和oxpapc种类(例如1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代-6-辛烯二酰基)sn-甘油-3-磷酸胆碱(hodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-酮-6-辛烯二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kodia-pc)、1-棕榈酰-2-(5-羟基-8-氧代辛基-6-烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(hooa-pc)、1-棕榈酰-(5-酮-8-氧代-6-辛烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(kooa-pc))，以及rhodo lps(来自类球红细菌的lps-rs或lps，先前已证明其可激活半胱天冬酶11依赖性炎性体)。
[0083]
可在诱导成熟后约3小时将炎症激活脂质添加至成熟的树突细胞中，尽管该时间可延长至约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约10小时，以及至多约24小时或更长时间。与炎症激活脂质的孵育可以是至少约5至约18小时和至多约48小时，或更长时间。通常，成熟的树突细胞与炎症激活脂质一起培养至少约5小时并且可以持续约18小时至约24小时或更长时间。脂质可以以至少1μg/ml和至多90μg/ml或更高的浓度使用。在某些实施方案中，炎症激活脂质以约1μg/ml、约3μg/ml、约10μg/ml、约25μg/ml、约30μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml或更多使用。
[0084]
抗原
[0085]
根据本发明的成熟的、过度激活的树突细胞可以将抗原呈递至t细胞。成熟的、过度激活的树突细胞可以通过在成熟之前、期间或之后在体外或离体使未成熟的树突细胞与预定抗原接触来形成。
[0086]
可选地，可以在体外或离体使已经与抗原接触的未成熟的树突细胞(例如，在体内，在分离之前)与包含tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质的组合物接触以形成被引发和过度激活以诱导增强的1型(th-1)应答的成熟的树突状细胞。
[0087]
合适的预定抗原可以包括任何t细胞激活期望的抗原。此类抗原可以包括，例如，细菌抗原、肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(例如，完整细菌或肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、从肿瘤中分离的抗原、融合蛋白、脂质体等)、病毒抗原和任何其他抗原或抗原片段，例如，包含肿瘤相关或肿瘤特异性表位的肽或多肽抗原。在某些实施方案中，抗原可以是，例如，但不限于肿瘤细胞裂解物、神经胶质瘤肿瘤抗原、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺酸性磷酸酶(pap)或前列腺特异性抗原(psa)。(参见，例如，pepsidero等人，cancer res.40:2428-32(1980)；mccormack等人，urology 45:729-44(1995))。抗原还可以是细菌细胞、细菌裂解物、肿瘤或细菌细胞或来自细胞裂解物的膜片段，或本领域已知的任何其他来源。抗原，例如肿瘤、细菌或病毒抗原，可以重组表达或产生，或甚至化学合成。重组抗原也可以在宿主细胞(例如，细菌、酵母、昆虫、脊椎动物或哺乳动物细胞)的表面上表达，可以存在于裂解物中，或者可以从裂解物中纯化。
[0088]
抗原也可以存在于来自受试者的样品中。例如，来自受试者的过度增殖或其他病况的组织样品可以用作抗原来源。例如，可以通过活组织检查或通过手术切除获得此类样品。这种抗原可以作为完整细胞、细胞裂解物、细胞膜制剂，或作为分离的抗原制剂使用。
[0089]
可选地，受试者(例如癌症患者)的细胞或已建立的细胞系(例如肿瘤细胞系)的膜制剂也可用作抗原或抗原来源。
[0090]
在示例性实施方案中，神经胶质瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤或其他肿瘤，或从手术标本中回收的其他肿瘤细胞可用作抗原来源。例如，在活检或手术切除时获得的癌症患者自身肿瘤样品可直接用于将抗原呈递至树突细胞或提供用于抗原呈递的细胞裂解物。可选地，可以使用癌症患者的肿瘤细胞的膜制剂。肿瘤细胞可以是前列腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、结肠肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、黑色素瘤细胞或任何其他类型的肿瘤细胞。可以通过本领域已知的方法从分离的肿瘤细胞制备裂解物和膜制剂。
[0091]
在另一个示例性实施方案中，可以将与单克隆抗体7e1 1-c.5特异性反应的纯化或半纯化的前列腺特异性膜抗原(psma，也称为psm抗原)用作抗原。(一般参见horoszewicz等人，prag.clin.biol.res.37:115-32(1983)，美国专利号5,162,504；美国专利号5,788,963；feng等人，proc.am.assoc.cancer res.32:(abs.1418)238(1991)；其公开内容通过引用并入本文)。在又一个示例性实施方案中，具有对应于psma的氨基酸残基4-12的氨基酸残基序列leu his glu thr asp ser ala val(seq id no:1)(称为psm p1)的抗原肽可以是用作抗原。可选地，具有对应于psma的氨基酸残基711-719的氨基酸残基序列ala leu phe asp ile glu ser lys val(seq id no:2)(称为psm-p2)的抗原肽可用作抗原。
[0092]
在具体实施方案中，具有氨基酸残基序列xaa leu(或met)xaa val(或leu)(称为psm-px)的抗原肽可以用作抗原，其中xaa代表任何氨基酸残基。该肽类似于hla a0201结合基序，即在hla-a2患者中发现的具有“锚定残基”、亮氨酸和缬氨酸的9-10个氨基酸残基的结合基序。(参见，例如，grey等人，cancer surveys 22:37-49(1995))。该肽可用作hla-a2 患者的抗原(参见central data analysis committee"allele frequencies",section 6.3,tsuji,k.等人(编辑)，tokyo university press,pp.1066-1077)。类似地，可以使用类似于其他hla结合基序的肽。
[0093]
在典型实施方案中，未成熟的树突细胞在均在tlr激动剂(有或没有干扰素γ)的情况下在体外或离体培养，并且在一段时间后在适合树突细胞成熟的条件下添加炎症激活脂质，如上所述。可以在tlr激动剂之前、一起或之后在合适的成熟条件下添加预定抗原。
[0094]
任选地，未成熟的树突细胞可以在没有gm-csf和il-4的典型树突细胞培养基中与预定抗原混合。在与抗原培养至少约10分钟至2天后，可以去除抗原，并在培养基中添加tlr激动剂(有或没有干扰素γ)。可以在适当的成熟期之后添加炎症激活脂质。例如，未成熟的树突细胞可以在添加炎症激活脂质之前成熟至少3小时。在添加炎症激活脂质之前的时间可以是4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时，和直至至少24小时。还可以添加细胞因子(例如，gm csf和il-4)至成熟培养基中。使树突细胞与抗原接触的方法在本领域中通常是已知的。(一般参见steel和nutman，j.immunol.160:351-360(1998)；tao等人，j.immunol.158:4237-4244(1997)；dozmorov和miller,cell.lmmunol.178:187-196(1997)；inaba等人，j.exp.med.166:182-194(1987)；macatonia等人，j.exp.med.169:1255-1264(1989)；de bruijn等人，eur.j immunol.22:3013-3020(1992)；其公开内容通过引用并入本文)。
[0095]
然后可以分离、洗涤和制剂所得到的呈递预定抗原的成熟、过度激活的树突细胞，以向个体施用。在任选的实施方案中，成熟的、过度激活的、抗原呈递树突细胞可以在体外或离体与t细胞例(例如幼稚t细胞)共孵育。从各种淋巴组织中获得的t细胞或t细胞亚群用
作应答细胞。此类组织包括但不限于脾脏、淋巴结和/或外周血。细胞可以作为混合的t细胞群或作为纯化的t细胞亚群与成熟的、引发的树突细胞共培养。t细胞纯化或富集可以通过阳性或阴性选择来实现，包括但不限于使用针对cd2、cd3、cd4、cd8等的抗体。
[0096]
通过在体外或离体使t细胞与成熟的抗原呈递、过度激活的树突细胞接触，提供抗原反应性或激活的极化t细胞或t淋巴细胞。如本文所用，术语“极化”是指产生高水平ifnγ或以其他方式引发用于诱导1型(th 1)应答的t细胞。此类方法通常包括使未成熟的树突细胞与细菌、细菌组分或细菌脂多糖(组合干扰素γ)和炎症激活脂质接触以制备成熟的、过度激活的抗原呈递树突细胞。在某些实施方案中，在适当条件下，未成熟的树突细胞可以在成熟的同时、之前或之后在体外或离体与预定抗原接触。
[0097]
在成熟期间，未成熟的树突细胞可以与t细胞(例如，幼稚t细胞)在体外或离体共培养，或在树突细胞成熟和过度激活后与t细胞(例如，幼稚t细胞)共培养以诱导增强的1型应答。未成熟的树突细胞或成熟的树突细胞可以在成熟前进一步富集。此外，在与树突细胞接触之前，可以从淋巴细胞群中富集t细胞。在具体实施方案中，使富集或纯化的cd4
或cd8
t细胞群与树突细胞接触。成熟的、引发的树突细胞与t细胞的共培养导致特定t细胞刺激，这些t细胞成熟为抗原反应性cd4
t细胞或抗原反应性cd8
t细胞。
[0098]
在另一方面，提供了用于体外再刺激t细胞的方法，通过在存在被引发诱导1型(th1)t细胞应答的成熟的过度活跃的树突细胞的情况下培养细胞。这种t细胞任选地可以在饲养细胞上培养。在与t细胞接触之前，可以任选地照射成熟的、引发的树突细胞。合适的培养条件可以包括一种或更多种细胞因子(例如，纯化的il-2、刀豆蛋白a刺激的脾细胞上清液或白细胞介素15(il-15))。通过添加未成熟的树突细胞、tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和炎症激活脂质以及预定抗原，体外或离体再刺激可用于促进t细胞群扩增。
[0099]
通过定期再刺激，可以在体外长期维持稳定的抗原特异性极化t细胞培养物或t细胞系。如此产生的t细胞培养物或t细胞系可以被储存，并且如果被保存(例如，通过用冷冻保存剂制剂和冷冻)，则用于以期望的间隔重新供应激活的、极化t细胞以供长期使用。
[0100]
在某些实施方案中，激活的cd8
或cd4
t细胞可以根据本公开的方法生成。通常，用于生成抗原反应性极化t细胞的成熟、引发的树突细胞对于它们将被施用的受试者是同源的(例如，获自受试者)。可选地，可以使用来自hla匹配供体的非癌细胞(例如，正常细胞)在体外制备具有与预期接受受试者相同的hla单倍型的树突细胞。在具体实施方案中，抗原反应性t细胞(包括细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和th1细胞)在体外作为免疫刺激的细胞来源进行扩增。
[0101]
细胞群的体内施用
[0102]
在本公开的另一方面，提供了用于施用上述细胞群的方法。对于需要免疫刺激的受试者，细胞群可以包括成熟的、过度激活的树突细胞或激活的、极化t细胞，或含有此类细胞的细胞群。此类细胞群可以包括成熟的、引发的树突细胞群和/或激活的、极化t细胞群。在某些实施方案中，此类方法通过以下进行：获得树突细胞前体或未成熟的树突细胞，在存在tlr激动剂(有或没有干扰素γ)、炎症激活脂质和预定抗原的情况下体外或离体分化和成熟这些细胞以形成成熟的过度激活的抗原呈递树突细胞群，其被引发诱导th1应答。在适当条件下，未成熟的树突细胞可以在成熟之前、同时或之后在体外或离体与抗原接触。此类成熟的、过度激活的抗原呈递树突细胞可以被分离并制剂用于直接施用于需要免疫刺激的
受试者。
[0103]
在相关的实施方案中，成熟的、引发的树突细胞可以在体外或离体与来自受试者的淋巴细胞接触以刺激淋巴细胞群内的t细胞。激活的极化淋巴细胞任选地随后在抗原反应性cd4
和/或cd8
t细胞的细胞培养物中进行克隆扩增，可以施用于需要免疫刺激的受试者。在某些实施方案中，激活的极化t细胞对于受试者是自体的。
[0104]
在另一个实施方案中，树突细胞、t细胞和接受受试者具有相同的mhc(hla)单倍型。确定受试者的hla单倍型的方法是本领域已知的。在相关的实施方案中，树突细胞和/或t细胞对接受受试者是同种异体的。例如，树突细胞对于具有相同mhc(hla)单倍型的t细胞和接受受试者是同种异体的。同种异体细胞通常与至少一个mhc等位基因匹配(例如，共享至少一个但不是所有mhc等位基因)。在不太典型的实施方案中，树突细胞、t细胞和接受受试者彼此均是同种异体的，但所有均具有至少一个共同的共同mhc等位基因。
[0105]
根据一个实施方案，t细胞从获得未成熟的树突细胞的同一受试者获得。在体外或离体成熟和极化后，将自体t细胞施用于受试者以激发和/或增强现有的免疫应答。例如，可以通过静脉内输注，例如，以约10
8-109个细胞/m2体表面积的剂量施用t细胞(参见，例如，ridell等人，science 257:238-241(1992)，其通过引用并入本文)。可以以期望的时间间隔重复输注，例如每月一次。可以在t细胞输注期间和之后监测接受者是否有任何不良反应的证据。
[0106]
在本公开的另一方面，未成熟的树突细胞可以通过本领域熟知的任何标准方法成熟，包括在不存在树突细胞成熟剂的情况下使未成熟的树突细胞与新的、清洁的、未使用的组织培养基质接触的方法。在成熟期间，可以使成熟树突细胞与预定抗原(例如肿瘤特异性或肿瘤相关抗原)接触。一旦成熟，可以将树突细胞制剂用于向个体施用，并且在施用时，成熟的树突细胞组合物与炎症激活脂质共同施用。
[0107]
如本文产生的过度激活的成熟的树突细胞和激活t细胞可以使用本领域技术人员熟知的方法和组合物与生理上可接受的载体、辅料、缓冲剂和/或稀释剂一起制剂。可以将树突细胞或t细胞组合物施用于需要免疫刺激的受试者。通常，将约102至约10
10
个细胞悬浮于药学上可接受的载体中。
[0108]
成熟的树突细胞和炎症激活脂质可以在统一制剂中施用或可以在单独的组合物中施用。当以单独的组合物施用时，成熟的树突细胞和炎症激活脂质可以同时施用或以任何顺序序贯施用。通常，成熟的树突细胞或成熟树突细胞直至未成熟的树突细胞与tlr激动剂，有或没有ifnγ，接触后至少3小时才与炎症激活脂质接触。在某些实施方案中，将炎症激活脂质局部施用至施用成熟的树突细胞的区域，例如通过注射。
[0109]
用本公开的组合物治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、预防性治疗和/或治疗性治疗的那些。
[0110]“有效量”是在受试者中产生期望的生理变化所必需的细胞数量。有效量通常用于研究目的。本文公开的有效量具有以下一项或多项作用：(i)诱导能够减少肿瘤或细菌细胞或病毒增殖或诱导肿瘤细菌细胞死亡或病毒破坏的th1免疫应答，以及(ii)具有抗癌或抗感染作用。
[0111]“预防性治疗”包括将本文所述的组合物施用于未表现出待治疗肿瘤的体征或症状或仅表现出待治疗肿瘤的早期体征或症状的受试者，使得所公开的组合物的施用的目的
是减少、预防或降低发生肿瘤或感染的风险。因此，预防性治疗起到针对病况的预防性治疗的作用。
[0112]“治疗性治疗”包括将本文所述的组合物施用于表现出病况的症状或体征的受试者并且施用于受试者以降低病况的严重程度或进展。
[0113]
施用于特定受试者的实际剂量和/或给予的剂量数可以由医师、兽医或研究人员在考虑参数(例如身体和生理因素，包括靶标；体重；病况类型；病况严重程度；即将发生的相关事件(如果已知)；既往或同时进行的治疗干预；受试者的特发性；和施用途径)后确定。此外，可以任选地采用体外和体内测定来帮助确定最佳剂量范围和/或剂量数。
[0114]
施用的治疗有效量可以包括大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于10
10
个细胞，甚至大于10
11
个细胞。
[0115]
如所指出的，本文公开的组合物和制剂可以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用，并且可以更具体地包括通过以下项中的一种或更多种：骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴内、腹腔、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、囊内和/或皮下输注和/或推注。
[0116]
成熟的过度活跃的树突细胞的施用
[0117]
根据另一个实施方案，树突细胞可以用树突细胞成熟剂，例如，tlr激动剂(有或没有干扰素γ)和根据本公开的炎症激活脂质诱导在体外或离体开始成熟。在该实施方案中，树突细胞在施用之前未实现完全成熟。这些树突细胞(如未成熟的树突细胞)保留了摄取和加工抗原的能力，并且如完全成熟的树突细胞，在向个体施用后可以诱导增强的抗肿瘤应答。
[0118]
完全成熟的树突细胞在质量和数量上与未成熟的dc不同。一旦完全成熟，d表达更高水平的mhc i类和ii类抗原，以及更高水平的t细胞共刺激分子，例如cd80和cd86。这些变化增加树突细胞激活t细胞的能力，例如，通过增加细胞表面上的抗原密度以及通过t细胞上的共刺激分子对应物(例如，如cd28)的t细胞激活信号。此外，成熟的dc产生大量细胞因子，其刺激和极化t细胞应答。这些细胞因子包括与th1型免疫应答相关的白细胞介素12和与th2型免疫应答相关的白细胞介素-10和白细胞介素-4。通常，炎症激活脂质将与部分成熟的树突细胞一起施用或在部分成熟的树突细胞施用之后施用。
[0119]
通常，如上公开的用于离体dc产生的方法包括从受试者获得富集dc前体细胞的细胞群，然后在体外或离体分化dc前体细胞以形成未成熟的树突细胞并诱导未成熟的树突细胞成熟为完全成熟的dc。通常，在此过程中，成熟的dc在体外或离体与预定抗原接触，以在dc成熟时摄取和加工。有人认为dc必须是终末分化的，否则它们将去分化回单核细胞/巨噬细胞并失去大部分免疫增强能力。从单核细胞生成的dc的离体成熟已经用本领域熟知的方法和试剂成功地完成并如上进一步描述。在本实施方案中，成熟的树突细胞是优选的，因为成熟的树突细胞被施用于患者并在体内摄取和处理抗原，同时在施用后完全成熟并转移至淋巴结以与幼稚t细胞接触。
[0120]
使用本领域技术人员熟知的方法和组合物，可以使用生理学上可接受的载体、辅料、缓冲剂和/或稀释剂来制剂本文产生的成熟的树突细胞。成熟的树突细胞可以直接施用于需要免疫刺激的受试者。通常，约102至约10
10
个细胞悬浮于药学上可接受的载体中。将细
胞直接注射至肿瘤中或注射至靠近、邻近或与肿瘤或肿瘤床循环或淋巴接触的区域中，以确保细胞能够接触肿瘤抗原。
[0121]
例如但不限于，可以将细胞直接施用至肿瘤中、在手术切除或切除肿瘤之后施用至肿瘤床中、在肿瘤周围施用至与肿瘤直接接触的引流淋巴结中、施用至血管中或淋巴管通向或喂养肿瘤或受肿瘤折磨的器官，例如，门静脉或肺静脉或动脉等。成熟的树突细胞的施用可以与肿瘤的其他治疗同时或之后进行，例如当作为单独的组合物施用时施用炎症激活脂质、化疗或放疗。此外，成熟的树突细胞可以与另一种药剂共同施用，该药剂充当树突细胞成熟和/或肿瘤内或肿瘤附近或邻近区域内的抗原加工的佐剂，例如炎症激活脂质。此外，还可以将树突细胞制剂成或复合成缓释基质，以植入肿瘤或肿瘤床内或周围的区域，从而使细胞缓慢释放至肿瘤或肿瘤床内，以与肿瘤抗原接触。
[0122]
成熟树突细胞可以通过适合制剂和施用方式的任何方式施用。例如，可以将细胞与药学上可接受的载体组合并用注射器、导管、插管等施用。如上所述，细胞可以在缓释基质中制剂。当以这种方式施用时，制剂可以通过适合所用基质的方式施用。适用于本公开的其他施用方法和模式是本领域技术人员熟知的。
[0123]
在另一个实施方案中，成熟树突细胞和接受受试者具有相同的mhc(hla)单倍型。确定受试者的hla单倍型的方法是本领域已知的。在相关的实施方案中，成熟树突细胞对于接受受试者是同种异体的。同种异体细胞通常与至少一个mhc等位基因匹配(例如，共享至少一个但不是所有mhc等位基因)。在不太典型的实施方案中，成熟树突细胞和接受受试者彼此均是同种异体的，但所有均具有至少一个共同的mhc等位基因。
[0124]
在一个实施方案中，通过上述方法中的任一种产生的成熟树突细胞可以作为放疗、化疗或其组合的佐剂施用。例如，成熟的过度激活的树突细胞可以在放疗、化疗或其组合之前、同时或之后施用。
[0125]
在另一个实施方案中，提供了一种用于产生增强的抗肿瘤免疫应答和/或临床应答的方法，该方法包括施用包含富集人树突细胞的细胞群的组合物，该人树突细胞已被诱导开始成熟并在体外用tlr激动剂，有或没有干扰素γ(ifnγ)，和炎症激活脂质过度激活。分离成熟的过度激活的树突细胞并与药学上可接受的载体组合；其中将组合物施用于需要这种治疗的个体的肿瘤、瘤床或肿瘤周围的组织区域。
[0126]
在另一个实施方案中，用树突细胞成熟剂(例如热灭活的bcg)与ifnγ组合诱导未成熟的树突细胞开始成熟。在完全成熟之前，成熟的树突细胞被分离并制剂用于向个体施用。制剂可以包含炎症激活脂质或炎症激活脂质可以是与包含成熟的树突细胞的组合物共同施用的单独组合物。可以在施用成熟的树突细胞之前、同时或之后施用包含炎症激活脂质的组合物。在该实施方案中，炎症激活脂质在其向个体施用之后充当成熟的树突细胞的佐剂。抗原在施用后在体内或离体被激活的成熟的树突细胞吸收并加工以呈递至个体体内的t细胞。如上所述，可以将激活的成熟的树突细胞和炎症激活脂质施用于需要此类治疗的个体的肿瘤、瘤床或肿瘤周围的组织区域。
[0127]
在又一个实施方案中，未成熟的树突细胞可以通过本领域已知的任何方法与预定抗原一起成熟。例如，可以用tlr激动剂(例如bcg)和ifnγ与肿瘤裂解物的组合使未成熟的树突细胞成熟。成熟树突细胞在成熟过程中摄取和加工肿瘤抗原，该抗原可以在施用于切除肿瘤的个体时呈递至幼稚t细胞。一旦完全成熟，目前呈递抗原的树突细胞被分离并制剂
用于向个体施用。与单独施用时制剂的成熟的树突细胞相比，制剂的成熟的树突细胞可以与激活炎症的脂质(例如oxpapc)一起施用以诱导增强的肿瘤特异性th1免疫应答。在该实施方案中，炎症激活脂质可以与成熟的树突细胞一起制剂或可以在单独的组合物中制剂。当制剂为单独的组合物时，制剂的成熟的树突细胞和炎症激活脂质可以同时或以任何顺序序贯施用。在某些实施方案中，炎症激活脂质可以作为局部组合物施用至施用制剂的成熟的树突细胞的区域或皮肤或粘膜。与单独施用时制剂的成熟的树突细胞相比，制剂的成熟的树突细胞和激活炎症的脂质的组合可以诱导增强的针对预定抗原的抗原特异性免疫应答。
[0128]
上述所有组合物，包括过度活跃的成熟的树突细胞组合物、成熟树突细胞组合物和激活的t细胞组合物等，可以与任何其他治疗肿瘤的方法组合使用，或例如，本公开的方法和组合物可以与手术切除肿瘤、化疗(细胞毒性药物、凋亡剂、抗体等)、放疗、冷冻疗法、近距离放疗、免疫疗法(施用抗原特异性成熟的激活的树突细胞、nk细胞、肿瘤抗原特异性抗体等)等。所有上述方法也可以以任何组合使用。联合治疗可以是同时的或序贯的，并且可以按照治疗医师确定的任何顺序施用。
[0129]
实施例
[0130]
提供以下实施例仅用于说明本文所述的组合物和方法的各个方面，而不应解释为以任何方式限制本公开。
[0131]
实施例1：单核树突细胞前体的分化和成熟
[0132]
在第一项研究中，通过与树突细胞分化剂接触，诱导富集人单核树突细胞前体的细胞群在体外或离体分化成未成熟的树突细胞，然后通过使前体与如上定义的树突细胞成熟剂和炎症激活脂质接触诱导其成熟。在本实施例中，树突细胞分化剂是gm-csf与2％人血清白蛋白的组合。使用gm-csf与il-4、il-7、il-13或il-15的组合，可以实现类似的结果，即单核树突细胞前体分化为未成熟的树突细胞。在树突细胞分化后，未成熟的树突细胞的富集群体被诱导成熟并被树突细胞成熟剂和树突细胞过度激活剂(炎症激活脂质)过度激活，其中树突细胞成熟剂是toll样受体的激动剂。在本具体实施例中，使用toll样受体4(tlr4)激动剂lps并且还可以包含细菌、细菌产物或lps的组分，或另一种细菌lps。树突细胞的成熟倾向于通过添加干扰素γ(ifnγ)诱导th1应答。过度激活由炎症激活脂质(例如oxpapc)诱导。
[0133]
具体地，人单核树突细胞前体的富集细胞群与含2％人血清白蛋白的gm-csf一起培养以产生富集未成熟的树突细胞的细胞群。用lps诱导富集的未成熟的树突细胞群开始成熟和激活，并且同时或在1至12小时后添加炎症激活脂质以诱导完全成熟和过度激活。成熟的树突细胞的状态可以通过确定例如il-12、tnfα和/或il-1β的产生来确定。此外，成熟的过度激活的树突细胞诱导效应和记忆t细胞产生的能力，或cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活的能力可以通过已知方法确定。
[0134]
在另一个实施方案中，单核树突细胞前体在补充有gm-csf和il-4的细胞培养基中培养以诱导分化形成未成熟的树突细胞，随后未成熟的树突细胞在tlr激动剂(例如bcg或r848)组合或未组合ifnγ的情况下培养足以使树突细胞完全成熟的时间段。通过使成熟和激活树突细胞与炎症激活脂质同时或序贯与树突细胞成熟剂/tlr激动剂接触来诱导过度激活。炎症激活脂质可以与树突细胞成熟剂同时或在成熟开始后1至20小时或更长时间添
加至培养物中。
[0135]
在一个实施方案中，在使未成熟的树突细胞与tlr激动剂(例如细菌lps、r848或本文公开的另一种树突细胞成熟)接触之前、同时或之后使预定抗原与未成熟的树突细胞接触。tlr激动剂可以与ifnγ组合使用，也可以使用ifnγ组合或不组合炎症激活脂质。更具体地，在树突细胞分化和/或成熟期间将肿瘤细胞裂解物添加至培养物中。如果在成熟后添加，可以使用已知方法(例如渗透负载)来增强抗原摄取。
[0136]
在任选的实施方案中，单核树突细胞前体仅与树突细胞成熟剂和ifnγ接触，不包括炎症激活脂质。相反，当完全成熟时，成熟的树突细胞与药学上可接受的载体一起制剂，并与炎症激活脂质一起施用。炎症激活脂质可以与成熟的树突细胞组合在单一制剂中，或单独制剂合。任选地，将炎症激活脂质制剂成单独的组合物并且在施用成熟的树突细胞之前、同时或之后施用。
[0137]
il-12、il-2、tnfα和il-1β或其他炎性细胞因子的量可以通过使用可商购获得的检测(例如elisa或多重测定)进行确定。cd4
和cd8
t细胞的终末分化以及效应t细胞和记忆t细胞的水平可以通过本领域熟知的方法确定。
[0138]
实施例2：过度活跃的树突细胞的产生和成熟
[0139]
在本实施例中，通过本领域熟知的方法获得富集未成熟的树突细胞的细胞群。未成熟的树突细胞的富集细胞群与bcg或r848，有或没有ifnγ，和oxpapc的组合一起培养12至24小时，或直到未成熟的树突细胞完全成熟。然后测定完全成熟的树突细胞的il-2、il-12p70、tnfα和/或il-1β的产生。此外，完全成熟的树突细胞诱导cd4
和cd8
t细胞终末分化和/或激活的能力以及效应t细胞和记忆t细胞的水平由本领域熟知的方法确定。
[0140]
在单独的研究中，将肿瘤细胞裂解物添加至成熟树突细胞中进行摄取和加工。培养成熟树突细胞直至它们完全成熟，然后如上所述检测成熟的过度激活的树突细胞样品。
[0141]
此外，还分离完全成熟的树突细胞并用例如pbs或新鲜培养基洗涤。然后可以将分离的过度激活的树突细胞制剂用于施用或冷冻保存以备后用。
[0142]
实施例3：从人外周血体外生成过度活跃的树突细胞
[0143]
在本实施例中，树突细胞(dc)从健康人供体的pbmc体外生成，并用toll样受体(tlr)的激动剂和炎症激活脂质诱导dc成熟和过度激活以生成过度活跃的成熟的树突细胞。本实施例中使用的炎症激活脂质是氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc)。在本实施例中检测了四种tlr激动剂，包括：细菌脂多糖(lps)(tlr4)、合成的二酰基脂肽pam2csk4(pam2；tlr2/tlr6)、合成的三酰基脂肽pam3csk4(pam3；tlr2/tlr1)和合成的双链rna类似物聚肌苷-聚胞苷酸(poly i:c)(tlr3)。用各种tlr激动剂激活dc，然后用正在检测的炎症激活脂质进行刺激，以确定导致这些细胞过度激活的原因。那些被过度激活的树突细胞有望更有效地治疗荷瘤动物和人。
[0144]
tlr是一类模式识别受体(prr)，其可检测微生物分子，通常称为病原体相关分子模式(pamp)。tlr免疫受体在白细胞(包括树突细胞)的膜上表达，并且tlr激动剂的结合触发可以导致免疫应答和抗原特异性获得性免疫的分子事件。细菌脂多糖(lps)是tlr4的强激动剂，具有增强对可溶性抗原的免疫应答的能力。lps通过识别常见pamp的tlr4通路刺激免疫系统细胞。pam2是合成的脂肽(lp)。这种脂肽模拟细菌脂蛋白，它们是强免疫调节剂，可在感染后激活早期先天宿主应答。pam2能够通过tlr2和tlr6通路诱导信号传导，也可以
depletion kit(miltenyi)富集谱系阴性祖细胞。将树突细胞前体铺板并均匀分布在6孔组织培养(tc)板的所有孔中，在孔中有以3ml/孔补充有gm-csf(10ng/ml)和il-4(10ng/ml)的rpmi 1640/10％胎牛血清(fbs)/青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺/2-巯基乙醇(2-me)。在培养的第2天，收获非贴壁细胞并重新铺板到新板中。在培养的第4天和第6天添加补充有gm-csf/il-4的另外的培养基。在第8天，收获未成熟的dc(仅悬浮和松散贴壁细胞)，并以2
×
105个细胞/孔重复三份铺板于96孔平底tc板中。用1μg/ml lps(sigma)、1μg/ml pam2(invivogen)、1μg/ml pam3(invivogen)或1μg/ml poly i:c hmw(invivogen)刺激dc 3小时。然后将以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml的滴定浓度的oxpapc(invivogen)添加至适当的样品中，并继续培养另外18小时。如果dc刺激导致激活的dc贴壁太紧而无法适当收获，则进行冷pbs孵育。
[0157]
进行流式细胞术分析以评估树突细胞表面标志物(cd11c、cd11b、cd80、cd83、cd69、cd86、cd40、mhc-i、mhc-ii、cd205)的表达，并确定活/死细胞的百分比。预期成熟的过度激活的树突细胞显示例如cd80、cd86、cd83、cd40、mhc-1和/或mhc-ii增加。
[0158]
使用luminex技术(可以同时检测单个样品中的多个靶标的免疫分析系统)，通过小鼠细胞因子和趋化因子组评估100μl培养基中的细胞因子产生，跨26种蛋白靶标(ifnγ；il12 p70；il13；il1β；il2；il4；il5；il6；tnfα；gm-csf；il18；il10；il17a；il22；il23；il27；il9；groα；ip10；mcp1；mcp3；mip1α；mip1β；mip2；rantes；和eotaxin)。预期用oxpapc和tlr激动剂进行刺激将上调至少多种炎性细胞因子，包括例如il1β、tnfα、il-2和/或il12 p70。
[0159]
讨论
[0160]
预期在本实施例中，用tlr激动剂成熟并用炎症激活脂质oxpapc过度激活的鼠源dc将产生诱导th1应答的细胞因子，最终导致上调效应t细胞(例如，cd8
细胞毒性t细胞)和记忆t细胞。
[0161]
在本实施例中，增加oxpapc的浓度导致il-12p70些许上调(在lps、pam2和pam3处理组中)。在较高的oxpapc浓度下，il-13的产生也有一些调节，特别是在lps和pam3处理组中，这也显示出il-10的一些下调。il-10下调通常导致th2应答抑制，这与il-12p70的产生增加相结合，可以表明免疫治疗的有利条件。
[0162]
实施例5：冷冻保存的富集鼠未成熟dc的体外研究
[0163]
在本实施例中，冷冻保存的c57bl/6和balb/c未成熟的dc在体外用toll样受体(tlr)激动剂和炎症激活脂质刺激以产生过度活跃的成熟的树突细胞。用四种tlr激动剂(包括细菌脂多糖(lps；tlr4)、热灭活的卡介苗(hbcg；tlr2/tlr4)、聚肌苷-聚胞苷酸(poly i:c；tlr3)和1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(r-848；tlr7/tlr8))刺激未成熟的dc。如前述实施例，包括pam 2(tlr2/tlr6)和pam3(tlr2/tlr1)未经处理且仅以最高炎症激活脂质浓度，用于跨研究比较。此外，如前述实施例，使用炎症激活脂质oxpapc，此外还包括1-棕榈酰-2-戊二酰磷脂酰胆碱(pgpc；cayman)，源自oxpapc的组分。预期用tlr激动剂激活鼠骨髓来源的未成熟的dc，然后用炎症激活脂质刺激导致这些细胞过度激活，并且这种过度激活的dc将更有效地治疗荷瘤动物和人。
[0164]
方法
[0165]
将未成熟的冷冻保存的c57bl/6和balb/c dc(cellero)于37℃下在水浴中快速解
冻，并将细胞重悬于10倍体积的rpmi 1640/10％fbs/青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺/2-me。使用完全培养基洗涤细胞两次。
[0166]
将解冻的细胞以2
×
105个细胞/孔重复三份铺板于96孔平底tc板中。用1μg/ml lps(sigma aldrich)、1:400稀释的hbcg(organon teknika/cognate)、1μg/ml r848(sigma aldrich)、1μg/ml pam2(invivogen)、1μg/ml pam3(invivogen)和25μg/ml poly i:c hmw(“高分子量”；invivogen)引发dc 3小时。将以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml滴定浓度的oxpapc(invivogen)或pgpc(cayman)添加至适当的样品中并另外培养48小时。
[0167]
如果激活的和成熟的dc在用tlr和炎症激活脂质刺激后紧密贴壁，则去除具有非贴壁细胞的上清液并将该悬浮液置于冰上。将冷pbs添加至孔中，并将板置于冰箱中30分钟以使贴壁细胞释放。用pbs收集贴壁和非贴壁细胞，并将其添加至先前收获的保存在冰上的细胞中。在流式细胞仪表型分析之前，将细胞用hbss或dpbs洗涤一次，将重复三份的孔合并用于流式细胞仪分析。
[0168]
用标记的单克隆抗体对dc进行染色，并进行流式细胞术分析以评估以下树突细胞表面标志物的表达：cd11b、cd11c、cd14、cd40、cd69、cd80、cd83、cd86、cd205、mhci、mhcii，并确定细胞是活细胞或死细胞。
[0169]
使用生产商的luminex多路复用技术，通过小鼠细胞因子和趋化因子组评估100μl培养基中的细胞因子产生，跨26种蛋白靶标(ifnγ；il12 p70；il13；il1β；il2；il4；il5；il6；tnfα；gm-csf；il18；il10；il17a；il22；il23；il27；il9；groα；ip10；mcp1；mcp3；mip1α；mip1β；mip2；rantes；和eotaxin)。xmap系统是以同时检测单个样品中的多个靶标的免疫分析系统。
[0170]
讨论
[0171]
在本实施例中，未成熟的鼠dc用tlr激动剂成熟，并用炎症激活脂质oxpapc或其组分脂质pgpc过度激活，以观察这些脂质是否如前述增强细胞因子的产生以产生th1应答。用增加浓度的oxpapc和pgpc处理的刺激的dc上调il-1β产生。il-1β的这种增加是dc过度激活的标志。
[0172]
实施例6：冷冻保存的人树突细胞前体的分化、成熟和过度激活的体外研究
[0173]
在本实施例中，使用冷冻的人pbmc在体外生成未成熟的dc的富集细胞群。获得的富集人未成熟dc的细胞群用各种toll样受体(tlr)的激动剂激活和成熟，随后用炎症激活脂质进一步激活以产生过度活跃的成熟的树突细胞。用实施例5中使用的四种tlr激动剂，即lps、热灭活的bcg、poly i:c和r848，诱导富集未成熟dc的细胞群成熟和激活。此外，如在实施例5中，用炎症激活脂质oxpapc和pgpc进一步刺激dc。
[0174]
方法
[0175]
将冷冻的人pbmc(hemacare,los angeles,ca)解冻并洗涤，然后在37℃下铺于t75 tc培养瓶(约2
×
106个细胞/ml)中至少2小时。在单核细胞贴壁至组织培养基质表面后，去除未贴壁的细胞，并用温热的完全培养基轻轻冲洗培养瓶。在补充有500u/ml重组人gm-csf和500u/ml重组人il-4的无酚红rpmi-1640/10％人热灭活ab血清中培养贴壁单核细胞7天。培养开始两天后，培养基中添加gm-csf/il-4。
[0176]
在第8天，通过收集悬浮液、贴壁细胞和非贴壁级分来收获富集未成熟的dc群，并将细胞以2
×
105个细胞/孔重复三份铺板于96孔平底tc板中。用各种tlr刺激富集的未成熟
dc：1μg/ml lps(sigma aldrich)、25g/ml poly i:c hmw(“高分子量”；invivogen)、1:400稀释的热灭活bcg(organon teknika/cognate)和1μg/ml r848(sigma aldrich)3小时。将以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml滴定浓度的炎症激活脂质oxpapc(invivogen)或pgpc(cayman)添加至适当的样品中，然后另外培养18小时。
[0177]
在用tlr和炎症激活脂质刺激后，如果激活的dc紧密贴壁于组织培养基质表面，则去除具有非贴壁细胞的上清液并将悬浮液置于冰上。向孔中加入冷pbs并将板放入冰箱中30分钟以使贴壁细胞从组织培养基质中释放。收集在pbs中收集的细胞并将其添加至先前收获的保存在冰上的细胞中。收集的细胞用hbss或dpbs洗涤一次，然后以重复三份制备孔组合，用于流式细胞仪表型和分析。
[0178]
对dc进行染色并进行流式细胞术分析以评估以下树突细胞表面标志物的表达：cd1c、cd11c、cd40、cd69、cd80、cd83、cd86、cd123、cd141、mhc-i、mhc-ii，以及活细胞和死细胞。
[0179]
如上所述，按照生产商的说明使用luminex免疫分析系统，通过小鼠细胞因子和趋化因子组评估100μl培养基中的细胞因子产生，跨34种蛋白靶标(eotaxin/ccl11；gm-csf；groα/cxcl1；ifnα；ifnγ；il1β；il1α；il1 ra；il2；il4；il5；il6；il7；il8/cxcl8；il9；il10；il12 p70；il13；il15；il17 a；il18；il21；il22；il23；il27；il31；ip10/cxcl10；mcp1/ccl2；mip1α/ccl3；mip1β/ccl4；rantes/ccl5；sdf1α/cxcl12；tnfα；tnfβ/lta)。luminex系统可以同时检测单个样品中的多个靶标。
[0180]
讨论
[0181]
人源dc用tlr激动剂成熟并用炎症激活脂质oxpapc及其组分脂质pgpc过度激活，将促进有助于诱导th1应答的细胞因子产生，从而导致效应t细胞(例如，cd8
细胞毒性t细胞)和记忆t细胞。通常与dc成熟和增强t细胞刺激的共刺激分子相关的细胞表面标志物将在这种环境中上调。il-1家族细胞因子(包括il-1β)和il-12的产生将与il-10抑制相一致，为t细胞介导的适应性免疫应答创造有利环境。
[0182]
实施例7：同基因肿瘤细胞-ct26、4t1、madison 109和a20与过度激活的树突细胞施用的体内研究
[0183]
在本实施例中，使用tlr、ifnγ(在一些情况下)和炎症激活脂质的各种组合在离体产生的负载肿瘤裂解物的成熟鼠dc以产生过度激活的dc，被施用于同系小鼠以确定何种过度活跃的dc在减缓荷瘤动物的肿瘤生长方面更有效。dc负载来自各种同系balb/c癌细胞系的肿瘤细胞裂解物，并进一步与tlr(加ifnγ)和炎症激活脂质组合，以生成过度活跃的dc，将其全身施用于雌性balb/c小鼠。使用的炎症激活脂质再次是氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(oxpapc；invivogen)和1-棕榈酰-2-戊二酰磷脂酰胆碱(pgpc；cayman)。本研究还包括1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(pov-pc；cayman)。pgpc和povpc是衍生自oxpapc的组分。
[0184]
本实施例中用于诱导富集的未成熟的树突细胞成熟的三种tlr激动剂是细菌脂多糖(lps；tlr4)、聚肌苷-聚胞苷酸(poly i:c；tlr3)和1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(r848，sigma aldrich)。r848是tlr7/tlr8的强合成激动剂，通常增加tnf-α、il-6和ifn-α的细胞因子水平。因此，在本实施例中包含的三种不同tlr中，tlr3、tlr4和tlr7/tlr8被探索为可能影响dc成功成熟和过度激活过程从而诱导
增强免疫应答的途径。
[0185]
选择四(4)种不同的同系癌小鼠模型细胞系作为本实施例的肿瘤细胞裂解物的来源。同系小鼠模型利用具有源自原株的肿瘤的免疫活性小鼠。选择具有描述生长动力学和对护理标准剂(例如抗ctla4和pd-1检查点抑制剂)应答的可用数据的免疫原性小鼠模型，因为这些模型可以提供与已批准药物进行比较的更好来源。
[0186]
为了表明本公开的方法和组合物对不同的癌症具有广泛的适用性，本实施例包括代表多种肿瘤组织型和反应特征的小鼠模型。选择以下四种小鼠模型：madison 109(肺癌)、ct26(结肠癌)、4t-1(乳腺癌)和a20(淋巴瘤)。ct26和a20型号是“应答”模型，4t-1和madison 109型号是“难治”模型。所有这些模型均来自balb/c小鼠并与其同源。
[0187]
肿瘤细胞裂解物的制备
[0188]
在对数期收获每个细胞系(ct26、madison 109、4t-1和a20)至少2
×
109个肿瘤细胞。用versene(或等同物)细胞解离溶液收集贴壁细胞，避免使用酶促细胞解离方法。用冷dpbs冲洗细胞两次以从细胞中去除血清。
[0189]
每次洗涤后，细胞以400
×
g沉淀5分钟。离心后，去除洗涤上清液并弃去。将肿瘤沉淀重悬于适当体积的不含酚红的rpmi-1640中(150至3亿个细胞/ml)并转移至微量离心管中。然后将细胞悬浮管在-80℃下冷冻超过(》)一(1)小时，然后在室温下解冻。可选地，将肿瘤颗粒在液氮中速冻，并于37℃下在干浴中快速解冻(《5分钟)。
[0190]
冻融过程再重复五(5)次，总共六(6)个冻融循环，以有效裂解肿瘤细胞。由于能够在冻融过程的冷冻步骤中使材料保持冷冻状态，因此可以选择在较长时间内(长达几天)对肿瘤细胞进行处理。如果粘稠，裂解物在冰上超声处理30秒。在台式离心机上全速离心含有解冻、裂解的细胞悬液的试管三(3)分钟。将肿瘤裂解物(上清液)合并在无菌的50ml离心管中，并取样用于使用dc蛋白测定法测定蛋白浓度。通过0.2μm过滤器调整和过滤至多2mg/ml的总蛋白。过滤后的裂解液被分装到内螺纹、标记的冷冻管中，并盖紧。使用标准比色蛋白测定法(biorad)来验证过滤的裂解物的最终蛋白浓度。每个肿瘤细胞系的肿瘤裂解物储存在-80℃待用。
[0191]
从未成熟的dc制备树突细胞作为阳性对照
[0192]
未成熟的dc与由肿瘤裂解物组成的肿瘤裂解物培养基孵育，在补充有10％fbs、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素、0.1％0.1m 2-me和10ng/ml鼠重组gm-csf的rpmi-1640中以100μg/ml稀释。dc以1.0
×
106个细胞/ml重悬至1.5
×
106个细胞/ml。然后将肿瘤细胞裂解物培养基细胞悬液置于标记以反映这些添加物的新培养瓶中，并放回培养箱中十四(14)至二十(20)小时。在这个孵育期之后，收获贴壁和非贴壁细胞。
[0193]
除去由非贴壁细胞组成的上清液，将悬浮液置于冰上。将冷pbs添加至孔中，并将板置于冰箱中30分钟以使贴壁细胞释放。随意使用细胞刮刀以去除在冷pbs处理后仍黏住的细胞。收集具有pbs的细胞并添加至先前在冰上收获的细胞中。在重悬注射之前，用rpmi(无添加剂)洗涤细胞一次。
[0194]
dc的脉冲和冷冻保存
[0195]
将本实施例中每项研究的充分冷冻保存的balb/c dc(cellero)(冷冻保存的总数和冻结的时间因批次而异)解冻并用补充有10％fbs、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素和0.1％0.1m 2me的rpmi1640洗涤两次。将10ng/ml鼠重组gm-csf新鲜添加至培养基中以产
生未成熟的dc。细胞以400
×
g沉淀4分钟。进行流式细胞仪表型分析，观察活细胞％，以及以下细胞表面标志物：cd11b、cd11c、cd14、cd40、cd69、cd80、cd83、cd205、mhc i、mhc ii。然后用含有100μg/ml肿瘤裂解物并补充有gm-csf的dc培养基以1
×
106个细胞/ml重悬剩余的细胞。然后将细胞置于t225或t125组织培养瓶中，并在37℃下培养20至24小时。
[0196]
然后将tlr激动剂和ifnγ添加至每个孔中，如果合适，如表1中指定，持续3小时，此时将适当的炎症激活脂质直接添加至培养基中，浓度为120μm。轻摇培养瓶以混合并在37℃下再培养16至20小时。通过用培养基轻轻冲洗来收获非贴壁和松散贴壁的细胞。将细胞悬液置于冰上。然后将冷dpbs添加至培养瓶中，并将任何剩余的细胞在2至8℃下孵育30分钟。用细胞刮刀轻轻刮掉贴壁在板上的细胞。收集细胞并与非贴壁级分组合。用hbss冲洗细胞两次。吸出洗涤缓冲液以去除另外的缓冲液。如前所述，再次通过流式细胞术分析细胞。剩余的细胞以每毫升5
×
106个细胞的细胞密度重悬于冷冻培养基(biolife)中。将细胞冷冻保存在具有10％dsmo(cryostor)的冷冻保存培养基中，以供以后给药。
[0197]
表1：刺激条件，肿瘤裂解物脉冲过度激活的dc的全身施用
[0198]
处理组刺激条件1dc，无处理。(阴性对照)2dcs 肿瘤裂解物(阳性对照)3dcs lps oxpapc 肿瘤裂解物4dcs lps pgpc 肿瘤裂解物5dcs lps pov-pc 肿瘤裂解物6dcs lps pgpc 肿瘤裂解物 ifnγ7dcs lps pov-pc 肿瘤裂解物 ifnγ8dcs poly i:c oxpapc 肿瘤裂解物9dcs poly i:c pgpc 肿瘤裂解物10dcs poly i:c pov-pc 肿瘤裂解物11dcs r848 oxpapc 肿瘤裂解物12dcs r848 pgpc 肿瘤裂解物13dcs r848 pov-pc 肿瘤裂解物14dcs lps 肿瘤裂解物15dcs poly i:c 肿瘤裂解物16dcs r848 肿瘤裂解物
[0199]
研究程序
[0200]
将小鼠分为四项独立的研究，每项研究涉及不同的同系小鼠模型细胞系。在研究开始时，小鼠年龄匹配(8-12周)。生长动力学和预期摄取率影响注射至小鼠体内的肿瘤细胞数量，ct26小鼠接受0.1ml的中3
×
105个细胞的注射，而其他三项研究中的小鼠(即4t-1、a20、和madison 109)接受0.1ml的中1
×
106个肿瘤细胞的注射。所有肿瘤细胞注射均皮下注射至右侧。当肿瘤达到80至120mm3的平均大小时进行配对匹配，此时开始处理。每项研究包含16组(至多)8只雌性balb/c小鼠，其中两组被指定为阳性和阴性对照。
[0201]
在第1、8和15天，将来自表1中各组的冷冻保存的刺激dc解冻并重悬于rpmi-1640(无添加剂)中，每次单独治疗性注射的目标密度为1
×
106个细胞/50μl。小鼠在左侧腋下皮内注射，与注射肿瘤细胞的腋下相对，3
×
105至1
×
106个细胞(计数不同，取决于批次产量)使激活的dc成熟，体积为0.05ml/小鼠。前5天每天记录体重，然后每周记录两次，直至研究结束。每周两次用卡尺测量肿瘤直至研究结束。肿瘤生长延迟(tgd)是研究终点，当肿瘤达到预先指定的大小(即4t-1模型中为1,000mm3，ct-26、a20和madison 109中为2,000mm3)时或研究结束45天后，以先发生者为准。
[0202]
讨论
[0203]
这些研究可以表明，用同基因肿瘤细胞裂解物脉冲并在不同刺激条件下(即tlr激动剂和/或ifnγ和/或炎症激活脂质)成熟的balb/c dc处理的balb/c小鼠组将在达到肿瘤生长延迟(tgd)的研究终点方面产生不同的结果。用tlr激动剂和炎症激活脂质刺激dc应该能够将过度激活的dc递送至注射部位，其中dc将迁移至引流淋巴结并在原位持续分泌增加水平的促炎细胞因子(例如il-1β)，避免细胞焦亡，并产生增强的t细胞介导的炎症应答。在一些情况下，t细胞应答应该足够强以延迟和/或逆转肿瘤生长并延长生命。
[0204]
实施例8：体内瘤内研究-ct26、4t-1、madison 109、a20同基因肿瘤细胞系
[0205]
在本实施例中，balb/c小鼠dc用tlr和ifn-γ的各种组合进行离体刺激，然后用炎症激活脂质激活，以产生过度激活的dc。测量肿瘤的大小以确定dc是否可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长。
[0206]
如在上述实施例7中，在本实施例中探索了相同的三种tlr激动剂(即lps、poly i:c和r848)和相同的三种炎症激活脂质(即oxpapc、pgpc和pov-pc)。在balb/c小鼠中开始源自如上文选择的相同的四(4)个同系癌细胞系小鼠细胞系的肿瘤。
[0207]
与上述实施例7相比，本实施例包括使用不同的施用方式(肿瘤内相比于全身递送)，以及dc摄取和加工抗原的位置/部位(体内与离体)。在实施例7中，用肿瘤裂解物离体脉冲dc，用tlr组合ifnγ和炎症激活脂质进一步刺激，然后全身(皮内)注射。在本实施例中，dc在离体时对肿瘤细胞是幼稚的，其中它们被tlr组合ifnγ刺激，然后被炎症激活脂质激活。收集并制剂dc用于直接原位注射至肿瘤块中，其中抗原被呈递至dc，被摄取和加工，其中dc随后迁移至引流淋巴结以将抗原呈递至幼稚t细胞以固定抗原特异性免疫应答。
[0208]
在本实施例中，所有四项肿瘤内研究均使用“新鲜”的balb/c骨髓来源细胞作为dc前体细胞的起始材料进行。所有四项研究中的细胞均由cellero制备。在细胞刺激过程结束时，dc仅冷冻保存一次，随后进行7天的dc培养，随后用tlr和炎症激活脂质进行刺激，以供各种瘤内注射。
[0209]
本例中四项研究中的三项(即使用a20、madison 109和4t-1细胞系)的治疗性肿瘤内dc疫苗接种剂量将在肿瘤达到约60至80mm3时开始。ct26瘤内施用研究的起始肿瘤体积约为80-120mm3。
[0210]
方法
[0211]
如上所述，从balb/c骨髓(cellero)分离单核细胞并培养以产生未成熟的dc。对未成熟dc的样品进行流式细胞仪表型分析，观察以下标志物组：cd11b、cd11c、cd14、cd40、cd69、cd80、cd83、cd86、cd205、mhc-i、mhc-ii。将剩余的细胞以1
×
106/ml的浓度用添加gm-csf的dc培养基重悬，然后加入t225或t125组织培养瓶中，并在37℃下孵育20至24小时。
[0212]
将等体积的2
×
tlr激动剂和ifn-γ混合物(如果适用)直接添加至补充有gm-csf的dc培养基中，并轻摇培养瓶以混合。三(3)小时后，根据表2添加120μm的炎症激活脂质(如果适用)。轻摇培养瓶以混合并在37℃下再培养16至20小时。通过用培养基轻轻冲洗收集非贴壁和松散贴壁的细胞，并将细胞悬液置于冰上。将冷dpbs添加至培养瓶中并在2-8℃下孵育30分钟。用细胞刮刀轻轻刮除贴在板上的细胞，收集细胞并与非贴壁级分合并。用hbss冲洗细胞两次。吸出洗涤缓冲液以去除另外的缓冲液。如前所述，通过流式细胞术分析细胞。剩余的细胞以每毫升5
×
106个细胞的细胞密度重悬于冷冻培养基(biolife)中。将细胞冷冻保存在含有10％dsmo(cryostor)的冷冻保存培养基中，以待用于瘤内施用研究。
[0213]
表2：刺激条件，过度激活的dc的瘤内施用
[0214]
处理组刺激条件1dcs，无处理。(阴性对照)2dcs r848 ifnγ(阳性对照)3dcs lps oxpapc4dcs lps pgpc5dcs lps pov-pc6dcs lps pgpc ifnγ7dcs lps pov-pc ifnγ8dcs poly i:c oxpapc9dcs poly i:c pgpc10dcs poly i:c pov-pc11dcs r848 oxpapc12dcs r848 pgpc13dcs r848 pov-pc14dcs lps15dcs poly i:c16dcs r848
[0215]
阳性对照的制备
[0216]
将r848(1μg/ml)和ifnγ(至1,000u/ml)添加至balb/c dc细胞悬液中3小时，然后将细胞置于tc培养瓶中并孵育16至20小时。收获贴壁和非贴壁细胞。去除具有非贴壁细胞的上清液并将悬浮液置于冰上。将冷pbs添加至孔中，并将板置于冰箱中30分钟以释放任何剩余的贴壁细胞。细胞刮刀用于仍贴在板上的细胞。然后收集含有pbs的细胞悬液，并将其添加至先前收获的已保存在冰上的细胞中。在重悬注射之前，用rpmi或hbss洗涤总收集的细胞一次。
[0217]
如上所述，在刺激后进行流式细胞术分析。
[0218]
研究程序
[0219]
将小鼠分为四项独立的研究，每项研究涉及不同的同系小鼠模型细胞系。在研究开始时，小鼠年龄匹配(8-12周)。生长动力学和预期摄取率影响注射至小鼠体内的肿瘤细胞数量，ct26小鼠接受0.1ml的中3
×
105个细胞的注射，而其他三项研究中的小鼠
(即4t-1、a20、和madison 109)接受0.1ml的中1
×
106个肿瘤细胞的注射。所有肿瘤细胞注射均皮下注射至右侧。当肿瘤达到80至120mm3的平均大小时进行配对匹配，此时开始处理。每项研究包含16组(至多)8只雌性balb/c小鼠，其中两组被指定为阳性和阴性对照。
[0220]
每组小鼠的dc在注射前解冻，并且在解冻时，表y中的每组dc在注射前以1
×
106个细胞/50μl的目标密度重悬于rpmi-1640(不含添加剂)中。在第1天、第2天、第3天和第7天小鼠接受四次每剂50ml的dc疫苗接种。根据表2中的组特异性刺激条件，用这些dc向小鼠肿瘤内注射。
[0221]
前5天每天记录体重，然后每周记录两次，直至研究结束。每周两次用卡尺测量肿瘤直至研究结束。肿瘤生长延迟(tgd)是研究终点，当肿瘤达到预先指定的大小(4t-1研究中为约1,000mm3；其他三项研究中为约2,000mm3)或研究结束后45天时，以先发生者为准。
[0222]
结果
[0223]
这些研究表明，用已在不同刺激条件下(即tlr激动剂和/或ifnγ和/或炎症激活脂质)成熟的balb/c dc处理的balb/c小鼠组将在达到肿瘤生长延迟(tgd)的研究终点方面产生不同的结果。用tlr激动剂和炎症激活脂质刺激dc将使dc过度激活，这些dc将原位获取肿瘤特异性抗原，然后迁移至引流淋巴结，将抗原特异性信息递送至t细胞。在注射后及之后，这些过度活跃的、非焦亡的dc将在原位分泌增加水平的促炎细胞因子(例如，il-1β)，比未受炎症激活脂质刺激时可能的时间更长。炎症应答可能足够强，以至于在一些情况下出现肿瘤生长延迟和/或逆转，因此小鼠的存活时间更长。
[0224]
实施例9：抗原特异性t细胞的体外或离体刺激
[0225]
在本实施例中，在tlr激动剂存在下成熟的未成熟dc与ifnγ和在肿瘤裂解物存在下的炎症激活脂质组合显示可刺激抗原特异性t细胞产生的ifnγ水平提高。
[0226]
t细胞或者从例如外周血中分离，或者可以在不分离的情况下在血液成分的细胞群中被刺激。将t细胞与未成熟的dc共培养，用tlr激动剂(例如lps、bcg、poly i:c和/或r848)和ifnγ使dc成熟，或用tlr激动剂ifnγ和炎症激活脂质(例如oxpapc)使dc成熟。在适当的时间后，可以分离激活的t细胞并使用市售的elisa测定法测定ifnγ的产生。
[0227]
结果将表明，用tlr激动剂(例如lps或bcg与ifnγ组合)刺激并用炎症激活脂质(例如oxpapc)激活的dc是抗原特异性t细胞的优异刺激物。与未成熟的dc共培养的t细胞预期产生非常少的ifnγ，而与使用bcg与ifnγ组合成熟的dc共培养的t细胞预期产生ifnγ的中间产物。与使用tlr激动剂(例如bcg与ifnγ组合)并随后用炎症激活脂质(例如oxpapc)激活的dc共培养的t细胞预期产生最高水平的ifnγ。因此，用例如bcg与ifnγ组合成熟的dc以及随后用oxpapc激活是抗原特异性t细胞的更佳刺激物。
[0228]
通过该方法产生的激活的t细胞可以在制剂用于向个体施用的t细胞之前被分离和洗涤。t细胞也可以冷冻保存以备后用，并在施用前解冻。
[0229]
实施例10：抗原呈递成熟的树突细胞的施用
[0230]
未成熟的树突细胞可以通过任何已知的方法产生。例如，未成熟的树突细胞可以在体外或离体与作为成熟剂的bcg和ifnγ接触。未成熟的dc可以通过在添加1％人血浆的培养基(gibco-brl)的存在下使外周血单核细胞与塑料接触来制备。未结合的单核细胞和其他细胞可以通过洗涤去除。结合的单核细胞可以在例如x-vivo培养基中在
每毫升500u gm csf和500u il-4的存在下培养6天以形成未成熟的树突细胞。
[0231]
随后可以培养未成熟的树突细胞并用灭活的卡介苗与ifnγ组合使其成熟足够长的时间以使树突细胞完全成熟。在成熟期间，使成熟的树突细胞与肿瘤裂解物接触，例如，来自从患者分离的神经胶质瘤的裂解物，以形成呈递激活的成熟的树突细胞的肿瘤抗原。可以将呈递肿瘤抗原的激活成熟的树突细胞配制用于在有或没有炎症激活脂质(例如oxpapc)的情况下施用。当与例如oxpapc一起制剂时，组合物可以肠胃外施用，例如，通过静脉内、肌内、皮下或瘤内全身注射至肿瘤或周围的肿瘤床中。当制剂为单独的组合物时，包含呈递肿瘤抗原的激活成熟的树突细胞的组合物和包含oxpapc的组合物可以同时或以任何顺序序贯施用。在一种方法中，oxpapc可以在施用包含呈递激活成熟的树突细胞的肿瘤抗原的组合物之前首先局部应用于注射区域。例如，可以将包含oxpapc的组合物局部施用于树突细胞组合物的注射部位周围的区域。
[0232]
实施例11：有和没有oxpapc的成熟的树突细胞的施用
[0233]
在本实施例中，成熟树突细胞可以用卡介苗、ifnγ的组合(有或没有oxpapc)诱导成熟。在完全成熟之前，通常在培养6至20小时后，分离、洗涤和制剂树突细胞以向个体施用或制备冷冻保存在dmso和人血清或血浆中以供以后施用。当冷冻保存时，将组合物迅速解冻，必要时稀释至患者施用剂量。
[0234]
当被诊断患有实体瘤时，患者接受化疗、放疗、冷冻疗法或近距离放疗治疗，随后瘤内施用成熟的树突细胞组合物。当施用的组合物是其中在oxpapc存在下诱导树突细胞成熟的组合物时，施用可以直接进入肿瘤或肿瘤周围的肿瘤床中。其中包含成熟树突细胞的组合物，其中不使用oxpapc。oxpapc可以单独制剂，也可以与成熟树突细胞一起制剂。当单独制剂以向受试者施用时，两种组合物可以在相同或不同部位同时施用，或者组合物可以以任一顺序序贯施用。在一个实施方案中，其中oxpapc和成熟的树突细胞被制剂用于单独施用，oxpapc被制剂用于局部施用并且在施用之前被施用于成熟树突细胞的施用区域。
[0235]
提供前述实施例以说明而非限制要求保护的发明的范围。本发明的其他变体对于本领域的普通技术人员来说将是显而易见的并且涵盖在所附权利要求中。本文引用的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献也通过引用以其全文并入本文。
[0236]
尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以在其中做出各种改变。
再多了解一些
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