针对移植物抗宿主病的预防或治疗用组合物的制作方法

1.本发明涉及包含细菌丛的组合物，特别是针对移植物抗宿主病(gvhd)的预防或治疗用组合物。


背景技术：

2.同种造血干细胞移植(allo-hsct)作为各种血液疾病的根治性治疗法而广泛实施，但伴随allo-hsct的急性gvhd是与复发
·
感染并列的重要的并发症之一。作为该gvhd的初始治疗(一次治疗)而使用的药剂有肾上腺皮质类固醇激素(类固醇)，但观察到效果的大约为一半(blood.2007；109(10)：4119-4126.(非专利文献1))，且不存在确立了的二次治疗。
3.已知肠内细菌、它们的代谢物在肠道的炎症抑制、免疫调整中起到重要的作用，在近年，提出了将粪便细菌丛移植法(fecal microbiota transplantation：fmt)适用于allo-hsct后的gvhd的可能性(blood.2014；124(7)：1174-1182.(非专利文献2))。此外，关于fmt，已知有日本特表2013-537531号公报(专利文献1)、日本特表2016-501852号公报(专利文献2)，日本专利第6408092号所述的发明。
4.然而，gvhd与fmt的关联性尚不明确。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特表2013-537531号公报
8.专利文献2：日本特表2016-501852号公报
9.专利文献3：日本专利第6408092号
10.非专利文献
11.非专利文献1：blood.2007；109(10)：4119-4126.
12.非专利文献2：blood.2014；124(7)：1174-1182.
13.非专利文献3：bone marrow tranplantation 1995；15，825-828.


技术实现要素：

14.本发明所要解决的技术问题
15.本发明特别以获得针对肠道急性gvhd的预防或治疗用组合物为目的。
16.解决技术问题的技术手段
17.本发明者为了解决所述问题而进行了锐意探讨的结果，通过移植包含来源于粪便的细菌丛的组合物，成功地预防或治疗gvhd，通过鉴定来源于粪便的细菌丛中包含的对gvhd的预防或治疗有效的菌，而完成了本发明。
18.即，本发明如下。
19.(1)
20.一种gvhd的预防或治疗用组合物，其包含属于选自下述属中的任一属的细菌、或
它们的组合：
21.布劳特氏菌(blautia)属、
22.梭菌(clostridium)属、
23.未分类梭菌(unclassified clostridiales)、
24.放线菌(actinomyces)属、
25.副拟杆菌(parabacteroides)属、
26.乳梭菌(lachnoclostridium)属、
27.拟杆菌(bacteroides)属、
28.栖粪杆菌(faecalibacterium)属、
29.未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、
30.罗氏菌(roseburia)属、
31.瘤胃球菌(ruminococcus)属、
32.未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、
33.多尔氏菌(dorea)属、
34.考拉杆菌(phascolarctobacterium)属、
35.萨特氏菌(sutterella)属、
36.巨单胞菌(megamonas)属、
37.柯林斯氏菌(collinsella)属、
38.优杆菌(eubacterium)属、
39.粪球菌(coprococcus)属、
40.schaalia属、
41.另枝菌(alistipes)属、
42.双歧杆菌(bifidobacterium)属、
43.乳杆菌(lactobacillus)属、
44.韦荣氏球菌(veillonella)属、
45.厌氧棒状菌(anaerostipes)属、
46.嗜胆菌(bilophila)属、
47.丁酸球菌(butyricicoccus)属、
48.巴恩斯氏菌(barnesiella)属、
49.fusicatenibacter属、
50.flavonifractor属、
51.未分类瘤胃球菌(unclassified ruminococcaceae)、
52.未分类梭菌(unclassified clostridiaceae)、
53.faecalicatena属、
54.普雷沃氏菌(prevotella)属、
55.巨球形菌(megasphaera)属、
56.robinsoniella属、
57.屎豆属菌(faecalitalea)属、
58.毛螺菌(lachnospira)属、以及
59.romboutsia属。
60.(2)
61.根据(1)所述的组合物，其包含属于选自下述属中的任一属的细菌、或它们的组合：
62.布劳特氏菌属、
63.梭菌属、
64.未分类梭菌(unclassified clostridiales)、
65.放线菌属、
66.副拟杆菌属、
67.乳梭菌属、
68.拟杆菌属、
69.栖粪杆菌属、
70.未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、
71.罗氏菌属、
72.瘤胃球菌属、
73.未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、
74.多尔氏菌属、
75.考拉杆菌属、
76.萨特氏菌属、
77.巨单胞菌属、
78.柯林斯氏菌属、
79.优杆菌属、以及
80.粪球菌属。
81.(3)
82.根据(1)所述的组合物，其包含属于选自下述属中的任一属的细菌、或它们的组合：
83.布劳特氏菌属、
84.梭菌属、
85.未分类梭菌(unclassified clostridiales)、
86.放线菌属、
87.副拟杆菌属、
88.乳梭菌属、
89.拟杆菌属、
90.未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、
91.罗氏菌属、
92.瘤胃球菌属、
93.考拉杆菌属、
94.栖粪杆菌属、
95.schaalia属、
96.另枝菌属、
97.双歧杆菌属、
98.乳杆菌属、
99.韦荣氏球菌属、
100.多尔氏菌属、
101.未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、
102.厌氧棒状菌(anaerostipes)属、
103.柯林斯氏菌属、
104.丁酸球菌属、
105.巴恩斯氏菌属、以及
106.fusicatenibacter属。
107.(4)
108.根据(3)所述的组合物，其包含属于选自下述属中的任一属的细菌、或它们的组合：
109.布劳特氏菌属、
110.梭菌属、
111.未分类梭菌(unclassified clostridiales)、
112.放线菌属、
113.副拟杆菌属、
114.乳梭菌属、以及
115.拟杆菌属。
116.(5)
117.根据(1)所述的组合物，其包含属于选自下述属中的任一属的细菌、或它们的组合：
118.栖粪杆菌属、
119.未分类梭菌(unclassified clostridiales)、
120.未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、
121.罗氏菌属、
122.瘤胃球菌属、
123.未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、
124.多尔氏菌属、
125.考拉杆菌属、
126.萨特氏菌属、
127.拟杆菌属、
128.布劳特氏菌属、
129.副拟杆菌属、
130.巨单胞菌属、
131.柯林斯氏菌属、
132.优杆菌属、
133.粪球菌属、
134.厌氧棒状菌(anaerostipes)属、
135.嗜胆菌属、
136.flavonifractor属、
137.未分类瘤胃球菌(unclassified ruminococcaceae)、
138.未分类梭菌(unclassified clostridiaceae)、
139.丁酸球菌属、
140.faecalicatena属、
141.普雷沃氏菌属、
142.梭菌属、
143.乳梭菌属、
144.另枝菌属、
145.巨球形菌属、
146.robinsoniella属、
147.fusicatenibacter属、
148.巴恩斯氏菌属、
149.屎豆属菌属、
150.毛螺菌属、以及
151.romboutsia属。
152.(6)
153.根据(5)所述的组合物，其包含属于选自下述属中的任一属的细菌、或它们的组合：
154.栖粪杆菌属、
155.未分类梭菌(unclassified clostridiales)、
156.未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、
157.罗氏菌属、
158.瘤胃球菌属、
159.未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、
160.多尔氏菌属、
161.考拉杆菌属、
162.萨特氏菌属、
163.拟杆菌属、
164.布劳特氏菌属、
165.副拟杆菌属、
166.巨单胞菌属、
167.柯林斯氏菌属、
168.优杆菌属、以及
169.粪球菌属。
170.(7)
171.一种gvhd的预防或治疗用组合物，其包含：含有下述dna的细菌、或它们的组合，所述dna包含与序列编号1～120所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的碱基序列。
172.(8)
173.根据(7)所述的组合物，其包含：含有下述dna的细菌、或它们的组合，所述dna包含与序列编号121～152所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的碱基序列。
174.(9)
175.根据(7)所述的组合物，其包含：含有下述dna的细菌、或它们的组合，所述dna包含与序列编号153～198所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的碱基序列。
176.(10)
177.根据(9)所述的组合物，其包含：含有下述dna的细菌、或它们的组合，所述dna包含与序列编号199～201所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的碱基序列。
178.(11)
179.根据(7)所述的组合物，其包含：含有下述dna的细菌、或它们的组合，所述dna包含与序列编号202～312所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的碱基序列。
180.(12)
181.根据(11)所述的组合物，其包含：含有下述dna的细菌、或它们的组合，所述dna包含与序列编号313～344所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的碱基序列。
182.(13)
183.根据(1)所述的组合物，其中，
184.细菌为选自下述细菌中的至少1种：
185.普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)、
186.粪便拟杆菌(bacteroides stercoris)、
187.单形拟杆菌(bacteroides uniformis)、
188.韦氏布劳特氏菌(blautia wexlerae)、
189.拟杆菌bacteroides sp.ar29、
190.长链多尔氏菌(dorea longicatena)、
191.phascolarctobacterium faecium、
192.马赛布劳斯特菌(blautia massiliensis)、
193.瘤胃球菌ruminococcus sp.k-1、
194.卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)、
195.普氏栖粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)、
196.单形巨单胞菌(megamonas funiformis)、
197.青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、
198.扭链瘤胃球菌([ruminococcus]torques)、
[0199]
产气柯林斯菌(collinsella aerofaciens)、
[0200]
粪副拟杆菌(parabacteroides merdae)、
[0201]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium m104/1、
[0202]
粪双歧杆菌(bifidobacterium faecale)、
[0203]
梭菌clostridium sp.826、
[0204]
粪居拟杆菌(bacteroides coprocola)、
[0205]
粪罗斯氏菌(roseburia faecis)、
[0206]
毛螺科菌lachnospiraceae bacterium djf＿vp18k1、
[0207]
梭菌clostridium sp.at4、
[0208]
罗氏乳杆菌(lactobacillus rogosae)、
[0209]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium a2-207、
[0210]
罗氏菌roseburia sp.1120、
[0211]
多氏拟杆菌(bacteroides dorei)、
[0212]
假小链双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)、
[0213]
马赛巨球形菌(megasphaera massiliensis)、
[0214]
马赛拟杆菌(bacteroides massiliensis)、
[0215]
anaerostipes hadrus、
[0216]
腐烂别样杆菌(alistipes putredinis)、
[0217]
副拟杆菌parabacteroides sp.d25、
[0218]
食葡糖罗斯拜瑞氏菌(roseburia inulinivorans)、
[0219]
嗜胆菌bilophila sp.4＿1＿30、
[0220]
普氏梭杆菌(flavonifractor plautii)、
[0221]
凸腹真杆菌(eubacterium ventriosum)、
[0222]
梭菌目细菌clostridiales bacterium 80/3、
[0223]
butyricicoccus faecihominis、
[0224]
纤维素类杆菌(bacteroides cellulosilyticus)、
[0225]
尖锐粪球菌(coprococcus catus)、
[0226]
约氏副拟杆菌(parabacteroides johnsonii)、
[0227]
毛螺科菌lachnospiraceae bacterium djf＿rp14、
[0228]
活泼瘤胃球菌([ruminococcus]gnavus)、
[0229]
长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、
[0230]
溶木聚糖拟杆菌(bacteroides xylanisolvens)、
[0231]
斯特科普雷沃菌(prevotella stercorea)、
[0232]
平常拟杆菌(bacteroides plebeius)、
[0233]
厚壁菌firmicutes bacterium djf＿vr50、
[0234]
华德萨特菌(sutterella wadsworthensis)、
[0235]
毛螺科菌lachnospiraceae bacterium 1＿1＿57faa、
[0236]
卵形布劳特氏菌(blautia obeum)、
[0237]
肠道巴恩斯氏菌(barnesiella intestinihominis)、
[0238]
挑剔真杆菌([eubacterium]eligens)、
[0239]
伴生粪球菌(coprococcus comes)、
[0240]
瘤胃球菌ruminococcus sp.djf＿vr70k1、
[0241]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium a2-175、
[0242]
柱状屎豆属菌(faecalitalea cylindroides)、
[0243]
布劳特氏菌blautia sp.yhc-4、
[0244]
解甘草皂苷梭菌([clostridium]glycyrrhizinilyticum)、
[0245]
瘤胃球菌ruminococcus sp.653、
[0246]
酸奶瘤胃球菌(ruminococcus lactaris)、
[0247]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium sm6/1、
[0248]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium ss3/4、
[0249]
梭菌科细菌clostridiaceae bacterium djf＿ls40、
[0250]
拟杆菌bacteroides sp.1＿1＿30、
[0251]
诺德式拟杆菌(bacteroides nordii)、
[0252]
食蔗糖纺锤链杆菌(fusicatenibacter saccharivorans)、
[0253]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium sl7/1、
[0254]
闪烁梭菌([clostridium]scindens)、
[0255]
狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis)、
[0256]
schaalia odontolytica、
[0257]
粪拟杆菌(bacteroides faecis)、
[0258]
脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、
[0259]
鲍氏梭菌([clostridium]bolteae)、以及
[0260]
梭菌clostridium sp.hgf2。
[0261]
(14)
[0262]
根据(13)所述的组合物，其中，
[0263]
细菌为选自下述细菌中的至少1种：
[0264]
普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)、
[0265]
粪便拟杆菌(bacteroides stercoris)、
[0266]
单形拟杆菌(bacteroides uniformis)、
[0267]
韦氏布劳特氏菌(blautia wexlerae)、
[0268]
拟杆菌bacteroides sp.ar29、
[0269]
长链多尔氏菌(dorea longicatena)、
[0270]
phascolarctobacterium faecium、
[0271]
马赛布劳斯特菌(blautia massiliensis)、
[0272]
瘤胃球菌ruminococcus sp.k-1、
[0273]
卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)、
[0274]
普氏栖粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)、
[0275]
单形巨单胞菌(megamonas funiformis)、
[0276]
青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、
[0277]
扭链瘤胃球菌([ruminococcus]torques)、
[0278]
产气柯林斯菌(collinsella aerofaciens)、
[0279]
粪副拟杆菌(parabacteroides merdae)、
[0280]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium m104/1、
[0281]
粪双歧杆菌(bifidobacterium faecale)、
[0282]
梭菌clostridium sp.826、
[0283]
粪居拟杆菌(bacteroides coprocola)、
[0284]
粪罗斯氏菌(roseburia faecis)、
[0285]
毛螺科菌lachnospiraceae bacterium djf＿vp18k1、
[0286]
梭菌clostridium sp.at4、
[0287]
罗氏乳杆菌(lactobacillus rogosae)、
[0288]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium a2-207、
[0289]
罗氏菌roseburia sp.1120、以及
[0290]
多氏拟杆菌(bacteroides dorei)。
[0291]
(15)
[0292]
根据(13)所述的组合物，其中，
[0293]
细菌为选自下述细菌中的至少1种：
[0294]
普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)、
[0295]
粪便拟杆菌(bacteroides stercoris)、
[0296]
单形拟杆菌(bacteroides uniformis)、
[0297]
韦氏布劳特氏菌(blautia wexlerae)、
[0298]
拟杆菌bacteroides sp.ar29、
[0299]
长链多尔氏菌(dorea longicatena)、
[0300]
phascolarctobacterium faecium、
[0301]
马赛布劳斯特菌(blautia massiliensis)、
[0302]
瘤胃球菌ruminococcus sp.k-1、以及
[0303]
卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)。
[0304]
(16)
[0305]
根据(1)～(15)中任一项所述的组合物，其中，
[0306]
gvhd为类固醇抵抗性或类固醇依赖性的gvhd。
[0307]
(17)
[0308]
根据(1)～(15)中任一项所述的组合物，其中，
[0309]
gvhd为肠道急性gvhd。
[0310]
(18)
[0311]
一种gvhd的预防或治疗用胶囊制剂，其包含(1)～(17)中任一项所述的组合物。
[0312]
(19)
[0313]
一种gvhd的治疗方法，其中，
[0314]
对gvhd患者施用(1)～(17)中任一项所述的组合物、或(18)所述的胶囊制剂。
[0315]
(20)
[0316]
一种gvhd预防方法，其中，
[0317]
在造血干细胞移植前、移植后或这两个时期，对造血干细胞移植对象患者施用(1)～(17)中任一项所述的组合物、或(18)所述的胶囊制剂。
[0318]
(21)
[0319]
一种粪便细菌丛移植用悬浮液的制造方法，其中，
[0320]
在从人类采集得到的粪便中，确认(1)～(15)中任一项所述的细菌的存在，将确认了所述细菌存在的粪便悬浮至水性介质中。
[0321]
(22)
[0322]
一种粪便细菌丛移植用细菌混合物的制造方法，其中，
[0323]
在从人类采集得到的粪便中，确认(1)～(15)中任一项所述的细菌的存在，从确认了所述细菌存在的粪便中分离该细菌，将分离得到的细菌混合。
[0324]
(23)
[0325]
一种粪便细菌丛移植用制剂的制造方法，其中，
[0326]
在从人类采集得到的粪便中，确认(1)～(15)中任一项所述的细菌的存在，从确认了所述细菌存在的粪便中分离该细菌，将分离得到的细菌制剂化。
[0327]
(24)
[0328]
根据(23)所述的方法，其中，
[0329]
制剂为胶囊制剂。
[0330]
(25)
[0331]
根据(21)～(24)中任一项所述的方法，其中，
[0332]
细菌的存在确认通过16s rrna基因解析进行。
[0333]
发明的效果
[0334]
通过本发明，可以预防或治疗肠道急性gvhd。
附图说明
[0335]
[图1]是表示基于香农指数(shannon index)的α多样性评价结果的图。
[0336]
[图2]是表示fmt前后的粪便细菌丛的属水平的组成比的图。
[0337]
[图3]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0338]
[图4]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0339]
[图5]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0340]
[图6]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0341]
[图7]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0342]
[图8]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0343]
[图9]是表示以属于各个属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0344]
[图10]是表示以属于棒杆菌属的细菌中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0345]
[图11]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的
图。
[0346]
[图12]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0347]
[图13]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0348]
[图14]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0349]
[图15]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0350]
[图16]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0351]
[图17]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0352]
[图18]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0353]
[图19]是表示以各菌种(species)中的16s rrna基因为指标的菌丛解析结果的图。
[0354]
本发明的具体实施方式
[0355]
本发明者想到，对肠内细菌丛的介入可能可以得到造血干细胞移植后的gvhd的新预防法和治疗法，于是尝试了对gvhd患者进行粪便细菌丛移植法(fecal microbiota transplantation：fmt)。fmt法是通过将健康人的粪便悬浮液施用至消化管内，而大量施用正常的细菌丛的治疗法，是在被认为与肠内细菌丛的平衡异常(菌群失调，dysbiosis)相关的疾病中尝试使用的治疗法。
[0356]
并且，本发明者对发病了造血干细胞移植后gvhd的患者实施了fmt前后的患者肠内菌丛解析，鉴定了对gvhd的预防和/或治疗有用的菌。解析的结果，发现了gvhd好转的患者与除此以外的患者之间，定值的菌丛分布存在明确的差异。并且，挑取gvhd好转的患者中定值的肠内菌丛作为对gvhd的治疗有用的菌，以基于受体的fmt的治疗效果的2组比较(以下cr或pr组-其他组)中的存在量的不均匀性，在受体中的定值期间的长度等独创的指标实施了分组。
[0357]
其结果，成功地鉴定出了对gvhd的预防和/或治疗有用的菌。
[0358]
1.fmt
[0359]
由于粪便细菌丛包含在粪便本身或粪便的处理物中，因此可以使用粪便的处理物作为本发明的组合物。粪便的处理物中，除了将采集得到的粪便悬浮在适当的溶剂(例如生理盐水、缓冲液)中而得的悬浮液之外，还包含将该悬浮液通过适当的筛、纱布、过滤器等(例如孔径0.1mm～0.5mm)过滤而得的过滤物、或离心分离后的沉淀物等。此外，也可以是将它们的组合物通过冰箱或液氮而冷冻、或进行冷冻干燥或喷雾干燥等而得的产物。在使用所述溶剂制成悬浮液的情况下，可以将平均1g粪便悬浮至1～20ml的液体中。在制作悬浮液后，进行离心而分离细菌并进行使用的情况下，可以以相对于其菌量1g为0.2-1ml的液量进行重悬。
[0360]
进行冷冻或冷冻干燥时，也可以添加各种糖(蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇等)、甘油、聚乙二醇(peg)、海藻糖、甘氨酸、葡萄糖、葡聚糖、赤藓糖醇等冷冻保护剂和/或冷冻干燥保护剂。
[0361]
在本发明中，采集得到的粪便或其处理物可以在粪便采集后或处理后保存6～10小时。保存温度无特别限定，优选为冷藏保存(例如4℃)。
[0362]
将如此制备的组合物作为fmt材料。制备的fmt材料优选在厌氧的条件下(例如厌氧单元、厌氧袋等)保存直至使用。在该情况下，优选保存为冷藏保存(例如4℃)。
[0363]
在本发明中，在不同的个体间，例如在人类与人类之间，或动物间，移植包含粪便细菌丛的组合物(未处理或经过处理的粪便材料)。fmt中使用的组合物可以是将其移植回与作为采集源的个体相同的个体中，也可以是将从一个个体中采集的粪便细菌丛移植至其他个体中。
[0364]
作为对象的疾病为gvhd，可以举出造血干细胞移植引起的gvhd。作为gvhd，可以举出肠道急性gvhd，但不限于此。
[0365]
移植方法可以是经口施用，也可以是非经口施用，无特别限定。例如，可以举出基于胃十二指肠管的移植、充填至胶囊等中的内服、坐剂的施用、使用大肠纤维或高压浣肠等而对大肠内进行的移植等。
[0366]
就1次移植的移植量而言，在液体的情况下为150ml～300ml，1天进行1次。根据受体的状态，在重复进行的情况下，每4天～2周总计进行2次～4次。
[0367]
如此，通过将本发明的组合物移植(施用)至gvhd患者，能够治疗gvh d。
[0368]
就治疗效果的判定而言，使用最终施用起4周后以及观察期间内的最大效果的结果，对作为完全缓解(cr)和部分缓解(pr)的合计的缓解率(cr pr)进行评价。对被判断为cr或pr的患者(组)中的菌丛与被判断为除此以外的组的患者(组)中的菌丛进行比较解析。使用供体的粪便调整液、以及患者的粪便(例如fmt前，最终的fmt起1～3天后、1、2、4周后)的一部分，实施各时间点处的肠内细菌丛的解析。
[0369]
2.cr或pr组-其他组间的菌的存在量的不均匀性
[0370]
以本发明中cr或pr组-其他组间的菌的存在量的不均匀性为指标的筛选(narrow down)的方法有以下2个。
[0371]
方法1.基于中位数(median)的筛选
[0372]
(1)在粪便采集的各时间点的cr或pr组(称为“cr或pr组”)、除此以外的组(称为“其他组”)中算出各个属或otu(operational taxonomic units)的相对丰度(relative abundance)的组内的样本的平均值，将“cr或pr组”或“其他组”中大的一方的平均值为0.1％以上的属或otu用于解析。
[0373]
(2)在各时间点处的cr或pr组、其他组中算出各个属或otu的相对丰度的组内的样本的中位数。
[0374]
(3)算出中位数的log2倍数变化(log2 fold change)(cr或pr组/其他组)。此处的log2倍数变化是指，求出cr或pr组的中位数除以其他组的中位数的比率，该比率的对数值(底2)。也有包含中位数为0的情况，因此中位数分别加0.0001后计算log2倍数变化。
[0375]
(4)log2倍数变化为0.5以上的属或otu视为在cr或pr组中较多，-0.5以下视为在其他组中较多。但是，就cr或pr组中供体与fmt前的受体的中位数的比的log2倍数变化为负
值的情况、或在供体中属于该属或者ot u的菌的保有率为0的情况而言，由于无法判断是否通过fmt而从供体进行了移植，因而除外。
[0376]
(5)对在粪便移植之后进行了粪便采集的时间点处，log2倍数变化为0.5以上或、-0.5以下的次数进行计数。
[0377]
(6)以在步骤5中，0.5以上的次数超过1的情况作为优选，次数越高，则越判定为有助于fmt的效果的菌。将计数得到的次数超过移植后的粪便采集的次数的过半数的情况，判断为越有助于fmt的效果。但是，在-0.5以下的次数超过0.5以上的次数的情况下，不判断为在cr或pr组中较多，并将之排除在外。
[0378]
方法2.基于平均值(mean)和保有率的菌的筛选
[0379]
(1)在粪便采集的各时间点处的cr或pr组(称为“cr或pr组”)、除此以外的组(称为“其他组”)中算出各个属或otu的相对丰度的组内的样本的平均值，将“cr或pr组”或“其他组”中大的一方的平均值为0.1％以上的属或otu用于解析。
[0380]
(2)在各时间点处的cr或pr组、其他组中，算出各个属或otu的相对丰度的组内的样本的平均值。并且，在各个时间点处，算出各组的属或otu的保有率(相对丰度大于0的供体或受体的比例)。
[0381]
(3)算出平均值的log2倍数变化(cr或pr组/其他组)。此处的log2倍数变化是指，将cr或pr组的平均值除以其他组的平均值而求出比率，该比率的对数值(底2)。也有包含平均值为0的情况，因此平均值分别加0.0001再计算log2倍数变化。
[0382]
(4)在粪便移植之后进行了粪便采集的时间点处，对log2倍数变化为0.5以上且cr或pr组的保有率为20％以上的次数进行计数。该次数越多，则越视为在cr或pr组中较多的属或otu。但是在(4)中，cr或pr组中供体与fmt前的受体的平均值之比的log2倍数变化为负值的情况、或供体中属于该属或otu的菌的保有率为0的情况，由于无法判断是否通过fmt而从供体进行了移植，因而除外。
[0383]
(5)在粪便移植之后进行了粪便采集的时间点处，对log2倍数变化为-0.5以下且其他组的保有率为20％以上的次数进行计数。该次数越多，则越视为在其他组中较多的属或otu。
[0384]
(6)在(4)中，以计数的次数超过1的情况为优选，次数越高，则越判定为有助于fmt的效果的菌。将计数的次数超过移植后的粪便采集的次数的过半数的情况，判断为越有助于fmt的效果。但是，在(5)的次数超过(4)的次数的情况下，不判断为在cr或pr组中较多，并将之除外。
[0385]
3.组合物的构成菌丛
[0386]
3-1.基于序列的定义
[0387]
通过方法1和2的筛选而选出的菌的16s rrna基因，例如v1-v2区域的序列是具有与序列编号1～120所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0388]
此处，“94％以上的相同性”是指，例如94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.8％以上、99.9％以上或100％相同(以下同样)。
[0389]
进一步优选为具有与序列编号121～152所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0390]
在本发明的其他方式中，通过方法1和2的筛选而选出的菌的16s rrn a基因，例如
v1-v2区域的序列是具有与序列编号1～120所示的任一碱基序列具有97％以上的相同性的dna的菌。
[0391]
进一步优选为具有与序列编号121～152所示的任一碱基序列具有97％以上的相同性的dna的菌。
[0392]
在本发明中，通过方法1(基于中位数的筛选)而被判断为优选的菌是其16s rrna基因的v1-v2区域的序列具有与序列编号153～198所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0393]
进一步优选为具有与序列编号199～201所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0394]
在本发明的另一方式中，通过方法1(基于中位数的筛选)判断为优选的菌是其16s rrna基因的v1-v2区域的序列具有与序列编号153～198所示的任一碱基序列具有97％以上的相同性的dna的菌。
[0395]
进一步优选为具有与序列编号199～201所示的任一碱基序列具有97％以上的相同性的dna的菌。
[0396]
在本发明中，通过方法2(基于平均值和保有率的筛选)而判断为优选的菌是其16s rrna基因的v1-v2区域的序列具有与序列编号202～312所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0397]
进一步优选为具有与序列编号313～344所示的任一碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0398]
在本发明的另一方式中，通过方法2(基于平均值和保有率的筛选)而判断为优选的菌是其16s rrna基因的v1-v2区域的序列具有与序列编号202～312所示的任一碱基序列具有97％以上的相同性的dna的菌。
[0399]
进一步优选为具有与序列编号313～344所示的任一碱基序列具有97％以上的相同性的dna的菌。
[0400]
3-2.基于属名的定义
[0401]
在本发明中，通过方法1(基于中位数的筛选)而判断为优选的菌是属于以下的属的菌。属于“unclassified taxonomy名”(例如未分类梭菌(unclassified clostridiales))的菌是具有与下述表1a所示的种(菌种(species))名所述的菌的16s rrna基因的碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0402]
布劳特氏菌(blautia)属
[0403]
梭菌(clostridium)属
[0404]
未分类梭菌(unclassified clostridiales)
[0405]
放线菌(actinomyces)属
[0406]
副拟杆菌(parabacteroides)属
[0407]
乳梭菌(lachnoclostridium)属
[0408]
拟杆菌(bacteroides)属
[0409]
未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)
[0410]
罗氏菌(roseburia)属
[0411]
瘤胃球菌(ruminococcus)属
[0412]
考拉杆菌(phascolarctobacterium)属
[0413]
栖粪杆菌(faecalibacterium)属
[0414]
schaalia属
[0415]
另枝菌(alistipes)属
[0416]
双歧杆菌(bifidobacterium)属
[0417]
乳杆菌(lactobacillus)属
[0418]
韦荣氏球菌(veillonella)属
[0419]
多尔氏菌(dorea)属
[0420]
未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)
[0421]
厌氧棒状菌(anaerostipes)属
[0422]
柯林斯氏菌(collinsella)属
[0423]
嗜胆菌(bilophila)属
[0424]
丁酸球菌(butyricicoccus)属
[0425]
巴恩斯氏菌(barnesiella)属
[0426]
fusicatenibacter属
[0427]
表1a
[0428][0429]
上述中，从在受体(recepient)中的定值期间的长度的观点出发，判断为更优选的菌是属于以下的属的菌。
[0430]
布劳特氏菌(blautia)属
[0431]
梭菌(clostridium)属
[0432]
未分类梭菌(unclassified clostridiales)
[0433]
放线菌(actinomyces)属
[0434]
副拟杆菌(parabacteroides)属
[0435]
乳梭菌(lachnoclostridium)属
[0436]
拟杆菌(bacteroides)属
[0437]
此外，在本发明中，通过方法2(基于平均值和保有率的筛选)判断为优选的菌是属于以下的属的菌。属于“unclassified taxonomy名”的菌是具有与表1a的种(菌种(species))名所述的菌的16s rrna基因的碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0438]
栖粪杆菌(faecalibacterium)属
[0439]
未分类梭菌(unclassified clostridiales)属
[0440]
未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)
[0441]
罗氏菌(roseburia)属
[0442]
瘤胃球菌(ruminococcus)属
[0443]
未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)属
[0444]
多尔氏菌(dorea)属
[0445]
考拉杆菌(phascolarctobacterium)属
[0446]
萨特氏菌(sutterella)属
[0447]
拟杆菌(bacteroides)属
[0448]
布劳特氏菌(blautia)属
[0449]
副拟杆菌(parabacteroides)属
[0450]
巨单胞菌(megamonas)属
[0451]
柯林斯氏菌(collinsella)属
[0452]
优杆菌(eubacterium)属
[0453]
粪球菌(coprococcus)属
[0454]
厌氧棒状菌(anaerostipes)属
[0455]
嗜胆菌(bilophila)属
[0456]
flavonifractor属
[0457]
未分类瘤胃球菌(unclassified ruminococcaceae)
[0458]
未分类梭菌(unclassified clostridiaceae)
[0459]
丁酸球菌(butyricicoccus)属
[0460]
faecalicatena属
[0461]
普雷沃氏菌(prevotella)属
[0462]
梭菌(clostridium)属
[0463]
乳梭菌(lachnoclostridium)属
[0464]
另枝菌(alistipes)属
[0465]
巨球形菌(megasphaera)属
[0466]
robinsoniella属
[0467]
fusicatenibacter属
[0468]
巴恩斯氏菌(barnesiella)属
[0469]
屎豆属菌(faecalitalea)属
[0470]
毛螺菌(lachnospira)属
[0471]
romboutsia属
[0472]
上述中，从在受体(recepient)中的定值期间的长度的观点出发，判断为更优选的菌是属于以下的属的菌。
[0473]
栖粪杆菌(faecalibacterium)属
[0474]
未分类梭菌(unclassified clostridiales)
[0475]
未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)
[0476]
罗氏菌(roseburia)属
[0477]
瘤胃球菌(ruminococcus)属
[0478]
未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)
[0479]
多尔氏菌(dorea)属
[0480]
考拉杆菌(phascolarctobacterium)属
[0481]
萨特氏菌(sutterella)属
[0482]
拟杆菌(bacteroides)属
[0483]
布劳特氏菌(blautia)属
[0484]
副拟杆菌(parabacteroides)属
[0485]
巨单胞菌(megamonas)属
[0486]
柯林斯氏菌(collinsella)属
[0487]
优杆菌(eubacterium)属
[0488]
粪球菌(coprococcus)属
[0489]
通过所述2种筛选而选出的细菌的属如下
[0490]
属于“unclassified taxonomy名”的菌是具有与表1a的种(菌种(species))名所述的菌的16s rrna基因的碱基序列具有94％以上的相同性的dna的菌。
[0491]
布劳特氏菌属、梭菌属、未分类梭菌(unclassified clostridiales)、放线菌属、副拟杆菌属、乳梭菌属、拟杆菌属、栖粪杆菌属、未分类毛螺菌(unclass ified lachnospiraceae)、罗氏菌属、瘤胃球菌属、未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、多尔氏菌属、考拉杆菌属、萨特氏菌属、巨单胞菌属、柯林斯氏菌属、优杆菌属、粪球菌属、schaalia属、另枝菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、韦荣氏球菌属、厌氧棒状菌(anaerostipes)属、嗜胆菌属、丁酸球菌属、巴恩斯氏菌属、fusicatenibacter属、flavonifractor属、未分类瘤胃球菌(unclassifie d ruminococcaceae)、未分类梭菌(unclassified clostridiaceae)、faecalicatena属、普雷沃氏菌属、巨球形菌属、robinsoniella属、屎豆属菌属、毛螺菌属、romboutsia属
[0492]
因此，本发明的组合物中包含属于选自布劳特氏菌属、梭菌属、未分类梭菌(unclassified clostridiales)、放线菌属、副拟杆菌属、乳梭菌属、拟杆菌属、栖粪杆菌属、未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、罗氏菌属、瘤胃球菌属、未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、多尔氏菌属、考拉杆菌属、萨特氏菌属、巨单胞菌属、柯林斯氏菌属、优杆菌属、粪球菌属、schaalia属、另枝菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、韦荣氏球菌属、厌氧棒状菌(anaerostipe s)属、嗜胆菌属、丁酸球菌属、巴恩斯氏菌属、fusicatenibacter属、flavonifr actor属、未分类瘤胃球菌(unclassified ruminococcaceae)、未分类梭菌(unclas sified clostridiaceae)、faecalicatena属、普雷沃氏菌属、巨球形菌属、robins oniella属、屎豆属菌属、毛螺菌属、romboutsia属中的任
一属的细菌。
[0493]
更优选本发明的组合物包含属于选自布劳特氏菌属、梭菌属、未分类梭菌(unclassified clostridiales)、放线菌属、副拟杆菌属、乳梭菌属、拟杆菌属、栖粪杆菌属、未分类毛螺菌(unclassified lachnospiraceae)、罗氏菌属、瘤胃球菌属、未分类厚壁菌(unclassified firmicutes)、多尔氏菌属、考拉杆菌属、萨特氏菌属、巨单胞菌属、柯林斯氏菌属、优杆菌属、粪球菌属中的任一属的细菌。
[0494]
3-3.基于种名的定义
[0495]
本发明中，所述方法1(基于中位数的筛选)以及方法2(基于平均值和保有率的筛选)也可以用于定义优选的菌种。就种名的定义而言，对属于“3-2.基于属名的定义”小节中定义的属名的菌种实施了筛选。
[0496]
本发明中，通过方法1(基于中位数的筛选)而被判断为优选的菌为以下的种。
[0497]
表1b
[0498]
基于中位数(median)的筛选
[0499][0500]
此外在本发明中，通过方法2(基于平均值和保有率的筛选)而判断为优选的菌为以下的种。
[0501]
表1c
[0502]
基于平均值(mean)和保有率的筛选
[0503][0504]
将通过所述两种筛选而选出的菌种(species)汇总，则如以下。
[0505]
表1d
[0506][0507]
在本发明中，菌种(species)的筛选的结果，表1d所述的76菌种(species)(称为a组)在cr或pr中较多。其中，进一步优选下述27菌种(species)(称为b组)，b组中包含的菌种(species)中，最优选下述10菌种(species)(称为c组)。
[0508]
b组(27菌种(species))：
[0509]
普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)
[0510]
粪便拟杆菌(bacteroides stercoris)
[0511]
单形拟杆菌(bacteroides uniformis)
[0512]
韦氏布劳特氏菌(blautia wexlerae)
[0513]
拟杆菌bacteroides sp.ar29
[0514]
长链多尔氏菌(dorea longicatena)
[0515]
phascolarctobacterium faecium
[0516]
马赛布劳斯特菌(blautia massiliensis)
[0517]
瘤胃球菌ruminococcus sp.k-1
[0518]
卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)
[0519]
普氏栖粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)
[0520]
单形巨单胞菌(megamonas funiformis)
[0521]
青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)
[0522]
扭链瘤胃球菌([ruminococcus]torques)
[0523]
产气柯林斯菌(collinsella aerofaciens)
[0524]
粪副拟杆菌(parabacteroides merdae)
[0525]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium m104/1
[0526]
粪双歧杆菌(bifidobacterium faecale)
[0527]
梭菌clostridium sp.826
[0528]
粪居拟杆菌(bacteroides coprocola)
[0529]
粪罗斯氏菌(roseburia faecis)
[0530]
毛螺科菌lachnospiraceae bacterium djf＿vp18k1
[0531]
梭菌clostridium sp.at4
[0532]
罗氏乳杆菌(lactobacillus rogosae)
[0533]
丁酸产生菌butyrate-producing bacterium a2-207
[0534]
罗氏菌roseburia sp.1120
[0535]
多氏拟杆菌(bacteroides dorei)
[0536]
c组：
[0537]
普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)
[0538]
粪便拟杆菌(bacteroides stercoris)
[0539]
单形拟杆菌(bacteroides uniformis)
[0540]
韦氏布劳特氏菌(blautia wexlerae)
[0541]
拟杆菌bacteroides sp.ar29
[0542]
长链多尔氏菌(dorea longicatena)
[0543]
phascolarctobacterium faecium
[0544]
马赛布劳斯特菌(blautia massiliensis)
[0545]
瘤胃球菌ruminococcus sp.k-1
[0546]
卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)
[0547]
本发明的组合物中可以包含一种属于所述列举的属的菌，也可以组合包含多种菌。在组合包含多种菌的情况下，优选为40种以下的菌，进一步优选为30种以下的菌，最优选为20种以下的菌。只要在20种以下，则例如可以选择20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2种的任意组合的菌。
[0548]
此外，本发明的组合物为了在allo-hsct中适宜使用，或能够长期使用，可以制成任意的粉末、固体或液体形态，也可以将它们的粉末、固体或液体形态制成胶囊制剂。通过制成胶囊制剂，能够避免管插入、大肠纤维等导致的出血等并发症，并且还有在实施时能够减轻患者的负担的优点。
[0549]
此外，本发明的组合物可以为活菌也可以为死菌，也可以为活菌和死菌的混合物。
[0550]
此外，本发明的组合物中还可以包含选自ph稳定剂、酸性化剂、防腐剂、维生素、矿物质、营养补充剂、益生元和益生菌中的至少1种。
[0551]
此外通过在造血干细胞移植前或后、或这两个时期，对该移植对象患者施用本发明的组合物，能够预防或治疗gvhd。
[0552]
作为gvhd，例如可以举出类固醇抵抗性或者类固醇依赖性的gvhd、或肠道急性gvhd。
[0553]
此处，就“治疗”而言，只要能够抑制gvhd的发症，就不限定抑制的程度。因此，“治疗”中包含完全缓解(cr)和部分缓解(pr)中的任一种。完全缓解(cr)是指，全部的消化管gvhd关联症状都消失，部分缓解(pr)是指，1种以上的消化管gvhd的降期(down staging)。在本发明中，将在类固醇抵抗例中在达到pr或cr的情况，或在类固醇依赖例中与治疗前相比成功实现40％以上的类固醇减量的情况视为有效(进行了治疗)。
[0554]
此外，“预防”包含事前抑制gvhd的发病、防止已经发生的gvhd的状态进一步恶化以及防止平稳化的gvhd的再发中的任一者。
[0555]
在本发明中，提供一种以对gvhd患者施用所述组合物或胶囊制剂为特征的gvhd的治疗方法。
[0556]
此外本发明还提供以在造血干细胞移植前、移植后或在这两个时期，对造血干细胞移植对象患者施用所述组合物或胶囊制剂为特征的、gvhd的预防方法。
[0557]
4.细菌混合物、制剂
[0558]
本发明提供一种粪便细菌丛移植用悬浮液的制造方法，其特征在于：在从人类采集得到的粪便中确认所述细菌的存在，将确认了所述细菌存在的粪便悬浮于溶剂(例如生理盐水、缓冲液)中。
[0559]
此外，本发明提供一种粪便细菌丛移植用悬浮液的制造方法，其特征在于：在从人类采集得到的粪便中确认所述细菌的存在，从确认了所述细菌存在的粪便中取得细菌丛，将该细菌丛悬浮于溶剂中。
[0560]
此外，本发明提供一种粪便细菌丛移植用细菌混合物的制造方法，其特征在于：在从人类采集得到的粪便中确认所述细菌的存在，从确认了所述细菌存在的粪便中分离该细菌，将分离得到的细菌混合。此处，就细菌的分离而言，样本中包含的细菌的种类可以是1种，也可以是2种以上。
[0561]
此外在本发明的另一方式中，提供一种粪便细菌丛移植用制剂的制造方法，其特征在于：在从人类采集得到的粪便中确认所述细菌的存在，将确认了所述细菌存在的粪便
的细菌丛、或从确认了所述细菌存在的粪便中分离得到的细菌制剂化。
[0562]
作为制剂化，可以举出封入胶囊的方法。
[0563]
粪便的采集可以依照所述“1.fmt”小节中记载的方法进行。
[0564]
确认细菌存在的方法无特别限定，例如可以举出16s rrna基因解析法、使用了对象细菌所特异的区域的dna序列的qpcr或microarray、或mald i-tof ms法等。
[0565]
如果通过16s rrna基因解析法等确认了细菌的存在，则为采集源的粪便中包含该细菌。将粪便的稀释悬浮液供至各种培养条件，采集单一菌落而将菌分离。
[0566]
本发明的制剂只要包含本发明的所述细菌，其剂型就无特别限定，但优选经口施用制剂。
[0567]
在制备经口用固形制剂的情况下，可以在向主药中加入赋形剂和根据需要的粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、味道气味调节剂等后，通过常法制成锭剂、包衣锭剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、胶囊剂等。
[0568]
作为胶囊剂，例如，可以使用耐酸性胶囊剂。作为耐酸性胶囊剂，可以举出dr caps(注册商标)(capsugel公司)。
[0569]
作为赋形剂，例如，可以使用乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等，作为结合剂，例如可以使用聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等，作为润滑剂，例如可以使用硬脂酸镁、滑石、二氧化硅等，作为着色剂可以使用被允许添加至医药品中的剂，作为味道气味调节剂，可以使用可可粉、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、冰片、肉桂粉等。
[0570]
在本发明中，在所述制剂中，优选为胶囊制剂。
[0571]
就制剂中包含的细菌而言，以与干燥菌体相当的量计，例如，可以为1～2000mg，优选为10～500mg，进一步优选为100～250mg，根据患者的体重、症状等可以每1天施用150～200mg，优选施用175mg。
[0572]
本发明涉及的菌可以作为医药品使用，也可以作为准药品使用。
实施例
[0573]
以下，将通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的范围不受这些实施例的限定。
[0574]
实施例1
[0575]
用于选拔优选的细菌丛的fmt
[0576]
[对象和方法]
[0577]
fmt的对象
[0578]
对类固醇抵抗性或依赖性的肠道急性gvhd病例15例实施了fmt。
[0579]
急性gvhd除了肠道以外，皮肤、肝脏也是目标脏器，但与其他脏器相比，从肠道急性gvhd的重症度更高的观点出发，此次将肠道作为对象。类固醇抵抗性是指，尽管进行了充分量(泼尼松龙为1mg/kg以上)的类固醇治疗，治疗开始第5天以后病态不变的病例，类固醇依赖例是指虽然一度对类固醇治疗起反应，但随着类固醇的减量而恶化，不得不再增量类固醇的病例(减量困难例)。
[0580]
除了所述病例之外，将类固醇治疗开始后第3天的肠道急性gvhd恶化例也作为对
象。
[0581]
即使是并发其他的肠道病变的病例，如果是肠道急性gvhd被认为是腹泻的主因的情况，则也作为可登录(entry)。
[0582]
除外基准如下。
[0583]
1)对类固醇治疗有反应的gvhd
[0584]
2)在基于类固醇的一次治疗后恶化的gvhd(该情况下不问罹患脏器)
[0585]
3)患有不可控的感染症的病例
[0586]
4)腹泻被认为是gvhd以外的原因导致的情况
[0587]
fmt的供体选择
[0588]
从患者的配偶、或4亲等以内的亲人或友人中选择供体候补
[0589]
从年龄为20-64岁，下述这样的无感染风险的人中选择。
[0590]
1)近3个月以内无进行新的纹身、打耳洞
[0591]
2)近3个月以内没有和新的伴侣进行性行为
[0592]
3)近3个月以内没有接受过输血
[0593]
4)近3个月以内没有热带地域的旅行史
[0594]
5)近1个月以内没有抗生素的使用历史
[0595]
6)无恶性疾病、炎症性肠疾病的既往史
[0596]
7)当天无腹泻等消化器症状(fmt当天进行确认)
[0597]
8)无高血压、糖尿病、高血脂、心肌梗塞、心绞痛、心脏衰竭等心脏病、中风、哮喘、过敏性皮炎、食物过敏等过敏性疾病(花粉症除外)
[0598]
上述项目都没有问题的话，则从供体候补处采血，并实施了粪便检查。在采血检查中，检测了hiv、人类嗜t淋巴球病毒一型(human t-lymphotropi c virus type i，htlv-1)、a型、b型以及c型肝炎、梅毒、巨细胞病毒(cyt omegalovirus，cmv)、eb病毒(epstein-barr virus，ebv)，在粪便检查中检测了寄生虫(parasites)、艰难梭菌(clostridium difficile)、隐孢子虫(cryptospori dium)、梨形虫(giardia)、微孢子虫(microsporidia)、痢疾内变形虫(entamoeba histolytica)、孢子虫(cyclospora)、等孢球虫(isospora)、脆双核阿米巴(dienta moeba fragilis)、人芽囊原虫(blastocystis hominis)、血吸虫(schistosoma)等病原性细菌的有无等。就cmv和ebv而言，如果患者为既感染形式的话，则判断为没有问题。
[0599]
fmt的方法
[0600]
fmt实施当天，从供体处采集粪便，在4℃、厌氧状态下保管直至使用。
[0601]
在患者插入胃十二指肠管的时开始制备粪便。粪便的制备为：首先测量粪便的重量，根据其量而添加灭菌生理盐水200-300ml，充分搅拌至均匀。将其用金筛进行一次过滤，除去大的未消化物。然后，以灭菌纱布过滤2次制作悬浮液。在患者的准备完成后实施fmt。
[0602]
将悬浮液充填至50ml的注射器中，通过胃十二指肠管施用粪便悬浮液。施用速度为每50ml不超过30秒的速度。在悬浮液全部注入结束后，以生理盐水50ml清洗管内，拔去管，结束了施用。
[0603]
如果观察不到与fmt关联的等级3(grade 3)(基于非专利文献3的定义)以上的副作用，则一边观察效果一边在第1次的fmt起的4-14天间实施了1次追加施用。在该情况下，
从与初次相同的供体处采集粪便。粪便移植在供体的粪便采集起12小时以内实施，尽可能在8小时以内实施。
[0604]
就由于肠道gvhd，而处于禁食的患者而言，从fmt开始前一天起摄入包含食物纤维
·
寡糖等的补充剂(gfo(注册商标)：大塚制药工业)作为益生元。此外，抗生素的施用在fmt的前后24小时内尽可能中止。
[0605]
在fmt后一周以内新发生的、或观察到等级1(grade 1)(根据非专利文献3的定义)以上的恶化的例子都认定为副作用，以national cancer institute co mmon terminology criteria for adverse events(ctc-ae)version 4.0进行评价。
[0606]
就治疗效果而言，从最终fmt起4周后进行了评价。治疗效果的判定基准如下。
[0607]
1)完全缓解(cr)：全部的消化管gvhd关联症状都消失
[0608]
2)部分缓解(pr)：1种以上的消化管gvhd的降期(down staging)
[0609]
3)进行(pg)：1种以上的阶段(stage)(基于非专利文献3的定义)的恶化
[0610]
4)无变化(nc)：阶段(stage)(基于非专利文献3的定义)内的变动
[0611]
5)未确定(not determined，nd)：治疗后早期(7天以内)的死亡、由于gvhd以外的症状而难以评价的情况
[0612]
就fmt而言，将在类固醇抵抗例中达到了pr或cr的情况，在类固醇依赖例中与治疗前相比成功实现了40％以上的减量的情况判断为有效。
[0613]
肠内细菌丛的解析(meta 16s解析法)
[0614]
使用制作的粪便调整液、以及患者的粪便(fmt前；最终的fmt起1～3天后；1、2、4周后)的一部分，实施了肠内细菌丛的解析。
[0615]
通过常法从各样本中提取细菌的dna。使用以覆盖16s rrna基因的可变区域、v1-v2的方式而设计的引物(27fmod：5
’‑
agrgtttgatymtggctcag-3’(序列编号345)、338r：5
’‑
tgctgcctcccgtaggagt-3’(序列编号346))，将其通过pcr(polymerase chain reaction)扩增后，以illumina公司miseq(注册商标)用250bp的paired end实施了测序。将得到的序列的read1和read2合并后进行质量检验，将通过检验的序列数据3000条用于解析。将得到的阅读数据以同一序列的丰度(abundance)降序排序，如果丰度(abundance)相同则根据质量(quality)的平均值降序排序。对于排序后的序列，使用uclust算法以97％的相同性为阈值实施了操作分类单元聚类(operational taxonomic units(otus)clusterin g)。此外，对于16s rrna基因数据库(refseq，rdp，grd，core)，通过使用glsearch进行相同性检索而实施了菌种的鉴定。属的鉴定中的相同性的阈值设为94％。菌种(species)的鉴定中的相同性的阈值设为97％。
[0616]
此外关于α多样性评价，使用了香农指数(shannon index)。需要说明的是，本解析中的分类(taxonomy)名依照截止2019年5月7天的ncbi分类数据库(taxonomy database)的ftp网站的taxdmp.zip的内容。
[0617]
肠内细菌丛的组间比较
[0618]
对于cr或pr组和其他组，使用“方法1.基于中位数的筛选”以及“方法2.基于平均值和保有率的菌的筛选”的小节中所述的2种方法，实施了在cr或pr组中较多的肠内细菌的提取。
[0619]
[结果和考察]
[0620]
在使用了最终施用起4周后的结果的治疗效果判定中，15例中6例被判定为cr，3例被判定为pr，缓解率为60％的结果。因此，通过本实施例，确认到了fmt作为gvhd的治疗
·
预防战略的有效性。
[0621]
fmt前后的粪便细菌丛的多样性随时间推移的变化如图1所示。cr或pr组、其他组都在fmt后观察到了α多样性的改善。fmt后4周内，α多样性缓缓降低，但cr或pr组与其他组相比，其降低受到抑制。
[0622]
表示fmt前后的粪便细菌丛的属水平的组成比的图表如图2所示。fmt前菌丛的多样性降低(disbiosis)，葡萄球菌(staphylococcus)、肠球菌(enteroco ccus)等处于优势的状态。fmt后菌丛的多样性恢复，变化成了包含拟杆菌(bacteroides)、双岐杆菌(bifidobacterium)等各种菌的菌丛。在其他组中，还观察到了在4周后埃希氏菌属(escherichia)变为优势的情况。此外各属的随时间推移的变化如图3～9所示。就图3～9所示的属而言，在与其他组的对比中，都确认到了在cr或pr组更多地存在。此外，确认到了图10所示的棒状杆菌(corynebacterium)属在全部的时间点中，都在其他组中更多地存在。
[0623]
通过2组的比较，将“方法1.基于中位数的筛选”以及“方法2.基于平均值和保有率的菌的筛选”的小节中所述的2个方法的结果中的otu水平分别记载于表2、表3。属(genus)水平记载于表4、表5。表中对log2倍数变化为0.5以上的次数在1次以上的菌进行了记载。
[0624]
[表2]
[0625]
[0626]
[0627]
[0628]
[0629][0630]
[表5-1]
[0631][0632]
[表5-2]
[0633][0634]
[表5-3]
[0635][0636]
此外，在fmt前后的粪便细菌丛的菌种(species)中，所述b组中的随时间推移的变化示于图11～19。确认了与其他组对比，图11～19所示的菌种(sp ecies)都在cr或pr组中
较多地存在。
[0637]
序列编号345：合成dna
[0638]
序列编号346：合成dna。