花青素在制备保护BMSCs生物学稳定性药物中的应用

花青素在制备保护bmscs生物学稳定性药物中的应用
技术领域
1.本发明属于化学药物技术领域，具体涉及花青素在制备保护bmscs生物学稳定性药物中的应用。


背景技术：

2.花青素（花青素mucronulatol，花青素）是天然黄酮类化合物，存在沙棘等植物中。
3.bmscs是来源于骨髓基质的一种多能成体细胞。近年来，在组织工程、细胞和基因治疗等乃至生命科学领域应用广泛，已经受到越来越多研究者的关注。因为其快速增殖、易于体外分离、易于导入外源基因、低免疫原性、向多种成熟细胞分化、自我更新能力等潜能。但目前也有大量研究结果表明，bmscs受理化因素诱导也具有促瘤或致瘤性。
4.bmscs在受到外界刺激下，遗传稳定性也会受到影响，如bmscs在与肺癌细胞a549共培养的环境下，以及在氯化镉的干预下，bmscs自身的遗传稳定性会发生改变，如染色体畸变率增加，微核数增多等，同时形态上伴有类肿瘤样细胞转化的表现。故bmscs可因肿瘤细胞类型、微环境、理化致癌因素的不同对肿瘤发挥抑制或促进的作用。这种安全性的问题为bmscs临床治疗的推广产生重要影响。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供花青素在制备保护bmscs生物学稳定性药物中的新应用，对验证花青素保护bmscs生物学稳定性提供了重要理论依据，具有广阔的应用前景。
6.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：本发明提供花青素在制备保护bmscs生物学稳定性药物中的应用。
7.为了进一步实现本发明，本发明提供了通过筛选得到的花青素的制药作用浓度；本发明还提供了花青素在制备保护bmscs形态药物中的应用；本发明还提供了花青素在制备抑制bmscs增殖药物中的应用；本发明还提供了花青素在制备抑制bmscs凋亡药物中的应用。
8.本发明还提供了花青素在制备维护bmscs在炎性微环境下成骨分化潜能药物中的应用。
9.本发明相较于现有技术的有益效果为：1、花青素及其制备的药物对tnf-α微环境中bmscs形态具有保护作用，与模型组相比可显著缩短胞体的长度；2、花青素及其制备的药物在诱导干预后，可有效降低tnf-α微环境中细胞微核数量，较模型组相比，花青素组微丝排列较整齐，由此可见，花青素及其制备的药物能够有效保护bmscs形态；3、花青素及其制备的药物对tnf-α微环境中bmscs增殖、凋亡均具有显著的抑制作用；4、花青素及其制备的药物能够维护bmscs在炎性微环境中的成骨分化潜能，由此
可见花青素及其制备的药物能够维持定向分化功能。
10.花青素及其制备的药物在体外可以通过改善细胞形态（维持细胞形态，骨架以及减低微核数量）、抑制细胞增殖和凋亡、维护细胞的成骨分化能力等途径，发挥维护tnf-α模拟炎性环境中的bmscs生物学特性稳定的作用。
11.通过本发明的发现和验证，挖掘了花青素的新功能，并对使用其制备药物的浓度进行了筛选，为进一步用药和制备药物提供了重要理论依据，具有广阔的应用前景。
附图说明
12.图1示不同浓度花青素对bmscs增殖的影响；图2示不同浓度花青素对a549增殖的影响；图3示诱导干预21天后各组bmscs的形态变化（40
×
）：a：空白bmscs组；b：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组；c：40
µ
mol/l花青素干预组；图4示诱导干预21天后各组bmscs的形态（20
×
）：a：空白bmscs组；b：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组；c：40
µ
mol/l花青素干预组；图5示诱导干预21天后各组bmscs的形态（40
×
）：a：空白bmscs组；b：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组；c：40
µ
mol/l花青素干预组；图6示诱导干预21天后各组bmscs微核率的变化（20
×
）：a：空白bmscs组；b：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组；c：40
µ
mol/l花青素干预组；图7示诱导干预21天后各组骨架变化：a：空白bmscs组；b：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组；c：40
µ
mol/l花青素干预组；图8示诱导干预21天后各组bmscs的总凋亡的变化：a：空白bmscs组；b：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组；c：40
µ
mol/l花青素干预组；图9示成骨诱导14d后bmscs茜素红染色结果：a：bmscs组；b：tnf-α组；c：7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷 tnf-α组；d：花青素 tnf-α组；图10示各组细胞成骨诱导14d后细胞计数和矿化结节面积；图11示各组细胞干预42天后runx2蛋白表达情况；图12示各组细胞干预42天后akt1蛋白表达情况；图13示各组细胞干预42天后runx2、osterixmrna的表达情况；图14示各组细胞干预42天后akt1mrna的表达情况。
具体实施方式
13.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
14.运用tnf-α干预bmscs并观察其生物学特性的变化，基于以下几种生物学实验方法对花青素在bmscs的生物学稳定性方面具有保护作用进行验证。
15.1、材料：1.1 实验材料与主要试剂：1.1.1 细胞株：人肺癌a549细胞株、人骨髓间充质干bmscs细胞株。
16.1.1.2 药物和试剂：
（1）花青素（花青素mucronulatol，花青素）（cfn99741）（纯度》98％）购自购自武汉中标科技有限公司，用dmso溶解，过滤除菌，于-20℃冰箱避光保存备用，实验前稀释至所需浓度；（2）0.25%胰蛋白酶（25200-056），gibco公司，-20℃冰箱保存；（3）青链霉素混合液（p1400），solarbio公司，4℃冰箱保存；（4）fbs（fb15011），clark公司，-20℃冰箱保存；（5）rpmi 1640，hyclone公司，4℃冰箱保存；（6）bmsc专用培养基，7501（sciencell）培养基（7）tnf-α（041525a0818），pepro tech公司，-20℃冰箱保存；（8）细胞增殖与活性检测试剂盒（kr675），dojindo公司，4℃冰箱保存；（9）annexin v-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒（ba00101），bioss公司，4℃冰箱保存；（10）细胞松弛素b（14930-96-2），solarbio公司，4℃冰箱保存；（11）吖啶橙染料（a8120），solarbio公司，4℃冰箱保存；（12）he染色试剂盒（g1120），solarbio公司，4℃冰箱保存；2、细胞复苏、培养、传代及冻存：2.1 细胞复苏：-80℃冰箱取冻存的bmscs和a549细胞，放入37℃的水浴锅中迅速摇晃，用1ml的移液器缓慢的将细胞冻存液移入到提前准备好的25cm2（含3ml的完全培养基）的细胞培养瓶中，标记名称，放入co2培养箱中进行培养4h，即细胞贴壁后，用pbs洗1次，加入4ml完全培养基后放入培养箱中继续培养。
17.2.2 细胞培养：镜下观测当漂浮的细胞或细胞碎片较多时，用pbs洗1遍，在换用新鲜的细胞培养基4ml，骨髓间充质干细胞每三天换液一次，a549细胞每两天换液一次。
18.2.3 细胞传代：显微镜下观察，bmscs和a549细胞的融合度达到90%时，对细胞进行传代。弃掉培养瓶中的细胞上清液，25cm2的培养瓶每次用2ml的pbs洗1次，用1ml的0.25%的胰酶消化细胞，用移液器吸取1ml的细胞悬液到新的细胞培养瓶（含3ml的细胞完全培养基），消毒后放入co2培养箱中继续培养。
19.2.4 细胞冻存：用pbs冲洗细胞1次，胰酶消化1min后加入细胞冻存液（a549细胞：dmem/f12:dmso=9:1；骨髓间充质干细胞：bmscs专用培养基：血清：dmso=6:3:1）2ml，吸取1ml加入到冻存管中，标记，于-80℃冰箱冻存。
20.实验例1、花青素的作用浓度筛选：1、实验设计：利用cck8法检测花青素对bmscs及a549增殖的影响。将花青素浓度和观察时间分别设为0μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20
µ
mol/l、40μmol/l和80μmol/l及24h、48h、72h、96h及120h五个时间段。
21.2、实验方法和结果分析：
2.1 cck8法检测不同浓度花青素对bmscs增殖的影响：取第3代处于对数生长期的bmscs，胰酶消化后制成单细胞悬液，用细胞计数仪进行计数并调整细胞浓度，种植于96孔板（2
×
103个/孔），每孔接种量为100μl，边缘36孔用200μl 无菌pbs填充，培养24h后，弃掉培养基，设置调零孔、空白孔（不加花青素的bmscs培养基）、不同浓度的的花青素干预孔，每组分别设置6个复孔，分别在培养24h、48h、72h、96h和120h。中途第72h进行半数换液，以保证细胞基本生存状态。检测前每孔加入cck8溶液10μl，放培养箱中孵育2h后，用酶标仪在450nm的波长处检测各组细胞的吸光度值。
22.cck8结果显示不同浓度的花青素对bmscs增殖的影响见表1和图1：与空白组比较，80
µ
mol/l 花青素在72h-96h抑制bmscs的增殖(p《0.05)，在120h显著抑制bmscs的增殖(p《0.01)；40
µ
mol/l 花青素在96h促进bmscs的增殖(p《0.05)；20
µ
mol/l 花青素在120h显著抑制bmscs的增殖(p《0.01)；10
µ
mol/l 花青素在48h促进bmscs的增殖(p《0.05)，在120h显著抑制bmscs的增殖(p《0.01)；5
µ
mol/l 花青素在120h显著抑制bmscs的增殖(p《0.01)；2.5
µ
mol/l 花青素在24h-120h对bmscs增殖的影响无统计学差异(p》0.05)。
23.2.2 cck8法检测不同浓度花青素对a549增殖的影响：取第4代处于对数生长期的a549，胰酶消化后制成单细胞悬液，用细胞计数仪进行计数并调整细胞浓度，种植于96孔板（2
×
103个/孔），每孔接种量为100μl，边缘36孔用200μl 无菌pbs填充，培养24h后，弃掉培养基，设置调零孔、空白孔（不加花青素的a549培养基）、不同浓度的花青素干预孔，每组分别设置6个复孔，分别在培养24h、48h、72h、96h和120h后。中途第72h进行半数换液，以保证细胞基本生存状态。检测前每孔加入cck8溶液10μl，放培养箱中孵育1.5h后，用酶标仪在450nm的波长处检测各组细胞的吸光度值。
24.cck8结果显示不同浓度的花青素对a549增殖的影响见表2和图2：与空白组比较，80
µ
mol/l、40
µ
mol/l 花青素在48h-120h显著抑制a549的增殖(p《0.01)；20
µ
mol/l、10
µ
mol/l 花青素在72h-120h显著抑制a549的增殖(p《0.01)；5
µ
mol/l 花青素在48h促进a549的增殖(p《0.05)；2.5
µ
mol/l 花青素在48h显著促进a549的增殖(p《0.01)。
25.综上，实验结果显示，与空白组比较，80
µ
mol/l花青素在48h-120h显著抑制a549的增殖(p《0.01)，同时80
µ
mol/l花青素在96-120h抑制bmscs增殖(p《0.05或p《0.01)；而40
µ
mol/l花青素在48h-120h显著抑制a549的增殖(p《0.01)，同时40
µ
mol/l花青素在48h-72h对bmscs增殖的影响无统计学差异(p》0.05)，仅在96h促进bmscs的增殖(p《0.05)；20
µ
mol/l花青素在72h-120h显著抑制a549的增殖(p《0.01)，同时20
µ
mol/l花青素在48h-96h对bmscs增殖的影响无统计学差异(p》0.05)，仅在120h显著抑制bmscs的增殖(p《0.01)；低浓度的10
µ
mol/l花青素在72h-120h显著抑制a549的增殖(p《0.01)，同时10
µ
mol/l花青素在48h-96h对bmscs增殖的影响无统计学差异(p》0.05)，在120h显著抑制bmscs的增殖(p《0.01)；低浓度的5
µ
mol/l花青素在48h促进a549的增殖(p《0.05)，同时在48h-96h对bmscs增殖的影响无统计学差异(p》0.05)，在120h抑制bmscs的增殖(p《0.05)；2.5
µ
mol/l 花青素在48h显著促进a549的增殖(p《0.01)，同时在48h-120h对bmscs增殖的影响无统计学差异(p》0.05)，故考虑10-40
µ
mol/l花青素为干预tnf-α诱导后bmscs的最佳浓度。
26.实验例2、花青素保护bmscs形态的生物学功能验证：1、炎性微环境细胞模型的建立和实验分组：1.1 实验方法：取第3代生长状态良好的细胞，胰酶消化取20μl细胞混悬液于细胞计数仪计数后，再用bmscs培养基调成浓度为1
×
104个/ml的单细胞悬液，按2ml/孔接种于六孔板中。实验分为空白bmscs组（a组）、tnf-α50ng/ml诱导组（b组）、40
µ
mol/l花青素干预组（c组）各组细胞每72h换液一次，每次按以上组别更换补充新的tnf-α、花青素，每1周传代一次，连续诱导21天后用于后续实验。诱导过程中，倒置相差显微镜密切观察细胞生长状态，并做好照片记录。
27.1.2 实验结果和分析：倒置显微镜40倍镜下观察显示：空白bmscs组细胞呈梭形；tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组、40
µ
mol/l 花青素干预组细胞呈梭形，变亮，突触变长明显。见图3。
28.2、he染色观察各组bmscs的形态变化：2.1 实验方法：取诱导21天后各组处于对数生长期的bmscs，胰酶消化，调整细胞浓度约1
×
105/
ml，滴于盖玻片上(置于6孔板中)，培养7天后，取出细胞爬片，用pbs洗涤2次，无水乙醇固定20min，pbs洗涤2次，每次1min，苏木素染液染色15min，pbs洗涤3次，伊红染液染色15min，pbs洗涤3次，自然晾干，中性树胶封片，光学显微镜下观察细胞形态变化。
29.2.2 实验结果和分析：倒置显微镜20、40倍镜下观察显示：空白bmscs组细胞排列有序，旋涡状生长，呈梭形；tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组40
µ
mol/l 花青素干预组细胞排列较整齐，分布较均匀，聚集性生长，呈梭形，变亮，突触变长，见图4-5。
30.通过倒置显微镜20倍镜下观察并运用image j计算各组胞体的长度发现：tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组、40
µ
mol/l 花青素干预组胞体长度值较空白bmscs组相比显著性增高（p《0.01），有统计学差异；40
µ
mol/l 花青素干预组与tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组胞体长度值相比显著性降低（p《0.01），有统计学差异。见表3。
31.3、cb法检测各组bmscs的微核形成率：3.1 实验方法：取诱导21天后各组处于对数生长期的bmscs，胰酶消化，调整细胞浓度约1
×
105/ml，滴于盖玻片上(置于6孔板中)，放入培养箱中培养3天，使细胞的融合度达到70%时，进行细胞换液，转入培养基后加入细胞松弛素b (终浓度1mg/ml)1μl，轻轻晃动六孔板，使其充分混匀，继续培养48h后弃去培养基，pbs洗2次，放入通风橱中用卡诺固定液固定30min，弃去固定液，倒扣六孔板，通风橱中干燥30min，吖啶橙染料染色15s。用荧光显微镜计数1000个双核细胞中的微核数，计算结果以千分率（
‰
）表示。
32.3.2 实验结果和分析：由图6和表4可知：诱导干预21天后，与空白bmscs组相比，tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组细胞微核形成率明显增加（p《0.01），差异有统计学意义；与tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组相比，40
µ
mol/l花青素干预组微核形成率明显减少（p《0.01），差异有统计学意义。
33.4、激光共聚焦观察各组bmscs的骨架变化：4.1 实验方法：制备每组1
×
104/ml细胞悬液，共6组。按照每孔1ml接种在6孔培养板中载玻片上，放置在培养箱24小时。待贴壁后，取出各组的载玻片，用pbs洗涤两次，室温放置10min于
3.7%甲醛溶液中。弃掉甲醛溶液，用pbs（含0.1%triton x-100）冲洗，每次5min放置于摇床洗涤，共3次。按照1：100的比例，用pbs（含0.1%triton x-100，5%bsa）稀释actin-tracker green。每个载玻片上滴200μlactin-tracker green，室温避光20-60min。用pbs（含0.1%triton x-100）冲洗，每次5min放置于摇床洗涤，共3次。将染色后的细胞爬片，观察骨架变化，最大激发波长设置为496nm，最大发射波长516nm。
34.4.2 实验结果和分析：通过激光共聚焦显微镜下观察发现，较模型组相比，空白bmscs组的骨架中微丝均匀分布于胞浆内、有方向性，排列整齐，而40
µ
mol/l 花青素干预组微丝排列较整齐。见图7。
35.综上所述，从实验结果可见，花青素可以从形态包括的不同方面发挥作用，进而改善bmsc细胞在tnf-α干预下发生的胞体长度增加，微核数增多以及骨架中微丝排序紊乱等变化，保护bmscs的形态。
36.实验例3、花青素抑制bmscs增殖的生物学功能验证：1、实验方法：cck8法检测各组bmscs增殖的变化，取诱导21天后各组处于对数生长期的bmscs，胰酶消化后种于96孔板（2
×
103个/孔），每孔接种量为100
µ
l，边缘36孔用200
µ
l无菌pbs填充，每组分别设置6个复孔，分别在培养24h、48h、72h和96h。中途第72h进行半数换液，以保证细胞基本生存状态。检测前每孔加入cck8溶液10
µ
l，放培养箱中孵育1.5h后，用酶标仪在450nm的波长处检测各组细胞的吸光度值。
37.2、实验结果和分析：由表5可见：诱导干预21天后，与空白bmscs组相比，tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组细胞在第2、3、4天增殖增加（p《0.05），差异有统计学意义；与tnf-α 50ng/ml诱导bmscs组相比，40
µ
mol/l花青素干预组第3、4天时增殖明显减少（p《0.01），差异有统计学意义；由上可见，诱导干预21天后，模型组细胞在第2、3、4天增殖增加显著，而花青素在第3-4天可明显改善这一过度增殖的表现。
38.实验例4、花青素抑制bmscs凋亡的生物学功能验证：1、实验方法：采用流式检测各组bmscs的细胞凋亡情况，每组细胞用预冷pbs-1ml冰浴洗涤两次，收集1份由1
×
结合缓冲液制成的细胞悬液，悬浮在结合缓冲液中，并在室温下用annexin-v/pi染色15分钟。每组试管加入1
×
结合缓冲液400μl，1h内流式细胞仪分析。
39.2、实验结果和分析：诱导干预21天后各组bmscs晚期（q2）凋亡的变化，与空白bmscs组相比，tnf-α50ng/ml诱导bmscs组比例显著增加（p《0.01），差异有统计学意义；与tnf-α50ng/ml诱导
bmscs组相比，40
µ
mol/l花青素干预组q2比例显著降低（p《0.01），差异有统计学意义。
40.诱导干预21天后各组bmscs早期（q4）凋亡的变化，与空白bmscs组相比，tnf-α50ng/ml诱导bmscs组、40
µ
mol/l花青素干预组比例变化不明显（p＞0.05），差异无统计学意义；诱导干预21天后各组bmscs总（z）凋亡的变化。与空白bmscs组相比，tnf-α50ng/ml诱导bmscs组比例显著增加（p《0.01），差异有统计学意义；与tnf-α50ng/ml诱导bmscs组相比，40
µ
mol/l花青素干预组显著降低（p《0.01），差异有统计学意义。见图8和表6。
41.由上可见，通过诱导干预21天后各组bmscs总凋亡的变化可以发现，与模型组相比，经花青素干预后，总凋亡比例显著降低。
42.实验例5、花青素维护bmscs在炎性微环境下成骨分化潜能验证：1、炎性微环境细胞模型的建立和实验分组：取第2代状态良好的bmscs，将细胞调整为1
×
104个/ml浓度的单细胞悬液，每孔2ml细胞悬液种于六孔板，分别以筛选出的最佳浓度100ng/ml的il-6和50ng/ml的tnf-α进行干预。实验分为空白组（bmscs完全培养基培养的bmscs）、模型组（tnf-α50ng/ml干预组）和药物组（7,2'-二羟基-3',4-二甲氧基异黄烷20μmol/l tnf-α50ng/ml和花青素40μmol/l tnf-α 50ng/ml）。连续诱导42d后，每3d换液1次，同时添加相应炎性因子及小分子药物以维持浓度。42d后，进行成骨方向诱导分化，以及检测其相关指标。
43.2、诱导成骨方向分化：六孔板每孔加入1.5ml 0.1%明胶，使底面充分覆盖；轻轻摇匀后在超净工作台内静置30min；30min后弃明胶，自然晾干；将细胞融合度达到80-90%的bmscs，用胰酶消化，并将bmscs悬液接种在事先明胶包被的六孔板中（2
×
104个/ml），每孔2ml，将细胞放入37℃，5% co2培养箱中继续培养；当细胞贴壁后融合度达到60-70%时，弃旧培养基，每孔加入2ml oricell tm成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基进行培养；每3d换液1次，换用新鲜成骨分化诱导培养基；每天镜下观察细胞诱导分化情况，于诱导14d后，进行茜素红染色。
44.3、形态学观察：在bmscs成骨诱导分化的过程中，每天在倒置相差显微镜下观察各组细胞形态变化并采集典型图像。
45.4、茜素红染色：4.1 实验方法：成骨诱导分化14d后，弃孔内成骨分化诱导液，用pbs清洗残留诱导液；每孔用2ml细胞固定液固定30min；然后弃细胞固定液，用pbs清洗残留细胞固定液。每孔加入2ml茜素红染液停留3-5min。弃掉茜素红染液后，用pbs清洗掉孔内多余杂质，于显微镜下观察并采
集图像。
46.4.2 实验结果和分析：分别诱导各组细胞向成骨方向分化14d后，空白bmscs组经茜素红染色后成鲜红色，着色较深；tnf-α 50ng/ml组茜素红染色后着色程度较空白组低；7,2'-二羟基
‑ꢀ
3',4'-二甲氧基异黄烷 tnf-α组、花青素 tnf-α组较tnf-α 50ng/ml组着色深；镜下观察，空白 bmscs 组染色矿化结节呈片状紧密连接，分布均匀，tnf-α 50ng/ml组染色后矿化结节分布明显分散，且单个结节较小，而7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷 tnf-α组、花青素 tnf-α组较tnf-α 50ng/ml组矿化结节面积均有所增加（图9）。
47.使用image pro plus 6.0 软件对各组细胞成骨诱导14d后的细胞计数和矿化结节面积进行统计计算， tnf-α组细胞计数和矿化结节面积均低于空白bmscs组，7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷 tnf-α组和花青素 tnf-α组细胞计数和矿化结节面积均有所增加（表7，图10），差异具有统计学意义（p《0.01）。
48.5、western blot 技术检测炎性微环境中bmscs成骨标记分子runx2和akt1表达的影响验证：5.1 实验方法：5.1.1细胞总蛋白的提取和蛋白样品制备将融合度达80-90%的bmscs用4℃预冷的pbs清洗2次，在培养瓶中加入1ml pbs缓冲液，用细胞刮刀仔细刮取细胞，并将细胞悬液转移至1.5ml离心管中，在4℃预冷的离心机中以12000 rpm离心15min，弃上清；再加入300μl含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，重悬细胞；并用细胞超声破碎仪碎裂细胞，离心15min（12000 rpm，4℃），将上清转移至新的离心管，使用pultton超微量分光光度计进行蛋白浓度检测。根据测定后的蛋白浓度加入相应的4
×
蛋白上样缓冲液，对样品进行稀释，并用封口膜包好后，沸水煮10min，-20℃冻存备用。
49.5.1.2 蛋白质印迹法（western blot）（1）sds-page电泳1）蒸馏水冲洗干净玻璃板后风干，将玻璃板分别安装到制胶架上。
50.2）按照抗体分子量所需分离胶浓度运用去离子水、30%丙烯酰胺、10%sds、tris-hcl（ph 8.8）、10%过硫酸铵、temed进行配比制胶，摇匀灌胶，再用无水乙醇液封满，待胶完全凝固后，倒掉无水乙醇用滤纸小心吸干剩余液体。
51.3）用去离子水、30%丙烯酰胺、10%sds、tris-hcl（ph6.8）、10%过硫酸铵、temed按比例配制5%浓缩胶，摇匀灌胶，并立即垂直插入梳子。
52.4）放置20min左右待浓缩胶凝固，安装放入电泳槽（区分正负极），向槽内及玻璃板内倒满1
×
电泳液，垂直拔出梳子，并用移液枪吹开上样孔的碎胶。
53.5）根据各组蛋白浓度，按照每孔20μg蛋白量算出每孔的上样体积，用微量进样器将marker加入各玻璃板的一侧位置，再加入各组蛋白样品。
54.6）电泳：p1模式：恒压80v，电泳30min，待溴酚兰到达浓缩胶与分离胶的分界部位切换至恒压120v，电泳1h左右的p2模式，直到溴酚蓝大约跑至玻璃板下沿1.5cm处终止。
55.（2）蛋白转膜1）提前裁剪适合凝胶的大小的pvdf膜，并将其全部浸于甲醇中激活5min。
56.2）将预冷的1
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转膜液倒入托盘，将转膜用的海绵垫、滤纸放入浸湿。用刮板撬开玻璃板，裁掉浓缩胶。
57.3）将夹子黑色面上依次放上海绵、滤纸、胶、pvdf 膜、滤纸和海绵，小心对齐合住夹子固定。
58.4）将夹子按照正负极安装进转膜槽中，向转膜槽中倒满1
×
转膜液至浸过转膜夹子。采用恒压90v，转膜时间2 h。放入冰盒，并冰浴转膜槽使转膜全过程低温进行。
59.（3）封闭及孵育抗体1）封闭：将转膜完成的pvdf膜标记好并置于装有封闭液的孵育盒中，恒温摇床封闭2h。
60.2）裁膜：根据条带 marker 的位置，用剪刀裁取目的蛋白的相对位置。
61.3）一抗孵育：将膜放入各自相应的一抗抗体孵育，4℃恒温摇床上孵育过夜，第二日，回收一抗，1
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tbst洗膜，每次5min，洗3次。
62.4）二抗孵育：用一抗对应种属的二抗，4℃恒温摇床孵育2h。1
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tbst洗膜，每次5min，洗3次。
63.（4）显色及图像分析1）将ecl 发光液等体积1:1混匀后滴加在置于干净玻璃板的pvdf膜上，注意避免气泡生成，在暗室中用凝胶成像仪（bio-rad）进行曝光并采集图像。
64.2）图像分析：运用image j软件算出条带灰度值，结果以目的蛋白条带与gapdh内参条带灰度值的比值表示。实验重复3次。
65.5.2 实验结果和分析：western blot法检测各组runx2的表达结果显示（图11），与正常bmscs组比较，tnf-α干预组的runx2表达降低（p《0.01），与tnf-α干预组相比，7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷和花青素组的runx2表达均有显著差异（p《0.01）。
66.western blot法检测各组akt1的表达结果显示（图12），与正常 bmscs 组比较，tnf-α组的akt1表达降低（p《0.01），与tnf-α组相比，7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷组和花青素组的akt1表达均有所上升，具有统计学差异（p《0.01）。
67.6、rt-pcr技术检测炎性微环境中bmscs成骨相关转录因子runx2、osterix和akt1表达的影响验证：6.1 实验方法：6.1.1细胞rna的提取和制备（1）提取细胞rna1）取生长状态良好的各组细胞，用1mlpbs/瓶清洗细胞3次，用无酶枪头吸取残余pbs，加入trizol 1ml/瓶，冰上静置8min。
68.2）用无酶枪头反复吹打细胞，待细胞脱落后，将细胞悬液移至1.5 ml无酶ep管中，加入200μl氯仿，摇匀15s，冰上静置10min，在4℃预冷的离心机中12000rpm，离心15min。
69.3）无酶枪头吸取上清上层水相至新的无酶ep管中，加入500μl的异丙醇，摇匀，冰上静置10min，在4℃预冷的离心机中12000rpm，离心15min。
70.4）离心后，可见底部有白色沉淀，弃去上清，加入1ml预冷的75%乙醇，轻弹管壁至沉淀漂浮，在4℃预冷的离心机中7500rpm，离心10min。
71.5）弃上清，离心管反扣自然风干10min，加入20μl free water，重悬沉淀，备用。
72.（2）rna浓度测定运用pultton超微量分光光度仪，通过p100.v1.0.0软件检测rna纯度与浓度，重复3次，取平均值。
73.（3）rna逆转录1）残留基因组dna去除在1.5ml无酶ep管中分别加入表8中体积组分，42℃孵育2min。
74.2）逆转录在1)的反应管中加入4
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hifair
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supermix plus，见表9用移液器轻轻吹打混匀。
75.3）逆转录程序设置（表10）使用55℃逆转录合成cdna，分装后置于-80℃保存备用。
76.6.1.2 实时荧光定量pcr1）本发明使用由生工公司设计并合成的引物序列，如表11所示：
2）real-time pcr反应液的配制（见表12，20μl体系）3）real-time pcr 扩增程序（见表13，两步法）6.2 实验结果和分析：rt-pcr法检测各组runx2、osterix的表达结果显示（表14，图13），与正常 bmscs 组比较，tnf-α干预组的runx2、osterix表达降低（p《0.05），与tnf-α组比较，7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷组和花青素组的runx2、osterix表达均有显著差异（p《0.05或p《0.01），其中，7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷组差异更显著（p《0.01）。
77.rt-pcr法检测各组akt1的表达结果显示（表15，图14），与正常bmscs组比较，tnf-α
组的akt1表达降低（p《0.01），与tnf-α组比较，7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷组和花青素组的akt1表达均有上升，差异具有统计学意义（p《0.05或p《0.01），其中7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷组上升更为明显（p《0.01）。
78.。