一种用于制备多种病毒的羊源永生化细胞系

1.本发明涉及羊胚胎鼻甲永生化细胞系的建立及应用，具体涉及将羊传染性脓疱病毒、羊痘病毒、疙瘩皮肤病病毒在该细胞系中培养、制备的应用。


背景技术：

2.永生化细胞系有多种构建方案。比较常见的方案包括过表达人源端粒酶逆转录酶基因(htert)、sv40 大t抗原片段、hpv早期基因片段等。永生化细胞系的构建可以使细胞处于连续的分裂状态，同时保持细胞的遗传及表型特性，有助于细胞分子生物学的基础性研究。不仅如此，永生化细胞系也可以用于病毒疫苗生产。在维持病毒遗传特征稳定的前提下，高效扩增、制备病毒，用于疫苗规模化生产。
3.本技术涉及领域为羊传染性脓疱病毒、羊痘病毒及疙瘩皮肤病病毒等痘病毒的扩增制备。前期研究表明，上述病毒均可在原代羊胚胎鼻甲细胞中培养。然而，上述原代细胞的传代能力有限，根据不同批次的经验，细胞可传20-30代，随后会发生分化，显著延长细胞分裂时间及减少病毒产量。多次进行原代细胞取材不仅具有较大的批间差异，而且成本高、耗时长。具有较大应用局限性。
4.不仅如此，也有报道称，羊、牛睾丸原代细胞也可以扩增上述病毒。然而，从生物安全性考虑，上述组织的获取过程具备感染布鲁氏杆菌的风险，每次取样均需进行严格检测，成本高、耗时长。亦具有一定局限性。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种用于培养、制备痘病毒的永生化羊胚胎鼻甲细胞系，所述痘病毒包括羊传染性脓疱病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、疙瘩皮肤病病毒。也包括基于上述病毒的人工传代驯化的减毒株及毒力基因缺失减毒株。
6.本发明提供了一种羊源永生化细胞系，保存编号为：cctcc no：c2022191，保藏名称为：羊鼻甲骨永生化细胞系oftu，保存于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国、武汉、武汉大学，电话(027)68752319，该培养物已于2022年6月23日由该保藏中心收到，并登记入册。该培养物的存活性该保藏中心于2022 年6月27日检测完毕，结果为存活。即为本发明提供的一种羊源永生化细胞系，又称oftu永生化细胞系或oftu细胞系。所述细胞系为用于病毒培养、制备的羊源永生化细胞系，所述细胞系为永生化羊胚胎鼻甲细胞系。优选的所述细胞系用于培养、制备痘病毒，所述痘病毒包括羊传染性脓疱病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、疙瘩皮肤病病毒，以及包括基于上述病毒的人工传代驯化的减毒株及毒力基因缺失减毒株。
7.本发明中，所述羊源永生化细胞系又称oftu永生化细胞系或oftu细胞系。
8.优选的是，所述羊源永生化细胞系是通过转染人源端粒酶逆转录酶基因制备得到的永生化羊胚胎鼻甲细胞系。所述羊永生化细胞系，多次传代后其htert基因均能够得到有效表达。对oftu细胞系进行转录水平的表达检测，至二十代htert基因表达维持高表达。
9.上述任一项优选的是，所述病毒为羊传染性脓疱病毒(orfv)、绵羊痘病毒(spv)、山羊痘病毒(gpv)、疙瘩皮肤病病毒(lsdv)中的至少一种，所述羊源永生化细胞系用于所述病毒的培养或制备。所述羊源永生化细胞系培养、制备所述病毒的能力部分优于vero、mdbk等常用细胞系。
10.上述任一项优选的是，所述羊源永生化细胞系用于所述病毒减毒株的制备，所述病毒减毒株为包括所述病毒至少一个毒力基因缺失。所述羊源永生化细胞系良好的病毒制备能力特别在于对相应病毒毒力基因缺失(单一或多个)减毒株的高效制备能力。所述羊永生化细胞系，在扩增病毒能力方面与原代oftu细胞并无显著差异，且均显著强于目前商业化的细胞系，如vero细胞系。并且所述羊永生化细胞系也可以对基因缺失毒进行有效扩增。
11.上述任一项优选的是，所述羊源永生化细胞系可以至少传代80代。所述羊永生化细胞系，多次传代后其细胞增殖速度显著快于原代oftu细胞，至少至八十代所述羊永生化细胞系，依旧保持良好的增殖状态，并且染色体形态正常。
12.上述任一项优选的是，所述羊源永生化细胞系传代比例为1：1～10，最优传代比例为1：5。也可以优选为，1：1、1：2、1：3、1：4、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10。
13.上述任一项优选的是，所述羊源永生化细胞系与原代细胞相比，具有分裂更加快速、不易分化、自发凋亡率低和对消化酶解过程耐受性高的特点。
14.上述任一项优选的是，所述羊源永生化细胞系可进行细胞转染。可以继续用细胞转染的方法进行基础性研究和药物开发。既可以使用脂质体、pei(聚乙烯亚胺)、磷酸钙等常用转染试剂进行细胞转染，也可以使用电转染法进行转染。转染试剂转染后的细胞活性大于80％，电转染后细胞活性大于60％。转染后，细胞系可以继续存活并增殖。
15.上述任一项优选的是，所述羊源永生化细胞系可再次进行遗传改造。在所述羊源永生化细胞系基础上再次进行遗传改造，使得经遗传优化的永生化细胞系对上述病毒的培养能力进一步提升：或适应更多痘病毒，进行高效培养、制备。
16.本发明提供了上述任一项羊源永生化细胞系在病毒培养及制备中的应用。
17.优选的是，所述应用还包括所述病毒减毒株的制备和培养，所述病毒减毒株包括所述病毒至少一个毒力基因缺失。
18.上述任一项优选的是，所述病毒为羊传染性脓疱病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、疙瘩皮肤病病毒中的至少一种。
19.本发明提供了上述任一项羊源永生化细胞系在细胞转染实验中的应用。
20.所述羊源永生化细胞系进行细胞转染。既可以使用脂质体、pei(聚乙烯亚胺)、磷酸钙等常用转染试剂进行细胞转染，也可以使用电转染法进行转染。转染试剂转染后的细胞活性大于80％，电转染后细胞活性大于60％。转染后，细胞系可以继续存活并增殖。
21.在本发明一项优选的实施方式中所述羊源永生化细胞系，通过以下步骤制备获得：
22.首先在妊娠3～5月龄健康孕羊中检测小反刍兽疫、结核病、口蹄疫、羊痘、布鲁氏菌病等传染性疾病，检测结果为阴性。随后麻醉孕羊，无菌取出胎羊，分离胎羊鼻甲组织，用含有双抗(其中青霉素为100 u/ml、链霉素为100μg/ml)的d-hank’s液清洗3-5次。在实验室内进行组织的消毒处理后，将其进一步无菌切割处理成细小组织块，经0.25％胰蛋白酶酶解37℃消化3次，每次15-20min，每隔5min摇晃一次，当液体变得混浊黏稠时停止。转移液体
至新的50ml离心管后加入血清终止消化。70μm筛网置于新的50 ml离心管进行过滤，去除组织块。过滤后的细胞悬液1000rpm离心10min后加含有双抗的d-hank’s吹打重悬，重复清洗3次。最后用含20％fbs、1％双抗的dmem培养液吹打细胞沉淀，转移至细胞培养瓶内。置于37℃、5％co2培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，根据细胞汇合度进行换液或传代操作。
23.当胎羊鼻甲组织细胞长满培养瓶后，弃去组织块及培养液。同时用胰蛋白酶进行原代细胞消化，将消化后的原代细胞1：2传代培养。将长满后的原代细胞进行部分冻存，冻存条件为含5％胎牛血清、10％ dmso的培养液。将冻存的细胞复苏后，细胞状态及长势良好。由此获得原代羊胚胎鼻甲细胞(oftu细胞)。
24.随后进行原代细胞转染条件筛选。首先将原代细胞铺在96孔板，待细胞分别达到50-60％、60-70％、 70-80％、80-90％、90-100％时进行转染。转染条件为：脂质体：dna(pegfp-c3，genbank:u57607.1) 比例为1：1-10：1。研究发现，细胞密度为70-80％时，脂质体(体积μl)：dna(质量μg)比例为2：1 时，对于该原代细胞的状态最好，且具有最高的转染效率。
25.以上述转染条件进行htert表达载体的转染试验。(1)将待转染细胞传代至100mm大皿中，细胞汇合度70-80％时弃掉旧培养液，更换为10ml新鲜的培养液；(2)1ml无血清无双抗的培养液中加入50 μl lipo3000转染试剂轻轻吹打混匀，室温静置5min；(3)1ml无血清无双抗的培养液中加入25μg质粒 dna吹打混匀；(4)将质粒dna混合液加入lipo3000混合液中轻轻吹打4-5次，室温孵育20min；(5) 将lipo-dna复合物沿培养板侧壁加到100mm皿中，按十字轻轻晃动培养皿混匀液体；(6)培养箱内培养6h后弃掉含lipo-dna复合物的培养液，更换为含血清的完全培养液继续培养。细胞转染48小时后，对其进行g418药物筛选，筛选浓度为300μg/ml。细胞筛选3天后，未转染质粒的对照组细胞全部死亡，在随后的1周内降低g418筛选浓度至150μg/ml。经上述筛选后挑取单细胞克隆，扩大培养。
26.将上述方案获得的细胞系扩大培养后提取总rna，反转录成cdna，用pcr方法对htert基因的转录水平进行检测。分别对第一、五、十、十五、二十、二十五代的细胞进行htert转录水平检测，在上述细胞系中均检测到了htert基因的转录，表明在我们所构建的细胞系中该基因得到有效的表达。
27.分别对第十五代、第二十代细胞系及第十五代、第二十代原代细胞通过cck8细胞活力检测试验以及细胞计数的方法进行细胞活力及细胞生长速度的分析。研究发现，上述各个代次的细胞在细胞活力及细胞长势等方面均无显著差异。证明，永生化细胞系构建成功。
28.将构建的oftu永生化细胞系传至六孔板，检测细胞的分种率。在培养板内分种细胞后检查细胞的长势，记录细胞的分种率在1：3到1：10之间时细胞传代后的长势。当细胞的分种率在1：3时，细胞系长满单层所需要的时间在48-50小时之间；当细胞的分种率在1：5时，细胞系长满单层所需要的时间在56-58 小时之间；当细胞的分种率在1：6时，细胞系长满单层所需要的时间在60-62小时之间；当细胞的分种率在1：10时，细胞系长满单层所需要的时间在72-74小时之间。
29.随后将羊传染性脓疱病毒(orfv)感染oftu永生化细胞系后，检测细胞病变(cpe)所需时间。试验结果表明，当oftu永生化细胞系接种orfv后80％的细胞产生cpe所需时间为3-4天。同时检测病毒滴度(logtcid
50
)为6.5以上，表明所述oftu永生化细胞系可以有效扩
增orfv。将羊痘病毒(spv) 感染oftu永生化细胞系后，80％的细胞产生cpe所需时间为5-6天；将疙瘩皮肤病病毒(lsdv)感染 oftu永生化细胞系后，80％的细胞产生cpe所需时间为4-5天，同时检测病毒滴度(logtcid
50
)为6.5 以上，所述oftu永生化细胞系可以有效扩增spv及lsdv。
30.选取呈现对数生长的原代细胞、第六十五代oftu永生化细胞系，在细胞培养液中加入秋水仙素孵育 5小时，经胰酶消化细胞后，离心获得细胞沉淀。用50mm kcl溶液重悬细胞沉淀，处理40分钟。加入甲醇/冰醋酸(3：1)对细胞进行30分钟固定，4℃离心收集细胞沉淀。再次加入甲醇/冰醋酸固定液，充分重悬细胞后将细胞悬液滴在4℃预冷的玻片上，进行干燥。随后进行吉姆萨染色，在显微镜下观察染色体。结果显示，原代细胞、oftu永生化细胞系染色体形态正常，呈2倍体，具有54条染色体。
31.选取原代细胞、六十五代oftu永生化细胞系，同时选取hela细胞作为阳性对照，选取pbs溶液作阴性对照，进行裸鼠皮下接种试验，接种细胞数量为107细胞/只。hela细胞接种裸鼠后第七天可以在原位检测到肿瘤肿块的形成，接种hela细胞20天后，肿瘤肿块的平均直径为1cm。相比之下，将原代、六十五代oftu永生化细胞系注入裸鼠皮下30天后，并无肿块形成。继续饲养3个月后，仍未出现肿块。上述试验证实，本发明所构建的羊源永生化细胞系(即oftu永生化细胞系)无致瘤性。
32.本发明通过所述羊源永生化细胞系，具有较好的应用、转化前景：(1)所述羊源永生化细胞系可以持续传代，增殖性能稳定；(2)所述羊源永生化细胞系对羊传染性脓疱病病毒敏感，感染后收获病毒滴度较高，且病毒形态稳定；(3)所述羊永生化细胞系，无致瘤性，细胞系安全可靠。使用所述羊源永生化细胞系制备病毒可以降低生产成本、减少批间差异，为获得高质量的疫苗提供保障。
附图说明
33.图1为本发明实施例1中pci-neo-htert质粒图谱。
34.图2为本发明实施例1中pcr鉴定不同代次oftu细胞系htert基因转录情况。
35.图3为本发明实施例2中显微镜观察不同代次原代oftu细胞和oftu细胞系生长状态对比。
36.图4为本发明实施例2中不同代次原代oftu细胞及oftu细胞系cck8法检测细胞的生存活力对比。
37.图5为本发明实施例3中显微镜观察orfv感染原代oftu细胞及oftu永生化细胞系后细胞病变状态。
38.图6为本发明实施例3中原代oftu细胞及oftu永生化细胞系接种orfv后形成病毒粒子的电镜观察。
39.图7为本发明实施例3中原代oftu细胞、oftu细胞系及vero细胞系接种orfv后病毒滴度对比。
40.图8为本发明实施例4中显微镜观察spv感染原代oftu细胞及oftu细胞系后细胞病变状态。
41.图9为本发明实施例5中显微镜观察lsdv感染原代oftu细胞及oftu细胞系后细胞病变状态。
42.图10为本发明实施例5中原代oftu细胞及oftu细胞系接种lsdv后病毒滴度对比。
43.图11为本发明实施例6中荧光显微镜观察原代oftu细胞与oftu细胞系的转染效率。
44.图12为本发明实施例6中荧光显微镜观察原代oftu细胞及oftu细胞系制备及扩增orfv-δ120-gfp 减毒株。
45.图13为本发明实施例6中显微镜观察orfv-δ120-gfp减毒株感染原代oftu细胞及oftu细胞系后细胞病变状态。
46.图14为本发明实施例7中原代oftu细胞与oftu细胞系染色体的显微镜观察。
47.图15为本发明实施例8中pbs对照、原代oftu细胞、oftu细胞系及对照hela细胞接种裸鼠后的成瘤情况。
具体实施方式
48.本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
49.实施例1
50.oftu细胞系htert基因表达水平鉴定：
51.如上所述，首先通过原代细胞培养技术获得状态良好的原代oftu细胞，该原代细胞的培养条件是含有20％fbs、1％双抗(其中青霉素为100u/ml、链霉素为100μg/ml)的dmem培养液，待细胞状态稳定后，可将fbs维持在10％。随后将原代细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养，每天观察细胞生长、增殖状况。对原代细胞进行传代时，用pbs洗涤2次弃去培养液的细胞，再用适量的0.25％胰蛋白酶进行消化。将经胰酶消化后的原代细胞进行1：2传代培养。待原代细胞状态及长势良好时，进行细胞转染试验。
52.以细胞密度为70-80％、脂质体(体积μl)：质粒dna(质量μg)比例为2：1的条件进行原代细胞转染，质粒dna为能够过表达htert基因(genbank:ab085628.1)的重组质粒pci-neo-htert(图1)。若细胞转染效率低，可以在细胞首次转染后进行二次转染，转染前弃掉10cm皿中旧培养液，更换为10ml 新鲜的培养液。将所述过表达htert基因的重组质粒dna混合液加入lipo3000混合液中轻轻吹打数次，室温孵育20min，随后将lipo-dna复合物逐滴加到100mm细胞培养皿中，轻轻晃动培养皿混匀转染复合物。添加转染复合物6h后更换新鲜完全培养液，于37℃、5％co2培养箱中培养48h，每天观察细胞生长、增殖状况。同时将空质粒转染至原代细胞作为对照组。然后对上述转染后的原代细胞及未经转染的原代细胞进行g418药物筛选，筛选浓度为300μg/ml。细胞筛选3-4天后，当未经转染的细胞全部死亡后，降低g418筛选浓度至150μg/ml。随后挑取单细胞克隆、进行细胞扩大培养。
53.将上述方案获得的单细胞克隆扩大培养，在不同代次获取细胞样本提取总rna，进而将其反转录成 cdna。用pcr方法对经质粒转染的htert基因的转录水平进行检测。试验结果提示，在上述细胞系中均检测到了htert基因的转录(269bp条带)，表明在上述代次的细胞系中，端粒酶基因得到有效的表达(图 2，m:dl2000 marker，1：oftu细胞系第一代，2：oftu细胞系第五代，3：oftu细胞系第十代，4：oftu 细胞系第十五代，5：oftu细胞系第二十代，6：oftu细胞系第二十五代，7：原代oftu细胞第一代，8：原代oftu细胞第十代，9：原代
oftu细胞第二十代，10：原代oftu细胞转染空质粒第一代，11：原代oftu细胞转染空质粒第十代，12：原代oftu细胞转染空质粒第二十代)。
54.实施例2
55.oftu细胞系生长、增殖状态鉴定：
56.将实施例1获得的原代oftu细胞、oftu永生化细胞系进行细胞生长状态的对比，如图3所示为显微镜观察不同代次原代oftu细胞和oftu永生化细胞系生长状态对比，其中a：原代oftu细胞第二十代b：原代oftu细胞第三十代c：oftu细胞系第二十代d：oftu细胞系第八十代。首先对比了同样是经历20次传代的原代oftu细胞(图3a)和oftu永生化细胞系(图3c)，发现经htert转染的oftu细胞的增殖速度显著快于原代oftu细胞。经历30次传代的原代oftu细胞(图3b)生长速度明显变慢，甚至停止增殖，而oftu永生化细胞系(图3d)，经过80次传代后依旧保持良好的增殖状态。
57.用cck8法检测不同代次细胞的生存活力。首先对比了同样是经历15次传代的原代oftu细胞和oftu永生化细胞系，发现oftu永生化细胞系在不同时间点(48h、72h、96h)的增殖速度显著快于原代oftu细胞(图4)。同样，当对比经历20次传代的原代oftu细胞和oftu永生化细胞系，发现oftu永生化细胞系的增殖速度显著快于原代oftu细胞(图4)。同时发现，15、20代的oftu永生化细胞系的活性状态并无显著差异；而15代的原代oftu细胞的活性状态优于20代的原代oftu细胞(图4)。
58.本发明所使用的的cck8检测法为现有技术中的已公开的方法。
59.实施例3
60.oftu细胞系扩增羊传染性脓疱病毒水平鉴定：
61.将上述方案获得的oftu细胞系(35代)与oftu原代细胞(10代)接种羊传染性脓疱病毒(orfv)，检测上述细胞或细胞系对病毒的敏感性。经野生型orfv感染细胞72h后，检测细胞病变(cpe)。试验结果表明，当接种orfv后72h内，原代oftu细胞及oftu细胞系均产生典型的cpe，表明oftu细胞系对orfv敏感(图5，其中5a为原代oftu细胞，5b为oftu细胞系)。
62.进而，检测orfv在所述羊源永生化细胞系中产生细胞病变的同时是否产生形态完整的病毒粒子。在接毒96h后收集病变细胞系及原代细胞(作为对照)，首先用超速离心机浓缩病毒，再用密度梯度离心法获得高纯度病毒液。经透射电子显微镜检测发现，经病毒感染后的细胞系可产生与原代细胞一样形态的病毒粒子(图6，其中6a为原代oftu细胞，6b为oftu细胞系)，证实将原代oftu细胞永生化为oftu细胞系后培养获得病毒粒子未发生形态及潜在性能的改变。
63.同时比较了原代oftu细胞、oftu细胞系及vero细胞系产生orfv病毒粒子的能力。在接毒96h后收集病变oftu细胞系、原代oftu细胞(作为对照)及vero细胞系(作为对照)。用tcid
50
法检测病毒滴度。结果表明，oftu细胞系在扩增病毒能力方面与原代oftu细胞并无显著差异，且均显著强于vero细胞系(图7)。表明，所述羊源永生化细胞系可以大量扩增orfv。orfv野生毒株来源如下。(1.zhongj#,guanj#,zhouy,cuis,wangz,zhous,xum,weix,gaoy,zhais,songd,hew,gaof,zhaok*.genomiccharacterizationoftwoorfvirusisolatesfromjilinprovinceinchina.virusgenes,2019,55:490
–
501.2.zhaok,songd,hew,luh,zhangb,lic,chenk,gaof.identificationandphylogeneticanalysisofanorfvirusisolatedfromanoutbreakinsheepin
thejilinprovinceofchina.vetmicrobiol.2010may19；142(3-4):408-15.)
64.实施例4
65.oftu细胞系扩增绵羊痘病毒水平鉴定：
66.将上述方案获得的oftu细胞系(35代)与oftu原代细胞(10代)接种绵羊痘病毒(spv)，检测上述细胞或细胞系对病毒的敏感性。经spv感染细胞96h后，检测细胞病变(cpe)。试验结果表明，当接种spv后96h内，原代oftu细胞及oftu细胞系均产生典型的cpe，表明oftu细胞系对spv敏感(图8，其中8a为原代oftu细胞，8b为oftu细胞系)。
67.实施例5
68.oftu细胞系扩增疙瘩皮肤病病毒水平鉴定：
69.将上述方案获得的oftu细胞系(35代)与oftu原代细胞(10代)接种疙瘩皮肤病病毒(lsdv)，检测上述细胞或细胞系对病毒的敏感性。经lsdv感染细胞72h后，检测细胞病变(cpe)。试验结果表明，当接种lsdv后72h内，原代oftu细胞及oftu细胞系均产生典型的cpe，表明oftu细胞系对lsdv敏感(图9，其中9a为原代oftu细胞，9b为oftu细胞系)。
70.同时比较原代oftu细胞及oftu细胞系产生lsdv病毒粒子的能力。在接毒120h后收集病变oftu细胞系及原代oftu细胞(作为对照)。用tcid
50
法检测病毒滴度。结果表明，oftu细胞系在扩增病毒能力方面与原代oftu细胞并无显著差异(图10)。
71.实施例6
72.oftu细胞系转染效率检测及制备、扩增orfv毒力基因缺失毒株能力鉴定：
73.将上述方案获得的细胞系oftu细胞系(35代)与oftu原代细胞(10代)传代至100mm皿中，脂质体(μl)：质粒(pegfp-c3)(μg)为2：1条件进行转染。试验结果表明细胞系的转染效率高于原代oftu细胞(图11，其中11a为原代oftu细胞，11b为oftu细胞系)
74.检测上述细胞系对orfv毒力基因缺失毒株的制备以及扩增能力。试验结果表明，原代oftu细胞及oftu细胞系均能产生携带绿色荧光的orfv120基因缺失毒株(orfv-δ120-gfp减毒株)(图12，其中12a为原代oftu细胞产生的orfv-δ120-gfp，12b为oftu细胞系产生的orfv-δ120-gfp)。同时以得到的orfv-δ120-gfp减毒株感染原代oftu细胞及oftu细胞系，试验结果表明，orfv-δ120-gfp减毒株可以在细胞系中得到有效扩增(图12，其中12c为orfv-δ120-gfp感染原代oftu细胞48h，12d为orfv-δ120-gfp感染oftu细胞系48h)。同时orfv-δ120-gfp感染细胞72h后，检测细胞病变(cpe)。试验结果表明原代oftu细胞及oftu细胞系均产生典型的cpe(图13，其中13a为原代oftu细胞，13b为oftu细胞系)。证明所获得的oftu永生化细胞系也可以对基因缺失毒进行有效扩增，从而增加了该细胞系的应用范围。orfv-δ120-gfp减毒株构建方法来源如下。(zhou,yanlongetal.orfvirusorf120proteinpositivelyregulatesthenf-κbpathwaybyinteractingwithg3bp1.journalofvirologyvol.95,19(2021))
75.实施例7
76.oftu细胞系染色体观察：
77.为了检测上述方案获得的oftu细胞系的染色体稳定性，制备细胞的染色体。选取呈现对数生长的原代细胞、第六十五代oftu细胞系，在细胞培养液中加入秋水仙素孵育5小时，经胰酶消化细胞后，离心获得细胞沉淀。用50mmkcl溶液重悬细胞沉淀，处理40分钟。加入甲醇/冰醋酸(3：1)对细胞进行30分钟固定，4℃离心收集细胞沉淀。再次加入甲醇/冰醋
酸固定液，充分重悬细胞后将细胞悬液滴在4℃预冷的玻片上，进行干燥。随后进行吉姆萨染色，在显微镜(100倍油镜)下观察染色体。结果显示，原代细胞、oftu永生化细胞系染色体形态正常，呈2倍体，具有54条染色体(图14，其中14a为原代oftu 细胞，14b为oftu细胞系)。
78.实施例8
79.oftu细胞系潜在致瘤性鉴定：
80.为检测经上述方案获得的oftu细胞系的安全性，进行细胞系潜在致瘤性检测。将pbs(阴性对照)、原代oftu细胞、六十五代oftu细胞系及hela细胞(阳性对照)进行裸鼠皮下接种试验，接种细胞数量为107细胞/只。细胞注射一周后逐日检测肿瘤生长情况。细胞注射7日后发现，接种hela细胞的裸鼠形成明显的肿瘤肿块，并且在接种hela细胞20天内，肿瘤肿块长势迅速，肿瘤的平均直径可达1cm。相比之下，同期一同注射原代oftu细胞、六十五代oftu细胞系的裸鼠在细胞注射30天后仍未在原位观察到明显肿块(图15，其中15a为pbs对照，15b为原代oftu细胞，15c为oftu细胞系，15d为hela细胞)。3个月后亦未见肿块形成。上述试验证实，所构建的oftu永生化细胞系无致瘤性，细胞系安全可靠。
81.本发明所述羊源永生化细胞系，保存编号为：cctcc no：c2022191。由实施例1所述的方法获得，并经由实施例2-8进行检测。证实所述羊源永生化细胞系多次传代后其htert基因均能够得到有效表达。对oftu细胞系进行转录水平的表达检测，至二十代htert基因表达维持高表达。在扩增病毒能力方面与原代oftu细胞并无显著差异，且均显著强于目前商业化的细胞系，如vero细胞系。并且所述羊永生化细胞系也可以对基因缺失毒进行有效扩增。所述羊永生化细胞系，多次传代后其细胞增殖速度显著快于原代oftu细胞，至少至八十代所述羊永生化细胞系，依旧保持良好的增殖状态，并且染色体形态正常。无致瘤性，细胞系安全可靠。