一种可注射自组装水凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种可注射自组装水凝胶及其制备方法和应用，属于水凝胶制备领域。


背景技术：

2.随着人口老龄化进程的加快和交通事故的频发，各种意外伤及慢性伤越来越多，皮肤缺损问题日益严峻。一旦皮肤出现严重缺损，伤口就会严重影响人们的生命和健康。皮肤创伤，特别是大面积的全层伤口，需要花费很长时间才能修复，创伤伤口一直是临床亟待解决的问题。传统敷料如绷带、纱布和药棉等，易粘连伤口，引起更换敷料的二次伤害，且吸收伤口渗出液的能力有限，被浸透后失去屏障保护功能，易引起外源性感染，不能很好的满足临床需求。寻找一种具有抗菌和促进伤口愈合的新型创伤敷料对于创伤修复尤其是感染皮肤修复具有重要意义。水凝胶是亲水性高分子或聚合物通过共价、氢键和范德华力等作用交联形成的三维网络结构材料。在诸多种类的水凝胶中，自组装可注射水凝胶无需添加教交联剂生物相容性优异，合成方法简单，可填充不规则伤口，因此成为理想的新型创伤敷料的一种。
3.壳聚糖是甲壳素脱乙酰作用的产物，甲壳素是仅次于纤维素的含量最高的第二大天然多糖，在自然界中广泛存在于低等植物(生物菌类、藻类)的细胞，节肢动物(虾、蟹和昆虫)的外壳，软体动物(如鱿鱼、乌贼)的内壳和软骨，以及高等植物的细胞壁等。壳聚糖凭借其优异的生物相容性、生物降解性、来源广泛易加工以及一定的抗菌性，广泛应用于生物医用水凝胶的构建及研究。然而，单一组分的壳聚糖凝胶力学性能差，抗菌能力有限常被用于轻度渗出伤口。对于高度渗出伤口，伤口处的浸溃和细菌増殖可能导致伤口恶臭和腐烂。为了克服壳聚糖的缺陷同时扩展其应用，需要对壳聚糖进行改性构建具有更优异抗菌性和创伤修复的可注射壳聚糖水凝胶。


技术实现要素：

4.为了解决皮肤缺损伤口愈合速度慢，伤口易感染的技术问题，本发明提供了一种可注射自组装水凝胶及其制备方法和应用。
5.第一方面，本发明提供了一种可注射自组装水凝胶，所述可注射自组装水凝胶为：由壳聚糖和葛根素自组装形成的具有纳米纤维网络结构的水凝胶；所述纳米纤维网络结构由聚糖和葛根素的自组装纳米纤维组成，所述纳米纤维的直径为50～300nm。本研究中，采用自组装构建剪切变稀壳聚糖复合葛根素(c@p)水凝胶，该凝胶具有可注射自修复和优异的抗菌性能，有利于皮肤创伤的愈合和伤口感染后的皮肤修复。
6.较佳的，所述可注射自组装水凝胶为物理交联水凝胶，体系内含有大量氢键、范德华力、π-π键等物理键合。所述可注射自组装水凝胶具有凝胶多孔结构；所述壳聚糖和葛根素的质量比为(1～10)：(0.5～20)，优选为1：(0.5～4)；所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为1.5～100mg/ml，优选为5～30mg/ml。其中，固态组分为未参与反应壳聚糖和
葛根素中的至少一种和壳聚糖和葛根素自组装形成纳米纤维。
7.较佳的，所述可注射自组装水凝胶具有凝胶多孔结构。
8.较佳的，所述可注射自组装水凝胶含有纳米纤维网络结构，所述纳米纤维网络结构含有自组装纳米纤维(即由自组装纳米纤维组成)，纳米纤维的直径为50～300nm，优选为60～200nm。
9.较佳的，所述可注射自组装水凝胶中的纳米纤维与葛根素浓度有关，葛根素浓度越高，纳米纤维数量越多。
10.较佳的，所述可注射自组装水凝胶的储能模量g
‘
高于损耗模量g“，且g
‘
的范围为10～10000pa，g”的范围为0～10000pa。
11.较佳的，所述可注射自组装水凝胶具有剪切变稀性能，水凝胶在低于500％剪切应变时保持凝胶态不变，超过500％的剪切应变下从凝胶态转变为非凝胶态，进而赋予其可注射能力。
12.较佳的，所述可注射自组装水凝胶具有自修复性能，超过500％剪切应变变为非凝胶态后，去掉剪切力后可重新恢复为凝胶态。
13.较佳的，所述可注射自组装水凝胶可有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的增殖生长并杀死细菌。
14.较佳的，所述可注射自组装水凝胶具有优异的细胞相容性，水凝胶培养细胞时，细胞可维持较高活性。
15.另一方面，本发明提供了一种可注射自组装水凝胶的制备方法，包括：(1)将壳聚糖和葛根素加入反应器皿中，再加入乙酸溶液作为溶剂，得到混合物；(2)将所得混合物在物理混合作用下发生自组装，再加入去离子水进行溶解，静置继续材料自组装过程，一段时间后得到可注射自组装水凝胶。在本发明中，由壳聚糖作为结构主体形成多孔网络结构，再与葛根素自组装时，葛根素与壳聚糖自组装成纳米纤维结构，因此在多孔网络结构(壳聚糖)的主体上逐渐形成纳米纤维。进一步纳米纤维逐渐增多进而形成纳米纤维网络结构，所得纳米纤维网络结构具有一定的吸水储水性，形成可注射自组装水凝胶。
16.较佳的，所述壳聚糖的脱乙酰度为85～100％；所述葛根素的纯度为90～100％。所述壳聚糖和葛根素的质量比为(1～10)：(0.5～20)。
17.较佳的，所述物理混合作用的方式包括研磨、机械球磨、搅拌、或混合离心；所述研磨的时间为2～20分钟；所述机械球磨的转速为60～600转/分钟，时间为2分钟～5小时；所述搅拌的转速为100～1000转/分钟，时间为2分钟～5小时；所述混合离心的转速为重力加速度50g～12000g，时间为2分钟～20分钟。
18.较佳的，所述乙酸溶液的浓度为0.05～10m，优选为浓度为0.1～1m的乙酸溶液；所述静置时间为0.05～24小时。
19.第三方面，本发明提供了一种可注射自组装水凝胶在制备皮肤修复材料中的应用。
20.第四方面，本发明提供了一种可注射自组装水凝胶在制备抗菌和感染皮肤修复材料中的应用。
21.有益效果：(1)本发明中，所制备的水凝胶可直接注射，注射过程具有凝胶剪切变稀特性，因此可通过针头注射，注射后仍保持凝胶态。体外试验中证明具有：优异的抗菌性能，可有效抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的增殖并杀死细菌；良好的细胞相容性；促进细胞的黏附生长；有效促进创面修复以及治疗伤口感染促进感染创面愈合(2)本发明中，可注射自组装水凝胶的制备工艺稳定可控，制做简单，成本低，易于实现，治疗效果好，便于推广应用。
附图说明
22.图1为可注射自组装凝胶的照片，从图1中a可知，壳聚糖(cts)和葛根素(pue)复合后，一开始为乳液状态，随着时间延长，凝胶逐渐形成；从图1中b可知，凝胶收到剪切力后变为溶胶态，放置一段时间后又可恢复为凝胶态；图2为自组装水凝胶注射到水中的照片。从图中可知，凝胶注射入水中后，仍可维持凝胶状态，表明凝胶的可注射性和结构稳定性图3为cp0.1(pue的浓度为0.5mg/ml的壳聚糖/葛根素复合乳液)的结构图。从图中可知，pue的质量分数较低时，无纳米线结构出现；图4为cp1(c@p，pue的浓度为5mg/ml的壳聚糖/葛根素复合水凝胶)凝胶的结构图。从图中可知，形成凝胶后，纳米线出现，表明纳米线结构与凝胶形成有关；图5为c@p凝胶在放置不同天数后的结构图。从图中可知，随着放置时间的延长，纳米线的数量增多；图6为cts和不同pue质量分数的cp(壳聚糖/葛根素的复合物)水凝胶的结构图。从图中可知，pue的质量于cts的质量比为0.2时，无纳米纤维形成，当质量比超过1，纳米纤维出现，且随pue的质量分数增多而增多；图7为cp1水凝胶的储能模量g’和损耗模量g”随时间变化的流变曲线。从图中可知，当cts和pue的质量分数均为5mg/ml时，cp1的g’＞g”.证明凝胶的形成；图8为cp1水凝胶的储能模量g’和损耗模量g”随剪切应变变化的流变曲线。从图中可知，剪切应变在500％附近，出现曲线交叉。当剪切应变＜500％时，g’＞g”材料为凝胶态。当剪切应变＞500％，g’＜g”材料为溶胶态；图9为cts和不同pue质量分数的cp水凝胶储能模量g’和损耗模量g”在循环剪切应变作用下的流变曲线。从图中可知，在1％应变时，g’＞g”，为凝胶态，在500％应变时，g’＜g”，为溶胶态，且凝胶在循环应变下，凝胶溶胶态可循环转变，表明cp自组装水凝胶具有可注射和自修复性能。图10为cts和pue质量分数的cp水凝胶的储能模量g’和损耗模量g”。从图中可知，当pue和cts的质量比不小于1时，为凝胶状态。过低的pue含量无法形成凝胶，形成凝胶后，凝胶的模量与pue质量分数成正相关，这可能与纳米纤维的增多有关；图11为cts、pue和c@p凝胶的傅里叶红外谱图(ftir)。从图中可知，相比于cts和pue的红外吸收峰，c@p曲线的峰位有一定的偏移，这可能与凝胶体系的大量物理键尤其是氢键有关，而这些键又诱导自组装过程的进行；图12为cts、pue和c@p凝胶的x射线衍射图(xrd)。从图中可知，c@p具有新的衍射
峰，表明其具有新的结晶结构，这可能与纳米纤维的形成有关；图13为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶zeta电位。从图中可知，相比于cts和pue以及未成凝胶的cp0.2，凝胶形成后，其zeta电位数值更高；图14为差示扫描量热(dsc)曲线。从图中可知，不同于cts和pue，c@p凝胶在120℃附近具有新的曲线拐点，表明其新的结晶温度和结晶相；图15为cts、pue和c@p凝胶的热重(tg)曲线。从图中可知，不同于cts和pue，c@p凝胶具有新的曲线拐点，表明其新的结晶温度和结晶相；图16为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养革兰氏阴性大肠杆菌(e.coli)后细菌增殖情况，荧光强度(fluorescence intensity)与细胞增殖和细胞数量正相关。从图中可知，cts和pue无抗菌性能，而凝胶组细菌基本全部死亡，表明凝胶的优异抗革兰氏阴性菌的能力；图17为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(s.aureus)后细菌增殖情况。从图中可知，pue无抗菌性能，低浓度的cts不仅无法抑菌，还会促进细菌增殖，cp0.2一定程度抑制细菌增殖，而凝胶组细菌基本全部死亡，表明凝胶的优异抗革兰氏阳性菌的能力；图18为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后细菌涂板照片。从图中可知，水凝胶培养细菌后，取菌液涂板，几乎无菌落形成，表明凝胶组的优异抑菌性能；图19为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后细菌电镜照片。从图中可知，水凝胶培养细菌后，细菌膜结构破裂，细胞质流出，细菌死亡，且少有细菌，表明凝胶可有效抑制细菌增殖并杀死细菌；图20为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养l929细胞后细胞增殖情况。从图中可知，各组材料相比于对照组均未抑制细胞增殖，且cts和cp各组一定程度上促进细胞增殖，表明各组材料的优异细胞相容性；图21为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养l929细胞后细胞活死染色图片。从图中可知，各组材料细胞状态良好，少有死细胞，表明各组材料的生物安全性优异；图22为cts、pue和不同pue质量分数的cp水凝胶培养l929细胞后细胞铺展情况。从图中可知，cts、pue和低比例的cp为明显促进细胞铺展，而对于凝胶组，随着pue含量提高，细胞铺展面积明显增大，表明凝胶可促进细胞铺展，这与自组装纳米纤维有关；图23为cts、pue和c@p可注射水凝胶治疗缺损皮肤的小鼠创面照片。从图中可知，3天凝胶组具有明显的促修复能力，cts可一定程度促进创面愈合，而pue促修复能力不佳，两者自组装后形成水凝胶具有协同促创面修复能力；图24为cts、pue和c@p可注射水凝胶治疗皮肤创面感染后小鼠创面照片。从图中可知，8天除cp凝胶其他组出现不同程度的创面感染情况，cts和pue无法促进感染创面愈合，而cp凝胶不仅可抑制创面感染同时可以促进感染创面愈合；图25为cts、pue和c@p可注射水凝胶治疗皮肤创面后h&e染色图片。从图中可知，相比于control(对照组)对照组，cts和pue的新生血管数量相对少，而c@p凝胶具有优异的皮肤修复性能；图26为cts、pue和c@p可注射水凝胶治疗皮肤创面感染后h&e染色图片。从图中可
知，相比于control(对照组)对照组，cts和pue治疗效果不佳，瘢痕组织明显，新生血管和细胞数量少，有明显炎症。而c@p水凝胶具有更好的皮肤修复性能和抗菌能力。
具体实施方式
23.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
24.在本公开中，可注射水凝胶是由壳聚糖和葛根素通过自组装形成的，其余组分为水。其中，部分壳聚糖和葛根素先自组装形成的纳米纤维再进一步形成网络结构。所述可注射自组装水凝胶具有纳米纤维组成的网络结构，其纳米纤维直径为60-300nm。
25.所述可注射自组装水凝胶中壳聚糖和葛根素的质量分别可为1-10mg/ml和0.5-20mg/ml。
26.在本公开中，通过将壳聚糖和葛根素研磨后自组装可立即形成可注射水凝胶，注射时剪切力作用凝胶剪切变稀，因此可顺利通过极细的特制针头，注射后具有自修复性能立即恢复至凝胶态，维持其力学性能。
27.在可选的实施方式中，所述可注射自组装水凝胶体系内含有大量氢键。
28.较佳的，所述可注射自组装水凝胶的储能模量g
‘
高于损耗模量g“，且g
‘
的范围为10-10000pa，g”的范围为0-10000pa。
29.所述可注射自组装水凝胶在剪切应变作用下由凝胶态转变为溶胶态。
30.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
31.实施例1称取50mg的壳聚糖和5mg的葛根素，加入研钵中。滴加200μl的0.875m(体积分数5％)的乙酸，用力研末至壳聚糖和葛根素混合均匀直至乙酸挥发完全，加入10ml去离子水搅拌均匀，静置12h。得到壳聚糖葛根素复合物cp0.1。所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为5.5mg/ml。
32.实施例2称取50mg的壳聚糖和10mg的葛根素，加入研钵中。滴加200μl的0.875m(体积分数5％)的乙酸，用力研末至壳聚糖和葛根素混合均匀直至乙酸挥发完全，加入10ml去离子水搅拌均匀，静置12h。得到壳聚糖葛根素复合物cp0.2。所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为6mg/ml。
33.实施例3称取50mg的壳聚糖和25mg的葛根素，加入研钵中。滴加200μl的0.875m(体积分数5％)的乙酸，用力研末至壳聚糖和葛根素混合均匀直至乙酸挥发完全，加入10ml去离子水搅拌均匀，静置12h。得到壳聚糖葛根素复合物cp0.5。所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为7.5mg/ml。
34.实施例4
称取50mg的壳聚糖和50mg的葛根素，加入研钵中。滴加200μl的0.875m(体积分数5％)的乙酸，用力研末至壳聚糖和葛根素混合均匀直至乙酸挥发完全，加入10ml去离子水搅拌均匀，静置12h。得到壳聚糖葛根素复合物cp1(c@p或cp)。所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为10mg/ml。
35.实施例5称取50mg的壳聚糖和100mg的葛根素，加入研钵中。滴加200μl的0.875m(体积分数5％)的乙酸，用力研末至壳聚糖和葛根素混合均匀直至乙酸挥发完全，加入10ml去离子水搅拌均匀，静置12h。得到壳聚糖葛根素复合物cp2。所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为15mg/ml。
36.实施例6称取50mg的壳聚糖和150mg的葛根素，加入研钵中。滴加200μl的0.875m(体积分数5％)的乙酸，用力研末至壳聚糖和葛根素混合均匀直至乙酸挥发完全，加入10ml去离子水搅拌均匀，静置12h。得到壳聚糖葛根素复合物cp3。所述可注射自组装水凝胶中固态组分的浓度为20mg/ml。
37.实施例7将实施例2制备的可注射自组装水凝胶cp用于抗菌实验，参见附图16-图19。
38.实施例8将实施例2所得可注射自组装水凝胶进行皮肤修复和感染皮肤修复实验，参见附图23-图26。