一种金纳米双锥复合纳米探针、制备方法及应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种金纳米双锥复合纳米探针的制备方法，还涉及该复合纳米探针的应用。


背景技术：

2.癌症已成为疾病死因之首，而且其发病率和死亡率还在不断攀升，已成为一个严重的公共健康问题。《ca：a cancer journal for clinicians》(临床医师癌症杂志)最近公布的全球癌症统计数据示：2018年，全球大约有癌症新发病例1810万例和死亡病例960万例；其中皮肤恶性黑色素瘤(malignant melanoma)占所有癌症新发病例和死亡病例的比率分别为1.6％和0.6％。我国于2016年在《ca：a cancer journal for clinicians》上发表的《cancer statistics in china，2015》最新结果显示：2015年中国估计有429.2万例癌症新发病例和281.4万例癌症死亡病例；其中，恶性黑色素瘤的平均存活时间仅为29.5个月。
3.与其它恶性肿瘤一样，目前人们对恶性黑色素瘤的病因迄今尚未完全清楚，可能与日光暴晒、种族和遗传、抑癌基因突变、病毒感染、外伤、性别和激素水平、年龄和部位等因素有关。由于人们对恶性黑色素瘤的认识不深，重视度不够，往往在发现时都已晚期，从而达不到满意的临床治疗效果，因此发展恶性黑色素瘤的早期诊断技术和寻找合理有效的治疗方案仍是一项重要而紧迫的研究课题。
4.近年来，临床前研究证实，基于纳米颗粒的多模态联合成像诊断相对于单一模态的成像诊断具有显著的肿瘤诊断优势，并且在肿瘤诊断的同时可以通过一定的方法实现成像指导下的精准治疗。如有学者将磁性增强对比剂四氧化三铁(fe3o4)或钆(gd
3
)与金纳米颗粒结合，使多功能化的纳米探针在肿瘤部位有效蓄积，可以联合用于mr和pa成像，提高了肿瘤检测的灵敏度和可靠性，获得肿瘤部位丰富的生物学和功能化信息，为进一步的光热治疗做出了精准定位；将光敏剂吲哚菁绿(icg)与金纳米棒(gnrs)组装在一起，解决了传统有机荧光染料的荧光不稳定性及早期经典荧光成像纳米制剂量子点的难以修饰和生物毒性等问题，还有效延长了有机荧光染料的生物体内循环时间,成功实现了nirf和pa联合成像指导肿瘤的多模态治疗作用。
5.能够用于肿瘤早期识别和诊断的理想诊疗制剂应该廉价易得，且同时携带具有靶向效能和有效分子成像的元素，以实现对肿瘤细胞的精准识别和检测。尽管上述的文献报道证实多功能化的纳米平台可以实现肿瘤的识别和诊断，但如何将人恶性黑色素瘤的靶向制剂与各成像、治疗元素有机结合在一起，既能使mr、pa和nirf成像得以取长补短，实现彼此的优势互补，以获取肿瘤组织更深、更广、更全面的信息，从而提高人恶性黑色素瘤早期成像诊断的灵敏度和精准度，为进一步的治疗提供更精确的生物和功能信息；同时又能在成像诊断的指导下提高人恶性黑色素瘤治疗的准确度和效率仍是亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种金纳米双锥复合纳米探针，其可以作为人体皮肤
恶性黑色素瘤的检测试剂，适用于多种成像诊断方式，提高人体皮肤恶性黑色素瘤早期成像诊断的灵敏度和精准度。
7.本发明的目的还在于提供一种上述金纳米双锥复合纳米探针的制备方法，其制备方法简单，易操作。
8.本发明的目的还在于提供一种上述金纳米双锥复合纳米探针在制备用于肿瘤诊断检测试剂中的用途。
9.为实现上述目的，本发明采取的第一种技术方案为：一种金纳米双锥复合纳米探针，所述金纳米双锥复合纳米探针包括金纳米双锥和分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇，所述分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a 和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于所述金纳米双锥上，所述焦脱镁叶绿酸-a 上螯合有锰离子。
10.进一步地，所述偶联有焦脱镁叶绿酸-a的聚乙二醇和所述偶联有靶向试剂叶酸的聚乙二醇的摩尔比为1:1。
11.进一步地，所述分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇通过硫醇-金反应修饰于所述金纳米双锥上。
12.为实现上述目的，本发明采取的第二种技术方案为：一种如上所述的金纳米双锥复合纳米探针的制备方法，包括步骤：
13.制备金纳米双锥；
14.将焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸分别偶联于聚乙二醇；
15.将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于所述金纳米双锥；
16.在修饰后的所述金纳米双锥的所述焦脱镁叶绿酸-a上螯合锰离子，即得所述金纳米双锥复合纳米探针。
17.示例性地，采用金种生长法制备所述金纳米双锥。
18.具体地，所述采用金种生长法制备所述金纳米双锥具体包括步骤：
19.将氯金酸、二甘醇以及聚二烯丙基二甲基氯化铵混合均匀，再加入强还原剂进行反应，生成金十面体种子；
20.将氯金酸和氨水溶液混合后，将所述金十面体种子加入其中反应，得到所述金纳米双锥。
21.进一步地，所述将焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸分别偶联于聚乙二醇具体包括步骤：
22.提供两份溶剂分别溶解焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸，然后向其中均加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺活化焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸结构的羧基；
23.提供两份均经过氨基化和巯基化修饰的聚乙二醇溶液分别与上述两份溶液混合，即可得偶联有焦脱镁叶绿酸-a的聚乙二醇和偶联有靶向试剂叶酸的聚乙二醇；所述焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸与各自对应的所述聚乙二醇溶液的摩尔比均为1:1。
24.进一步地，所述将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于所述金纳米双锥为：利用硫醇-金反应将所述分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于所述金纳米双锥结构上；所述偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的
聚乙二醇和所述金纳米双锥的摩尔比均为 1：5。
25.为实现上述目的，本发明采取的第三种技术方案为：如上所述的金纳米双锥复合纳米探针在制备用于肿瘤诊断检测试剂中的用途。
26.进一步地，所述肿瘤为人体皮肤恶性黑色素瘤。
27.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明将偶联有焦脱镁叶绿酸-a的聚乙二醇和偶联有靶向试剂叶酸的聚乙二醇功能化修饰gnps，而且在焦脱镁叶绿酸-a上螯合金属锰离子，可以用于靶向人恶性黑色素瘤细胞的 mr/pa/nirf多模态分子成像诊断，提高人恶性黑色素瘤早期诊断的灵敏性和准确性；而且其制备方法简单，制备原料无毒性，生物运用安全性高。
附图说明
28.图1为本发明制备的金纳米双锥的微观结构示意图；
29.图2为本发明制备的金纳米双锥的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
30.本发明公开一种金纳米双锥复合纳米探针，该金纳米双锥复合纳米探针包括金纳米双锥和分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a(缩写为ps)和靶向试剂叶酸 (缩写为fa)的聚乙二醇(缩写为peg)，分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于金纳米双锥结构上，而且焦脱镁叶绿酸-a上还螯合有锰离子。
31.金纳米双锥(gold-nanobipyramids，简写为gnps)是由两个五角形的椎体构成的无机纳米材料，可以通过调节纵横比控制其纵向表面等离子体共振峰(lspr)的位置，gnps独特的几何学形状，使其比胶囊状的金纳米棒(gnrs) 具有更大的光学吸收截面，对周围环境的改变更敏感。而且经过对比研究还发现，在相同的表面等离子体共振(spr)位置，gnps的光致发光量子产率是 gnrs的两倍。因而，gnps在光致发光成像、pa成像以及光热治疗等方面更具有优越性。
32.焦脱镁叶绿酸-a是叶绿素降解产物卟啉类化合物，作为新一代的二氢卟吩类光敏剂，焦脱镁叶绿酸-a具有独特的优势：
33.1)在600～800nm的光谱范围内具有较强的紫外吸收值，在合适波长的激光作用下，能瞬间产生较强的近红外光(在720nm有发射峰)，可用于生物体的nirf成像；
34.2)三重激发态量子产率为0.5，可作为理想的光敏剂用于光动力学治疗；
35.3)化学结构中含有自由羧基基团(-cooh)，能够进行进一步修饰；
36.4)属于四吡咯大环化合物，能够直接鳌合金属离子(如fe、pt、cu、mn 等)作为生物造影剂用于pa、ct、pet、mr等增强成像。
37.当锰离子(mn
2
)插入焦脱镁叶绿酸-a的四吡咯大环中时，焦脱镁叶绿酸
ꢀ‑
a产生单线态氧的能力被淬灭。但是，mn
2
的插入减少了焦脱镁叶绿酸-a的光漂白现象，其在激光照射下的升温效果有了明显的提高；同时mn
2
本身对 gnps的pa成像和光热治疗具有协同作用。
38.焦脱镁叶绿酸-a螯合金属锰离子(mn
2
)的反应式如下所示：
[0039][0040]
本发明的金纳米双锥复合纳米探针的优点包括：
[0041]
1)合成步骤简单，通过一步修饰的方法可以赋予gnps肿瘤靶向多模态成像和光热治疗能力；
[0042]
2)peg的修饰提高了gnps的稳定性及生物相容性；
[0043]
3)焦脱镁叶绿素-a的存在，一方面赋予gnps螯合mr造影剂mn
2
的能力；另一方面赋予了gnps荧光成像能力的同时，还能有效提高gnps的光热治疗效果；
[0044]
4)实现了对肿瘤的多模态成像，弥补了单一成像模式的不足，可对肿瘤进行全方面的精确诊断；同时，在多模态精准定位的基础上指导光热治疗，能有效提高肿瘤治疗效果；
[0045]
5)多种肿瘤细胞(皮肤癌、卵巢癌、乳腺癌)都有叶酸受体的高表达，本发明选用fa靶向的人恶性黑色素瘤模型，为后续研究领域的扩展打下了基础。
[0046]
因此，该纳米诊疗体系的制备工艺严谨可行，诊断结果全面，应用潜力巨大，将为肿瘤的精准全面诊断以及诊疗一体化纳米体系的临床转化提供新的思路。
[0047]
进一步地，偶联有焦脱镁叶绿酸-a的聚乙二醇和偶联有靶向试剂叶酸的聚乙二醇的摩尔比为1:1。从而使得修饰金纳米双锥结构的焦脱镁叶绿酸-a 和靶向试剂叶酸数量相等。
[0048]
进一步地，分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇通过硫醇-金反应修饰于金纳米双锥上。
[0049]
本发明还提供一种如上所述的的制备方法，包括步骤：
[0050]
制备金纳米双锥；
[0051]
将焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸分别偶联于聚乙二醇；
[0052]
将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于金纳米双锥；
[0053]
在修饰后的金纳米双锥的焦脱镁叶绿酸-a上螯合锰离子，即得金纳米双锥复合纳米探针。
[0054]
本发明分别制备金纳米双锥和分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a、靶向试剂叶酸的聚乙二醇(fa-peg5k-sh和ps-peg5k-sh)，然后将两种聚乙二醇溶液混合后加入金纳米双锥进行反应，从而将偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于金纳米双锥结构上，最后加入含有金属锰离子的溶液将 mn
2
螯合于焦脱镁叶绿酸-a的四吡咯大环中。
[0055]
示例性地，采用金种生长法制备所述金纳米双锥。具体包括步骤：
[0056]
将氯金酸(haucl4)、二甘醇(deg)以及强阳离子聚电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)混合均匀，再加入强还原剂进行反应，生成金十面体种子；
[0057]
示例性地，强还原剂可以选择硝酸银溶液(agno3)。
[0058]
进一步地，可以在210℃油浴条件下进行反应，反应后生成的金十面体种子的直径约30-35nm。
[0059]
将金十面体种子加入氯金酸和氨水的混合溶液中反应，得到金纳米双锥。
[0060]
进一步地，将金十面体种子加入氯金酸和氨水的混合溶液中后置于125℃油浴条件下进行反应，通过优化得到尺寸均一、尖角明显的gnps。
[0061]
进一步地，将焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸分别偶联于聚乙二醇具体包括步骤：
[0062]
提供两份溶剂分别溶解焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸，然后向其中均加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(缩写为edc)和n-羟基丁二酰亚胺(缩写为nhs)活化焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸结构的羧基；
[0063]
提供两份完全相同的分子量为5000(mw＝5k)、且两端均经过氨基化和巯基化修饰的聚乙二醇溶液(peg5k-sh)分别与上述两份溶液混合，即可得偶联有焦脱镁叶绿酸-a的聚乙二醇和偶联有靶向试剂叶酸的聚乙二醇；焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸与各自对应的聚乙二醇溶液的摩尔比均为1:1。即每个聚乙二醇分子均对应偶联有一个焦脱镁叶绿酸-a或靶向试剂叶酸分子。
[0064]
溶剂可以选择二甲基亚砜(dmso)。
[0065]
该步骤中偶联有叶酸或焦脱镁叶绿酸-a的聚乙二醇反应式具体对应如下：
[0066]
进一步地，将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于金纳米双锥为：利用硫醇-金反应将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于金纳米双锥结构上；偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇和所述金纳米双锥的摩尔比均为1：5。
[0067]
具体可以将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的两份聚乙二醇按照摩尔比1:1进行混合，然后向其中加入金纳米双锥，分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的两份聚乙二醇与金纳米双锥的摩尔比均为1:5，即每个金纳米双锥结构上均修饰有五个分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇。
[0068]
经典的gnrs是通过有生物剧毒的阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(ctab)合成，而本发明的gnps的合成原料没有毒性，生物运用安全性较高。
[0069]
参见图1和图2可知，本发明制备的金纳米双锥的均一性较好，长159nm 左右，宽46nm左右，纵横比约为3.4，其纵向表面等离子体共振峰在870nm 左右。
[0070]
本发明还公开一种如上所述的金纳米双锥复合纳米探针在制备用于肿瘤诊断检测试剂中的用途。
[0071]
进一步地，该肿瘤为人体皮肤恶性黑色素瘤。
[0072]
下面将结合本发明具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地
描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0073]
实施例
[0074]
本实施例提供一种金纳米双锥复合纳米探针的制备方法，具体包括以下步骤：
[0075]
制备金纳米双锥：
[0076]
将10μl 1mmol/l的氯金酸(haucl4)与36μl 5mmol/l的二甘醇(deg) 及4μl 100μg/ml的聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)充分混匀后，再加入5μl 1mmol/l的强还原剂硝酸银(agno3)，置于210℃油浴条件下反应，生成直径约30～35nm的金十面体种子；然后将25μl 1mmol/l的氯金酸和1μl 10mmol/l的氨水溶液混合，将前述合成的金十面体种子加入haucl4和氨水溶液的混合溶液中并置于125℃油浴中反应，通过优化得到尺寸均一、尖角明显的gnps。
[0077]
将焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸分别偶联于聚乙二醇：
[0078]
提供两份二甲基亚砜，分别向内加入1μg焦脱镁叶绿酸-a和2μg靶向试剂叶酸进行溶解，然后加入100μl 5mmol/l的edc和50μl 5mmol/l的nhs活化焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸上的羧基，反应时长为4h；
[0079]
随后向内分别加入经过分子量为5000、且经过氨基化和巯基化修饰的聚乙二醇，将焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸偶联于对应加入的聚乙二醇的氨基端位上。其中，焦脱镁叶绿酸-a、靶向试剂叶酸偶与对应加入的聚乙二醇摩尔比为1:1。即每个聚乙二醇分子上均偶联有一个焦脱镁叶绿酸-a或靶向试剂叶酸偶。
[0080]
将分别偶联有焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的聚乙二醇修饰于金纳米双锥：
[0081]
将上述分别偶联焦脱镁叶绿酸-a和靶向试剂叶酸的两份聚乙二醇混合，其摩尔比为1:1，然后将金纳米双锥加入其中，每份聚乙二醇与金纳米双锥的摩尔比均为1:5，聚乙二醇的巯基端位与金纳米双锥通过硫醇-金反应形成金硫键(au-s)，从而将聚乙二醇修饰到gnps的表面。
[0082]
在焦脱镁叶绿酸-a上螯合金属锰离子：
[0083]
然后向上述混合溶液中加入mncl2，mn
2
离子插入焦脱镁叶绿酸-a的四吡咯大环中，从而在焦脱镁叶绿酸-a上螯合金属锰离子，即得本实施例的金纳米双锥复合纳米探针。
[0084]
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0085]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。