单萜吲哚类生物碱及其制备方法和应用

1.本发明涉及中药活性成分提取鉴定技术领域，具体涉及一种单萜吲哚类生物碱及其制备方法和应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，m.tb)感染引起的一种慢性传染性疾病，是全球近年来由单一病原微生物感染导致死亡的头号杀手。其感染之后m.tb会侵入到患者的各个器官，其中尤以肺部为主(肺结核)，具有传染源不易控制、传染性强及死亡率高等特点，已成为全球重大公共卫生问题。在临床中，利用预防性疫苗和化学药物是防治tb的主要手段，然而，随着近年来全球范围内耐药结核病的出现与传播，特别是耐多药结核病、广泛耐药结核病及hiv双重感染的产生与传播，对防控tb提出了更大的挑战。主要体现在：第一，耐药患者数量逐年増多，而当前临床一线药物仍为多年前老药，新药研发迟缓。第二，现有的联合用药方案多具有治疗周期长、耐受性差、副作用大等缺陷，严重降低患者生存质量且可能促进耐药性进一步恶化，不能从根本上解决临床用药的困难。第三，现有的tb预防性疫苗，其仅仅针对儿童具有较好的预防作用，对青少年和成人保护效果不佳，且随着接种时间的延长其免疫保护能力将不断减弱甚至消失。由此可见，面对现有临床药物治疗tb的严峻挑战，开发高效低毒、未产生耐药性的新型抗结核药物从根本上解决临床用药困难问题，是当前防治tb的一项急迫课题，具有重要的临床意义。
3.理肺散，又名接骨丹、凉喉茶等，以茜草科耳草属植物攀援耳草(攀茎耳草)hedyotisscandens roxb.的全株入药，是我国白族、傣族、纳西族、傈僳族、昂德族、哈尼族等民间常用的药食两用中药。据《中华本草》记载，其性凉、味苦，归肺、肾经，具有清热解毒、理肺止咳、接骨续筋等功效，主治肺结核、肺炎、支气管炎、咽喉肿痛及骨折等临床病症。民间常将其以单味药入药用于治疗感染性疾病，如《云南中草药》记载“理肺散30g，炖肉服，治肺结核”，实地考察表明，云南怒江一带至今将该方作为治疗肺结核的特效药方，再如“理肺散30g，水煎服，治肺炎、支气管炎、口腔炎”。结合其传统功效及现代医学观点分析，表明理肺散中蕴藏着潜在的抗菌活性成分，特别是抗结核分枝杆菌活性成分。由此可见，理肺散作为我国民间用于治疗肺结核具有特色疗效的药食两用中药，拥有悠久的药用历史，具有重要的研究价值和开发利用前景。
4.prakash basnet等通过纸片扩散法研究表明理肺散提取物对普通变形杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用。由此可见，理肺散具有显著的抗菌活性，尤其是抗结核分枝杆菌活性，这与理肺散传统用药中的“清热解毒，理肺止咳功效，主治肺结核、肺炎、支气管炎”具有高度一致性。此外，理肺散提取物亦具有抗病毒及抗氧化等生物活性。关于理肺散的化学成分研究，目前报道甚少，仅有三篇文献报道从其乙醇提取物中分离鉴定了28个化合物，包括黄酮类6个、三萜类6个、甾体类1个、以及酚酸类15个。此外，何可群等通过紫外分光光度法对其中可能含有的生物碱类成分作了初步测定，然而并没有文献
报道从理肺散中分离得到生物碱。
5.由此可见，关于理肺散化学成分研究一直以来都较为表层浅显、不够深入，特别是现有的化学成分研究不能支撑其治疗肺结核确切疗效的药效物质基础，这对理肺散的充分开发与利用造成了极大的限制。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种单萜吲哚类生物碱；本发明的目的之二在于提供一种所述单萜吲哚类生物碱的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种所述单萜吲哚类生物碱在制备抗耻垢分枝杆菌药物中的应用；本发明的目的之四在于提供一种所述单萜吲哚类生物碱在制备抗结核分支杆菌药物中的应用；本发明的目的之五在于提供一种所述单萜吲哚类生物碱在制备治疗结核病药物中的应用。
7.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.1、一种单萜吲哚类生物碱，结构式为式1或2所示：
[0009][0010]
本发明优选的，所述单萜吲哚类生物碱从中药理肺散中分离得到。
[0011]
2、一种所述单萜吲哚类生物碱的制备方法，包含如下提取步骤：
[0012]
a.将理肺散乙醇粗提物用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取，得到相应萃取物；
[0013]
b.将二氯甲烷萃取物进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯15:0、10:1、8:1、7:1、5:1、4:1、2:1、1:1、1:3、1:5、0:1梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积；合并石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱组分共得到13个组分，其中第7个组分主要由7:1～4:1梯度洗脱合并得到；
[0014]
c.将洗脱所得第7个组分经mci柱层析，以甲醇-水按40％、50％、60％、70％、80％、 90％、100％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，总共得到23个洗脱组分；
[0015]
d.针对第17个组分，主要由60％-70％梯度洗脱合并得到，采用rp-hplc分离，68％甲醇等度洗脱，获得式(1)所示单萜吲哚类生物碱；
[0016]
e.针对第21个组分，主要由70％-80％梯度洗脱合并得到，采用rp-hplc分离，75％甲醇等度洗脱，获得式(2)所示单萜吲哚类生物碱。
[0017]
3、一种所述单萜吲哚类生物碱在制备抗耻垢分枝杆菌药物中的应用。
[0018]
4、一种所述单萜吲哚类生物碱在制备抗结核分支杆菌药物中的应用。
[0019]
5、一种所述单萜吲哚类生物碱在制备治疗结核病药物中的应用。
[0020]
本发明的有益效果在于：
[0021]
首次研究理肺散抗结核活性物质基础，发现其单萜吲哚类生物碱为其主要有效成分，并获得其有效部位；
[0022]
首次从理肺散中分离获得生物碱类成分，并从有效部位中分离获得2个新的生物碱化合物，并显示出显著的抗分支耻垢杆菌活性。
[0023]
制备获得理肺散抗结核药效活性部位，并明确其主要化学成分，为理肺散进一步开发利用提供依据。
附图说明
[0024]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0025]
图1为四种民族中药抗耻垢分枝杆菌活性；
[0026]
其中，a为四种民族中药乙醇总提物(500mg/ml)：1dmso、2乙醇、3理肺散、4 岩豇豆、5矮地茶、6金荞麦；b对照品：1h2o、2dmso、3卡那霉素(500μg/ml)、4链霉素(200μg/ml)、5异烟肼(1mg/ml)、6利福平霉素(2mg/ml)；
[0027]
图2为理肺散提取物萃取部位抗耻垢分枝杆菌活性；
[0028]
其中，a、b、c分别为石油醚相、二氯甲烷相和正丁醇相；1均为溶剂dmso，2-6分别为相应萃取物不同浓度，依次为250、100、50、10、1mg/ml；
[0029]
图3为理肺散提取物萃取部位抗bcg及结核分枝杆菌h37ra活性；
[0030]
其中，a为抗bcg活性：1、2、3、依次为石油醚、二氯甲烷、正丁醇对照，4、5、6依次为石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取部位，浓度均为250mg/ml；b、c分别为二氯甲烷和正丁醇萃取部位抗结核分枝杆菌h37ra活性，浓度均为250mg/ml；
[0031]
图4为活性生物碱部位hplc分析色谱图(hplc洗脱条件为甲醇-5
‰
甲酸水系统： 0-35-40min，45-90-100％甲醇，254nm波长)；
[0032]
图5为活性生物碱部位抗制耻垢分枝杆菌活性；
[0033]
其中，a为对照：1h2o、2dmso、3卡那霉素(500μg/ml)、4链霉素(200μg/ml)、 5利福平霉素(2mg/ml)、6异烟肼(1mg/ml)；b为洗脱部位(50mg/ml)；
[0034]
图6为活性生物碱部位的uplc-hrms分析离子流图；
[0035]
图7为化合物1的结构式；
[0036]
图8为化合物2的结构式。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0038]
实施例1、理肺散抗结核活性的制备
[0039]
初期选取了具有抗结核功效用药历史的四种中药，分别为理肺散、金荞麦、矮地茶及岩豇豆，以耻垢分枝杆菌为抗结核活性筛选模型，利用纸片扩散法对其乙醇总提取物(95％乙醇，三倍体积提取三次，50℃减压浓缩而得)和水总提取物((去离子水，三倍体积提取三次，50℃减压浓缩而得))分别进行活性筛选，实验结果显示，理肺散乙醇总提取物具有
显著抑菌圈(图1)，表现出确切的抗耻垢分枝杆菌活性。
[0040]
首先，将理肺散乙醇总提取物分散于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取，得到相应部位，活性测试表明二氯甲烷部位具有最好的抗耻垢分枝杆菌活性(图2)，且较总提物有明显提高，并与浓度呈现出显著相关性，表明活性成分主要集中于二氯甲烷部位。其次，以bcg(牛型结核分支杆菌减毒株)和结核分枝杆菌h37ra菌株为抗结核活性筛选模型，对萃取部位进一步活性测试(图3)，得到与耻垢分枝杆菌模型一致的实验结论，进一步证实了理肺散二氯甲烷萃取部位中具显著的的抗结核活性成分。
[0041]
实施例2、理肺散中生物碱类抗结核活性成分的精制
[0042]
针对二氯甲烷部位，运用活追踪与uplc-hrms指认相结合的策略，对其活性成分进行指认和精制。将二氯甲烷萃取物进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯15:0、10:1、8:1、7:1、 5:1、4:1、2:1、1:1、1:3、1:5、0:1梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积；合并石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱组分共得到13个组分。经活性分析得知其中第7个组分(主要由7:1～4:1梯度洗脱合并得到，hplc色谱图见图4)具有最为显著的抗耻垢分枝杆菌活性(图5)；进一步通过uplc-ms分析发现，该洗脱部位主要为生物碱类化合物，从中初步指认出19个生物碱类色谱峰(图6，表1)。通过上述方法精制即得抗耻垢分枝杆菌“有效部位”，也称为“活性生物碱部位”。
[0043]
表1、石油醚-乙酸乙酯为7:1～4:1的洗脱部位中推测的生物碱
[0044]
[0045]
注：*为分离得到的新化合物
[0046]
实施例3、有效部位中生物碱主成分的分离与鉴定
[0047]
化合物1和2的分离制备：首先，将活性生物碱部位利用mci柱层析进行粗分，溶剂为甲醇-水，洗脱程序为40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇，每个浓度洗脱4个柱体积，合并得到含化合物的23个组分。针对第17个组分(主要由60％-70％梯度洗脱合并得到)，采用rp-hplc制备(68％甲醇等度洗脱)获得化合物1；针对第21个组分(主要由 60％-80％梯度洗脱合并得到)，采用rp-hplc制备(75％甲醇等度洗脱)获得化合物2。
[0048]
从中分离鉴定了2个生物碱类单体化合物，且均为新化合物。
[0049]
化合物1和2的结构鉴定：通过核磁共振、高分辨质谱等技术鉴定化合物1和2均为单萜吲哚类生物碱，为首次从理肺散中发现的生物碱类化合物，且均为新化合物。化合物1具体结构如图7所示，nmr数据如表2所示，分子式为c
21h25
n2；化合物2具体结构如图8 所示，nmr数据如表3所示，分子式为c
31h38
n2o2。
[0050]
表2.化合物1的nmr数据
[0051]
no.δh(mult,j in hz)δc2 134.43 138.458.16(br s)132.768.04(overlap)115.57 132.98 119.598.06(overlap)122.5107.31(t,8.4)121.6117.61(t,8.4)131.6127.83(d,8.4)114.213 145.0143.96(s)44.51’5.84(s)111.52
’ꢀ
154.93’2.41(m)39.04’2.30(m)25.85’5.12(t,6.9)123.36
’ꢀ
132.87’1.51(s)19.38’1.71(s)25.89’1.65(s)17.8nh13.3(s) [0052]
表3.化合物2的nmr数据
[0053][0054]
[0055]
实施例4、新化合物的活性检测
[0056]
在耻垢分枝杆菌模型中，化合物1和2均显示明显的抑制活性，mic分别为62.5μg/ml 和1.25μg/ml；在结核分枝杆菌h37ra模型中，化合物1和2的mic分别为63.7μg/ml和 3.78μg/ml。
[0057]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。