一种具有免疫微环境调控功能的可注射水凝胶系统

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1.本发明属于生物技术领域，涉及具有免疫微环境调控功能的可注射水凝胶系统，具体涉及一种用于胶质母细胞瘤切除术后填充的具备免疫微环境调控功能的可注射水凝胶系统。


背景技术：

2.研究显示，胶质母细胞瘤(gbm)是中枢神经系统最常见、侵袭性最强的原发性肿瘤之一，大多数患者预后极差。由于gbm的独特位置和强浸润性所带来的局限性，正常脑实质内浸润的肿瘤细胞不能通过手术完全切除。尽管近几十年来gbm的外科治疗和辅助治疗取得了进展，但术后其中位生存期仍小于15个月，这表明在目前的临床治疗方案中，仅仅依靠辅助化疗来抑制肿瘤复发是不够的。目前临床治疗方案中的一个问题是：在手术和后续的辅助治疗之间通常存在一个“治疗空窗”以帮助患者身体从手术中恢复以完成后续治疗。然而，“治疗空窗”已经被证明是肿瘤复发的机会，同时也是进一步优化治疗的机会。
3.通过优化制剂、减少化疗药物用量来缩短“治疗空窗”是当前本技术领域研究的热点。基于术后复发的因素的复杂，越来越多的关注落在了手术治疗方式可能对肿瘤复发的诱导作用，比如，手术诱导肿瘤复发的一些关键因素，如交感神经系统激活、输血，麻醉剂会导致术后免疫抑制。术后的免疫抑制微环境是诱导肿瘤复发的关键因素。而对微环境的及时纠正可能对于防止胶质母细胞瘤复发具有重要意义。术后免疫抑制的加重有明确的时间轴，可分为急性期、增殖期和重塑期，其中前14天(急性期和增殖期)是免疫细胞浸润和微环境调控的关键时期。正是在这段时间内，局部微环境转变为强免疫抑制状态，以保护机体免受损伤。临床证据表明，术后前两个阶段免疫抑制作用的加重似乎与术后复发有关。杀伤性t细胞是激活肿瘤细胞的另一个潜在治疗靶点，但是杀伤性t细胞在手术后受到抑制。作为t细胞活化的关键信使，树突状细胞激活杀伤性t细胞已成为抑制肿瘤复发的有效策略。另外，浸润的巨噬细胞/小胶质细胞和被抑制的杀伤性t细胞是前两阶段免疫抑制状态的典型细胞。因此，它们的调控对缓解和纠正免疫抑制环境具有重要意义。由于原发性肿瘤中浸润的巨噬细胞/小胶质细胞大部分在实体瘤切除过程中被清除，因此随后被细胞因子受体轴浸润的巨噬细胞/小胶质细胞是术后免疫微环境中的主要成分。cxcl12是一种具有诱导巨噬细胞/小胶质细胞聚集功能的细胞趋化因子，在创伤后2周内达到高峰。据报道，cxcl12-cxcr4轴可作为阻断巨噬细胞/小胶质细胞浸润的潜在靶点。
4.与此同时，术后免疫微环境的变化是持续的，而多次间断静脉注射可能不足以调节这一连续过程。这意味着在辅助治疗中迫切需要能够提供连续给药的给药系统。同时，肿瘤复发的过程与时间有关，因此药物在给药系统中的精确释放应体现在对时间的控制上。可注射水凝胶是一种具有三维网络结构和良好生物相容性的亲水性载体，可用于组织工程和局部给药。然而，已有报道的水凝胶主要是通过绕开血液循环来提高药物释放空间的准确性和效率，而忽略了术后治疗的时间要求。
5.基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供一种具有胶质母细胞瘤术后调控免
疫微环境的原位治疗技术。尤其涉及一种具有按照时间需求进行药物控制释放的可注射水凝胶体系。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种具有胶质母细胞瘤术后调控免疫微环境的原位治疗技术。涉及具有免疫微环境调控功能的可注射水凝胶系统，尤其涉及一种具有按照时间需求进行药物控制释放的可注射水凝胶体系。本水凝胶体系应用于浸润性胶质母细胞瘤切除术后的即时治疗，解除术后免疫抑制微环境，填补临床方案中的治疗空窗期，达到抑制肿瘤复发的作用。
7.本发明的具有胶质母细胞瘤术后调控免疫微环境的的可注射水凝胶系统，包括plga-plga-peg水凝胶，普乐沙福-醋酸锌螯合物，cpg，dgl。
8.优选的，plga-plga-peg水凝胶peg-plga-peg三嵌段分子形成，用于胶质母细胞瘤术后原位组织填充与药物递送。
9.优选的，该用于脑部肿瘤切除术后填充的水凝胶系统由双组分plga-peg-plga三嵌段聚合物构成，其中具有难溶于水特性的嵌段聚合物c1与具有能溶于水特性的嵌段聚合物c2的质量比为2∶1，水凝胶体系的浓度为25wt％。该体系具有稳定的体温下发生溶胶-凝胶转变的特性，胶凝温度为30℃，37℃时，弹性模量为560pa。
10.优选的，药物-锌离子螯合物是利用药物与醋酸锌分子按照1∶2的摩尔比例混合，，在甲醇回流的条件下螯合形成。
11.优选的，药物-锌离子螯合物与水凝胶可以产生静电吸附作用，延长药物释放(＞14天)
12.优选的，cpg纳米粒是通过cpg分子与dgl分子静电吸附的方式进行制备，将cpg与dgl按照氮磷比4∶1的比例，等体积混合形成，所形成的纳米粒具有均匀的粒径，粒径分布在180nm附近。
13.本发明提供了一种具有可注射功能的具备免疫微环境调控功能的水凝胶给药系统用于胶质母细胞瘤术后原位药物递送辅助临床化疗方案抑制肿瘤术后复发。本发明益于利用具有控释功能的免疫治疗的原位治疗体系，本水凝胶药物共递送体系具有在体温下(＞30℃)可以发生溶胶-凝胶转变的功能，可以用于临床手术切除后切除空腔的原位直接填充，该体系可以实现所装载的小分子药物普乐沙福和大分子药物的共装载以及缓慢释放，协同调控肿瘤术后免疫微环境，增强免疫系统对残余肿瘤细胞的杀伤，抑制胶质母细胞瘤的术后复发。
14.由上述制备方案及本发明后续实施例可知：本发明的光热辅助穿透的诊疗型纳米药物，至少有以下优点：
15.1)本发明所述水凝胶中构成原料包括聚乙二醇、d、l-丙交酯，乙二醇不会对机体产生明显毒性；
16.2)与传统静脉给药或口服给药相比，该药物递送体系可以极大的增加药物在靶部位浓度，降低药物对其他脏器组织的毒性；
17.3)本方法中采用纳米技术结合水凝胶原位药物递送载体制备了一种具有大分子药物缓释功能的术后原位药物递释系统；
18.4)本方法采用金属离子螯合技术实现小分子药物的缓慢释放；
19.5)本发明提供了一种可供临床或科研的胶质母细胞瘤术后即时原位免疫治疗方法，该策略可调节急性期和增殖期的术后免疫微环境，以克服目前临床治疗存在的局限。
附图说明
20.图1为制剂表征，其中：
21.a为制剂水凝胶弹性模量剪切模量随温度变化曲线，提示水凝胶性状随温度发生改变，
22.b为动态光散射法测定cpg纳米粒的平均流体动力学尺寸，插图为tem结果，
23.c为cpg纳米粒负载水凝胶的代表性低温扫描电镜图像，
24.d为琼脂糖凝胶电泳研究原始的cpg纳米粒与从水凝胶释放纳米粒子的cpg状态比较，证明cpg以纳米粒形式被释放，
25.e为通过动态光散射测定原始制备的cpg纳米粒的粒径与从水凝胶中释放纳米粒子48小时的比较，
26.f为植入9天后，荧光ivis成像显示不同制剂在体内保留cpg-yoyo3情况，
27.实验重复3次，荧光ivis成像显示不同制剂在体内保留cpg-yoyo3定量结
28.果，在0，3，6，9天测试，数据表示为平均值
±
标准差(n＝3)，
29.g为amd3100-zn与各对照组的h，x射线衍射(xrd)结果，
30.h为不同制剂对神经元的毒性研究，数据表示为平均值
±
标准差(n＝3)。
31.图2为cpg纳米粒促进dc细胞提呈活化杀伤性t细胞分析，其中：
32.a为基于yoyo3标记的cpg的荧光信号，通过流式细胞术分析dc细胞对不同制剂的细胞摄取，
33.b为不同制剂与原代提取的dc细胞共孵育2小时后，cpg-yoyo3和溶酶体在dc细胞中的共定位情况，利用共聚焦显微镜拍摄(40
×
)，
34.c为流式细胞术分析不同制剂诱导的dc成熟能力，流式细胞术分析数据的量化表示为平均值
±
s.d.(n＝3)，
35.d为流式细胞术分析经不同制剂处理的dc细胞诱导的t细胞极化能力。流式细胞术定量分析，数据以平均值
±
s.d.(n＝3)。
36.图3为普乐沙福-锌螯合物抑制cxcl12-cxcr4轴的作用分析，其中：
37.a为利用跨孔迁移实验研究普乐沙福-醋酸锌螯合物对cxcl12诱导的bv2细胞迁移的抑制作用。g1：pbs，g2：cxcl12，g3：cxcl12 amd3100，g4：cxcl12 amd3100-zn，
38.b细胞迁移增加的定量，数据以平均值
±
s.d.表示(n＝3)，
39.c为利用跨孔迁移实验研究普乐沙福-醋酸锌螯合物对cxcl12诱导的raw细胞迁移的抑制作用。g1：对照 pbs，g2：cxcl12，g3：cxcl12 amd3100，g4：cxcl12 amd3100-zn，
40.d为细胞迁移增加的定量，数据以平均值
±
s.d.表示(n＝3)，
41.e为阻断amd3100锌对c57小鼠g422胶质瘤组织cxcl12介导的肿瘤复发和cxcr4过表达的方案，
42.f为g422细胞经不同制剂处理48小时后的细胞增殖情况。数据以平均值
±□
s.d.(n＝3)表示，
43.g为不同制剂组处理g422细胞48小时后，细胞stat3/p-stat3的western印迹分析，
44.h为qpcr分析不同组g422细胞中vegf的表达，数据以平均值
±□
s.d.(n＝3)表示，
45.i流式细胞术分析不同制剂处理的cpg纳米粒诱导的dc成熟，
46.j为流式细胞术分析的定量，数据以平均值
±
s.d.(n＝3)表示。
47.图4为术后第七天的免疫情况以及肿瘤复发分析，其中：
48.a为动物模型以及分析方案，在c57小鼠颅内原位植入g422细胞10天后，进行手术切除，基于不同制剂处理，术后第七天进行分析，
49.分组情况：g1：pbs，g2：空白水凝胶，g3：游离amd3100-zn及cpg纳米粒，g4：水凝胶包含amd3100 cpg，g5：水凝胶包含amd3100及cpg纳米粒，g6：水凝胶包含amd3100-zn及cpg，g7：水凝胶包含amd3100-zn及cpg纳米粒；
50.b-c为用流式细胞术分析不同治疗术后一周肿瘤病灶中的cd8 t细胞、和小胶质细胞/巨噬细胞水平的定量结果(n＝3)，
51.d-f为用elisa分析分析不同治疗术后一周脑组织中ifn-γ，tnf-α，il-10分泌情况的定量结果(n＝3)；
52.g-h为用流式细胞术分析不同治疗术后两周肿瘤病灶中的cd8 t细胞、和小胶质细胞/巨噬细胞水平的定量结果(n＝3)，
53.i为用wb分析术后第七天脑组织中stat-3，p-stat3，vegf表达情况(n＝3)，
54.j为术后第七天小鼠脑切片he染色结果表征术后肿瘤复发程度。
55.图5为术后第七天各对照组脏器he染色结果表征制剂毒性，结果显示制剂不会引起脏器毒性，提示良好的安全性。
具体实施方式：
56.以下通过具体实施方式详细说明本发明的技术方案，应理解以下的具体实施方案仅为示例性，任何改动或变化只要不脱离本发明的技术方案设计，都应在本发明权利的要求保护范围之内。
57.实施例1
58.1)合成plga-peg-plga共聚物p1：
59.精密称取10.0g peg1000于250ml三颈烧瓶中，加热至120℃3小时。将温度冷却至100℃，精密称取26.8g d、l-丙交酯、2.7g乙二醇和89mg辛酸亚锡添加于烧瓶中。150℃氩气气氛下反应12h。共聚完成后，粗产物在80℃的水中洗涤三次，除去未反应的单体、催化剂和低分子量共聚物。冻干后得到纯品，-20℃保存至使用。
60.2)合成普乐沙福-锌螯合物
61.精密称取20mg普乐沙福和16.4mg醋酸锌粉末，溶于3ml甲醇中，80℃加热甲醇回流装置下反应3小时。旋蒸除去甲醇液体。乙醚洗涤产物三次，获得普乐沙福-锌螯合物。
62.3)制备cpg纳米粒
63.精密称取dgl粉末25.0mg，溶于1.0ml双蒸水中，混合均匀，制备形成25mg/ml的dgl储备溶液。精密称取cpg-odn粉末1mg，溶于1ml双蒸水中，制备形成1mg/ml的cpg-odn溶液。以双蒸水稀释dgl储备溶液至1.85mg/ml，取等体积dgl溶液与cpg-odn溶液吹打混匀，静置30分钟
64.4)制备空白水凝胶
65.采用直接溶解法制备，精密称取1.40g聚合物c1和0.7g聚合物c2，溶于6.3ml双蒸水中，获得质量分数为25wt％的共聚物溶液，c1/c2的质量比为2/1。
66.5)制备含药水凝胶
67.按10μg/20μl浓度，称取普乐沙福-锌螯合物粉末，按cpg-odn浓度为20μg/20μl浓度，取cpg纳米粒悬浊液，与水凝胶溶液混合，形成含药水凝胶。
68.本发明的具有可注射功能的具备免疫微环境调控功能的水凝胶给药系统进行了动物实验，结果显示(如图1-图5所示)，所述水凝胶给药系统具有在体温下(＞30℃)可以发生溶胶-凝胶转变的功能，可以用于临床手术切除后切除空腔的原位直接填充，该体系能实现所装载的小分子药物普乐沙福和大分子药物的共装载以及缓慢释放，协同调控肿瘤术后免疫微环境，增强免疫系统对残余肿瘤细胞的杀伤，抑制胶质母细胞瘤的术后复发。本水凝胶药物共递送体系有益于利用具有控释功能的免疫治疗的原位治疗体系。