预防性治疗猪的疫苗组合的制作方法

1.本发明大体上涉及猪(swine/pig)健康的领域。猪容易感染许多病原微生物。感染的控制通常是通过农场和饲料管理，用抗病毒药物和抗生素等药物治疗，或用疫苗预防性治疗。特别是，本发明涉及针对猪圆环病毒2型(pcv2或pcv-2)、猪肺炎支原体以及猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒的疫苗，以及使用此类疫苗保护动物免受此类感染的方法。


背景技术：

2.pcv-2与在仔猪中观察到的断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)有关。这种疾病于1991年在加拿大首次出现。临床体征和病理首次发表于1996年，包括进行性消瘦、呼吸浑南、呼吸急促，偶尔出现黄疸和黄疸。
3.nayar等,can.vet.j.volume 38,june 1997在有pmws临床症状的猪上检测到了pcv，并得出结论，除了已知的pk-15细胞自然宿主pcv外，pcv可能与pmws有关。后来的出版物(hamel等,j.virol.,72(6),5262-5267,1998；meehan等,j.gen.virol.,79,2171-2179,1998)证实了这些发现，并且有人建议(meehan等，同上)将新的致病性pcv称为pcv-2，而最初的pk-15细胞培养分离物(tischer等,nature 295,64-66,1982)则称为pcv-1。
4.pcv-2是一种小的(17-22nm)二十面体非包膜病毒，含有一个环状单链dna基因组。pcv-2基因组的长度约1768bp。来自世界不同地区的pcv-2分离株之间关系密切，显示出约95至99％核苷酸序列同一性(fenaux等,j.clin.micorbiol.,38(7),2494-2503,2000)。micorbiol.,38(7),2494-2503,2000)。pcv的orf2编码病毒的衣壳蛋白。pcv-2的orf2基因编码约233个氨基酸的蛋白质。所有pcv-2分离株的orf2基因具有91-100％核苷酸序列同一性和90-100％的推导氨基酸序列同一性。
5.猪肺炎支原体(mhyo)是一种已知可引起猪地方性肺炎的细菌，这是一种影响猪的高度传染性和慢性疾病。mhyo体积小(400-1200nm)，有一个小的基因组(893-920千碱基对(kb))并缺乏细胞壁。mhyo附着在猪的肺部上皮细胞的纤毛上。它们导致纤毛停止跳动、结块和纤毛丢失，最终导致上皮细胞死亡。这是猪地方性肺炎猪肺部病变的来源。这种损伤阻碍了正常的纤毛清除，并且经常会发生继发性感染，导致动物体重的显著下降。据估计，美国的损失每年高达10亿美元。猪流行性肺炎在全世界流行，mhyo几乎存在于所有猪群中。猪体内存在mhyo所诱发的免疫反应缓慢且无效。因此这种疾病的治疗是最重要的，但仅限于抗生素，因为抗生素目前仅部分有效，不能完全消除感染。已经发现疫苗可以降低疾病的严重程度，但不能完全防止该病在受感染猪群中发生。
6.prrs病毒于1987年首次在北美和中欧报道。prrs病毒是小型的、包膜rna病毒。它包含单链、正义的rna基因组，大小约15千碱基。该基因组包含九个开放阅读框。该病毒是动脉炎病毒属、动脉炎病毒科、尼多病毒目成员。prrsv的两个原型毒株是北美毒株vr-2332和欧洲毒株lelystad病毒(lv)。欧洲和北美prrsv毒株引起类似的临床症状。最近在中国出现了一个北美基因型的高致病性毒株。该毒株，hp-prrsv，比所有其他株的毒性更强，并在亚洲国家造成巨大损失。临床症状包括母猪繁殖失败，如流产和产下死胎或木乃伊胎，以及耳
朵和外阴发绀。在新生猪中，这种疾病会导致呼吸窘迫，增加对呼吸道感染的易感性，如病。
7.针对上述确定的病原体的疫苗是常见的。预防性治疗动物，特别是猪感染pcv2的常规疫苗，可能基于全灭活pcv-2病毒作为(非复制性)免疫原。另外，在本领域中已经证明orf2编码的衣壳蛋白(例如，当重组表达时)适合作为pcv-2的亚单位免疫原用于适当的疫苗。这是可以理解的，因为循环系统中的这个亚单位与病毒本身呈现相同的方式(它形成病毒样颗粒)，本质上的区别仅在于dna和非结构蛋白不存在于衣壳内。目前，市售有几种针对pcv-2的疫苗。2的疫苗。pcv(msd animal health,boxmeer,the netherlands)是一种针对猪pcv-2的疫苗，适用于三周及以上的猪。当作为两针(两剂)疫苗接种时，免疫持续时间(doi)为22周，几乎完全覆盖了猪的育肥期。ingelvac(boehringer ingelheim,ingelheim)是一种针对猪pcv-2的疫苗，适用于两周及以上的猪。它登记为仅一针(一剂)疫苗。(ceva,libourne,france)是一种针对猪pcv-2的疫苗，适用于三周及以上的猪。pcv(zoetis,capelle a/d ijssel,the netherlands)是一种针对猪pcv-2的疫苗，适用于三周及以上的猪。其他pcv-2疫苗在例如wo2007/028823、wo 2007/094893和wo2008/076915中描述。
8.关于mhyo，存在许多商业疫苗并且这些疫苗通常用于大多数商业养猪作业。通常，这些疫苗包含非复制性免疫原例如亚单位蛋白和/或细菌(即包含被杀死细菌的组合物，可以是全细胞，(部分)裂解的、均质的、法式压榨的，这种组合或由另一种形式的被杀死的细菌组成，只要该组合物来自被杀死细菌培养物)，通常通过肠胃注射给药。一些例子是：(zoetis)，m.hyo，和(boehringer ingelheim)、(merial)、mycoplasma(elanco animal health)，mh(zoetis)和和mhyo(均购自msd animal health)。
9.关于prrs病毒，虽然已经描述了灭活病毒疫苗并且可以是市售的，但由欧洲型(i型)或北美型(ii型)减毒活疫苗组成的修饰活疫苗(mlv疫苗)是控制它的主要免疫工具。本领域市售多种疫苗。pcv(msd animal health,boxmeer,the netherlands)是一种由i型prrs病毒减毒活疫苗组成的疫苗，以减少由prrs病毒感染引起的感染(病毒血症)。ingelvacmlv(boehringer ingelheim,ingelheim)是一种有助于减少由prrs病毒引起的疾病的疫苗，该疫苗对不痛类型的毒株提供交叉保护。prrs(zoetis,florham park,new jersey,usa)也是一种mlv疫苗，用于预防prrs病毒引起的呼吸道和生殖疾病。另一种prrs mlv疫苗是primepac prrs(ii型)，可购自merck animal health,madison,nj,usa。其他prrs疫苗在例如wo2006/074986、us 8728487和wo2014/048955中描述。
10.上述疫苗通常作为单价疫苗、即用型混合物(例如porcilis pcv m hyo)、终端用户制造混合物(例如ingelvac 3flex)和/或用于相关非混合用途，如wo2018/189290中所述。
11.发明目的
12.猪的健康管理持续需要方便、安全和有效的方法。特别是需要方便、安全且有效的疫苗，可用于预防性治疗猪的pcv-2感染、mhyo感染和prrs病毒感染，从而提供充分的保护，
而不会对疫苗接种过程产生严重的负面影响，同时尽量减少对接种猪的压力。


技术实现要素：

13.为了达到本发明的目的，发现第一疫苗(包含猪圆环病毒2型(pcv2)的非复制性免疫原和猪肺炎支原体的非复制性免疫原)和第二疫苗(包含减毒活猪繁殖与与呼吸综合征(prrs)病毒)的组合通过所述第一疫苗和所述第二疫苗分别在第一和第二注射部位注射至猪的组织中的单独注射可有利地用于所述猪的猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和prrs病毒感染的预防性治疗，其中所述第一和第二注射部位彼此之间最多间隔5cm。
14.虽然在wo2018/189290中已经描述了第一疫苗(包含pcv-2的非复制性免疫原和mhyo的非复制性免疫原)和第二疫苗(包含减毒活prrs病毒)的关联单独施用，但发现通过将第一疫苗和第二疫苗分别注射到猪的组织中，彼此之间最多间隔5cm，可以进一步提高保护效果，而不引入任何副作用。在不受理论约束的情况下，相信近距离的注射会以某种方式刺激免疫反应，可能是通过增加在所要求的组合中使用的抗原，即pcv-2和mhyo的非复制性免疫原以及减毒活prrs病毒的局部存在。抗原局部存在的增加似乎会提高单独疫苗的效力，或至少不会降低效力，而不会诱发任何不必要的副作用。尽管通常情况下，注射后在猪组织(如肌肉组织)中的沉积区可能达3-4cm，因此，当两个单独的疫苗将被注射到6-7cm的距离时，仍然会有沉积区的重叠，并且因此预计会有刺激作用，但据信，当注射部位之间的距离超过5cm时，各自疫苗的沉积区重叠很小，以至于没有任何实际优势。
15.本发明还涉及一种用于预防性治疗猪的猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和prrs病毒感染的成套试剂盒，其包含第一疫苗和单独地第二疫苗，所述第一疫苗包含猪圆环病毒2型(pcv2)的非复制性免疫原和猪肺炎支原体的非复制性免疫原，所述第二疫苗包含减毒活prrs病毒，所述成套试剂盒是通过所述第一疫苗和所述第二疫苗分别在第一和第二注射部位注射至猪的组织中的关联单独注射来使用，其中所述第一和第二注射部位彼此之间最多间隔5cm。
16.本发明还体现一种通过第一疫苗和第二疫苗分别在第一和第二注射部位注射至猪的组织中的关联单独注射来预防性治疗所述猪的猪圆环病毒2型(pvc2)感染、猪肺炎支原体感染和prrs病毒感染的方法，其中所述第一和第二注射部位彼此之间最多间隔5cm。
17.定义
18.疫苗是一种可安全施用于受试动物的药物组合物，并且能够诱导该动物对病原微生物的保护性免疫，即诱导成功的预防性治疗，如下所述。
19.第一和第二疫苗的组合是一组疫苗，其中第一疫苗单独地与第二疫苗不同，但这两种疫苗在一次协同治疗中联合施用于同一受试者。
20.病原体的非复制性免疫原是与病原体相对应的任何物质或化合物，而不是整体的活体可复制性病原体(野生型或减毒型)，病原体对其会产生免疫反应，从而使相应的毒性病原体或其异种或多种毒性因子作为这种免疫反应的结果被宿主的免疫系统所识别，并最终至少部分地被中和。非复制性免疫原的典型例子是杀死的整个病原体(该术语包括裂解形式的病原体)和这些病原体的亚单位例如衣壳蛋白、表面表达分子(例如重组表达蛋白或脂多糖)和分泌分子例如毒素。
21.菌苗是被杀死的细菌悬浮液，可以是全细胞，也可以是部分裂解或完全裂解(例如
通过均质化、法压或两种或多种裂解方法的组合)。
22.减毒活病原体是一种可存活的、具有复制能力的、毒性降低的病原体形式。减毒的过程是将传染性病原体变得无害或毒性较低，通常通过细胞系统多次传递病原体或通过对病原体进行基因改造。
23.针对病原体感染的预防性治疗有助于预防、改善或治愈该病原体感染或该感染引起的疾病，该疾病是由病原体治疗后的挑战引起的，特别是在这种挑战后减少其在宿主体内的负荷，或帮助预防或改善因治疗后病原体感染而导致的一种或多种临床表现。
24.猪是属于偶蹄类哺乳动物(俗称猪、猪或公猪)的猪科动物。目前已知的现存物种有十八种(或分别按家猪和野猪算的十九种)，分为四至八个属。在这个家族中，sus属包括家猪，物种家猪或家猪。
25.联合接种疫苗，也称为同时接种，是指分别向目标动物接种这些疫苗，因此在接种前不混合，但在免疫干扰预计会发生的时间范围内，通常在24小时内。联合使用的例子是在目标动物的不同应用部位同时接种，以及在同一或不同应用部位但在不同时间接种，通常间隔1-6小时。
26.同时接种疫苗是指在完全相同的时间或至少在1小时的时间范围内接种，优选在55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2分钟内，甚至在1分钟内。
27.用于预防性治疗的疫苗的单剂量接种意味着为了达到保护性免疫，不需要通过第二次接种来加强疫苗接种。在两针疗法中，第一(主要)疫苗接种通常在第一次接种后6周内加强，通常在第一次接种3或2周内加强，只有在第二(加强)接种后才能获得保护性免疫力，即上文定义的成功预防性治疗。
具体实施方式
28.在根据本发明所述用途的第一和第二疫苗组合的一个实施方式中，第一和第二注射部位彼此之间最多间隔3cm。据信注射的距离越近，所发现的刺激作用就越大。
29.在根据前述权利要求中任一项所述用途的第一和第二疫苗的组合的另一个实施方式中，其特征在于第一和第二疫苗的关联单独注射同时发生。本实施方式的优点是只需处理一次动物，或至少在很短的时间内，因为两种疫苗的沉积距离很近。
30.在另一个实施方式中，通过所述注射的第一和第二疫苗至少部分地沉积到猪的肌肉组织中。猪的肌肉组织被发现对近距离沉积两种独立的疫苗特别有利。例如可以通过使用伸入肌肉组织的皮下注射器来注射疫苗，或者通过使用无针装置的各自疫苗的喷射流注射，其中喷射流可穿透猪的皮肤病最终到达下面的肌肉组织(不排除部分疫苗沉积在真皮层)。
31.在另一个实施方式中，第一和第二疫苗是通过单剂量施用。研究发现单剂量接种这两种疫苗均可有效预防所有病原体。这为保护动物免受这些病原体的侵害提供了一种非常方便且经济的方法。
32.在另一个实施方式中，pcv-2的非复制性免疫原是由pcv-2的orf2基因编码的重组表达的蛋白，例如本领域已知的pcv-2的杆状病毒表达蛋白。该重组蛋白已被证实适用于本发明的应用。特别是，orf2蛋白可以在杆状表达系统中表达，如wo2007/028823、wo2007/
094893或wo2008/076915中所述。
33.在另一个实施方式中，猪肺炎支原体的非复制性免疫原是猪肺炎支原体菌苗。这种mhyo抗原相对容易生产，并且在日常养猪行业实践中有良好的疗效记录。
34.现在将用以下的实施例更详细地解释本发明。
35.实施例
36.目的
37.本试验的目的是通过接种后2周的pcv2挑战，确定不同混合或非混合的pcv-2、mhyo和prrs疫苗对3周龄仔猪的效力。基于血清学评估prrs和mhyo效力。
38.研究设计
39.本研究使用三十头猪。三组10只3周龄( /-3天)的动物接种疫苗。组1在颈部右侧用皮下注射器肌肉注射2ml商业疫苗porcilis pcv m hyo(包含杆状表达的pcv2 orf2蛋白和mhyo菌苗)，并在颈部同侧用皮下注射器肌肉注射单剂量2ml商业疫苗porcilis prrs(包含减毒活prrs病毒，i型)，与另一接种部位间隔3cm。组2接受了同样的疫苗接种，但pcv mhyo疫苗是在颈部右侧接种，而prrs疫苗是在颈部左侧接种。组3只接种prrs疫苗，作为pcv-2攻击对照。接种后两周(5周龄)，所有动物都接受挑战，使用5.8log
10 tcid
5o
的野生型pcv-2b攻击病毒的剂量，在鼻内注射。
40.攻毒后三周，对所有动物进行解剖，并对腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体和肺部进行采样用于pcv-2核酸检测。接种后，每天观察所有仔猪的临床症状。在接种疫苗当天和2、4和5周后(尸检时)收集血清样本。检测样本是否存在pcv-2病毒核酸以及抗prrs和mhyo抗体。
41.结果
42.接种疫苗是安全的，没有发现不可接受的副作用。
43.pcv-2结果一致表明对pcv-2攻毒具有改善的保护作用。结果示于下表1-3中。可以看到，病毒血症(在sd28和35)，特别是各种原始组织中的病毒载量和ihc评分似乎在组1得到了总体改善，该组接种两种疫苗的距离很近，即在5cm内，特别是在3cm左右。
44.表1pcv2病毒血症(qpcr)
[0045][0046]
表2组织中pcv2病毒载量(log10拷贝数/ul)
[0047] 扁桃体肺inglnmesln1.pcv m hyo prrs(同侧)4.584.423.973.862.pcv m hyo prrs(不同侧)5.284.774.834.063.对照(prrs)7.416.326.716.89
[0048]
表3平均ihc评分
[0049] 扁桃体inglnmesln总分
1.pcv m hyo prrs(同侧)0.30.30.41.02.pcv m hyo prrs(不同侧)0.70.40.41.53.对照(prrs)2.52.32.47.2
[0050]
此外，组1的mhyo结果似乎有所改善。结果如下表4和5所示。血清转换更快，获得的s/p比率也一直较高。
[0051]
表4血清转化动物百分比
[0052] sd0sd13sd28sd351.pcv m hyo prrs(同侧)02090902.pcv m hyo prrs(不同侧)0040803.对照(prrs)0000
[0053]
表5对mhyo的免疫反应
[0054][0055]
此外，组1的prrs结果似乎有所改善。结果如下表6所示。组1获得的s/p比率一直较高。
[0056]
表6prrs免疫反应(elisa)
[0057][0058]
简而言之，与在颈部不同部位注射pcv mhyo疫苗和prrs疫苗相比，单独注射pcv mhyo疫苗和prrs疫苗的距离很近导致了整体更好的免疫应答。考虑到这种效应对所有类型的抗原都存在，无论是亚单位抗原(pcv2的orf2蛋白)、菌苗(mhyo)或减毒活病毒(prrs)，抗原的准确选择似乎并不关键。因此认为，至少当第一疫苗包含与所列举的基本类型相同的免疫原，即通常诱导体液免疫反应的非复制免疫原，以及第二疫苗包含减毒活prrs病毒时，可以获得本发明的优点。