血红素过氧化物酶的生产方法

血红素过氧化物酶的生产方法1.本发明涉及生产血红素过氧化物酶的方法。2.血红素过氧化物酶是一类重要的工业酶，具有广泛的应用，包括免疫分析、诊断试剂盒、诸如elisa、emsa、蛋白免疫印迹和southern印迹的基于探针的检测技术、废水处理、作为有机合成的试剂，以及潜在的治疗应用。血红素过氧化物酶类中一个众所周知的成员是辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)，它通常用于研究和工业。3.迄今为止，血红素过氧化物酶经常从植物中产生；例如hrp主要由辣根(armoraciarusticana)毛状根培养物提取而得。然而，这是一个效率低下、耗时的过程。缺点包括产量低、栽培时间长、仅季节性供应、同工酶成分异质(制剂的生化特性不同)、对根系生长条件的依赖性、以及植物糖基化模式，这些模式对人类具有免疫原性，可能导致不符合医疗用途要求。4.血红素过氧化物酶的重组生产是一种理想的替代方法，因为它是一种更有前途的生产方式，可以确保稳定供应高质量的特定酶制剂。特别是，在大肠杆菌(e.coli)中进行重组生产可以获得一种具有稳定生化特性的亚型的特定制剂，同时缺乏糖基化，因此不具有免疫原性。5.然而，天然血红素过氧化物酶的重组生产具有挑战性。例如，hrp在八个天冬酰胺残基上含有糖基化，使得重组生产困难。与植物源酶相比，大肠杆菌产生的野生型hrp的稳定性较低。6.为了在不同宿主中重组产生血红素过氧化物酶，人们做了许多尝试：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母菌(巴氏酵母菌(p.pastoris)和酿酒酵母(s.cerevisiae))、其他植物(红花烟草(nicotianatabacum)、本氏烟草(nicotianabenthamiana)、辣根(armoracialapathifolia))和大肠杆菌。然而，这些生产策略导致产量极低和/或酶活性和稳定性降低。对于大肠杆菌的生产，这是由于细胞内产生的蛋白质导致因大肠杆菌细胞质中还原条件形成包涵体。因此，下游过程比在酵母中更精细。通过添加信号序列，酶也可以转位到周质，但随后产量甚至更低，酶的活性和稳定性可能会因添加转位标签而受到影响。此外，大肠杆菌不能进行翻译后修饰，因此酶不糖基化，导致蛋白质稳定性降低。7.过去进行了几项研究，目的是改善重组hrp的性质。humer和spadiut("improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis."internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)总结了通过突变改善hrp特性的尝试，其中揭示了一些突变对稳定性和/或酶活性的影响。8.然而，尽管做出了所有这些努力，仍然缺乏新的和改进的血红素过氧化物酶生产方法。特别是，需要在合适的宿主(特别是大肠杆菌)中重组生产和纯化血红素过氧化物酶的方法。本发明的目的是提供这种方法。9.因此，本发明提供了一种从包涵体(ib)生产血红素过氧化物酶的方法，包括以下步骤：[0010]-以ib的形式提供血红素过氧化物酶；[0011]-溶解所述ib；[0012]-将溶解的ib转移到复性缓冲液中，以获得复性混合物；[0013]-向所述复性混合物中添加血红素辅因子，其中在至少1小时、优选至少2小时、更优选至少3小时、更优选至少6小时、尤其是至少10小时的时间段内向复性混合物分散添加血红素辅助因子。[0014]此外，本发明提供了一种生产血红素过氧化物酶产品的方法，包括生产根据本发明的血红素过氧化氢酶。[0015]在本发明的背景下，令人惊讶的是，当在某一时间段内将血红素辅因子分散添加到复性混合物，血红素过氧化物酶的复性过程可以得到显著改善(参见实施例3，特别是表5和表6之间的比较)。在不受特定理论约束的情况下，发明人推测这种有益效果是由于血红素辅因子的疏水性。由于这种辅因子是形成全酶所必需的，因此复性产量取决于复性后可整合进正确折叠的血红素过氧化物酶中的游离血红素辅因子。由于辅因子的疏水性，如果在一个步骤中添加，它可能会形成无法整合的聚集体。[0016]如下文更详细地描述的，当在添加血红素辅因子之前将复性混合物孵育一定时间时(具体参见图1)、当使用具有特定氧化还原特性和ph值的溶解和复性缓冲液时(参见实施例2-5)、当复性后包括具有特定盐浓度的沉淀步骤时(参见实施例4，表9)、以及当通过疏水相互作用色谱进一步纯化蛋白质时(hic；参见实施例4)，观察到了进一步的有利效果。重要的是，所有这些单独的功能可以相互独立地产生有利的效果。此外，当其中一些，尤其是全部被组合起来时，可以获得高度优化和高效的工艺(特别参见实施例5)。[0017]除了这种新的和改进的生产工艺外，本文还公开了hrp的新突变体，它们不仅比野生型hrp和已知的hrp突变体提供了改进的热稳定性和动力学参数，而且特别适合于细菌中的重组生产；特别是根据本发明的方法。因此，可以将高度改良的血红素过氧化物酶与高效生产工艺相结合。[0018]来自ib的蛋白质表达和复性技术已经得到确认，并且在本领域中常用。例如，cabrita和bottomley("proteinexpressionandrefolding-apracticalguidetogettingthemostoutofinclusionbodies."biotechnologyannualreview10(2004):31-50)以及yamaguchi和miyazaki("refoldingtechniquesforrecoveringbiologicallyactiverecombinantproteinsfrominclusionbodies."biomolecules4.1(2014):235-251)给出了此类技术的概述。重组蛋白在细菌(如大肠杆菌)中的过度表达通常会导致ib的形成，ib是具有非天然构象的蛋白聚集体。“包涵体”(ib)是指存在于转化宿主细胞细胞质中的含有异源多肽(如血红素过氧化物酶)的不溶性聚集体。这些通常在显微镜下显示为亮点，可以通过细胞质分离来恢复。这种包涵体通常含有相对纯净和完整的蛋白质；然而，包涵体需要被溶解，蛋白质需要复性成它们的天然结构。[0019]通常，ib在含有变性剂(如尿素)、盐酸胍(gdnhcl)或离子洗涤剂(如n-月桂酰氯)的溶解缓冲液中溶解。通常添加还原剂，如2-巯基乙醇(β-me)、二硫苏糖醇(dtt)或1-单硫甘油(mtg)，以减少非天然分子间和分子内二硫键，并保持半胱氨酸处于还原状态。术语“溶解(solubilization)”或“溶解(solubilizing)”是指溶解ib所需的过程，旨在以最小的分子内和分子间相互作用实现多肽的单分子分散。“溶解缓冲液”是一种适合溶解ib的缓冲液，即通常具有充分变性条件的缓冲液。[0020]从变性蛋白质(可溶性ib)到活性蛋白质(折叠形式)的复性通常通过去除变性剂发生，是有效回收蛋白质的关键步骤。术语“复性(refolding)”是指变性蛋白质获得天然构象或活性构象的机制。本领域已知几种复性方法。由于其简单性，稀释复性是一种优选方法，特别是在生产级别中。蛋白质浓度和变性剂浓度在一步内降低，防止分子间相互作用聚集。本文所用的“复性缓冲液”是指适合复性目的的缓冲液，即提供条件使变性蛋白质获得其天然构象或活性构象的缓冲液。复性蛋白的复性效率(产量)可以通过生物活性(如酶活性)来估计。[0021]本领域已经描述了从包涵体中生产和纯化血红素过氧化物酶的多种方法。eggenreich等人概述了此类技术("productionstrategiesforactiveheme-containingperoxidasesfrome.coliinclusionbodies-areview."biotechnologyreports10(2016):75-83)。已经描述了用于生产各种血红素过氧化物酶的这些工艺，所有这些酶都可以使用上述相同的基本工艺(ib生产、溶解、复性)。示例包括辣根过氧化物酶(smith等人，"expressionofasyntheticgeneforhorseradishperoxidasecinescherichiacoliandfoldingandactivationoftherecombinantenzymewithca2 andheme."journalofbiologicalchemistry265.22(1990):13335-13343)，真菌染料脱色过氧化物酶(linde等人，"heterologousexpressionandphysicochemicalcharacterizationofafungaldye-decolorizingperoxidasefromauriculariaauricula-judae."proteinexpressionandpurification103(2014):28-37)，阳离子细胞壁过氧化物酶(kim等人，"optimizedrefoldingandcharacterizationofs-peroxidase(cwpo_cofpopulusalba)expressedine.coli."proteinexpressionandpurification80.2(2011):268-273)，拟南芥过氧化物酶(shigeto等人，"catalyticprofileofarabidopsisperoxidases,atprx-2,25and71,contributingtostemlignification."plosone9.8(2014))，负离子烟草过氧化物酶(zakharova等人，"high-yieldreactivationofanionictobaccoperoxidaseoverexpressedinescherichiacoli."proteinexpressionandpurification113(2015):85-93)等。[0022]wo2014/128726a2描述了ib重组蛋白的复性过程；然而，它与过氧化物酶或血红素辅因子无关。[0023]lin等人("highyieldproductionoffungalmanganeseperoxidasesbye.colithroughsolubleexpression,andexaminationoftheactivities."proteinexpressionandpurification145(2018):45-52)描述了大肠杆菌中可溶性形式的真菌锰过氧化物酶类的表达。描述了一种与ib复性完全无关的方法，该方法将氯化血红素连续添加到细菌细胞培养物中，以增加细胞中氯化血红素的摄入量，并避免在蛋白表达过程中破坏适当的细胞活性。[0024]血红素过氧化物酶是含有血红素的酶，可以使用过氧化氢作为电子受体来催化氧化反应。在本发明的背景下，血红素过氧化物酶优选为酶代码ec1.11.1.7(酶委员会编号)的酶。血红素过氧化物酶的一个主要超家族，也是本发明的首选，是植物、真菌和细菌过氧化物酶的超家族(见welinder"superfamilyofplant,fungalandbacterialperoxidases."currentopinioninstructuralbiology2.3(1992):388-393)。这个超家族通常被视为由三大类组成：第i类是细胞内过氧化物酶，第ii类是分泌型真菌过氧化物酶，而第iii类则是分泌型植物过氧化物酶。ii类和iii类相似，因为它们的成员通常有一个血红素基团，4个二硫键，并结合两个ca2 离子。此外，这两个类别的成员通常在天然状态下糖基化，在大肠杆菌中难以表达。由于在本发明方法的背景下，血红素辅因子在一定时间内分散添加的有利效果，除其他外，是该辅因子的性质的结果，因此本发明方法可以有利地用于所有血红素过氧化物酶的复性。然而，由于ii类和iii类血红素过氧化物酶对重组表达特别具有挑战性，因此这些类别特别受欢迎。因此，在优选实施方案中，血红素过氧化物酶是ii类或iii类血红素过氧化氢酶，尤其是iii类血红素过氧化物酶。[0025]本发明背景下使用的血红素辅因子可以是血红素本身，或整合进载脂蛋白过氧化物酶的任何血红素前体或衍生物。例如，氯化血红素(血红素的三氯化铁型；cas[16009-13-5])经常用作血红素辅因子(参见与从上述包涵体中生产和纯化血红素过氧化物酶的方法相关的出版物)。因此，在本发明的优选实施方案中，血红素辅因子是氯化血红素。[0026]在本发明的背景下，特别优选血红素过氧化物酶是辣根过氧化物酶(hrp)。如果hrp是一种突变型hrp，其在大肠杆菌中优化重组表达和/或具有改进的性质，例如改进的热稳定性和/或改进的催化性质，则尤其优选。[0027]令人惊讶的是，在野生型hrp的脯氨酸-146(p146)和/或天冬酰胺-275(n275)位置引入突变可以改善hrp的性质。特别是，发现此类hrp突变体可以在大肠杆菌中以高产量(特别是使用根据本发明的方法)和高纯度重组生产，显示出令人惊讶的良好热稳定性(参见实施例7)和令人惊讶的高酶活性(参见实施例8)。尽管已经研究了hrp的许多突变(参见humer和spadiut，"improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis."internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)，但现有技术中尚未描述氨基酸p146和/或n275的替代。[0028]野生型hrp的序列在本领域是已知的，例如gajhede等人("crystalstructureofhorseradishperoxidasecatresolution."naturestructuralbiology4.12(1997):1032-1038,proteindatabankpdbid1atj)或uniprot条目p00433。除非另有规定，此处使用的残基编号是指seqidno:1中规定的野生型hrp序列(p146和n275位置用粗体表示)。[0029]野生型hrp(seqidno:1)：[0030][0031]植物源的酶经翻译后被修饰，除其他外，产生一个游离的n端，没有附加蛋氨酸。然而，当例如在大肠杆菌中重组产生时，它通常由于起始密码子在产生时带有n端蛋氨酸残基。因此，重组产生的野生型hrp通常具有以下序列：[0032]重组产生的野生型hrp(seqidno:2)：[0033][0034]在本发明的一个实施方案中，血红素过氧化物酶包括包含如seqidno:1所示氨基酸序列的多肽。更优选地，血红素过氧化物酶是包含如seqidno:2所示氨基酸序列的肽。当血红素过氧化物酶是包含与seqidno:1相比含有至少两个氨基酸交换的氨基酸序列的多肽时，获得了特别好的结果，其中所述至少两个胺基酸交换是seqidno:1的氨基酸p146和n275的交换。从实施例7中提供的实验结果可以看出，p146和n275的氨基酸交换组合(在hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k中)可以导致比仅一个位置交换(hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d或hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k)更高的热稳定性。[0035]在本发明的背景下，特别优选血红素过氧化物酶包含氨基酸序列，该序列包含与seqidno:1相比的至少一个氨基酸交换，其中所述至少一个胺基酸交换选自p146q、p146a、p146r、p146v、p146e、n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e组成的组。特别推荐p146q和n275k。[0036]与seqidno:1相比，如果氨基酸序列包含选自p146q、p146a、p146r、p146v和p146e，特别是p146q组成的组的氨基酸交换，则更优选。与seqidno:1相比，如果氨基酸序列包括选自n275k、n275r、n275d、n275s、n275q、n275a和n275e，优选n275k，如果p146(尤其是p146q)的一个首选氨基酸交换和n275(尤其是n275k)的一种首选氨基酸交换结合，则是最优选的。从实施例7和8中提供的实验结果可以看出，这种组合可以导致高热稳定性(与hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d或hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k相比，在hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275中)和高酶活性(与hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d相比，在hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275中)。在本发明的背景下，当多肽包含seqidno:3中所示氨基酸序列时，观察到了特别有利的结果。所述序列包括相对于seqidno:1的氨基酸交换p146q和n275k，以及氨基酸交换n13d、n57s、n175s、n255d和n268d(均在下面用粗体标记)。[0037]hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:3)：[0038][0039]如上所述，对于野生型hrp，当重组产生时，例如在大肠杆菌中，突变型hrp通常会产生起始密码子产生的n端蛋氨酸残基。因此，上述hrp突变体通常将以蛋白质的形式重组产生，序列如下：[0040]重组生产的hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)：[0041][0042]如上所述，在本发明背景下使用的突变体通常包含n端蛋氨酸。然而，在所有情况下，根据本发明使用的氨基酸编号是根据缺乏n端蛋氨酸的野生型序列应用的(seqidno:1)；即该编号适用于相应地包含n端蛋氨酸的突变体，这意味着例如，在seqidno:4中，突变n13d位于(绝对)第14号位等。这也适用于携带缺失或插入的其他突变实施方案。[0043]在本发明的背景下，血红素过氧化物酶优选为具有过氧化物酶活性的多肽，并且包含与seqidno:3具有至少70百分比序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与seqidno:1相比包含至少一个氨基酸交换，其中，所述至少一个氨基酸交换是seqidno:1的氨基酸p146或氨基酸n275的交换。[0044]在优选实施方案中，血红素过氧化物酶包含氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:3具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、尤其是至少98％、最优选至少99％的序列同一性。为了增加偏好，该氨基酸序列与seqidno:3具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的序列同一性。特别优选地，所述氨基酸序列是seqidno:3所示的序列。最优选地，血红素过氧化物酶由如seqidno:4所示的氨基酸序列组成。[0045]优选地，氨基酸序列进一步包含相对于seqidno:1的至少一个、优选至少两个、更优选至少三个、更优选至少四个、尤其是五个选自n13d、n57s、n175s、n255d和n268d的氨基酸交换。[0046]突变n13d、n57s、n255d和n268d已在capone等人("glyco-variantlibraryoftheversatileenzymehorseradishperoxidase."glycobiology24.9(2014):852-863)以及humer和spadiut("improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis."internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)中发现。与此无关，且仅在酵母中表达的情况下，突变n175s已在morawski等人("functionalexpressionandstabilizationofhorseradishperoxidasebydirectedevolutioninsaccharomycescerevisiae."biotechnologyandbioengineering76.2(2001):99-107)中披露。[0047]在本发明的背景下，优选相对于seqidno:1的所有上述突变n13d、n57s、p146q、n175s、n255d、n268d和n275k；单独或相互组合。令人惊讶的是，五个突变n13d、n57s、n175s、n255d和n268d的组合导致了特别高的热稳定性(参见实施例6)。此外，进一步组合迄今为止完全未知的突变p146q和n275k导致酶活性显著增强(参见实施例3；seqidno:4)。[0048]本领域已知天然hrp的其他几种突变，在本发明的背景下也是优选的。例如，ryan等人("effectsofsinglemutationsonthestabilityofhorseradishperoxidasetohydrogenperoxide."biochimie89.8(2007):1029-1032)描述了突变k232n和t110v的有益影响。因此，在优选实施方案中，与seqidno:1相比，氨基酸序列进一步包含氨基酸交换t110v或k232n。[0049]在本发明的背景下，“过氧化物酶活性”优选指底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，2,2'-叠氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)或过氧化氢(h2o2)中的至少一种的活性。优选地，当在ph5和30℃下，在含有1mmh2o2的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中测定时，血红素过氧化物酶具有对应于底物tmb的kcat/km值的过氧化物酶活性为至少0.01mm-1s-1，优选至少0.1mm-1s-1、更优选至少1mm-1s-1、更优选至少10mm-1s-1、更优选至少20mm-1s-1、更优选至少100mm-1s-1、更优选至少1000mm-1s-1、更优选地为至少10000mm-1s-1，尤其是至少20000mm-1s-1。在另一优选实施方案中，当在ph5和30℃下在含有1mmh2o2的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中测定时，血红素过氧化物酶具有对应于底物abts的kcat/km值的过氧化物酶活性为至少0.1mm-1s-1，优选至少1mm-1s-1、更优选至少10mm-1s-1、更优选至少100mm-1s-1，最优选至少250mm-1s-1。在又一优选实施方案中，当在ph5和30℃下在含有10mmabts的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中测定时，血红素过氧化物酶具有对应于底物h2o2的kcat/km值的过氧化物酶活性为至少为1mm-1s-1，优选至少为10mm-1s-1、更优选至少为100mm-1s-1、更优选至少1000mm-1s-1，最优选至少2500mm-1s-1。优选地，如实施例6所述测定过氧化物酶活性。将25.7ml0.2m磷酸氢二钠和24.3ml0.1m柠檬酸添加到50ml去离子水中，可获得50mm柠檬酸磷酸盐缓冲液。[0050]进一步优选地，血红素过氧化物酶的过氧化物酶活性至少为野生型hrp过氧化物酶活性的10％、优选至少20％、更优选至少50％，尤其是如seqidno:1或seqidno:2(优选seqidno:2，尤其是在相同条件下生产和测定多肽时)所示的氨基酸序列组成的多肽。[0051]优选地，血红素过氧化物酶相对于野生型hrp的热稳定性增强。对于上述与seqidno:3具有一定百分比序列同一性的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸序列组成的多肽相对于如seqidno:1或seqidno:2所示的(优选seqidno:2所示的)氨基酸序列组成的多肽具有更高的热稳定性。蛋氨酸残基可以附加到所述氨基酸序列的n端，与seqidno:3具有一定的百分比序列同一性，从而可以在大肠杆菌中重组产生；即优选n端蛋氨酸残基和所述氨基酸序列组成的多肽类相对于如seqidno:2所示氨基酸序列组成的多肽具有更高的热稳定性。为了比较这两种多肽的热稳定性，可以在相同的条件下生产和测定多肽。“提高热稳定性”优选是指在60℃下，在由20mmbistris/hcl(ph7)、7％甘油和500mmnacl组成的缓冲液中孵育时半衰期更长。优选地，所述氨基酸序列(和/或包含所述氨基酸序列的血红素过氧化物酶)组成的多肽相对于如seqidno:1或seqidno:2所示氨基酸序列组成的多肽的半衰期为至少1.5倍、优选至少3倍、更优选至少6倍、更优选至少12倍。优选地，半衰期是通过在ph5和30℃的不同时间点用7mmabts在含有1mmh2o2的50mm磷酸柠檬酸盐缓冲液中测定剩余过氧化物酶活性来确定的。对于半衰期的测定，多肽的浓度优选为2.86μm。优选地，如实施例6所述确定半衰期。[0052]在优选实施方案中，血红素过氧化物酶和/或由氨基酸序列组成的多肽，如上文所定义，与seqidno:3具有一定百分比的序列同一性，其在60℃下的半衰期至少为0.5小时，优选至少1小时、更优选至少2小时、更优选至少4小时，最优选地，在由20mmbistris/hclph7、7％甘油和500mmnacl组成的缓冲液中至少6小时，如在ph5和30℃下用7mmabts在含有1mmh2o2的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中的残余过氧化物酶活性测得的。[0053]在本发明制备血红素过氧化物酶的方法的背景下，令人惊讶的是，与在一批中一次性添加辅因子相比，在一定时间内将血红素辅因子分散添加到复性混合物中会产生更好的结果(参见实施例3；表5和表6的比较)。血红素辅因子的缓慢添加通常是优选的。优选在至少1小时的时间段、更优选更长的时间段将血红素辅因子分散添加到复性混合物中。按照优先顺序，时间段至少为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时，尤其是至少10小时。在这种情况下，“在至少1小时的时间段内分散”可能意味着血红素辅因子的恒定供给至少持续1小时，或者血红素辅助因子的总量被分成几个较小的剂量，例如每10分钟一剂，或在几个小时的时间内每小时一剂。这一点也相应地适用于其他时间段(例如，在优选实施方案中，添加分散在至少10小时的时间段内，部分辅因子可以在至少10个小时的时间内每小时添加一次，或者作为至少10小时内的恒定进料)。血红素辅因子的添加优选涉及血红素辅助因子浓度的至少2次(但优选至少3次、更优选至少4次、更优选至少6次，最优选至少10次)增加，其中，第一次和最后一次增加至少按上述规定的时间间隔分开(例如，至少2次血红素辅因子浓度增加间隔至少1小时，优选间隔至少4小时，尤其是至少10小时)。这可以通过血红素辅因子浓度增加的多个离散步骤(血红素辅助因子添加总量分为多个较小剂量)或血红素辅因子的连续供应或两者的组合来实现。如果添加到复性混合物中的血红素辅因子总量均匀分散，则尤其有利。因此，优选在小于1小时的时间段内添加添加到复性混合物中血红素辅因子总量的不超过80％，优选不超过70％、更优选不超过60％、更优选不高于50％、更优选不超过40％、更优选地不超过30％、更优选不高于20％、最优选不超过10％。[0054]尤其优选将血红素辅因子作为连续进料添加到复性混合物中，因为这允许血红素辅助因子的添加特别缓慢且均匀。如果随血红素辅因子进料提供的血红素辅助因子的浓度随时间保持恒定，则特别有利。[0055]在本发明方法的优选实施方案中，血红素辅因子以0.1至10μmol/l/小时、0.2至5μmol/小时、更优选0.5至3μmol/l/小时、更优选1至2.5μmol.l/小时，尤其是1.4至1.8μmol/l/小时的速率添加到复性混合物中。关于复性混合物中存在的血红素过氧化物酶，优选血红素辅因子以每小时0.01到1摩尔当量之间，优选每小时0.02到0.5摩尔当量之间、更优选每小时0.05到0.2摩尔当量之间的速率添加。所述速率优选为平均速率，即如果血红素辅因子在某一时间段内以离散步骤应用，则可以通过将血红素辅助因子的总量除以第一步和最后一步之间的时间段来计算平均速率。[0056]在本发明的背景下，发现当血红素辅因子不立即添加到复性混合物中时，尤其是当它尚未存在于复性缓冲液中时，结果可以进一步改善。相反，如果仅在孵育复性混合物一段时间后添加血红素辅因子，则是有利的(具体参见实施例2、doe4和图1)。因此，如果在没有血红素辅因子的情况下，至少可以进行一段时间的复性，则是有利的。因此，在本发明的优选实施方案中，在添加血红素辅因子之前，将复性混合物孵育至少1小时、优选至少2小时、更优选至少4小时，尤其是至少8小时。然而，这并不意味着在此孵育期间根本不存在血红素辅因子；在本实施方案的背景下，仅要求在指定的时间段之后将血红素辅因子添加到复性混合物中。然而，优选地，在所述时间段内，存在于复性混合物中的血红素辅因子小于10μm、优选小于2μm、更优选小于0.5μm和最优选小于0.1μm。[0057]在优选实施方案中，将血红素辅因子的至少1μmol/l、优选至少4μmol/l、更优选至少10μmol/l，特别是至少20μmol/l添加到复性混合物中。优选地，将血红素辅因子添加到复性混合物中，在1μmol/l和200μmol/l之间、更优选在4μmool/l和100μmol/l之间、更优选在10μmol/l和50μmol/l之间、特别是在15μmol-l和25μmo1/l之间。尤其优选的是，将相对于血红素过氧化物酶至少0.25、优选至少0.5、更优选至少1、尤其是至少2摩尔当量添加到复性混合物中。具体而言，可将0.25至10之间、优选0.5至5之间、更优选1至4之间、尤其是1至2摩尔当量的血红素辅因子添加到复性混合物中。[0058]为了获得用于根据本发明的方法中的ib，可以使用本领域已知的标准技术。本领域技术人员熟悉在合适的宿主细胞(例如大肠杆菌)中重组表达某种血红素过氧化物酶的方法，并获得含有所述血红素过氧化氢酶的ib。优选地，ib形式的血红素过氧化物酶通过以下步骤提供：孵育表达编码血红素过氧化氢酶基因的宿主细胞；以及从所述宿主细胞中获得ib。宿主细胞优选为原核细胞，优选为大肠杆菌细胞。[0059]由于其优点，根据本发明的方法非常适合大量生产血红素过氧化物酶。如本文所述实施例所示，本发明方法可扩展到更大的孵育体积，从而产生更多的血红素过氧化物酶。因此，在优选实施方案中，细胞在至少2l、优选至少5l、更优选至少20l、更优选至少50l、尤其是至少100l的体积中孵育。[0060]在本发明过程中，事实证明，通过使用溶解缓冲液和复性缓冲液的特定组合物，可以进一步改进血红素过氧化物酶的生产方法(参见实施例2-5)。优选地，溶解ib包括在溶解缓冲液中孵育ib。如实施例中所述，发现所述溶解缓冲液的特定ph值可导致特别有利的结果(尤其参见实施例2、表3以及图2和图3)。特别是，优选地，溶解缓冲液的ph值至少为8，优选至少为8.5、更优选至少为9.0、更优选至少9.5。优选地，溶解缓冲器的ph值在8和12.5之间，优选在8.5和11.5之间、更优选在9和11之间，甚至更优选在9.5和10.5之间。[0061]用于溶解ib的溶解缓冲液优选含有还原剂。在本发明的背景下，发现还原剂的某些浓度会导致特别有利的结果(具体参见实施例2，doe1-3；实施例3，反应器运行1-4)。还原剂优选dtt。然而，也可以使用其他还原剂。本领域技术人员熟悉通常用于ib溶解的其他还原剂，例如β-me、tcep(三(2-羧乙基)膦)、半胱氨酸等。在本发明方法的背景下，也优选所有这些还原剂。优选地，溶解缓冲液中的氧化还原条件对应于1到50mmol/ldtt之间的dtt浓度，优选2到25mmol/l之间、更优选4到15mmol/l之间，尤其是6到8mmol/l。在这种情况下，术语“氧化还原条件”是指还原电位，“对应”是指dtt以指示的量存在，或另一还原剂(例如，β-me、tcep或半胱氨酸)以导致相同还原电位的浓度存在，如在ph为10、25℃的50mm甘氨酸、6m尿素在水中的溶液中测得的。优选地，溶解缓冲液的还原电位在-150mv和-500mv之间，优选在-200mv和-450mv之间、更优选在-250mv到-400mv间、更优选在-280mv到-370mv间、更优选在-300mv至-340mv之间以及最优选在-310mv到-300mv之间。还原电位优选在25℃温度和101.300pa压力下测定。技术人员熟悉测定还原电位的方法。优选使用连接到lucullus处理系统的easyfermplusorparc425测定还原电位，优选如实施例3所述。或者，测定可按照标准astmd1498-14(“standardtestmethodforoxidation-reductionpotentialofwater”,astminternational,westconshohocken,pa,2014,www.astm.org)进行。[0062]在另一优选实施方案中，还原剂含有巯基。优选地，溶解缓冲液中巯基的浓度在2和100mmol/l之间，优选在4和50mmol/l.之间、更优选在8和30mmol/l、尤其是在12和16mmol/l之间。溶解缓冲液中巯基的浓度优选地基于添加到溶解缓冲溶液中的含硫醇物质的浓度来确定(例如，dtt每个分子含有2个巯基；因此，1mmol/ldtt的浓度对应于2mmol/l-巯基的浓度)。或者，巯基的浓度也可以通过实验测定。优选地，使用埃尔曼(ellman)试剂测定溶解缓冲液中巯基的浓度。埃尔曼试剂(5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)或dtnb)是一种用于量化样品中巯基数量或浓度的化学品。技术人员熟悉如何使用埃尔曼试剂进行测定。优选按照simpson("estimationoffreethiolsanddisulfidebondsusingellman'sreagent."cshprotocols2008(2008):pdb-prot4699)中的描述进行测定。[0063]除还原剂外，溶解缓冲液通常还含有变性剂。技术人员熟悉合适的变性剂，例如尿素或gdnhcl。优选地，溶解缓冲液含有尿素，优选浓度为至少4mol/l、更优选至少5mol/l、更优选至少6mol/l。优选地，溶解缓冲液含有4mol/l到8mol/l的尿素，优选5mol/l和7mol/l，尤其是5.5到6.5mol/l。[0064]为了溶解ib，优选将ib在溶解缓冲液中孵育至少5分钟，优选至少10分钟、更优选至少15分钟、尤其是至少30分钟。优选地，在4℃至40℃、优选10℃至35℃、更优选20℃至25℃的温度下，在所述溶解缓冲液中孵育ib。[0065]当溶解的ib以1:5v/v和1:250之间(溶解的ib:复性缓冲液)的比例、优选1:10和1:100之间、更优选1:20和1:80之间、尤其是1:30和1:60之间的比例与复性缓冲溶液混合时，可以获得有利的结果。如上所述，本发明方法特别适合大量生产血红素过氧化物酶。因此，优选在至少5l、优选至少10l、更优选至少25l、更优选至少100l的体积中进行复性。这意味着复性混合物优选具有至少5l，优选至少10升、更优选地至少25l、更优选地最少100l的容积。[0066]与溶解缓冲液的情况类似，发现对复性缓冲液的某些ph范围有有利影响(具体见表3、7和14以及图2和3)。因此，如果复性缓冲液的ph值至少为8、优选至少为8.5、更优选至少为9、更优选至少9.5，则优选。特别是，优选复性缓冲液的ph值在8和12.5之间，优选在8.5和11.5之间、更优选在9和11之间，甚至更优在9.5和10.5之间。特别优选地，溶解缓冲液和复性缓冲液之间的ph差值小于2ph增量，优选小于1ph增量、更优选小于0.5ph增量、更优选小于0.2ph增量，尤其是小于0.1ph增量。这意味着，例如，如果溶解缓冲液的ph值为10，则复性缓冲液的ph值优选在9和11之间(即差值小于1ph增量)、更优选在9.5和10.5之间(差值小于0.5ph增量)等。[0067]在本发明方法中使用的复性缓冲液优选含有氧化剂。本领域技术人员熟悉复性缓冲液中常用的氧化剂，例如谷胱甘肽二硫化物(gssg)或胱氨酸，它们在本发明方法的背景下都是优选的。如本实施方案中所示(例如，参见表1、3和7以及图2和3)，在一定浓度的氧化剂下观察到了有利的效果。优选地，复性缓冲液具有对应于gssg浓度在0.2和6mmgssg之间、优选在0.4和4mmgsgsg之间、更优选在0.8和2.5mmgss之间、尤其是1.1和1.6mmgsg之间的氧化还原条件。在这种情况下，当在ph10、25℃、2mmcacl2、2m尿素、7％v/v甘油的溶液中测定时，术语“氧化还原条件”是指还原电位，“对应”是指gssg以指示的量存在，或另一氧化剂(如胱氨酸)以导致相同还原电位的浓度存在。优选地，复性缓冲液具有介于50mv和110mv之间的还原电位，优选介于60mv和100mv之间、更优选介于65mv和95mv之间、最优选介于70mv和90mv之间。优选地，如上所述在溶解缓冲液的背景下测定还原电位。[0068]进一步优选地，复性缓冲液含有变性剂。优选与溶解缓冲液相同的变性剂，尽管浓度较低。优选地，复性缓冲液含有0.5到3mol/l尿素，优选1mol/l到2.7mol/l、更优选1.5mol/l和2.4mol/l之间，尤其是1.8到2.2mol/l。[0069]特别优选地，复性混合物同时含有dtt和gssg。优选地，复性混合物中dtt和gssg之间的摩尔比在1:2(dtt:gssg)和1:30之间，优选在1:3和1:20之间、更优选在1:4和1:15之间，尤其是在1:6和1:8之间。这些比值应理解为根据添加到溶解缓冲液和复性缓冲液中的dtt和gssg的初始量进行计算；不考虑dtt和/或gssg的消耗。[0070]优选地，复性混合物具有介于-105mv和135mv之间的还原电位，优选介于-90mv和105mv之间、更优选介于-80mv到80mv之间、更优选介于-70mv与60mv之间以及最优选介于-60mv和50mv之间。优选地，如上所述在溶解缓冲液的背景下测定所述还原电位。优选地，在添加血红素辅因子之前，在混合溶解缓冲液和复性缓冲液后立即测定还原电位。[0071]在本发明的背景下，发现当复性后包括涉及高盐浓度的沉淀步骤时是有利的(参见实施例4，表9)。令人惊讶的是，通过这种方式可以有效去除杂质，而不会沉淀大量的血红素过氧化物酶。因此，本发明方法优选还包括向复性混合物中添加盐的步骤。在优选实施方案中，盐的浓度在2mol/l和12mol/l之间、优选在4mol/l到10mol/l、更优选在4.5mol/l至8mol/l。当盐为氯化钠时，获得特别好的结果，优选浓度在0.5到6mol/l之间、更优选1.5到5.5mol/l、更优选2.5到5mol/l间，尤其是3.5到4.5mol/l。在获得良好结果的另一优选实施方案中，盐为硫酸铵，优选浓度在0.25和1.5mol/l之间，优选浓度为0.5和1.4mol/l、更优选浓度为0.8和1.2mol/l。通常用于盐析蛋白质的任何盐都可以在本发明方法的背景下使用。技术人员熟悉这些盐，例如kcl、k2co3、cacl2、nh4cl、na2so4或naoac。此类替代盐的最佳浓度可基于所得溶液的离子强度(定义为i＝0.5*∑(ci*zi2)，其中ci是每个离子的摩尔浓度，zi是该离子的电荷数；总和是盐中所有离子的总和；例如对于1mol/l(nh4)2so4，离子强度为i＝0.5*(2mol/l*12 1mol/l*22)＝3mol/l)。优选地，将盐添加到复性混合物中，使离子强度介于0.5和6mol/l之间，优选介于1.5和5mol/l、更优选介于2.5和4.5mol/l间，尤其是介于3.5和4.5mol/l之间。[0072]特定盐的盐析强度也可以由其在所谓的hofmeister序列(也称为“离子促变序列(lyotropicseries)”)中的位置决定。hofmeister序列是按照离子在蛋白质中盐析或盐析能力的顺序对离子进行的分类(按照盐析强度的降低顺序，示例性阴离子为so42-》hpo42-》oac-》cl-》no3-》i-》scn-；同样对于阳离子：nh4 》k 》na 》li 》mg2 》ca2 》胍基)。在本发明的背景下，优选地，如果所述盐具有硫酸铵和氯化钠之间的盐析强度，如由其在hofmeister序列中的位置确定的，优选地其中盐的浓度在1.25和6mol/l之间、更优选地在0.5和5mol/l间、更优选地介于1.0和4.5mol/l，最优选地在1.5和4mol/l。在另一优选实施方案中，所述盐的盐析强度比氯化钠弱，这由其在hofmeister序列中的位置决定，优选其中盐的浓度为至少2mol/l，优选至少4mol/l、更优选至少4.5mol/l。如本文所用，如果第一盐的阳离子和阴离子的盐析强度都高于/低于hofmeister序列测定的第二盐的阳离子与阴离子，则第一盐被视为具有比第二盐更高/更低的盐析强度。[0073]优选地，本发明方法还包括用于从复性血红素过氧化物酶中去除杂质的离心步骤。或者，除此之外，本发明方法还可以包括过滤步骤，用于从复性的血红素过氧化物酶中去除杂质。当将盐添加到复性混合物中以使杂质沉淀但(大部分)血红素过氧化物酶保留在溶液中时，这些实施方案特别有利。[0074]优选地，根据本发明的方法还包括纯化折叠血红素过氧化物酶的步骤。研究发现，如果血红素过氧化物酶在纯化过程中呈完整形式，则特别有利；因此，优选在血红素辅因子被添加到复性混合物中后，纯化血红素过氧化物酶。[0075]出于纯化目的，本领域中使用常用纯化标签，例如多组氨酸标签(通常由许多组氨酸残基组成，例如6-10个，通常附加到蛋白质的n或c端)。此类标签也可以在本发明的背景下使用。然而，优选血红素过氧化物酶不包含纯化标签。特别是，优选血红素过氧化物酶不包含多组氨酸标记。[0076]在本发明方法的背景下，优选通过色谱，特别是通过疏水相互作用色谱(hic)纯化血红素过氧化物酶。如实施例所示，这种类型的纯化可产生令人惊讶的良好结果，尤其是高终浓度、高纯度和高活性(参见实施例4)。如上所述，hic特别适合与盐沉淀步骤结合，以去除杂质，因为hic通常涉及高盐浓度的结合条件。因此，高盐浓度可以沉淀杂质以及过量的血红素辅因子，而正确折叠的血红素过氧化物酶保留在溶液中，并可直接用作hic的上样。技术人员熟悉如何执行hic；优选地，如实施例4所述进行。如果固定相是丁基琼脂糖树脂，则尤其优选。[0077]如本文所用，“血红素过氧化物酶产品”可以是从根据本发明的方法生产的血红素过氧化物酶中获得的任何产品，例如血红素过氧化酶与另一分子的缀合物，例如蛋白质或以其他方式改性或衍生的血红素过氧化物酶，例如与固体载体相连的血红质过氧化物酶等。“血红素过氧化物酶产品”也可以是含有血红素过氧化物酶(或修饰/衍生/结合血红素过氧化物酶)的任何类型的商业产品，例如含有这种血红素过氧化氢酶的组合物(例如溶液或冻干形式)，或含有这种组合物的容器或任何类型的包装产品，例如装有这种容器的试剂盒。[0078]在许多应用中，血红素过氧化物酶(如hrp)被用作与其他分子的共轭物。这种缀合物在诸如蛋白免疫印迹、elisa和免疫组织化学等技术中很有用。一种广泛使用的缀合物是与抗体或另一结合蛋白的缀合物。在这种情况下，通过添加hrp底物，可以在结合蛋白与其靶标结合的部位产生可检测的信号。其他常用的hrp缀合物包括hrp链霉亲和素缀合物(例如用于检测生物素化抗体的夹心elisa应用)或hrp蛋白a、g或l缀合物(蛋白质a、g和l与免疫球蛋白结合，因此可用于检测初级抗体，例如elisa、elispot、ihc或蛋白免疫印迹)。[0079]许多商业供应商提供将血红素过氧化物酶(如hrp)与感兴趣的蛋白质结合的试剂盒；例如abcam公司的hrp结合试剂盒/hrp标记试剂盒ab102890，bio-rad公司的lynx快速hrp抗体结合试剂盒(产品代码lnk001p)，或thermofisherscientific公司的ezlinkplus激活过氧化物酶试剂盒(目录号31489)。此类试剂盒的目的通常是使用户能够将过氧化物酶偶联到任何感兴趣的蛋白质，例如抗体。此类试剂盒可包含活性形式的血红素过氧化物酶(用于与另一蛋白质直接反应)，或试剂盒可包括血红素过氧化物酶和适合用户偶联的交联剂。[0080]因此，在优选实施方案中，本发明方法还包括激活血红素过氧化物酶以进行偶联反应的步骤。优选地，血红素过氧化物酶与适于将血红素过氧化物偶联到另一分子、优选另一蛋白质的交联剂反应。本领域技术人员已知合适的偶联技术和合适的交联剂，例如，可以在hermanson,gregt.bioconjugatetechniques.academicpress,2013一书中找到。交联剂优选与血红素过氧化物酶形成共价键。优选地，交联剂包含选自nhs酯、琥珀酰亚胺酯、亚胺酯、二氟、卤代乙酰基、马来酰亚胺、吡啶二硫醇和酰肼中一种、尤其是两种反应基团。例如，交联剂可以是具有马来酰亚胺基团和活性酯基团的双功能peg交联剂，例如马来酰亚胺-peg8-丁二酰亚胺酯(cas编号756525-93-6，例如sigma-aldrich市售的，目录号746207)。[0081]优选地，当血红素过氧化物酶“活化用于偶联”时，这意味着血红素过氧化氢酶包含能够与另一蛋白质形成共价键的反应基团，优选与结合蛋白质，尤其是与抗体形成共价连接。特别优选血红素过氧化物酶与如上所述的化学交联剂共价连接，特别是其中交联剂的至少一个反应基团可用于与另一分子、优选另一蛋白质反应。例如，这可以通过使交联剂的另一个反应基团与血红素过氧化物酶反应以形成共价键来实现。[0082]血红素过氧化物酶产品可由包装在适当容器(例如小瓶)中的冻干形式或溶液中的用于偶联的活化血红素过氧化氢酶组成。然而，血红素过氧化物酶和交联剂也可以单独提供；因此，血红素过氧化物酶产品可以是包含血红素过氧化物酶和交联剂的试剂盒。因此，制备血红素过氧化物酶产品的方法可进一步包括将血红素过氧化物酶以及上述交联剂包装在试剂盒中。优选地，所述交联剂适于将所述多肽偶联到另一蛋白质，优选偶联蛋白质。[0083]根据本发明方法生产的血红素过氧化物酶可以是由seqidno:4所示氨基酸序列组成的多肽。然而，所述血红素过氧化物酶也可以是具有上文所定义的过氧化物酶活性的多肽，并且进一步包含另一蛋白质的氨基酸序列。可通过已知方法获得融合蛋白，例如通过产生遗传融合(将编码血红素过氧化物酶的核酸序列与编码其他蛋白质的核酸序列连接，优选在两个蛋白质之间包含连接序列)。所述其他蛋白质可能是链霉亲和素。在另一优选实施方案中，所述其他蛋白质是抗体结合蛋白质，优选蛋白质a、蛋白质g或蛋白质l。在特别优选的实施方案中，根据本发明方法产生的血红素过氧化物酶包括结合蛋白的氨基酸序列。所述结合蛋白可以是作为试剂结合到目标分子的任何蛋白质，例如检测特定蛋白质或其他分子。优选地，所述结合蛋白是抗体。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白是抗体片段，优选单链可变片段(scfv)或抗原结合片段(fab)。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白是抗体模拟物，优选选自adnectin、亲合体(affibody)、anticlin、darpin、工程化kunitz型抑制剂和monobody。本领域已知许多此类合适的结合蛋白，例如来自gebauer和skerra("engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics."currentopinioninchemicalbiology13.3(2009):245-255)。[0084]在本发明制备血红素过氧化物酶产品的方法的优选实施方案中，所述方法还包括偶联反应以获得血红素过氧化物酶缀合物。优选地，血红素过氧化物酶偶联到结合剂，优选抗体上。在进一步优选的实施方案中，结合剂是结合蛋白，优选上文列出的任何结合蛋白。特别优选的是，血红素过氧化物酶偶联到抗体片段，优选单链可变片段(scfv)或抗原结合片段(fab)上。此外，优选血红素过氧化物酶与选自adnectin、亲合体、anticlin、darpins、工程化kunitz型抑制剂和monobody的抗体模拟物偶联。在另一优选实施方案中，血红素过氧化物酶与抗体结合蛋白，优选蛋白a、蛋白g或蛋白l偶联。在又一优选实施方案中，血红素过氧化物酶与另一蛋白质、优选链霉亲和素偶联。[0085]血红素过氧化物酶和其他蛋白质之间的缀合物可以通过偶联反应获得，这是技术人员所知的，例如通过化学交联。为此，血红素过氧化物酶和其他蛋白质可以通过化学交联剂连接在一起，在两个分子之间形成稳定的、优选是共价的连接。此类方法通常称为生物偶联，在本领域是已知的。例如，可以在hermanson,gregt.bioconjugatetechniques.academicpress,2013一书中找到大量合适的方法。[0086]本发明生产血红素过氧化物酶产品的方法可以包括血红素过氧化氢酶的进一步纯化、浓缩或其他处理。优选地，该方法还包括纯化血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物的步骤。在这种情况下，血红素过氧化物酶可能已经被衍生或以其他方式修饰。在优选实施方案中，该方法还包括冷冻血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物的步骤。作为上述实施方案的替代或结合，该方法优选还包括将血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物冷冻干燥的步骤。[0087]血红素过氧化物酶产品也可以是包含通过根据本发明的方法生产的血红素过氧化氢酶的组合物或包含所述组合物的产品(例如容器)。优选地，向所述组合物中添加一种或多种赋形剂。例如，这些赋形剂可以进一步提高血红素过氧化物酶在储存中的稳定性，确保更长的保质期和稳定的生物活性水平。优选的赋形剂包括ph缓冲剂、稳定剂、填充剂、渗涨度调节剂(tonicitymodifier)等。特别优选适用于冷冻干燥的赋形剂。[0088]本领域技术人员已知合适的赋形剂。例如，组合物优选含有ph缓冲剂，优选选自甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸、磷酸盐、乙酸和天冬氨酸。进一步优选所述组合物包含填充剂，优选选自甘露醇、甘氨酸、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖或木糖醇。该组合物优选包含稳定剂，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆糖、异麦芽糖和阿拉伯糖、葡萄糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨醇、甘氨酸、精氨酸盐酸盐、聚羟基化合物，包括多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、n-甲基吡咯烷、纤维素和透明质酸、氯化钠。该组合物还可包括表面活性剂，优选选自十二烷基硫酸钠、琥珀酸磺酸二辛酯钠、磺化二辛酯磺酸钠、鹅去氧胆酸、n-月桂酰基肉桂酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、水合胆酸钠、脱氧胆酸钠和糖脱氧胆汁酸钠盐、氯化苯扎氯铵或氯化苯乙氧基铵、氯化十六烷基吡啶一水合物、十六烷基三甲基溴化铵、chaps、chapso、sb3-10、sb3-12、洋地黄、tritonx-100、tritonx-114、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧(40)酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯20、40、60、65和80、大豆卵磷脂、dopc、dmpg、dmpc和dopg；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。[0089]有利的是，该组合物包含至少0.01mg、优选至少0.1mg、更优选至少1mg、更优选至少5mg、尤其是至少10mg根据本发明产生的血红素过氧化物酶。更有选地，组合物含有浓度至少为0.0001％(重量/重量，w/w)、优选至少0.001％w/w、更优选至少0.01％w/w、更优选至少0.1％w/w、更优选至少1％w/w，尤其是至少10％w/w的血红素过氧化物酶。[0090]有利的是，该组合物是固体组合物(在25℃和大气压下)，优选冻干组合物。在另一优选实施方案中，该组合物是液体组合物(在25℃和大气压下)。有利的是，该组合物含有根据本发明产生的血红素过氧化物酶，其浓度至少为0.001mg/ml、优选至少0.01mg/ml、更优选至少0.1mg/ml、更优选至少0.5mg/ml、最优选至少2mg/ml。[0091]进一步优选的是，该组合物基本上不含dna，尤其是dsdna。优选地，该组合物含有小于1μg/g、优选小于100ng/g、更优选小于10ng/g，最优选小于1ng/gdna。可使用染料sybrgreeni(n',n'-二甲基-n-[4-[(e)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-铀-2-基]-n-丙基丙烷-1,3-二胺)通过荧光法测定dna浓度。技术人员熟悉使用荧光法测定dna浓度。测定可以按照rengarajan，kalpana等人的描述进行("technicalbriefquantifyingdnaconcentrationsusingfluorometry:acomparisonoffluorophores."molecularvision8(2002):416-421)。[0092]血红素过氧化物酶产品可用于多种治疗应用，例如用于靶向癌症治疗。因此，在优选实施方案中，血红素过氧化物酶产品是一种药物组合物，优选包含一种或多种赋形剂，其在药学上可被个体，特别是哺乳动物，特别是人类服用。本领域技术人员已知合适的赋形剂，例如水(尤其是注射用水)、生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液、缓冲液、hank液、囊泡形成化合物(例如脂质)、固定油、油酸乙酯、溶于生理盐水的5％葡萄糖、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其他合适的赋形剂包括当施用给患者对患者有害时不会诱导产生抗体的任何化合物。示例为耐受性良好的蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。该药物组合物优选适用于肠外给药，尤其是静脉给药。药物组合物可以注射剂量单位形式提供，例如作为溶液、悬浮液或乳液，与上述药学上可接受的赋形剂一起配制。当血红素过氧化物酶产品是药物组合物时，也优选上文列出的一般组合物的所有优选实施方案(尤其与血红素过氧化物酶的浓度和量有关)。[0093]在治疗应用方面，血红素过氧化物酶可能是酶前药系统的一部分。本领域已知包含血红素过氧化物酶(例如hrp)的酶前药系统，特别是用于癌症治疗(参见例如tupper等人，"invivocharacterizationofhorseradishperoxidasewithindole-3-aceticacidand5-bromoindole-3-aceticacidforgenetherapyofcancer."cancergenetherapy17.6(2010):420-428)。例如，靶向癌症治疗可能涉及包含hrp和吲哚乙酸(iaa)的酶前药系统，其中hrp氧化吲哚乙酸(iaa)，从而降低癌细胞的生存能力。前药iaa和hrp都不是单独的细胞毒性物质，这表明有必要将这两种物质以一种纯净的、与人类匹配的、非免疫原性的形式结合起来，以获得所需的细胞毒性效果。在另一项研究中，hrp可以将扑热息痛转化为强大的细胞毒素(tupper等人，"useofhorseradishperoxidaseforgene-directedenzymeprodrugtherapywithparacetamol."britishjournalofcancer90.9(2004):1858-1862)。然而，作者发现，市面上可买到的植物hrp制剂在该转化反应中不是很有效，因此没有进一步开展这项研究。[0094]根据本发明生产的血红素过氧化物酶产品尤其可用于抗体导向酶前药治疗(adept；例如，见bagshawe"antibody-directedenzymeprodrugtherapy(adept)forcancer."expertreviewofanticancertherapy6.10(2006):1421-1431)。adept的原理通常是使用针对肿瘤相关抗原的抗体将酶(例如hrp)定位到肿瘤部位。可以给患者使用前药，然后将前药转化为其特定位置的激活型。编码血红素过氧化物酶的核酸分子也可用于治疗，特别是基因治疗，如基因导向酶前药疗法(gdept)。[0095]对于许多应用，特别是工业应用，例如废水处理(例如去除氯酚)，如果血红素过氧化物酶固定在固体载体上，则可能是有利的。因此，优选地，血红素过氧化物酶产品包含固定在固体载体上的血红素过氧化氢酶。因此，本发明方法优选还包括将血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物固定在固体载体上的步骤。[0096]除其他优点外，酶固定化可实现特别高的存储稳定性、增强的重复使用性、降低操作过程成本等。固定在固体载体上的血红素过氧化物酶及其工业应用在本领域是已知的，参见例如tatsumi等人("removalofchlorophenolsfromwastewaterbyimmobilizedhorseradishperoxidase."biotechnologyandbioengineering51.1(1996):126-130)和sarno和iuliano("immobilizationofhorseradishperoxidaseonfe3o4/au_gonanoparticlestoremove4-chlorophenolsfromwastewater."chemicalengineeringtransactions73(2019):217-222)。技术人员熟悉在固体载体上固定酶的方法，如andreescu等人所述(“chapter7-nanostructuredmaterialsforenzymeimmobilizationandbiosensors."thenewfrontiersoforganicandcompositenanotechnology.elsevier,2008,355-394)。[0097]纳米材料由于其比表面积和有效的酶负载，特别适合作为固体载体。因此，在本实施例的背景下，优选固体载体是纳米颗粒。本文中使用的“纳米颗粒”优选为所有三个尺寸在1x10-12至1x10-6范围内、更优选在1x10-9至1x10-17m范围内的任何形状的颗粒。例如，纳米颗粒可以是磁铁矿(fe3o4)纳米颗粒或金纳米颗粒。特别优选磁性纳米颗粒，因为它们通过施加磁场提供了易于分离的额外优势。固体载体的进一步优选实例是纳米纤维、碳/聚乙烯材料、碳纳米管、纳米线、纳米棒、纳米晶体、介孔二氧化硅和复合材料。[0098]在另一优选实施方案中，固体载体是膜，特别是合成膜，例如聚合物膜。本领域已知包含固定化血红素过氧化物酶的膜、制备此类膜的方法以及此类膜的应用(例如在废水处理中)，例如来自vasileva等人("applicationofimmobilizedhorseradishperoxidaseontomodifiedacrylonitrilecopolymermembraneinremovingofphenolfromwater."internationaljournalofbiologicalmacromolecules44.2(2009):190-194)。[0099]在另一优选实施方案中，血红素过氧化物酶产品是试剂盒。因此，本发明方法优选还包括将血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物包装在试剂盒中的步骤。优选将选自缓冲液、试剂、说明书的其他成分加入到试剂盒中。血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物可以冻干形式提供在试剂盒中。在替代优选实施方案中，血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物以溶液形式提供。[0100]根据本发明方法产生的血红素过氧化物酶可进一步用作偶联酶分析的反应物。在这种分析中，目标酶(例如葡萄糖氧化酶)产生h2o2，然后可被血红素过氧化物酶利用(参见例如aumiller等人，"coupledenzymereactionsperformedinheterogeneousreactionmedia:experimentsandmodelingforglucoseoxidaseandhorseradishperoxidaseinapeg/citrateaqueoustwo-phasesystem."thejournalofphysicalchemistryb118.9(2014):2506-2517)。因此在优选实施方案中，将产生h2o2的酶添加到试剂盒中。[0101]根据本发明产生的血红素过氧化物酶可进一步用作聚合物交联反应物。例如，hrp已成功用于制备水凝胶的葡聚糖-酪胺缀合物的酶交联，例如作为软骨组织工程应用的3d支架(jin等人，"enzymaticallycrosslinkeddextran-tyraminehydrogelsasinjectablescaffoldsforcartilagetissueengineering."tissueengineeringparta16.8(2010):2429-2440)。[0102]为了便于理解本发明，下面定义了一些术语。此处定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”等术语并非仅指单一实体，而是包括可用于举例说明的一般类。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其用法并不限定本发明，除非权利要求中概述。[0103]参考多肽或蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”、“x％序列同一性”或“x％相同”(例如“70％序列同一性”或“70％相同”)定义为候选序列中与参考多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在对齐序列并引入空缺后，如有必要，实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守替换作为序列恒等性的一部分。可通过本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列标识百分比的校准，例如，使用公开可用的计算机软件，例如blast、blast-2、align、align-2、meg-align(dnastar)或emboss软件包的“needle”成对序列校准应用程序。本领域技术人员可以确定用于对齐序列的适当参数，包括在所比较序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，百分比氨基酸序列同一值是使用emboss软件包的计算机程序“needle”的序列比对计算的(可从欧洲分子生物学实验室公开获得；rice等人，emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,trendsgenet.2000jun；16(6):276-7,pmid:10827456)。[0104]可以在网站上访问needle程序http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/或从http://emboss.sourceforge.net/下载作为emboss包的一部分用于本地安装。它在许多广泛使用的unix操作系统上运行，如linux。[0105]为了比对两个蛋白质序列，优选使用以下参数运行needle程序：[0106]commandline:needle-auto-stdout-asequencesequence_file_a-bsequencesequence_file_b-datafileeblosum62-gapopen10.0-gapextend0.5-endopen10.0-endextend0.5-aformat3pair-sprotein1-sprotein2(align_format:pairreport_file:stdout)[0107]给定氨基酸序列a与给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性百分比(也可以称为具有或包含给定氨基酸序列的氨基酸序列a)计算如下：[0108]分数x/y的100倍，其中x是序列比对程序needle在该程序的a和b比对中得分为相同匹配的氨基酸残基数，y是b中氨基酸残基总数。需要注意的是，如果氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度，a到b的百分比氨基酸序列同一性不等于b到a的百分比氨基酸顺序同一性。如果“a的序列与b的整个序列相同超过n％”，y是b的整个顺序长度(即b中氨基酸残基的总数)。除非另有特别说明，否则本文中使用的所有百分比氨基酸序列同一性都是按照前一段中的描述使用needle计算机程序获得的。[0109]除非另有规定，否则本文使用的所有参数均对应于iupacsatp条件下的参数(“标准环境温度和压力”)，尤其是25℃的温度和101.300pa的压力。[0110]此处使用的百分比(％)对应于每体积重量(w/v)，除非指定为每重量/重量(w/w)或其他。[0111]本发明涉及以下优选实施方案：[0112]实施方案1.从包涵体(ib)制备血红素过氧化物酶的方法，包括以下步骤：[0113]-以ib的形式提供血红素过氧化物酶；[0114]-溶解所述ib；[0115]-将所述溶解的ib转移到复性缓冲液中，以获得复性混合物；[0116]-向所述复性混合物中添加血红素辅因子，其中在至少1小时的时间段内向复性混合物分散添加血红素辅助因子。[0117]实施方案2.根据实施方案1的方法，其中将血红素辅因子分散添加到复性混合物中的时间在至少2小时、优选至少3小时、更优选至少6小时、更优选至少8小时、尤其是至少10小时的时间段内。[0118]实施方案3.根据实施方案1或2的方法，其中血红素辅因子作为连续进料添加到复性混合物中。[0119]实施方案4.根据实施方案1至3中任一项的方法，其中血红素辅因子以0.1至10μmol/l/小时、优选0.2至5μmol/小时、更优选0.5至3μmol/l/小时、更优选1至2.5μmol.l/小时，尤其是1.4至1.8μmol/l/小时的速率添加到复性混合物中。[0120]实施方案5.根据实施方案1至4中任一项的方法，其中在添加血红素辅因子之前，将复性混合物孵育至少1小时、优选至少2小时、更优选至少4小时，尤其是至少8小时。[0121]实施方案6.根据实施方案1至5中任一项的方法，其中将血红素辅因子以至少1μmol/l、优选至少4μmol/l、更优选至少10μmool/l、尤其是至少20μmol/l添加到复性混合物中。[0122]实施方案7.根据实施方案1至6中任一项的方法，其中将血红素辅因子添加到复性混合物中，添加量在1μmol/l至200μmol/l之间，优选在4μmol/l至100μmol/l之间、更优选在10μmol/l至50μmol-l之间，尤其是在15μmool/l至25μmo1/l之间。[0123]实施方案8.根据实施方案1至7中任一项的方法，其中将血红素辅因子相对于血红素过氧化物酶的至少0.25、优选至少0.5、更优选至少1、尤其至少2摩尔当量添加到复性混合物中。[0124]实施方案9.根据实施方案1至8中任一项的方法，其中将相对于血红素过氧化物酶0.25至10之间、优选0.5至5之间、更优选1至4之间、尤其是1至2摩尔当量之间的血红素辅因子添加到复性混合物中。[0125]实施方案10.根据实施方案1至9中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶是ii类或iii类血红素过氧化氢酶，优选iii类血红素过氧化物酶。[0126]实施方案11.根据实施方案1至10中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶是辣根过氧化物酶(hrp)。[0127]实施方案12.根据实施方案1至11中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶不包含纯化标记，特别是多组氨酸标记。[0128]实施方案13.根据实施方案1至12中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶包含氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:3具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、尤其是至少99％的序列同一性。[0129]实施方案14.根据实施方案1至13中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶包含seqidno:3所示的氨基酸序列。[0130]实施方案15.根据实施方案1至14中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶包含seqidno:4所示的氨基酸序列。[0131]实施方案16.根据实施方案1至15中任一项的方法，其中血红素辅因子是氯化血红素。[0132]实施方案17.根据实施方案1至16中任一项的方法，其中通过以下步骤提供ib形式的血红素过氧化物酶：[0133]–培养表达编码血红素过氧化酶基因的宿主细胞；以及[0134]-从所述宿主细胞获得ib。[0135]实施方案18.根据实施方案17的方法，其中宿主细胞是原核细胞，优选大肠杆菌细胞。[0136]实施方案19.根据实施方案17或18的方法，其中宿主细胞以至少2l、优选至少5l、更优选至少20l、甚至50l、尤其是至少100l的体积培养。[0137]实施方案20.根据实施方案1至19中任一项的方法，其中所述溶解包括在溶解缓冲液中孵育ib。[0138]实施方案21.根据实施方案20的方法，其中溶解缓冲液的ph值至少为8，优选至少为8.5、更优选至少为9.0、更优选至少9.5。[0139]实施方案22.根据实施方案20或21的方法，其中溶解缓冲液的ph值在8和12.5之间，优选在8.5和11.5之间、更优选在9和11之间、更优选在9.5和10.5之间。[0140]实施方案23.根据实施方案20至22中任一项的方法，其中溶解缓冲液包含还原剂。[0141]实施方案24.根据实施方案20至23中任一项的方法，其中所述溶解缓冲液具有对应于二硫苏糖醇(dtt)浓度在1至50mmol/l之间、优选在2至25mmol/l之间、更优选在4至15mmol/l之间、尤其是在6至8mmol/l.dtt之间的氧化还原条件。[0142]实施方案25.根据实施方案20至24中任一项的方法，其中溶解缓冲液含有尿素，浓度优选为至少4mol/l、更优选为至少5mol/l、更优选至少6mol/l。[0143]实施方案26.根据实施方案20至25中任一项的方法，其中，溶解缓冲液包含4mol/l至8mol/l尿素，优选5mol/l至7mol/l，尤其是5.5至6.5mol/l的尿素。[0144]实施方案27.根据实施方案20至26中任一项的方法，其中ib在所述溶解缓冲液中孵育至少5分钟，优选至少10分钟、更优选至少15分钟，尤其是至少30分钟。[0145]实施方案28.根据实施方案20至27中任一项的方法，其中ib在所述溶解缓冲液中在4℃至40℃、优选10℃至35℃、更优选20℃至25℃的温度下孵育。[0146]实施方案29.根据实施方案1至28中任一项的方法，其中溶解的ib以1:5v/v和1:250的比率(溶解的ib:复性缓冲液)，优选1:10和1:100、更优选1:20和1:80，尤其是1:25和1:60，最优选1:30和1:50的比例与复性缓冲溶液混合。[0147]实施方案30.根据实施方案1至29中任一项的方法，其中，折叠在至少5l、优选至少10l、更优选至少25l、更优选至少100l的体积中进行。[0148]实施方案31.根据实施方案1至30中任一项的方法，其中复性缓冲液的ph至少为8，优选至少8.5、更优选至少9、更优选至少9.5。[0149]实施方案32.根据实施方案1至31中任一项的方法，其中复性缓冲液的ph值在8至12.5，优选在8.5至11.5、更优选在9至11、更优选在9.5至10.5。[0150]实施方案33.根据实施方案1至32中任一项的方法，其中溶解缓冲液和复性缓冲液之间的ph差值小于2ph增量，优选小于1ph增量、更优选小于0.5ph增量、更优选小于0.2ph增量，特别是小于0.1ph增量。[0151]实施方案34.根据实施方案1至33中任一项的方法，其中复性缓冲液包含氧化剂。[0152]实施方案35.根据实施方案1至34中任一项的方法，其中复性缓冲液具有对应于谷胱甘肽二硫化物(gssg)浓度在0.2和6mmgssg之间、优选在0.4和4mmgsgsg之间、更优选在0.8和2.5mmgssr之间、尤其是1.1和1.6mmgssh之间的氧化还原条件。[0153]实施方案36.根据实施方案1至35中任一项的方法，其中复性缓冲液包含0.5至3mol/l的尿素，优选1mol/l至2.7mol/l、更优选1.5mol/l到2.4mol/l之间，尤其是1.8至2.2mol/l。[0154]实施方案37.根据实施方案1至36中任一项的方法，其中复性混合物中dtt和gssg之间的摩尔比在1:2(dtt:gssg)和1:30之间，优选在1:3和1:20之间、更优选在1:4和1:15之间，尤其是在1:6和1:8之间。[0155]实施方案38.根据实施方案1至37中任一项的方法，其中复性混合物的还原电位在-105mv和135mv之间，优选在-90mv和105mv之间、更优选在-80mv到80mv之间以及更优选在-70mv至60mv之间(最优选在-60mv到50mv之间)。[0156]实施方案39.根据实施方案1至38中任一项的方法，还包括向复性混合物中添加盐的步骤。[0157]实施方案40.根据实施方案39的方法，其中将盐添加到复性混合物中，使离子强度介于0.5和6mol/l之间，优选介于1.5和5mol/l、更优选介于2.5和4.5mol/l间，尤其是介于3.5和4.5mol/l之间。[0158]实施方案41.根据实施方案39或40的方法，其中盐是氯化钠，优选浓度在0.5到6mol/l之间、更优选浓度在1.5到5.5mol/l、更优选浓度介于2.5到5mol/l、尤其是3.5到4.5mol/l。[0159]实施方案42.根据实施方案39至41中任一项的方法，其中盐为硫酸铵，优选浓度在0.25至1.5mol/l之间，优选浓度为0.5至1.4mol/l、更优选浓度为0.8至1.2mol/l。[0160]实施方案43.根据实施方案39至42中任一项的方法，其中盐在硫酸铵和氯化钠之间具有盐析强度，由其在hofmeister序列中的位置确定，优选其中盐的浓度在1.25至6mol/l之间、更优选在0.5至5mol/l、更优选在1.0至4.5mol/l间，最优选在1.5和4mol/l之间。[0161]实施方案44.根据实施方案39至43中任一项的方法，其中盐的由其在hofmeister序列中的位置确定的盐析强度弱于氯化钠，优选其中盐的浓度为至少2mol/l、优选至少4mol/l、更优选至少4.5mol/l。[0162]实施方案45.根据实施方案44的方法，其中盐的浓度在2mol/l和12mol/l之间，优选在4mol/l到10mol/l、更优选在4.5mol/l至8mol/l。[0163]实施方案46.根据实施方案1至45中任一项的方法，还包括离心步骤，用于去除折叠血红素过氧化物酶中的杂质。[0164]实施方案47.根据实施方案1至46中任一项的方法，还包括过滤步骤，用于去除折叠血红素过氧化物酶中的杂质。[0165]实施方案48.根据实施方案1至47中任一项的方法，还包括纯化折叠血红素过氧化物酶的步骤。[0166]实施方案49.根据实施方案48的方法，其中在将血红素辅因子添加到复性混合物中后纯化血红素过氧化物酶。[0167]实施方案50.根据实施方案48或49的方法，其中血红素过氧化物酶通过色谱纯化。[0168]实施方案51.根据实施方案48至50中任一项的方法，其中血红素过氧化物酶通过疏水相互作用色谱(hic)纯化。[0169]实施方案52.根据实施方案51的方法，其中所述固定相是丁基琼脂糖树脂。[0170]实施方案53.血红素过氧化物酶产品的生产方法，包括根据实施方案1-52中任一项的方法生产血红素过氧化氢酶。[0171]实施方案54.根据实施方案53的方法，还包括激活血红素过氧化物酶以进行偶联反应的步骤。[0172]实施方案55.根据实施方案53或54的方法，还包括偶联反应以获得血红素过氧化物酶缀合物。[0173]实施方案56.根据实施方案55的方法，其中血红素过氧化物酶偶联到优选为抗体的结合剂。[0174]实施方案57.根据实施方案55的方法，其中血红素过氧化物酶偶联到抗体片段，优选单链可变片段(scfv)或抗原结合片段(fab)。[0175]实施方案58.根据实施方案55的方法，其中血红素过氧化物酶与抗体模拟物偶联，所述抗体模拟物优选选自adnectin、亲合体、anticlin、darpins、工程化kunitz型抑制剂和monobody。[0176]实施方案59.根据实施方案55的方法，其中血红素过氧化物酶与优选为蛋白a、蛋白g或蛋白l的抗体结合蛋白偶联。[0177]实施方案60.根据实施方案55的方法，其中血红素过氧化物酶与另一种蛋白质，优选为链霉亲和素偶联。[0178]实施方案61.根据实施方案53至60中任一项的方法，还包括纯化血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物的步骤。[0179]实施方案62.根据实施方案53至61中任一项的方法，还包括冷冻血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物的步骤。[0180]实施方案63.根据实施方案53至62中任一项的方法，还包括将血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物冷冻干燥的步骤。[0181]实施方案64.根据实施方案53至63中任一项的方法，还包括将血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物固定在固体载体上的步骤。[0182]实施方案65.根据实施方案64的方法，其中固体载体是纳米颗粒，优选磁性纳米颗粒或纳米纤维。[0183]实施方案66.根据实施方案64的方法，其中固体载体是碳/聚乙烯材料。[0184]实施方案67.根据实施方案64的方法，其中固体载体是膜。[0185]实施方案68.根据实施方案53至67中任一项的方法，还包括将血红素过氧化物酶或血红素过氧化物酶缀合物包装在试剂盒中的步骤。[0186]实施方案69.根据实施方案68的方法，其中选自缓冲液、试剂、说明书中的其他成分被添加到试剂盒中。[0187]实施方案70.根据实施方案69的方法，其中将产生h2o2的酶添加到试剂盒中。[0188]以下附图和实施例进一步说明了本发明，但不限于此。[0189]图1.(a)不同血红素辅因子浓度和添加到复性混合物中的次数分别对体积活度、复性收率的影响。(b)血红素辅因子添加的不同时间的响应等高线图，血红素辅助因子浓度作为因子，体积活度[u/ml]作为响应(doe4)。[0190]图2.取决于溶解混合物中的dtt浓度和复性缓冲液中的gssg浓度(doe1)的体积活度[u/ml]响应等高线图。[0191]图3.doe3不同dtt和gssg浓度(均以mm为单位)下ph8.5、ph9.25和ph10的响应等高线图。[0192]图4.反应器实验2的氧化还原电位和体积活度(在线取样)。在复性开始20小时后添加20μm氯化血红素，此时氧化还原信号显示急剧上升。[0193]图5.反应器实验5的氧化还原电位和体积活度。在氯化血红素进料结束之前，每2小时抽取一次样品，并在测定前(正圆)用20μm的最终氯化血红素浓度进行孵育。开始进料氯化血红素后，每2小时抽取一次样品，并立即测定体积活度(正方形)。[0194]图6.使用一步梯度法(stepgradient)洗脱hic1的活性hrp和杂质。活性hrp在120和125ml(75％缓冲液b)之间洗脱，而疏水杂质从131ml开始洗脱(100％缓冲溶液b)。[0195]图7.使用线性梯度对hic2的活性hrp和杂质进行洗脱。活性hrp从125ml到135ml洗脱，而疏水杂质从145ml洗脱。[0196]图8.使用线性梯度洗脱hic3的活性hrp和杂质。活性hrp在梯度后期洗脱(约90％缓冲液b)，导致与疏水杂质洗脱重叠，疏水杂质用100％缓冲液b洗脱。[0197]图9.使用一步梯度法洗脱hic4的活性hrp和杂质。虽然使用90％的缓冲液b可以将活性hrp从疏水杂质中分离出来，但这会导致活性hrp峰的强烈拖尾，从而造成需要在活性hrp浓度较低和较低回收率之间决定。[0198]图10.使用一步梯度法洗脱hic5的活性hrp和杂质。活性hrp在1250至1400ml(75％缓冲液b)之间洗脱，而疏水杂质从1400ml(100％缓冲液b)开始洗脱。[0199]图11.在ph8.5下进行复性的hic色谱图。纯hrp在75％缓冲液b下洗脱，而疏水杂质在100％缓冲液b上洗脱。[0200]图12.在ph10下复性的hic色谱图。纯hrp在75％缓冲液b下洗脱，而疏水杂质在100％缓冲液b上洗脱。[0201]图13.与重组野生型hrp(rhrp，seqidno:2)和植物源hrp(phrp)相比，hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(mhrp，seqidno:4)的残留活性。将浓度为2.9μm的150μlphrp(三角形)、mhrp(方形)和rhrp(圆形)在50mmbistris/hclph7、0.5mnacl、7％甘油中在60℃下孵育10h。如实施例1所述，使用abts测定初始酶活性和残余酶活性，并以％为单位绘制孵育时间曲线。mhrp的热稳定性比rhrp提高了13倍以上，甚至比植物源(即糖基化的)phrp提高1.7倍。[0202]图14.从三个不同的复性实验中获得的酶活性。“成批添加”：在复性20小时后成批添加血红素辅因子(第一列)。“氯化血红素进料10小时”：在复性开始后8小时添加血红素辅因子作为10小时进料(第二列)。“氯化血红素进料1小时”：在复性开始后8小时添加血红素辅因子作为1小时进料；直接在进料结束后(最后一列)以及进一步孵育10小时后(第三列)进行测定。[0203]实施例1.材料和方法[0204]试剂[0205]l-氧化谷胱甘肽(gssg)和2,2'-叠氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)来自applichem。氯化血红素是从sigma购买的(氯化血红素来自牛，≥90％).二硫苏糖醇(dtt)和所有其他化学品均购自roth。[0206]菌株和生长条件[0207]编码hrp变体c1a的hrp基因是针对大肠杆菌进行密码子优化的，并从genscriptusainc.(piscataway，新泽西州，美国)获得。质粒pet21d 用于细胞质中hrp包涵体的产生。引入了一个终止密码子，这样产生的蛋白质没有任何标记。hrp是在10lbiostatcplus不锈钢生物反应器(satorius，德国)中的大肠杆菌bl21(de3)中产生的。在delisa培养基中成批进料孵育12h，用0.5mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导hrp生成。通过离心法收集生物质，并将湿的生物质储存在-20℃下，直到进一步处理。[0208]均质和清洗[0209]使用ikat10碱性ultra-turrax在3-5ml缓冲液a/g湿生物量(缓冲液a：50mmtris/hcl；ph8；500mmnacl；1.5mmedta)中重新悬浮生物质，并均质(使用geanirosoavipandaplus)(》1300bar，3道，冷却)。离心均质悬浮液(15650g；20min，4℃)，丢弃上清液，细胞碎片重新悬浮在10ml缓冲液b/g湿细胞碎片(缓冲液b：50mmtris/hcl；ph8；500mmnacl；2m尿素)中，然后再次离心(15650g；20min；4℃)。使用缓冲液b的清洗步骤重复一次。然后，将ib/细胞碎片重新悬浮在水中(5ml水/g湿细胞碎片)，将悬浮液加入预先称重的50ml反应管中，离心分离(15650g；20min，4℃)，并将颗粒储存在-20℃下，直到进一步使用。[0210]溶解[0211]为了溶解，将一等分冷冻ib解冻、称重，以计算湿包涵体(wib)的重量，并重悬在适当的溶解缓冲液中(溶解缓冲液1：50mmtris/hcl；ph8；6m尿素/溶解缓冲液2：50mm甘氨酸；ph10；6m脲)，以达到100g/l的wib浓度。重悬后，添加dtt(使用1mdtt储备液)，使溶解混合物中的最终浓度从1mm到28.44mmdtt不等，然后孵育溶解混合物(rt；0.5h；轻微搅拌)，然后离心(20379g；20min；4℃)。上清液立即用于复性，小球被丢弃。[0212]实施例2、小规模复性实验[0213]分析方法[0214]bradford：使用bradford分析法测定蛋白质浓度，使用genesys20光度计(thermoscientific)在595nm室温下孵育10分钟后测定吸收。以牛血清白蛋白为标准品。[0215]酶活性测定：使用tecaninfinitem200pro，用平底聚苯乙烯96孔板测定hrp酶活性。根据正确折叠hrp的浓度，样品在稀释缓冲液中以1:50-1:200的比例稀释(稀释缓冲液：20mmbis-trisph7；7％v/v甘油)。将170μlabts溶液(50mmkh2po4ph5中的5mmabts)与10μl稀释样品混合在微孔中，然后添加20μlh2o2(10mmh2o2)以开始反应。随后立即记录420nm处2分钟内的吸光度变化(30℃)。体积酶活性使用以下公式计算：[0216]其中[0217]vtotal…试管中的总体积，单位为[μl][0218]δa/min…吸光度变化[δ绝对值420nm/分钟][0219]dilution……样品的稀释度[0220]vsample…样品体积[μl][0221]d…穿过反作用力的光束路径长度(d＝0.58cm)[0222]ε…消光系数(ε420＝36mm-1cm-1)。[0223]sec-hplc：使用sec-hplc测定hic捕获步骤后活性hrp部分的纯度。为此，使用xbridge蛋白behsec柱，3.5μm，7.8mmx150mm(waters)。该方法以0.5ml/min的速度与100％缓冲液a(缓冲液a：80mm磷酸盐，ph6.8；250mmkcl)一起运行18分钟。将柱保持在25℃的恒定温度下，并214nm、280nm和404nm测定。[0224]reinheitszahl(rz)：以404nm至280nm处的吸光度比测定reinheitszahl。使用日立双光束分光光度计u-2900测定吸光度。[0225]modde10：实验设计(doe)的规划和分析使用umetricsmodde10。[0226]实验设置[0227]一般材料和方法如实施例1所述。所有小规模复性实验均使用2ml反应管进行。在适当的复性缓冲液(复性缓冲溶液1:20mmtris/hcl；ph8.5；2m尿素；2mmcacl2；7％v/v甘油；不同gssg浓度/复性缓冲液体2:20mm甘氨酸；ph10；2m脲；2mm-cacl2，7％v/v甘油；不同的gssg浓度)中稀释1:40，然后在4℃下孵育；48小时；带着轻微的激动。在100mm氢氧化钾中制备用于所有实验的1mm氯化血红素储备溶液。[0228]doe1：对于第一个doe(实验设计)，用于溶解的dtt浓度(溶解缓冲液1；ph8)和复性缓冲液(复性缓冲溶液1；ph8.5)中的gssg浓度不同(见表1)，而氯化血红素在添加20小时后保持恒定在20μm。采用复性后体积活度作为响应的ccf(中心复合表面设计(centralcompositeface-centereddesign))。[0229]表1：dtt和gssg浓度用于使用doeccf方法优化氧化还原条件，以体积活度作为响应[0230]dtt浓度[在增溶质中的mm]gssg[在复性缓冲液中的mm]2.50.58.752153.5[0231]doe2：对于第二个doe，用于溶解的dtt浓度(溶解缓冲液1；ph8)、复性缓冲液(复性缓冲溶液1；ph8.5)中的gssg浓度和复性混合物中的蛋白质浓度各不相同(见表2)，而氯化血红素添加20小时后保持在20μm不变。采用复性后体积活度和比活度作为响应的中心复合表面设计(ccf)。[0232]表2：dtt和gssg浓度以及总蛋白浓度，用于使用doeccf方法研究氧化还原系统和复性混合物中蛋白质浓度之间的相互作用[0233][0234]doe3：对于第三种doe，用于溶解的dtt浓度、复性缓冲液中的gssg浓度以及溶解和复性缓冲溶液的ph值都不同(见表3)。对于ph8.5的溶解和复性，使用缓冲液1，对于ph10的溶解，使用复性缓冲液2。20小时后，氯化血红素的添加保持恒定在20μm。采用复性后体积活度作为响应的ccf(中心复合表面设计)。[0235]表3:dtt和gssg浓度以及溶解和复性缓冲液的ph值，用于使用doeccf方法研究溶解和复性期间氧化还原系统和ph之间的相互作用[0236][0237][0238]doe4：对于此doe，添加氯化血红素的时间和浓度分别在复性开始后0h-24h、6μm–80μm的氯化血红素之间变化。使用的确切要素如表4所示。所有实验均使用溶解缓冲液1(ph8)和复性缓冲液1。为了优化这两个要素，将体积活度用作响应。[0239]表4：作为doe4要素的复性混合物中氯化血红素的添加时间和浓度，以优化复性混合物的氯化血红素添加[0240]氯化血红素添加(复性开始后的时间)[h]最终氯化血红素浓度[μm]0662012402480[0241]结果：氯化血红素添加[0242]为了评估复性开始后氯化血红素的最佳浓度和最佳添加时间，以体积活度为响应，在小规模实验中筛选了几种不同的条件。结果如图1所示。对于复性开始后0h添加的氯化血红素，复性收率显示出对氯化血红素浓度的强烈依赖性，与优化条件相比，氯化血红素浓度更高导致减少10倍以上。此外，即使在最低氯化血红素浓度(6μm)下，复性收率也降低到60％。在随后的氯化血红素添加时间中，这种影响会降低，24小时后添加的氯化血红素几乎不受浓度的影响。选择20μm进行进一步实验。[0243]结果：氧化还原系统gssg。使用溶解缓冲液1(ph8)和复性缓冲液1。从复性开始后8小时到20小时(12小时进料时间)，连续进料(2ml1mm氯化血红素/h；最终浓度20μm氯化血红素)。对于反应器2，每2小时抽取一次样品，并测定活性。开始进料氯化血红素后，直接测定样品(在开始进料时氯化血红素浓度较低)，另外，在将氯化血红素添加到最终浓度为20μm的氯化血红霉素后孵育2小时测定样品。[0257]结果：氯化血红素添加时间[0258]基于小规模优化(实施例2)，在复性开始后20小时，将氯化血红素添加至最终浓度20μm，用于反应器实验2。在添加氯化血红素之前(即前20小时)，每2小时采集一次样品，以测定线处的活性(图4)。为了测定与复性成功相关的体积活度，在采样后立即向每个样品中添加20μm氯化血红素，并在孵育2小时后测定活性。向反应器中添加氯化血红素后(即20小时后)，仍然每2小时采集一次样品，但没有添加更多氯化血红素。然而，样品在与之前相同的条件下孵育(测定前2小时)。从在线活性测定可以看出，复性大约在10小时后完成，之后活性停滞，直到添加氯化血红素。向反应器中添加氯化血红素后活性的提高可能是由于反应器中的有利条件，例如更好的表面-体积比和更充分的混合。[0259]表5.反应器实验2的结果[0260][0261][0262]这些实验表明，在添加血红素辅因子之前，将复性混合物孵育一段时间是非常有利的。在复性过程中，血红素的疏水性质似乎促进了聚集。如小规模实验所示，如果早期添加高浓度氯化血红素，则会显著降低复性收率，而后期添加则不会产生这种效果。在反应早期添加疏水物质(在本实施例中为氯化血红素)可能会促进蛋白质聚集，导致复性收率降低。然而，复性反应完成后(hrp在所用条件下约10小时)，添加氯化血红素不再导致聚集(对于所有测试浓度)，因为氯化血红素的加入是全酶形成的最后一步。[0263]结果：线性氯化血红素进料[0264]对于反应器实验5，在复性开始后8小时内应用线性氯化血红素进料，总进料时间为12小时。根据反应器实验2所述的取样程序(每两小时)提取样品。开始进料氯化血红素后，在不进一步添加氯化血红素的情况下测定一次样品(即，在开始进料氯化血红素时，低氯化血红素浓度；表6中的样品b1-b10)，以及在添加氯化血红素后测定一次，以达到20μm氯化血红霉素的最终浓度，并再孵育2小时(表6中样品a1-a9)。[0265]表6.反应器实验5的结果。[0266][0267][0268]从反应器实验2和5的比较中可以明显看出，在一定时间段内分散添加氯化血红素与一次性成批添加相比的有益效果。实验2、样品4和实验5、样品a4均基于在复性和测定开始后6小时成批添加20μm氯化血红素。因此，观察到的体积活度非常相似(31.97±0.52对33.10±1.49)。这表明样品的结果可以在这些实验之间进行比较。实验2样品10(18小时后成批添加20μm氯化血红素，20小时后测定：35.44±0.86)和实验5样品b6(复性后8小时至20小时之间作为线性进料添加，20.5小时之后测定：62.40±2.10)的比较表明，成批添加与长时间添加的差异很明显。这两个样品之间的唯一区别是添加氯化血红素的持续时间(一次一批或在12小时内分散)，这清楚地表明，添加氯化血红素的时间越长，效果越好。[0269]图5示出了氧化还原电位以及测定的体积活度。与反应器实验2(图4)相比，两个实验的复性开始时间非常相似，实验2在8小时后达到的体积活度为32.0，实验5为33.1。然而，添加氯化血红素后，实验5采用的线性氯化血红素进料比实验2的复性收率增加了25％。[0270]结果：氧化还原系统[0271]为了确认使用小规模实验(实施例2)获得的结果，进行了四个反应器实验。表7列出了条件和最终比活度。总体来说，这些条件与使用小规模实验获得的结果一致，ph值为10时的优化dtt/gssg浓度显示出最高的复性收率。[0272]表7：在生物反应器中进行的实验室规模复性实验(1.2l)中使用的ph、dtt和gssg浓度以及获得的比活度[u/mg]，这反过来代表复性收率。[0273][0274][0275]实施例4.复性后捕获[0276]一般材料和方法如实施例1所述。分析方法如实施例2所述。[0277]在本实施例中，疏水相互作用色谱(hic)被用作复性后的捕获步骤。这有一个优点，即结合条件需要高盐浓度，这会沉淀杂质，例如过量的氯化血红素、聚集物和杂质，而正确折叠的hrp在高盐浓度下是稳定的。这样做的优点是将这些杂质从用于捕获步骤的上样中分离出来，从而使色谱树脂具有更高的结合能力，更容易清洗和再生。[0278]小规模沉淀试验[0279]为了使用hic(疏水相互作用色谱法)找到捕获步骤的最佳盐浓度，在2ml反应管中测试了不同浓度的(nh4)2so4和nacl。在2ml反应管中称量适量盐(见表8)，并添加1ml复性混合物(复性完成后)。混合反应管以溶解盐，并在室温和轻微搅拌下孵育30分钟。离心后(20379g；20min；4℃)，上清液用于bradford和活性测定。然后利用最佳条件，使用较大的体积，制备各种hic试验的上样。因此，在10min内连续搅拌下缓慢添加盐，然后在室温下搅拌20min的同时孵育溶液，然后离心(20379g；20min；22℃)。[0280]表8：(nh4)2so4和nacl的不同盐浓度用于小规模实验，以优化复性后的盐沉淀[0281][0282][0283]所有描述的色谱步骤均使用了pure系统(gehealthcare)。监测了三个波长(214nm、280nm和404nm)以及电导率。[0284]沉淀步骤测试了两种不同的盐，即(nh4)2so4和nacl。为了找到最佳盐浓度，在2ml反应管中测试了两种盐的几种盐浓度，结果如表9和表10所示。通常，目标蛋白与hic树脂结合所需的最低盐浓度用于制备上样，因为在这种浓度下，杂质的结合量最低。然而，在这种情况下，选择了活性hrp未沉淀的最高量。一方面，这确保了大量杂质沉淀(见表9中的纯化系数)。另一方面，在这些条件下，几乎所有与树脂结合的杂质都更疏水，因此在较低的盐浓度下也会结合。此外，结合强度的差异使得很容易从这些杂质中分离出活性hrp。因此，选择1m(nh4)2so4或4mnacl制备上样。[0285]表9：复性结束后不同浓度的(nh4)2so4对蛋白质浓度(使用bradford分析测定)、比活度(根据总蛋白质和体积活度计算)以及纯化系数的影响[0286][0287]表10：复性结束后不同浓度的氯化钠对体积活度的影响[0288][0289][0290]然后，使用体积为150ml的小规模实验验证小规模实验的结果，如表11所示。(nh4)2so4和nacl在所选盐浓度下的体积活度回收率分别为96％和95％。(nh4)2so4的比活度增加了2.5倍，nacl的比活度提高了4.5倍，从而为后续hic步骤提供了有利条件。[0291]表11：使用1m(nh4)2so4或4mnacl作为hic捕获步骤的样品制备物的实验室规模(150ml)盐沉淀的体积和比活度以及蛋白质浓度和纯化系数[0292][0293]hic实验1(hic1)[0294]如上所述，通过添加267g氯化钠/1l复性混合物制备上样。使用1mlhitrapbutylff(gehealthcare)，流速为0.5ml/min(75cm/h；0.5cv/min；cv＝柱体积)。用缓冲液a(缓冲液a：20mmbis-trisph7；7％甘油；4m氯化钠)平衡色谱柱，并在平衡期间所有信号保持不变后上样49ml。上样后，使用缓冲液a(8ml；8cv)执行清洗步骤。此后，使用25％缓冲液b(缓冲液b：20mmbis-trisph7；7％甘油/8ml；8cv)、75％缓冲液b(10ml；10cv)和100％(17ml；17cv)缓冲液b进行分步洗脱，活性hrp在75％缓冲液b洗脱。测定所有馏分的体积酶活性[u/ml]和蛋白质浓度。使用sec-hplc和reinheitszahl测定活性池的纯度。[0295]该捕获步骤为复性后hrp的纯化和捕获提供了优化方法。图6示出了本实验使用的步骤洗脱，表12示出了相应的分析。在色谱步骤中，活性hrp浓度约为9倍，产生0.5g/l，预计在放大过程中会进一步提高。更多疏水性杂质在100％缓冲液b中洗脱，因此该方法具有良好的分辨率。404nm信号与280nm信号的比值表明活性组分纯度较高。sec-hplc进一步证实了这一点(纯度≥98％)。因此，这提供了一种从大肠杆菌包涵体中获得纯净、正确折叠和完全活性的hrp的方法。[0296]表12：采用盐沉淀和疏水相互作用色谱法的捕获步骤的体积、蛋白质浓度、比活度和纯化系数[0297][0298]hic实验2(hic2)[0299]如上所述，通过添加132g(nh4)2so4/1l复性混合物制备上样。使用hitrapoctylff1ml(gehealthcare)，流速为1ml/min(150cm/h；1cv/min)。用缓冲液a(缓冲液a：20mmtrisph8.5；7％甘油；1m(nh4)2so4平衡色谱柱，并在平衡过程中所有信号保持不变后，上样50ml。上样后，使用缓冲液a(16ml；16cv)执行清洗步骤。此后，在30ml(30min；30cv)中用0-100％b(缓冲液b：20mmbis-trisph7；7％甘油)进行线性梯度洗脱。测定所有馏分的体积酶活性[u/ml]。由于目前在流穿中发现的活性hrp百分比最大，因此未应用进一步分析。sorvall6000离心机中离心30分钟。将上清液用作hic上样(加盐后约1250–1300ml)，并丢弃颗粒。[0321]对于ph值为10的情况，容器的最终复性体积为1.2l(因此使用30ml增溶质，稀释度为1:40)。复性缓冲液含有20mm甘氨酸ph10(用hcl调节)、2m尿素、7％甘油、2mmcacl2、1.27mmgssg。从复性开始后8h到18h(10h进料时间)，连续进料(2.4ml1mm氯化血红素/h；最终浓度20μm氯化血红素)，19h后终止反应器运行。盐沉淀前，用hcl将ph值从ph值10降至ph值8.5。然后在室温下搅拌时，在30分钟内添加0.27g氯化钠/ml复性混合物。然后，将复性混合物在17568g、4℃、thermoscientificlynxsorvall6000离心机中离心30分钟。将上清液用作hic上样(加盐后约1250–1300ml)，并丢弃颗粒。[0322]对于hic，使用填充有丁基琼脂糖凝胶4fastflow(gehealthcare)的色谱柱，床层体积为80ml。以113cm/h的流速，用缓冲液a(缓冲液a：20mmbistrisph7；4mnacl)使色谱柱平衡，直到所有信号保持不变。然后以90cm/h的流速上样1250-1300ml。上样后，用20％缓冲液b(缓冲液b：20mmbis-trisph7)以90cm/h的流速执行清洗步骤2cv。此后，用75％缓冲液b(79cm/h)和100％缓冲液b进行分步洗脱，用75％的缓冲液b洗脱活性hrp。测定所有馏分的体积酶活性[u/ml]和蛋白质浓度。使用reinheitszahl测定活性池的纯度。[0323]结果[0324]根据该方法，发现在ph值为10的条件下进行的小规模开发实验比ph值为8.5的条件下更适合复性(参见实施例2)。因此，使用相同数量的hrp湿包涵体进行两次反应器运行，一次在ph8.5下复性，另一次在ph10下复性。结果概述见表14。与ph8.5(44％)下的收率相比，在ph110下复性可使复性收率高达74％。此外，reinheitszahl更高，纯hrp的总产量在ph10下增加了1.7倍。这证实了小规模doe的结果(示例2)。图11和12显示了hic运行的色谱图。这里可以看出，在ph10下复性会导致疏水性杂质显著减少，并且在75％的缓冲液b处会出现一个很大的尖锐hrp峰。[0325]表14.ph8.5和ph10条件下复性的最终参数比较。[0326][0327][0328]实例6.hrp突变研究的材料和方法[0329]hrp突变体的表达和纯化[0330]vi-a型植物hrp(货号：p6782)来自sigmaaldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)。除非另有规定，否则在大肠杆菌中产生的所有hrp变异体都由如seqidno:2所示的序列组成，并带有指定的突变。[0331]表达宿主和质粒[0332]如前所述，进行标准分子克隆技术(humer和spadiut，"improvingtheperformanceofhorseradishperoxidasebysite-directedmutagenesis."internationaljournalofmolecularsciences20.4(2019):916)。编码hrp变体c1a(野生型hrp；seqid号：2)的hrp基因是针对大肠杆菌进行了密码子优化的，从genscriptusainc.(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)获得。hrp由psf-t7-laco-nh2-dsba(og4591)(oxfordgeneticsltd.，牛津，英国)或pet21d (novagen，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)在大肠杆菌菌株bl21(de3)(lucigen，米德尔顿，威斯康星州，美国)中产生。质粒psft7编码一个dsb标签，以输出到易位后被裂解的周质中。质粒pet21d 用于细胞质中hrp包涵体的产生。引入了一个终止密码子，这样产生的蛋白质没有任何标记。[0333]包涵体(ib)的蛋白质表达和纯化[0334]sb培养基(32gl-1个胰蛋白胨；20gl-1份酵母提取物；5gl-1氯化钠；5mmnaoh)用于培养bl21(de3)细胞，该细胞包含不含任何n端或c端标记的hrp基因(或其变体)的载体pet21d 。将氨苄西林添加到最终浓度为100mgl-1的培养基中。预培养物在37℃下在50mlsbamp培养基中振荡(250rpm)孵育过夜，并接种2.5lultrayield烧瓶(uyf)，以在最终体积为500mlsbamp培养基中达到0.3的光密度(od600)。细胞在37℃下振荡(250rpm)生长，直至od600为0.5，随后通过添加0.1mm异丙基β-d-1硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导hrp表达。在25℃和250rpm下生长20h后，通过离心(5000g，20min，4℃)收集细胞。[0335]使用ikat10碱性ultra-turrax在3-5ml缓冲液a/g湿生物量(缓冲液a：50mmtris/hcl；ph8；500mmnacl；1.5mmedta)中重新悬浮生物质，并均质(使用geanirosoavipandaplus)(》1300bar，3通道，冷却)。离心均质悬浮液(15650g；20min，4℃)，丢弃上清液，细胞碎片重新悬浮在10ml缓冲液b/g湿细胞碎片(缓冲液b：50mmtris/hcl；ph8；500mmnacl；2m尿素)中，然后再次离心(15650克；20min；4℃)。使用缓冲液b的清洗步骤重复一次。然后，将ib/细胞碎片重新悬浮在水中(5ml水/g湿细胞碎片)，将悬浮液加入预先称重的50ml反应管中，离心分离(15650g；20min，4℃)，并将颗粒储存在-20℃下，直到进一步使用。[0336]为了溶解，解冻一份冰冻ib，称重以计算湿包涵体(wib)的重量，并将其重新悬浮在适当的溶解缓冲液(50mmtris/hcl；ph8.5；6m尿素)中，以达到100g/l的wib浓度。重悬后，添加dtt(使用1mdtt储备液)，使溶解混合物中的最终浓度达到7.11mmdtt，并孵育溶解混合物(4℃；0.5h；轻微搅拌)，然后离心(20379g；20min；4℃)。上清液立即用于复性，小球被丢弃。[0337]在适当的复性缓冲液(例如，20mmtris/hclph8.5，2m尿素，7％甘油，2mmcacl2，1.27mmgssg)中以1:40的比例稀释增溶质，向其中添加最终浓度为20μm的氯化血红素，并在10℃下复性19小时。[0338]通过疏水相互作用色谱(hic)进一步纯化蛋白质。使用填充有丁基琼脂糖凝胶4fastflow(gehealthcare)的色谱柱，床层体积为80ml。8ml/min(90cm/h)。以113cm/h的流速，用缓冲液a(缓冲液a：20mmbistrisph7；4mnacl)使色谱柱平衡，直到所有信号保持不变。然后以90cm/h的流速上样1250-1300ml。上样后，用20％缓冲液b(缓冲液b：20mmbis-trisph7)以90cm/h的流速执行清洗步骤2cv。此后，用75％缓冲液b(79cm/h)和100％缓冲液b进行分步洗脱，用75％的缓冲液b洗脱活性hrp。[0339]对于几个突变体，交替地使用实施例5(ph10)中描述的最优选方法进行蛋白质生产和纯化。[0340]动力学参数[0341]使用tecaninfinitem200pro仪器(tecan，mánnedorf，瑞士)，在96孔板分析中测定底物abts、tmb和过氧化氢的酶动力学参数。[0342]对于以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)为底物的测定，96孔板每个孔中的反应混合物在最终体积为200μl的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(ph为5)中含有1mm的饱和过氧化氢浓度和不同的tmb浓度(20–550μm)。将蛋白质样品(5μl)与175μltmb缓冲液混合物混合，并用20μl过氧化氢溶液(10mm)开始反应。tecaninfinitem200pro仪器中，在652nm处30℃下持续60秒吸收增加。使用sigmaplot软件(systatsoftwareinc.，sanjose，加利福尼亚州，美国)计算动力学参数，消光系数ε652＝39mm-1cm-1(见josephy等人，"thehorseradishperoxidase-catalyzedoxidationof3,5,3',5'-tetramethylbenzidine.freeradicalandcharge-transfercomplexintermediates."journalofbiologicalchemistry257.7(1982):3669-3675)。[0343]对于以abts为底物的测定，96孔板每个孔中的反应混合物在最终体积为200μl的50mm磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(ph为5)中含有1mm的饱和过氧化氢浓度和不同的abts浓度(0.1–7mm)。将蛋白质样品(5μl)与175μlabts缓冲液混合物混合，并用20μl过氧化氢溶液(10mm)开始反应。在tecaninfinitem200pro仪器中，在30℃的温度下，在420nm处进行持续120秒的吸收增加。使用sigmaplot软件(systatsoftwareinc.，sanjose，加利福尼亚州，美国)计算动力学参数，消光系数ε420＝36mm-1cm-1(见childs和bardsley，"thesteady-statekineticsofperoxidasewith2,2′‑azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonicacid)aschromogen."biochemicaljournal145.1(1975):93-103)。[0344]对于以过氧化氢为底物的测定，96孔板每个孔中的反应混合物包含10mm的饱和abts，以及最终体积为200μl的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液ph5中的不同过氧化氢浓度(0.001–1mm)。将蛋白质样品(5μl)与145μl过氧化氢缓冲液混合物混合，并用50μlabts溶液(40mm)开始反应。在tecaninfinitem200pro仪器中，在30℃的温度下，在420nm处进行持续120秒的吸收的增加。使用sigmaplot软件(systatsoftwareinc.，sanjose，ca，usa)计算动力学参数，消光系数ε420＝36mm-1cm-1(见childs和bardsley，"thesteady-statekineticsofperoxidasewith2,2′‑azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonicacid)aschromogen."biochemicaljournal145.1(1975):93-103)。[0345]热稳定性[0346]在60℃下，在50mmbistris/hclph7、7％甘油和500mmnacl中评估酶变体的热稳定性。用abts在0、30、60、90和120min后测定hrp野生型(seqidno:2)和hrpn13d/n57s/n255d/n268d的酶活性；在0、90、180、300、420和588min后，测定变体n13d/n57s/n175s/n255d/n268d、hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d、hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k的酶活性，在0、90、180、300和420min后，测定植物hrp的酶活性。热处理期间，包括植物hrp在内的所有变体的酶浓度为2.86μm。然后将样品在冰上冷却5分钟，然后在4℃下以16162g离心15min。随后，使用tecaninfinitem200pro仪器，使用7mmabts测定残余活度。反应混合物含有5μl蛋白质、饱和过氧化氢浓度1mm和溶于ph为5的50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中的abts7mm，总体积为200μl。在30℃下，在420nm处持续120s，实行吸收的增加。将残余酶活度与孵育时间绘制曲线，并使用以下方程式中的失活速率计算60℃下的半衰期：[0347]t1/2＝ln(2)/kin[0348]其中t1/2是半衰期，kin是残余活度对数的斜率。[0349]实例7.hrp突变体的热稳定性[0350]如实施例6所述，表达和纯化了hrp的几个突变体，并测定了热稳定性。发现一些突变增加了热稳定性。最优选的突变型hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)的热稳定性比野生型hrp(seqidno:2)提高了13倍以上，甚至比植物源(即糖基化的)酶的热稳定性提高了1.7倍。重要的是，对于突变p146q和n275k(hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k)的组合，观察到的热稳定性明显高于单独突变p146q(hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d)或n275k(hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k)的热稳定性。[0351]表15.植物hrp和重组产生的hrp变异体。[0352][0353]实例8.hrp突变体的动力学参数[0354]如实施例6所述，表达和纯化了hrp的几个突变体，并测定了底物abts、tmb和过氧化氢的动力学参数。发现hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)对底物tmb和过氧化氢的活性显著高于hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d。突变p146q和n275k被发现对酶活性有强烈的有益影响。[0355]表16.底物tmb的动力学参数。[0356][0357]表17.底物h2o2的动力学参数。[0358][0359]表18.底物abts的动力学参数。[0360][0361]实施例9.与植物源性和野生型hrp的比较[0362]将hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)的动力学参数和热稳定性与野生型hrp(seqidno:2)以及植物源hrp(phrp)进行了比较。如实施例6所述，测定动力学参数和热稳定性。[0363]热稳定性的测定如图13所示。如上文实施例7所述，最优选的突变型hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(mhrp，seqidno:4)的热稳定性比野生型hrp(rhrp，seqidno:2)提高了13倍以上，甚至比植物源(即糖基化的)phrp的热稳定性提高了1.7倍(见表15)。此外，研究发现，即使热稳定性得到了极大的改善，也观察到了与野生型hrp(rhrp，seqidno:2)和植物源hrp相似的催化效率(见下表19和20)。[0364]表19.底物abts的动力学参数。[0365][0366]表20.底物tmb的动力学参数。[0367][0368]实施例10.146和275位的定点饱和突变[0369]为了测试p146和n275位所有可能的氨基酸交换的效果，对这些位置进行了定点饱和突变。作为定点饱和突变的起点，选择了优选突变株hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:3)。分别研究了146位和275位氨基酸交换的影响。[0370]文库生成[0371]以下质粒是用标准分子克隆技术构建的。使用psf-t7中hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:3)的全质粒pcr，通过第146和275位处的定点饱和突变，引入hrp基因突变。使用相应的寡核苷酸扩增6.3kb片段，以生成位点饱和库(表21)。所有寡核苷酸均购自microsynth(巴尔加，瑞士)。根据以下方案磷酸化寡核苷酸：300pmol引物dna、1×t4pnk缓冲液(neb)、1mmatp、5％peg、10单位t4多核苷酸激酶(pnk，neb)。反应在37℃下孵育45分钟，然后在65℃下热失活20分钟。每个pcr反应包含1×q5反应缓冲液、200μmdntpmix、200nm正向和反向磷酸化引物、100ng模板载体dna和1uq5高保真dna聚合酶。pcr产物用newenglandbiolabs(neb，ipswich，ma，usa)的monarchpcr&dna纯化试剂盒纯化，模板质粒dna用fastdigestdpni(thermoscientifictm，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)消化。将2个dpni的fdu(fastdigest单元)添加到纯化的pcr产品中，并在37℃下孵育4小时。在80℃下热失活20min后，对质粒进行平末端连接：50ng质粒dna，1×t4dna连接酶缓冲液(neb)，400个粘性末端单元t4dna连接酶(neb，16℃过夜。在65℃下热灭活20分钟后，质粒转入bl21(de3)。[0372]表21.用于全质粒pcr的引物。[0373][0374]筛选[0375]从选择板中提取阳性转化子，并在96孔板中用200μlsb培养基(32gl-1胰蛋白胨；20gl-1酵母提取物；5gl-1nacl；5mmnaoh；50mgl-1卡那霉素)在37℃、250rpm的塑料盒中孵育16小时，以防干燥。随后，将90μl75％甘油添加到主平板中，然后将其储存在-80℃下。在含有190μlsb培养基的辅平板(slaveplate)上接种10μl主平板。此处培养基含有2mmcacl2；6μm氯化血红素和0.1mmiptg，最终体积为200μl。细胞在25℃、250rpm的塑料盒中生长16h，细胞密度通过使用tecaninfinitem200pro(tecan，mánnedorf，switzerland)平板阅读器测定595nm处的吸收来确定。然后，使用thermofisherlynxsorvall离心机在4℃下以5000g的速度离心6min，并将细胞完全悬浮在200μl/孔b-per细菌蛋白提取试剂(thermoscientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)、5uml-1dnasei和1/2蛋白酶抑制剂混合物片(complete片，不含edta；rochediagnosticsgmbh，mannhein，德国)和200mmmgcl2中。在室温下进行细胞裂解15min，然后在5000g、4℃下离心20分钟。然后用bradford方法测定总蛋白含量。将每个孔的90μl转移到一个新的平板上，在80℃下孵育20分钟(位置146)或在80℃下孵育15min(第275位)，然后将加热的平板和对照平板在5000g、4℃下再次离心20min。随后，用395μmtmb(位置146)或406μmtmb(第276位)、1mmh2o2和溶于50mm磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(ph5)的10μl细胞裂解液(总体积为200μl)中测定酶活性。在30℃下进行测定，并使用tecaninfinitem200pro平板阅读器监测652nm处吸光度的增加(蓝色tmb自由基的ε＝3.9x104m-1cm-1)120s。初始和残余活度使用总蛋白浓度进行归一化，热稳定性显示为残留活度与初始活度的比率。程序与上述相同。每个位置筛选了180个菌落，这对应于预期的库完整性超过99％。每个平板含有6个hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(对应seqidno:3)菌落作为阳性对照。[0376]结果[0377]下面的表22(位置p146)和表23(位置n275)给出了所选突变体的结果。由于本实施例使用96孔板筛选分析，因此变异性(标准偏差)高于本文报告的其他分析。因此，每个突变体的结果只能在测定的每个平板内进行比较。[0378]从表22和表23可以看出，146和275位的多种不同氨基酸交换被发现具有优异的热稳定性。每个位置的几次氨基酸交换产生了有利的结果。在位置146，146a、146r、146v、146e，尤其是146q的情况下，被发现特别有利(均在最优选突变体146q的标准偏差范围内)。在位置275的情况下，观察到275r、275d、275s、275q、275a、275e，尤其是275k的最佳结果(均在最优选突变体275k标准偏差范围内)。[0379]表22.位置146处的位点饱和诱变产生的选定突变体。测定了两个单独的平板(应在每个平板内比较结果)。某些突变体含有相同的氨基酸交换。对于对照组(seqidno:3)，给出了六个重复的平均值和标准偏差。[0380]氨基酸交换u/mg总蛋白残余活度平板1:ꢀꢀ146q(对照)0.056±0.00849％±14％146a0.05450％146e0.04853％146r0.05260％146r0.05359％146q0.05760％平板2:ꢀꢀ146q(对照)0.058±0.00474％±6％146v0.04975％146q0.05977％146q0.05777％146q0.05682％[0381]表23位置275处的位点饱和诱变产生的选定突变体。测定了两个单独的平板(应在每个平板内比较结果)。某些突变体含有相同的氨基酸交换。对于对照组(seqidno:3)，给出了六个重复的平均值和标准偏差。[0382][0383][0384]实施例11.血红素辅因子添加在不同时间段的分散[0385]方法[0386]按照实施例5所述进行工艺运行，其差异如下所示。如实施例1所述进行菌株和生长条件以及均质和包涵体洗涤。如实施例3所述使用复性反应器。[0387]为了溶解，将一等分冷冻ib解冻、称重，以计算湿包涵体(wib)的重量，并将其重新悬浮在适当的溶解缓冲液(溶解缓冲液2:50mm甘氨酸；ph值10；6m尿素)中，以达到100g/l的wib浓度(3.5gib＝35ml溶解混合物，离心后得到30ml溶解混合物)。重悬后，添加dtt以达到7.11mmdtt溶解混合物中的最终浓度，并孵育溶解混合物(4℃；0.5h；轻微搅拌)，然后离心(20379g；20min；4℃)。上清液立即用于复性，小球被丢弃。容器的最终复性体积为1.2l(因此使用30ml溶解剂和1:40的稀释度)。复性缓冲液含有20mm甘氨酸ph10(用hcl调节)、2m尿素、7％甘油、2mmcacl2、1.27mmgssg。[0388]比较了三种不同的血红素添加方式：(a)复性20小时，然后成批添加血红素至最终浓度20μm，并在测定前再孵育5小时；(b)8h复性，然后添加10h氯化血红素进料(2.4ml1mm氯化血红素/h；最终浓度20μm氯化血凝素)，并在测定前再孵育1h；(c)复性8小时，然后添加1小时氯化血红素进料(24ml1mm氯化血红素/h；最终浓度20μm氯化血凝素)，再孵育10小时。[0389]如实施例2所述，测定蛋白质浓度和酶活度。[0390]结果[0391]所得结果如图14所示。在1小时的时间段内分散添加血红素辅因子有明显的益处。即使在1小时氯化血红素进料结束后直接测定(即总复性时间为9小时后)，比活度也比成批添加实验(总复性时间为25小时)的比活度高1.4倍。当在额外孵育10小时后(即总复性时间为19小时后)测定来自1小时进料实验的样品时，比活度甚至比批量添加的样品高1.7倍。在较长的时间段10小时内(实验(b)；总复性时间为19小时)分散添加氯化血红素，比活度甚至比成批添加增加了2倍。[0392]实例12.其他hrp突变体的动力学参数和热稳定性[0393]根据野生型hrp(seqidno:2)、hrpn175s和hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d，研究p146和n275位点突变的有益作用。此外，还研究了单个突变体及其组合的有益效果。在这种情况下，p146和n275位点突变对生化特性的作用是通过测定60℃下的特定酶活性和热稳定性来确定的。[0394]材料和方法[0395]以下野生型hrp突变体(seqidno:2)由sanger测序法创建并验证：hrpp146q、hrpn175s、hrpn275k、hrpp146q/n275k、hrpp146q/n175s、hrpn175s/n275k、hrpp146q/n175s/n275k。如实施例6所述进行纯化。也如实施例7所述测定动力学参数和热稳定性。[0396]比酶活度(abts)[0397]所有hrp变体的单位/mg蛋白质比活度在tecan平板阅读器中用底物abts进行测试(表24)。hrpp146q的比活度是hrp野生型的1.4倍。有趣的是，hrpn175s的比活度较低；然而，hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)能够抵消这种活性降低，并将其恢复为hrp野生型值。[0398]表24.与hrp野生型和hrp[0399]n13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k相比，以abts为底物，所选hrp变体的比活度。[0400][0401][0402]比酶活(h2o2)[0403]此外，用过氧化氢底物测定单位/mg蛋白质的比活度。此处趋势与观察到的abts数据相同，其中变体p146q导致比活度增加，n175s的引入导致数值降低。这也适用于双突变体p146q/n175s和n175s/n275k以及三突变体p1460q/n175s/n275k。当n175s缺失或出现seqidno:4的额外突变时，比活度与seqidno:2相当甚至更好。[0404]表25.与hrp野生型和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k相比，以h2o2为底物所选hrp变体的比活度[0405][0406]比酶活(tmb)[0407]关于底物tmb，hrp变体之间的比活度差异不太明显。然而，p146q的比酶活再次显著增加，而n175s的u/mg相对于野生型最低。[0408]表26.与hrp野生型和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k相比，以tmb为底物所选hrp变体的特定活性。[0409][0410]热稳定性[0411]对所有hrp突变体在60℃下的酶稳定性进行了研究，令人惊讶的是，n175s并不是高温下稳定性增加的唯一原因。hrpn13d/n57s/n255d/n268d将酶的半衰期增加了1.5倍，而hrpn175s将稳定性提高了7.7倍，一旦结合，稳定性就比hrp野生型提高了13倍，表明存在协同效应(表27)。由于hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d和hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)显示了类似的稳定性，可以假设与n175s结合的四倍突变体是这种增强的原因。[0412]对于p146q和n275k，相对于hrp野生型，单突变体和双突变体p146q/n275k的稳定性略有降低。然而，三突变体p146q/n175s/n275k与n175s单独突变表现出相同的稳定性，而双突变体p1460q/n175s和n175s/n275k则不太稳定。这表明，当只有一个突变体与n175s结合时，对稳定性产生不利影响，这种影响在结合中得到缓解，表明p146q、n275k和n175s之间存在协同效应。与hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268k(seqidno:4)相比，hrpn13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d和hrpn13d/n57s/n175s/n255d/n268d/n275k的效果也相同。[0413]表27.以60℃下半衰期描述的几种hrp变体的热稳定性。灰色阴影数据来自实施例7用于比较。[0414][0415]结论[0416]结果发现，取代p146q本身导致hrp酶活性对所有受试底物强烈增加。例如，对于底物abts，相对于野生型酶(seqidno:2)增加了1.4倍，比活度比hrpn175s高2倍。[0417]发现取代物n175s能显著提高hrp的热稳定性。n175s自身观察到了这种效应，与突变的n-糖基化位点氨基酸n13d/n57s/n255d/n268d结合时，这种效应更为强烈，其中观察到了协同效应。单突变p146q或单突变n275k与n175s的组合导致稳定性略有下降；然而，当p146q和n275k与n175s结合时，还原作用减弱，表明p146q、n275k和n175s之间存在协同效应。[0418]n175s被发现可以降低几种底物的酶活性。然而，这种影响被n13d/n57s/p146q/n175s/n255d/n268d/n275k(seqidno:4)抵消。因此，这种突变体提供了高热稳定性和最佳动力学性能的组合。当前第1页12当前第1页12