一种布雷非德菌素A软膏的制备方法及应用与流程

一种布雷非德菌素a软膏的制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种布雷非德菌素a软膏的制备方法及应用。


背景技术：

2.银屑病是一类慢性、炎症性皮肤疾病，全球受累人数高达1.25亿。银屑病特征性病理表现为表皮角质形成细胞过度增殖及异常分化、真表皮炎症细胞浸润以及真皮血管扩张。
3.现代西医治疗银屑病主要根据银屑病发病机理，从抑制角质形成细胞增殖、免疫抑制、抗炎、抗感染和补充维生素等方面进行治疗。
4.目前常用的银屑病外用药物有糖皮质激素、维a酸、维生素d衍生物、地蒽酚、焦油制剂以及钙调磷酸酶抑制剂等。地蒽酚、焦油制剂和糖皮质激素因副作用较大使用受限，而维a酸、钙调磷酸酶抑制剂和维生素d衍生物的治疗效果不是十分理想。一些生物制剂虽然疗效快，但是价格昂贵，而中药类制剂由于成分复杂，往往疗效不明确且容易产生副作用。因此，有必要找到一种疗效好，使用安全的新药用于治疗银屑病。


技术实现要素：

5.针对上述背景技术所提出的问题，本发明的目的是：旨在提供一种布雷非德菌素a软膏的制备方法及应用。
6.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种布雷非德菌素a软膏的制备方法，包括以下步骤，
8.s1：称取50
±
0.1mg布雷非德菌素a溶解于600
±
1μl的聚乙二醇-2000中，备用；
9.s2：称取白凡士林1.2
±
0.01g、十八醇0.8
±
0.01g、单硬脂酸甘油酯0.2
±
0.01g和对羟基苯甲酸乙酯0.02
±
0.001g放置于烧杯a中，将水浴锅预先加热至80
±
1℃，然后将烧杯a放入水浴锅中，缓慢搅拌烧杯a中的原料，待烧杯a中的原料加热到75
±
1℃后，保持恒温；
10.s3：称取十二烷基硫酸钠0.1
±
0.01g、甘油0.7
±
0.01g和蒸馏水7
±
0.01g放置于烧杯b中，将水浴锅预先加热至80
±
1℃，然后将烧杯b放入水浴锅中，缓慢搅拌烧杯b中的原料，待烧杯a中的原料加热到75
±
1℃后，保持恒温；
11.s4：将所述s1中溶解了布雷非德菌素a的聚乙二醇-2000缓慢加入至所述s3中的烧杯b中，并在加入过程中缓慢搅拌，加入完毕后，然后将所述s2中的烧杯a中的原料缓慢加入烧杯b中，搅拌混合均匀；
12.s5：将所述s4中的烧杯b取出，放置于室温，继续搅拌混合液，直至常温凝固，得到布雷非德菌素a软膏。
13.作为本发明的一种优选方案，所述s2中，烧杯a保持恒温的时间不低于10min。
14.作为本发明的一种优选方案，所述s4中，待s3中的烧杯b保持恒温7min-10min后再加入所述s1中溶解了布雷非德菌素a的聚乙二醇-2000。
15.作为本发明的一种优选方案，所述s4中，将烧杯a中的原料完全加入烧杯b中后，继续搅拌10min-15min。
16.一种布雷非德菌素a软膏的应用，布雷非德菌素a软膏应用于银屑病治疗。
17.本发明的有益效果：
18.本发明首次将内质网应激诱导剂布雷非德菌素a(brefeldin a，bfa)应用于银屑病治疗，bfa通过活化内质网应激信号通路perk和xbp1s，进而抑制表皮角质形成细胞增殖、促进其分化，发挥治疗银屑病的作用。
19.采用本发明技术方案，
附图说明
20.本发明可以通过附图给出的非限定性实施例进一步说明；
21.图1为本发明实施例中代表性imq诱导小鼠银屑病样及外用bfa处理后动物外观示意图；
22.图2为本发明实施例中各组小鼠银屑病样严重程度评分(pasi)数据图；
23.图3为本发明实施例中各组小鼠代表性皮肤组织he染色结果示意图；
24.图4为本发明实施例中免疫组织化学方法检测各组imq诱导银屑病样小鼠皮肤组织grp78、involucrin(ivl)、keratin1(krt1)和ki67表达的代表性图；
25.图5为本发明实施例中各蛋白在不同处理组imq诱导银屑病小鼠皮肤组织表达水平统计图；
26.图6为本发明实施例中人表皮角质形成细胞系hacat及小鼠原代角质形成细胞增殖和分化能力结果数据图；
27.图7为本发明实施例中xbp1s以及perk在imq诱导银屑病样小鼠皮损和正常皮肤中表达的代表性图；
28.图8为本发明实施例中xbp1s以及perk的免疫组化评分统计分析数据图；
29.图9为本发明实施例中布雷非德菌素a分别处理人表皮角质形成细胞系hacat及小鼠原代角质形成细胞不同时间点，检测xbp1s和perk表达数据图。
具体实施方式
30.为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。
31.一种布雷非德菌素a软膏的制备方法，包括以下步骤，
32.s1：称取50.03mg布雷非德菌素a溶解于600μl的聚乙二醇-2000中，备用；
33.s2：称取白凡士林1.201g、十八醇0.801g、单硬脂酸甘油酯0.202g和对羟基苯甲酸乙酯0.021g放置于烧杯a中，将水浴锅预先加热至80
±
1℃，然后将烧杯a放入水浴锅中，缓慢搅拌烧杯a中的原料，待烧杯a中的原料加热到75℃后，保持恒温；
34.s3：称取十二烷基硫酸钠0.101g、甘油0.702g和蒸馏水7.003g放置于烧杯b中，将水浴锅预先加热至80
±
1℃，然后将烧杯b放入水浴锅中，缓慢搅拌烧杯b中的原料，待烧杯a中的原料加热到75℃后，保持恒温；
35.s4：将s1中溶解了布雷非德菌素a的聚乙二醇-2000缓慢加入至s3中的烧杯b中，并
在加入过程中缓慢搅拌，加入完毕后，然后将s2中的烧杯a中的原料缓慢加入烧杯b中，搅拌混合均匀；
36.s5：将s4中的烧杯b取出，放置于室温，继续搅拌混合液，直至常温凝固，得到布雷非德菌素a软膏。
37.咪喹莫特乳膏(imq)诱导银屑病小鼠模型的建立
38.取70只balb/c小鼠(由动物研究中心提供，雌性，spf级，日龄：42-70天)，小鼠饲养于通风、清洁的动物房中，控制室温(20
±
2)℃，相对湿度(40-70)％，12h光照和12h黑暗循环进行，进行适应性饲养，选用符合要求的50只动物，
39.分为3组，对照组(10只)、咪喹莫特(imq)诱导模型组(20只)、咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)诱导模型组(20只)。背部用脱毛霜脱毛，背部涂抹面积约为3cm
×
1.5cm。对照组小鼠背部无毛区每日涂抹凡士林，模型组小鼠背部无毛区涂相对应的产品，连续7天。
40.对7天后的小鼠进行试验，
41.如图1所示，通过咪喹莫特(imq)诱导的小鼠其皮肤有明显的褶皱，对照组的小鼠皮肤光滑，而通过咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)诱导的小鼠皮肤有一定的褶皱，其效果没有通过咪喹莫特(imq)诱导的小鼠明显，这说明布雷非德菌素a软膏对银屑病有一定的治疗作用；
42.如图2所示，对比小鼠银屑病样严重程度评分(pasi)，咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)诱导模型组与咪喹莫特(imq)诱导模型组比较，咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)诱导模型组小鼠银屑病样严重程度显著降低；
43.如图3所示，各组小鼠代表性皮肤组织he染色，咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)处理后，小鼠表皮厚度较咪喹莫特(imq)诱导模型组显著降低；
44.免疫组织化学方法检测各组小鼠皮肤组织grp78、involucrin(ivl)、keratin1(krt1)和ki67表达，其代表性图如图4所示，从图中可以看出，咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)诱导模型组与咪喹莫特(imq)诱导模型组对比，其皮损增殖能力降低，分化能力增强，表明银屑病样症状显著改善；
45.免疫组织化学方法检测各组小鼠皮肤组织grp78、involucrin(ivl)、keratin1(krt1)和ki67表达，其水平统计数据结果如图5所示；从图5的结果可以看出，在grp78蛋白和keratin1蛋白上，咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)诱导模型组数值较高，而在involucrin蛋白和ki67蛋白上的数值较低。
46.20nm布雷非德菌素a(bfa)处理人角质形成细胞系hacat不同时间后，检测involucrin(ivl)、keratin1(krt1)等细胞分化相关蛋白和内质网应激标志蛋白grp78表达，检测结果如图6中的a所示，其结果表明布雷非德菌素a(bfa)增强内质网应激标志蛋白grp78和细胞分化相关蛋白keratin1(krt1)表达，同时降低involucrin(ivl)水平，进而促进hacat分化，改善人角质形成细胞系hacat分化状态；20nm布雷非德菌素a(bfa)处理人角质形成细胞系hacat，检测增殖能力，其结果如图6中的b表示，其结果表明布雷非德菌素a(bfa)抑制hacat细胞增殖能力；20nm布雷非德菌素a(bfa)处理原代小鼠角质形成细胞不同时间后，检测分化相关蛋白和内质网应激标志蛋白grp78表达，其结果如图6中的c表示，其结果表明布雷非德菌素a(bfa)增强原代小鼠角质形成细胞的内质网应激标志蛋白grp78和
细胞分化相关蛋白keratin1(krt1)表达，同时降低involucrin(ivl)水平，进而促进原代小鼠角质形成细胞分化，改善原代小鼠角质形成细胞分化状态。
47.检测内质网应激反应关键信号通路蛋白xbp1s以及perk在imq诱导银屑病样小鼠皮损和正常对照皮肤的表达，其代表性图如图7所示；咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)处理小鼠后，通过提高xbp1s以及perk水平，激活内质网应激反应信号通路，改善小鼠银屑病样皮肤症状；
48.xbp1s以及perk的免疫组化评分统计分析，其结果如图8所示，从图8可以看出，咪喹莫特(imq) 布雷非德菌素a软膏(bfa)处理小鼠后，其结果明显优于咪喹莫特(imq)处理，并且与对照组的数值相差无几。
49.20nm布雷非德菌素a(bfa)处理人表皮角质形成细胞hacat和原代小鼠角质形成细胞不同时间点，检测内质网应激反应关键信号通路蛋白xbp1s和perk表达，其结果如图9所示，其结果表明布雷非德菌素a(bfa)通过提高xbp1s以及磷酸化perk(p-perk)水平，激活内质网应激反应信号通路，改善角质形成细胞分化状态。综上所述本发明将内质网应激诱导剂布雷非德菌素a(bfa)应用于银屑病治疗，bfa通过活化内质网应激信号通路xbp1s和perk，进而抑制表皮角质形成细胞增殖、促进其分化，发挥治疗银屑病的作用。
50.上述实施例仅示例性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。