对tau蛋白病中的β-抑制蛋白寡聚化的抑制

对tau蛋白病中的β-抑制蛋白寡聚化的抑制相关申请的交叉引用1.本技术要求于2020年2月7日提交的美国临时申请号62/971,510的权益，该申请在此通过引用整体并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明2.本发明是在由美国国立卫生研究院授予的资助号ag059721下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。背景3.作为早发性非血管性痴呆的病因，额颞叶变性(ftld)是一种侵袭性神经退行性疾病，其发病率仅次于阿尔茨海默病，其病理基础不明确(irwindj,etal.(2015)actaneuropathol129(4):469-491)。与ad一样，最常见的ftld(ftld-tau)形式在受影响区域的神经元包涵体中显示出过度磷酸化的tau的积累，包括皮层和颞叶以及一些皮层下神经元(cairnsnj,etal.(2007)actaneuropathol114(1):5-22)。与ad相反，其中淀粉样蛋白β(aβ)是缠结的组成部分，在ftld神经元中没有aβ的积累，而是在大多数形式中观察到tau的明显积累。有趣的是，即使在ad中，tau似乎对于aβ转导神经毒性信号也是必不可少的(vosselka,etal.(2010)science330(6001):198；jinm,etal.(2011)procnatlacadsciusa108(14):5819-5824)。事实上，tau蛋白病与ad中认知缺陷的相关性比aβ明显更好(nelsonpt,etal.(2010)brainpathol20(1):66-79；tiraboschip,etal.(2004)neurology62(11):1984-1989；matthewsfe,etal.(2009)plosmed6(11):e1000180)。tau在ad中的致病作用，以及一些关于g蛋白偶联受体(gpcr)在ad病理学和治疗中的观察结果表明，需要更好地了解gpcr和相关蛋白如何整合到ftld的tau蛋白病中，其中迄今为止缺乏独特的治疗策略。发明概述4.如本文所公开，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2水平在ftld-tau患者的脑中高度升高，这表明β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2两者在患有ad和fltd患者的脑中均升高。目前的工作还表明，当β-抑制蛋白2过度表达时，tau水平会升高。数据表明β-抑制蛋白2通过削弱p62介导的自噬来降低tau清除，这是由β-抑制蛋白2的寡聚形式发挥的作用。5.β-抑制蛋白2可以作为寡聚体存在于多种细胞类型中(milanosk,etal.(2006)jbiolchem281(14):9812-9823；storezh,etal.(2005)jbiolchem280(48)：40210-40215)。六磷酸肌醇(ip6)通过将相邻分子桥接成头对尾构型来增强β-抑制蛋白2的这种自缔合。发现β-抑制蛋白2的n末端和c末端内带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基对ip6结合和寡聚化都至关重要。鉴于ip6和gpcr结合位点的物理重叠，β-抑制蛋白2与激活的gpcr和与ip6的结合是相互排斥的，这表明在寡聚形式中，β-抑制蛋白2可以用于除gpcr结合之外的其他目的。6.因此，本文公开了β-抑制蛋白寡聚化抑制剂，其可用于防止β-抑制蛋白寡聚化并因此防止tau在细胞中的积累，即tau蛋白病。还公开了治疗受试者中的tau蛋白病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的β-抑制蛋白寡聚化抑制剂。7.β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2形成同源和异源寡聚体，而肌醇六磷酸(ip6)促进这些寡聚体。因此，在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是阻断ip6结合从而减少β-抑制蛋白2的寡聚化的分子，例如肽。在一些实施方案中，寡聚化抑制剂是β-抑制蛋白突变体，其作为β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2的同源-异源寡聚化的显性失活。8.所提供的数据还表明，用于β-抑制蛋白寡聚化的药理学抑制剂可以代表一种有希望的治疗策略，可以减轻ad和tau蛋白病。因此，使用ftmap分析进行分子对接筛选以筛选阻断β-抑制蛋白2和β-抑制蛋白2之间界面的数百万种化合物。使用基于细胞的测定法测试了大约30种预测的抑制性化合物，产生了一些减少致病性tau的小分子化合物及其类似物。9.关于突变体，它们的大小与全长β-抑制蛋白2相同。ip6结合位点位于c末端和n末端。(只是点突变)。阻断ip6与c末端或n末端的结合可以消除其寡聚化。因此，最初的想法是筛选阻断ip6结合位点的化合物，但发现有几种化合物可以结合β-抑制蛋白2和β-抑制蛋白2之间的界面。通过co-ip、fret和pla测定法，证实这些化合物可阻断寡聚化。10.本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从描述和附图以及从权利要求中显而易见。附图说明11.图1a至1i显示在ftld-tau患者和taup301s转基因小鼠的脑中β-抑制蛋白2(β-arrestin2)增加。图1a包含来自12名年龄匹配的未受影响对照和10名ftld-tau患者的额叶皮层的β-抑制蛋白2的代表性免疫印迹。泳道上方的数字是与受试者相对应的样品编号，一些样品在第二块凝胶上重复。图1b和1c显示了与未受影响的对照相比，ftld-tau患者的额叶皮层中β-抑制蛋白2蛋白和mrna水平的定量(n＝12名健康对照，n＝10ftld-tau，**p《0.005；*p《0.05)。图1d显示了ftld-tau患者(n＝10ftld-tau)中不溶性tau和β-抑制蛋白2表达的相关性。每个数据点代表来自给定受试者的重复测定的平均结果。印迹显示在si附录中，图1e包含来自7个月大的wt和taup301s转基因同窝仔的小鼠皮层中β-抑制蛋白2的代表性免疫印迹。图1f和1g显示了wt和taup301s转基因同窝仔的皮质中β-抑制蛋白2蛋白和mrna水平的定量(n＝5wt，n＝4taup301s，**p《0.005，*p《0.05)。图1h显示了使用源自wt和taup301s同窝仔的div21海马原代神经元对β-抑制蛋白2(β-arrestin2)(洋红色)和总tau(绿色)进行的代表性染色(条＝10μm)。图1i显示了β-抑制蛋白2(β-arr2)免疫反应性的定量(n＝3个独立实验，*p《0.05)。箱线图显示所有数据点、中值和iqr，以及最小值和最大值。12.图2a至2m显示β-抑制蛋白2的过表达和敲低调节tau水平。图2a包含用gfp或gfp-β-抑制蛋白2瞬时转染的hela-v5-tau细胞中所示蛋白质的代表性免疫印迹。图2b至2d显示了来自6个实验的tau、phf1和at8水平的定量(*p《0.05，**p《0.005vsgfp)。图2e显示了用对照sirna或β-抑制蛋白2sirna瞬时转染的hela-v5-tau细胞中所示蛋白质的代表性免疫印迹。图2f显示了来自4个实验的tau水平的定量(#p《0.0001)。图2g显示了来自用对照(cont-ad)或β-抑制蛋白2腺病毒(β-arrestin2-ad)转导的taup301s-转基因小鼠的海马原代神经元中tau和at8的代表性染色(条＝10μm)。图h和2i显示了来自3个独立实验的at8和总tau免疫反应性的定量，#p《0.0001，***p《0.0005)。图1j显示了来自用gfp-lentishrna或gfp-lentiβ-抑制蛋白2shrna转导的taup301s-转基因小鼠的海马原代神经元中tau的代表性染色。图2k显示了总tau免疫反应性的定量(n＝4个独立实验，#p《0.0001)。图2l显示来自用gfp或gfp-β-抑制蛋白2转染并用放线菌酮(cycloheximide)(100μg/ml)处理指定时间的hela-v5-tau细胞的指定蛋白质的代表性免疫印迹。图2m显示了用放线菌酮处理的tau水平的定量(n＝4；**p《0.005，#p《0.0005，*p《0.05，重复测量anova，然后是bonferroni事后检验)。箱线图显示所有数据点、中值和iqr，以及最小值和最大值。13.图3a至3i显示β-抑制蛋白2的遗传减少减轻了神经元tau蛋白病。图3a显示了来自7个月大的taup301s、taup301s/arrb2 /-和taup301s/arrb2-/-同窝仔的脑的月桂酰肌氨酸(sarkosyl)-可溶性和月桂酰肌氨酸不溶性tau的代表性免疫印迹。图3b和3c显示了如a)中所示进行的4次实验的定量，**p《0.005，#p《0.0001。图3d显示了7个月大的taup301s、taup301s/arrb2 /-和taup301s/arrb2-/-小鼠的海马和皮层中磷酸-tau、ps199/202的代表性染色(条＝20μm)。图3e和3f显示皮层和海马中ps199/202免疫反应性的定量(n＝4/基因型，#p《0.0001)。图3g显示了通过将wt、taup301s、taup301s/arrb2 /-和taup301s/arrb2-/-急性切片中的刺激幅度从1步升到15mv而生成的输入/输出(i/o)分析。(n＝35-46切片/基因型来自4小鼠/基因型)。图3h显示了ppf，显示fepsp斜率作为30-300ms刺激间隔的函数(n＝38-49切片/基因型来自4小鼠/基因型)。图3i显示了由θ爆发刺激诱导的ltp，显示taup301s与wt、taup301s/arrb2 /-和taup301s/arrb2-/-切片比较之间fepsp斜率的显著差异(n＝25-43切片/基因型来自4只小鼠/基因型,#p《0.0001)。显示的数据是箱线图或平均值±sem。14.图4a至4e显示β-抑制蛋白2寡聚化是抑制tau周转(tauturnover)所必需的。图4a显示在div5，来自用gfp、β-抑制蛋白2δip6c-gfp或β-抑制蛋白2δip6n-gfp转导的taup301s的div18皮质原代神经元的代表性免疫印迹。图4b显示了tau水平的定量(n＝4，#p《0.0001，***p《0.0005)。图4c和4d包含在用对照载体、β-抑制蛋白2δip6c、β-抑制蛋白2δip6n转染的用放线菌酮(100μg/ml)处理指定时间hela-v5-tau细胞中指定蛋白质的代表性免疫印迹。图4e显示了用放线菌酮处理的tau水平的定量(n＝4；**p《0.005，***p《0.0005，#p《0.0001，重复测量anova，然后是bonferronipost-hoc)。数据显示为箱线图或平均值ꢀ±ꢀsem。15.图5a至5n显示β-抑制蛋白2寡聚抑制p62介导的tau降解。图5a包含来自用对照载体(controlvector)或β-抑制蛋白2-myc瞬时转染的有/没有100nm巴弗洛霉素(bafilomycin)a1的hela-v5-tau细胞的lc3阳性自噬体的代表性图像(条＝10μm)。图5b显示lc3斑点的定量(n＝4个独立实验，*p《0.05)。图5c包含来自用对照载体或β-抑制蛋白2-myc瞬时转染的有/没有100nm巴弗洛霉素a1的hela-v5-tau细胞的gfp-p62阳性自噬体的代表性图像(条＝10μm)。图5d显示了gfp-p62斑点的定量(n＝4个独立实验，#p《0.0001，***p《0.0005)。图5e包含在div5，用mcherry-gfp-p62aav9与对照、β-抑制蛋白2、β-抑制蛋白2δip6c或β-抑制蛋白2δip6n慢病毒转导的div21taup301s海马原代神经元的代表性图像。图5f显示了仅mcherry颗粒的定量(n＝3个独立实验，**p《0.005，#p《0.0001)。图5g包含用对照载体或β-抑制蛋白2-myc与gfp-p62和/或ha-p62瞬时转染并进行裂解，然后进行co-ip的hela-v5-tau细胞的代表性免疫印迹。图5h显示了通过co-ip对gfp-p62和ha-p62相互作用的定量(n＝5个独立实验，#p《0.0001)。图5i包含用对照载体、β-抑制蛋白2、β-抑制蛋白2δip6c或β-抑制蛋白2δip6n转染的hela-v5-tau细胞的邻近连接测定法(pla)的代表性图像(条＝10μm)。图5j显示pla斑点的定量(n＝4个独立实验，#p《0.0001，**p《0.005)。图5k显示在afm成像之前，将0.4μg的p62与/不与0.2μg的β-抑制蛋白2在rt下孵育2hr。图5l显示p62粒度的定量(n＝3个独立实验，*p《0.05)。图5m显示了用对照载体、β-抑制蛋白2-flag、β-抑制蛋白2δip6c-flag或β-抑制蛋白2δip6n-flag与gfp-p62转染的有/没有100nm巴弗洛霉素a处理的hela-v5-tau细胞中flag的代表性染色(条(bar)＝10μm)。图5n显示了gfp-p62斑点的定量(n＝4个独立实验，#p《0.0001)。数据显示为箱线图或平均值ꢀ±ꢀsem。16.图6a至6e显示寡聚化缺陷型β-抑制蛋白2在体内减轻了tau蛋白病。图6a显示了来自7个月大的taup301s小鼠的脑的月桂酰肌氨酸可溶性和月桂酰肌氨酸不溶性tau的代表性免疫印迹，该小鼠在5月龄时将编码gfp、gfp-β-抑制蛋白2δip6c或gfp-β-抑制蛋白2δip6c的raav9立体定向注射到海马中。图6b和6c显示了来自如图6a所示立体定向注射的taup301s小鼠的月桂酰肌氨酸可溶性和不溶性tau的定量，n＝4/基因型，**p《0.005，***p《0.0005)。图6d显示了如图6a所示立体定向注射的7个月大的taup301s的海马总tau(洋红色)的代表性染色(条＝20μm)。图6a显示了总tau免疫反应性的定量(n＝4/基因型，#p《0.0001)。数据显示为箱线图。17.图7是β-抑制蛋白2如何促进ftld中的tau蛋白病的图解模型。在健康的脑中，单体β-抑制蛋白2调节gpcr运输，并且没有过量的寡聚β-抑制蛋白2，因此错误折叠的tau被有效地泛素化并被靶向以自噬清除。然而，在ftld-tau脑中，β-抑制蛋白2寡聚体增加，抑制p62介导的自噬，导致错误折叠/聚集的tau无法有效清除。在ad中，增加的β-抑制蛋白2也导致aβ淀粉样蛋白的增加(未图示)18.图8显示了与ftld-tau脑中的tau水平相关的β-抑制蛋白2水平。来自10名ftld-tau患者的额叶皮层的指定蛋白质的ripa不溶性免疫印迹。19.图9a至9f显示β-抑制蛋白2增加tau水平而不改变mrna。图9a包含来自在div5上，用对照腺病毒(对照-ad)或β-抑制蛋白2腺病毒(β-arr2-ad)转导的div18taup301s皮质初级神经元的指定蛋白质的代表性免疫印迹。图9b显示了总tau水平的定量(n＝4，**p《0.005)。图9c包含来自在div5上，来自用对照shrna-慢病毒或β-抑制蛋白2shrna-慢病毒转导的div18taup301s皮质初级神经元的指定蛋白质的代表性免疫印迹。图9d显示了总tau水平的定量(n＝4，**p《0.005)。图9e显示了用对照载体或β-抑制蛋白2转染的hela-v5-tau细胞并针对taumrna进行qrt-pcr并归一化至对照(n＝6每个)。图9f显示了用对照sirna或β-抑制蛋白2sirna转染的hela-v5-tau细胞并针对taumrna进行qrt-pcr并归一化至对照(n＝6每个)。20.图10a至10f显示β-抑制蛋白2的遗传减少降低了月桂酰肌氨酸不溶性tau并减轻了taup301s原代神经元中的突触功能障碍。图10a包含来自源自taup301s和taup301s；arrb2-/-的div18皮质神经元的月桂酰肌氨酸可溶性和不溶性tau的代表性免疫印迹。图9a和9b显示来自源自taup301s和taup301s；arrb2-/-的div18皮质初级神经元的月桂酰肌氨酸可溶性tau(图9b)月桂酰肌氨酸不溶性tau(图9c)的定量(n＝3；***p《0.005)。图9d包含来源于在div5上，用gfp-lentishrna或gfp-lentiβ-抑制蛋白2shrna转导的wt和taup301s同窝仔的div21海马原代神经元中突触素(synaptophysin)和脑发育调节蛋白(drebrin)的代表性共焦图像(比例尺＝10μm)。图9e和9b显示了突触素(图9e)和脑发育调节蛋白(图9f)免疫反应性的定量(n＝3个独立实验，#p《0.005)。21.图11a至11e显示β-抑制蛋白2寡聚化突变体减少tau聚集体。图11a包含用yfp、yfp-β-抑制蛋白2δip6c或yfp-β-抑制蛋白2δip6n转染的hela-v5-tau细胞中总tau的代表性共焦图像(比例尺＝10μm)。图11b包含用β-抑制蛋白2-flag和β-抑制蛋白2-myc与yfp对照、yfp-β-抑制蛋白2δip6c或yfp-β-抑制蛋白2δip6n转染的hela-v5-tau细胞中邻近连接测定法(pla)的代表性共焦图像。图11c显示了β-抑制蛋白2-flag/β-抑制蛋白2-mycpla斑点/细胞的定量(n＝3个独立实验，**p《0.005，***p《0.0005)。图11d包含对来自用对照载体、β-抑制蛋白2δip6c-flag或β-抑制蛋白2δip6n-flag转染的hela-v5-tau细胞的tau的过滤器陷阱测定法的代表性免疫印迹。图11e显示不溶性tau聚集体的定量(n＝8/条件，#p《0.0001)。22.图12a至12e显示β-抑制蛋白2与p62相互作用，并且β-抑制蛋白2寡聚化抑制p62自身相互作用。图12a包含在用mcherry-gfp-p62连同对照载体、β-抑制蛋白2-flag或β-抑制蛋白2δip6n-flag转染的hela-v5-tau细胞中mcherry和egfp的代表性共焦图像(比例尺＝10μm)。图12b显示了仅mcherry颗粒与归一化至对照的总颗粒的定量(n＝3个独立实验，#p《0.0001)。箱线须线图显示所有数据点，箱线图显示所有数据点、中位数和iqr，以及最小值和最大值。图12c包含来自用gfp或gfp-β-抑制蛋白2有/没有ha-p62转染的hela-v5-tau细胞的指定蛋白质的代表性免疫印迹。请注意，β-抑制蛋白2仅在ha-p62存在的情况下存在于ha免疫复合物中，而在对照igg珠中未检测到β-抑制蛋白2。图12d包含来自用对照、β-抑制蛋白2-flag、β-抑制蛋白2δip6c-flag或β-抑制蛋白2δip6n-flag连同ha-p62和/或gfp-p62转染的hela-v5-tau细胞的指定蛋白质的代表性免疫印迹。对裂解物进行用于ha的ip处理。图12e包含用β-抑制蛋白2-flag、β-抑制蛋白2δip6c-flag或β-抑制蛋白2δip6n-flag转染的hela-v5-tau细胞的邻近连接测定法(pla)的代表性共焦图像(比例尺＝20μm)。图12f显示flag/p62pla斑点/细胞的定量(n＝4个独立实验，#p《0.0001)。23.图13a至13f显示mglur2和β2ar介导的致病性tau增加需要β-抑制蛋白1。图13a显示了用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染的hela-v5-tau细胞。转染后，用媒介物或10μm异丙肾上腺素(iso)处理细胞，裂解并针对指定的蛋白质进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图13b显示了磷酸-tau水平的定量。n＝3个独立实验。*p《0.05。具有dunnett检验的1路anova。图13c显示了用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染并用媒介物、1μm或10μmly-379,268处理的hela-v5-tau细胞，裂解和针对指定的蛋白质进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图13d显示了磷酸-tau水平的定量。n＝4个独立实验。*p《0.05，**0《0.005。具有dunnett检验的1路anova。图13e显示用对照sirna或β-抑制蛋白2sirna转染并用媒介物、10μmiso或10μmly-379,268处理的hela-v5-tau细胞，裂解和针对指定的蛋白质进行免疫印迹。图13f显示了磷酸-tau水平的定量。n＝4个独立实验。*p《0.05，**p《0.005。具有dunnett检验的1路anova。24.图14a至14g显示ftld-tau患者脑中增加的β-抑制蛋白1。图14a显示来自健康对照和ftld-tau患者的额叶皮层的ripa可溶性提取物针对β-抑制蛋白1和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图14b显示了ripa可溶性β-抑制蛋白1水平的定量。健康对照(n＝12)，ftld-tau患者(n＝10)。***p《0.0005。非配对t检验。图14c显示来自健康对照和ftld-tau患者的额叶皮层的ripa不溶性提取物针对β-抑制蛋白1和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图14d显示了ripa不溶性β-抑制蛋白1水平的定量。健康对照(n＝12)，ftld-tau患者(n＝10)。***p《0.0005。非配对t检验。图14e显示对来自ftld-tau患者的额叶皮层的ripa不溶性提取物针对β-抑制蛋白1、tau和肌动蛋白进行免疫印迹。图14f显示了ftld-tau患者中ripa不溶性tau和β-抑制蛋白1之间的相关性(n＝10ftld-tau；r2＝0.4874，p＝0.0248，线性回归)。图14g显示了ftld-tau脑的代表性z-堆叠图像，显示β-抑制蛋白1和at8 (ps202/pt205)tau病理学是共定位的(比例尺＝20μm)。下面放大了白框。25.图15a至15g显示β-抑制蛋白1增加tau水平。图15a显示用gfp或β-抑制蛋白1-shrna-gfp慢病毒转导源自p0taup301s小鼠的div5海马原代神经元，并在div21上对tau进行免疫染色。显示了代表性图像(比例尺＝10μm)。图15b显示了tau强度的定量。n＝4个独立实验。#p《0.0001。非配对t检验。图15c显示用对照或β-抑制蛋白1shrna慢病毒转导源自p0taup301s幼崽的div5皮质原代神经元。在div18裂解皮质神经元，并对β-抑制蛋白1、tau和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图15d显示了总tau水平的定量。n＝4个独立实验。**p《0.005。非配对t检验。图15e显示了用对照载体或β-抑制蛋白1转染的hela-v5-tau细胞，裂解并针对β-抑制蛋白1、tau、磷酸-tau和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图15f和15g显示了总tau(图15f)和磷酸-tau(图15g)水平的定量。n＝6个独立实验。*p《0.05，#p《0.0001。非配对t检验。26.图16a至16j显示β-抑制蛋白1的遗传减少减轻了体内的tau蛋白病。图16a包含7个月大的taup301s和taup301s；arrb1 /-同窝仔马对ps199/ps202tau染色的共焦图像(比例尺＝10μm)。下面放大了白框。显示了代表性图像。图16b显示ps199/ps202tau强度的定量。n＝4/基因型。#p《0.0001。非配对t检验。图16c显示来自7个月大的taup301s和taup301s；arrb1 /-脑的月桂酰肌氨酸可溶性和不溶性提取物针对β-抑制蛋白1、tau和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图16d和16e显示了月桂酰肌氨酸可溶性和不溶性tau水平的定量。n＝5/基因型。**p《0.005。非配对t检验。图16f显示来自4个月大的wt、taup301s和taup301s；arrb1 /-急性切片的输入-输出分析。(wt：33个切片，5只小鼠；taup301s：32个切片，5只小鼠；taup301s；arrb1 /-：30个切片，4只小鼠)。未观察到显著差异。图16g显示来自4个月大的wt、taup301s和taup301s；arrb1 /-急性切片的配对脉冲促进(ppf)分析；。(wt：33个切片，5只小鼠；taup301s：40个切片，5只小鼠；taup301s；arrb1 /-：35个切片，4只小鼠)。具有dunnett事后检验的2路anova。#p《0.0001：20-180ms，wt对比taup301s。***p《0.0005：20ms，taup301s对比taup301s；arrb1 /-。**p《0.005：200-260ms，wt对比taup301s。*p《0.05：280-300ms，wt对比taup301s；40、100和120ms，taup301s对比taup301s；arrb1 /-。图16h显示了由θ爆发刺激诱导的长期增强(ltp)。(wt：31个切片，5只小鼠；taup301s：29个切片，5只小鼠；taup301s；arrb1 /-：31个切片，4只小鼠)。具有dunnett事后检验的2路anova。*p《0.0001在所有时间点，wt对比taup301s和taup301sarrb1 /-对比taup301s。所有数据均表示为平均值±sem。图16i显示源自wt和taup301sp0幼崽的海马原代神经元在div5上用gfp或β-抑制蛋白1-shrna-gfp慢病毒转导。神经元在div21上用突触素染色(比例尺＝10μm)。显示了代表性图像。图16j显示了突触素强度的定量。n＝4个独立实验，#p《0.0001。具有dunnett检验的1路anova。27.图17a至17f显示β-抑制蛋白1抑制tau诱导的微管蛋白聚合并破坏微管稳定性。图17a显示了使用1μg重组tau与2μgbsa或2μg重组β-抑制蛋白1一起孵育的微管结合沉降测定法。在tau存在下，用或不用0.4nm预聚合微管孵育指示量的β-抑制蛋白1或bsa，并通过共沉淀和随后的tau免疫印迹监测微管结合的tau。显示了代表性的印迹。图17b显示了微管结合的tau的定量。n＝5个独立实验。*p《0.005。非配对t检验。图17c显示了使用指示量的重组β-抑制蛋白1、1μg的tau和0.4nm预聚合微管的微管结合沉降测定法。通过共沉淀和随后的免疫印迹监测微管结合沉淀和未结合上清液中的tau和β-抑制蛋白1。图17d显示了在2μg指定的重组蛋白存在下通过在340nm处的浊度测量的微管蛋白聚合。n＝4个独立实验。#p《0.0001。2路重复测量anova。图17e显示了用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染并用20μm诺考达唑处理30min并再恢复1小时的hela-v5-tau细胞的共聚焦图像。固定细胞并对微管蛋白和β-抑制蛋白1进行免疫染色(比例尺＝10μm)。右侧放大的白框。图17f显示了转染细胞的定量，其中微管蛋白强度归一化至对照sirna转染细胞。n＝4个独立实验。#p《0.0001。非配对t检验。28.图18a至18n显示β-抑制蛋白1抑制自噬介导的tau清除。图18a显示在用对照载体或β-抑制蛋白1转染的hela-v5-tau细胞中通过qrt-pcr定量β-抑制蛋白1mrna水平。n＝6个独立实验。图18b显示在用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染的hela-v5-tau细胞中通过qrt-pcr定量β-抑制蛋白1mrna水平。n＝6个独立实验。图18c显示了用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染并用放线菌酮(100μg/ml)处理2小时和4小时的hela-v5-tau细胞。细胞针对β-抑制蛋白1、tau和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图18d显示了在放线菌酮处理后剩余的tau的定量。n＝3个独立实验。*p《0.05。2路重复测量anova。图18e包含用gfp-p62和对照载体或β-抑制蛋白1-myc进行转染并用媒介物或20μm诺考达唑处理30分钟的hela-v5-tau细胞的共聚焦图像。固定细胞并针对myc和lc3进行免疫染色(比例尺＝10μm)。显示了代表性图像。图18f显示了gfp-p62和lc3共定位的定量。n＝4个独立实验。#p《0.0001。具有dunnett事后检验的1路anova。图18g包含用gfp-p62和载体对照(vectorcontrol)或β-抑制蛋白1-myc转染并用媒介物或100nm巴弗洛霉素a1处理4小时的hela-v5-tau细胞的共聚焦图像。固定细胞并针对myc和lc3进行免疫染色(比例尺＝10μm)。显示了代表性图像。图18h显示了gfp-p62斑点区域的定量。n＝4个独立实验。***p《0.0005，**p《0.005，#p《0.0001。具有dunnett事后检验的1路anova。图18i显示了gfp-p62和lc3共定位的定量。n＝4个独立实验。***p《0.0005，**p《0.005，#p《0.0001。具有dunnett事后检验的1路anova。图18j包含用mcherry-gfp-p62和对照sirna或β-抑制蛋白1sirna进行转染并用媒介物或100nm的巴弗洛霉素a1处理4小时的hela-v5-tau细胞的共聚焦图像。固定细胞并针对β-抑制蛋白1进行免疫染色(比例尺＝10μm)。mcherry被伪着色为洋红色。显示了代表性图像。图18k显示了归一化至对照媒介物处理的总p62斑点(mcherry gfp)的定量。n＝4个独立的实验。#p《0.0001，**p《0.005。具有dunnett检验的1路anova。图18l显示了归一化至对照媒介物处理的仅mcherry(mcherry-仅)(品红色)斑点的定量。n＝4个独立的实验。#p《0.0001。具有dunnett检验的1路anova。图18m显示了用对照载体或β-抑制蛋白1-myc连同gfp-p62和/或ha-p62一起瞬时转染的hela-v5-tau细胞，并针对ha进行免疫共沉淀和针对gfp、ha、myc和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图18n显示了gfp-p62和ha-p62相互作用n＝3个独立实验的定量。**p《0.005。非配对t检验。29.图19是β-抑制蛋白1促进tau蛋白病的图解模型。在ftld-tau和ad脑中，β-抑制蛋白1被上调。增加的β-抑制蛋白1可以与ꢀ‑分泌酶相互作用，以促进aβ的生成。(1)增加的β-抑制蛋白1也与微管结合，并促进tau从微管中解离，从而破坏微管的稳定性并导致tau错配。(2)β-抑制蛋白1还与p62物理相互作用并抑制p62小体形成，从而削弱p62流通和致病性tau的清除。tau置换、微管不稳定性和tau积累的组合作用促进了tau蛋白病。30.图20a至20e显示β-抑制蛋白是mglur2和β2ar介导的tau积累和磷酸化所必需的。图20a显示源自ps19p0幼崽的div18皮层初级神经元，用媒介物或10μm异丙肾上腺素(iso)处理24小时，裂解和针对tau、ps396/ps404-tau(phf1)和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图20b显示了phf1水平的定量。n＝4个独立实验。*p《0.05。非配对t检验。所有数据均表示为平均值±sem。图21c显示源自用媒介物、1μm或10μmly-379,268处理的源自ps19p0幼崽的div18皮质初级神经元，裂解和针对tau、phf1和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图20d显示了phf1水平的定量。n＝4个独立实验。***p《0.0005。非配对t检验。所有数据均表示为平均值±sem。图20e显示用媒介物、10μmiso或10μmly-379,268处理来自arrb2-/-p0幼崽的div11皮层初级神经元24小时，裂解和针对tau、phf1和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。31.图21a和21b显示在ftld-tau患者中与磷酸-tauat8共定位的β-抑制蛋白1。图21a包含用β-抑制蛋白1和at8染色的健康对照脑的共焦图像(比例尺＝20μm)。图21b显示仅二抗染色显示在ftld-tau脑中没有免疫反应性。32.图22a和22b显示降低的β-抑制蛋白1降低了tau水平。图22a显示用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染的hela-v5-tau细胞，裂解和针对β-抑制蛋白1、tau和肌动蛋白进行免疫印迹。显示了代表性的印迹。图22b显示了tau的定量。n＝4个独立实验。#p《0.0001。非配对t检验。所有数据均表示为平均值±sem。33.图23a至23c显示增加的β-抑制蛋白1损害lc3介导的自噬。图23a显示了用对照载体或β-抑制蛋白1-myc转染并用媒介物或100nm巴弗洛霉素a1处理4小时的hela-v5-tau细胞。固定细胞并针对myc和lc3进行免疫染色(比例尺＝10μm)。显示了代表性图像。图23b显示了归一化至载体对照媒介物条件的lc3斑点区域的定量。n＝4个独立实验。#p《0.0001。具有dunnett事后检验的1路anova。所有数据均表示为平均值±sem。图23c显示了用gfp或gfp-β-抑制蛋白1和/或ha-p62转染的hela-v5-tau细胞，针对ha进行co-ip，并针对gfp、ha和肌动蛋白进行免疫印迹。34.图24a至24d显示β-抑制蛋白2寡聚化突变体损害β-抑制蛋白1同源寡聚体和β-抑制蛋白1/β-抑制蛋白2异源寡聚体。hela-v5-tau细胞与载体对照(vec)或β-抑制蛋白2寡聚化突变体(δip6c或δip6n)连同β抑制蛋白1-gfp β抑制蛋白1-myc或β抑制蛋白2-myc进行共转染。然后使用针对gfp和myc的抗体对细胞进行邻近连接测定法(pla)，以检测β抑制蛋白1同源寡聚体(图24a，24b)和β抑制蛋白1/β抑制蛋白2异源寡聚体和dapi染色(图24c，24d)(斑点)。结果显示β-抑制蛋白2寡聚化突变体(δip6c或δip6n)显著降低β抑制蛋白1同源寡聚体(图24a、24b)以及β抑制蛋白1/β抑制蛋白2异源寡聚体(n＝4，1路anova，事后dunnett's，#p《0.0001)。仅接受1个探针或排除一抗的细胞显示没有红色pla斑点(阴性对照)。35.图25显示了用于筛选阻断β-抑制寡聚化和减少病理性tau的化合物的工作流程。基于β-抑制蛋白2的晶体结构，我们对可以对接在β-抑制蛋白2三聚体结合界面上的数百万种化合物进行了电脑模拟计算筛选。然后对前30种化合物测试它们降低病理性tau的能力。然后对那些减少tau的化合物测试它们阻断β-抑制蛋白2寡聚化的能力。36.图26显示c1和c2化合物降低tau水平hela-v5-tau细胞用10μm潜在的β-抑制蛋白2寡聚化抑制剂处理6小时并进行蛋白质印迹。c1和c2显著降低hela-v5-tau细胞中的总tau水平。(n＝4，1路anova，事后dunnett's，**p《0.005，***p《0.0005)。37.图27a和27b显示c1和c2化合物减少致病性tau。图27a显示了用20μm的o1、c1或c2化合物处理6小时的hela-v5-tau细胞，并进行了月桂酰肌氨酸可溶性和不溶性分级。c1和c2显著降低了hela-v5-tau细胞中月桂酰肌氨酸不溶性tau水平。(n＝4，1路anova，事后dunnett's，**p《0.005，***p《0.0005)。图27b显示源自用20μm的o1、c1或c2化合物处理6小时并针对ht7(总人tau)染色的tau-p301s小鼠的div21海马原代神经元。c1和c2显著降低ht7免疫反应性(n＝3，1路anova，事后dunnett's，*p《0.05，***p《0.0005。38.图28a和28b显示化合物c2和c2抑制β-抑制蛋白2寡聚化。用gfp-β抑制蛋白2和flag-β抑制蛋白2转染hela-v5-tau细胞，并用20μm的o1、c1或c2处理6小时。图28a显示使用针对gfp和flag(m2)的抗体检测gfp-β抑制蛋白2/flag-β抑制蛋白2复合物的邻近连接测定法(pla)显示β抑制蛋白2寡聚化显著降低(n＝3，1路anova，事后dunnett's，*p《0.05，***p《0.0005)。仅包含1个pla探针作为阴性对照显示没有pla红色斑点。图28b显示对进行裂解和针对gfp-β抑制蛋白2/flag-β抑制蛋白2复合物进行免疫共沉淀(co-ip)的细胞，证明c1和c2化合物将β抑制蛋白2自身相互作用降低到与单独的抗小鼠igg珠相似的背景水平。39.图29显示化合物c2抑制β抑制蛋白2寡聚化。用cfp-β抑制蛋白2和yfp-β抑制蛋白2转染hela-v5-tau细胞，并用媒介物或20μmc2处理30分钟。通过fret测定法检测β-抑制蛋白2寡聚化，表明c2化合物而非媒介物可将cfp降低为yfpfret信号。详细说明40.在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。41.在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值至下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限与任何其他规定或所述范围内的中间值包含在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且也包含在本公开内，但受所述范围内的任何具体排除限制的限制。在所述范围包括限制之一或两者的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。42.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。43.本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指示通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开而早于此类出版物。此外，提供的发布日期可能与可能需要独立确认的实际发布日期不同。44.如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，本文描述和示例显示的单个实施方案中的每一个都具有离散的组件和特征，它们可以容易地与其他几个实施方案中的任何一个的特征分离或组合而不背离本公开的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来执行。45.除非另有说明，否则本公开的实施方案将采用本领域技术范围内的化学、生物学等技术。46.提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何执行本文公开和要求保护的方法和使用探针的完整公开和描述。已努力确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些错误和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以℃为单位，压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。47.在详细描述本公开的实施方案之前，应当理解，除非另有说明，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造工艺等，因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。在本公开中，步骤也可以在逻辑上可行的情况下以不同的顺序执行。定义48.必须注意，如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。49.如本文所用，术语“残基”是指掺入多肽中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，否则可以包括可以以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物。50.术语“变体”是指具有保守氨基酸取代，非保守氨基酸取代(即简并变体)，编码氨基酸的每个密码子(即dna和rna)的摆动位置内的取代，添加到肽c末端的氨基酸，或与参考序列具有60％、70％、80％、90％或95％同源性的肽的氨基酸或肽序列。51.关于氨基酸的“带正电荷”是指在生理ph下带正电荷的那些氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸模拟物和化学部分。带正电荷的氨基酸包括例如赖氨酸和精氨酸。52.术语“保守氨基酸取代”是指蛋白质中具有相似侧链的氨基酸残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸由丝氨酸和苏氨酸组成；一组具有含酰胺侧链的氨基酸由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；一组具有芳香侧链的氨基酸由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成；一组具有碱性侧链的氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成；一组具有酸性侧链的氨基酸由谷氨酸和天冬氨酸组成；以及一组具有含硫侧链的氨基酸由半胱氨酸和蛋氨酸组成。示例性的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。53.术语“百分比(％)序列同一性”或“同源性”定义为在比对序列并在必要时引入空位，以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。用于确定序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用诸如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastar)软件的公开可用的计算机软件。可通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。54.如本文所用，“肽模拟物”是指肽的模拟物，其包括正常肽化学的一些改变。肽模拟物通常增强原始肽的一些特性，例如增加稳定性、增加功效、增强递送、增加半衰期等。基于已知多肽序列制备肽模拟物的方法描述于例如美国专利号5,631,280；5,612,895；和5,series,和edwardb.roche,ed.,bioreversiblecarriersindrugdesign,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress(1987)中提供了全面的讨论。62.术语“载体”是指一种化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合时，有助于或促进该化合物或组合物对其预期用途和目的的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或的任何其他特征。例如，可以选择载体以使活性成分的任何降解最小化并且使受试者中的任何不利副作用最小化。63.术语“治疗”是指旨在治愈、缓解、稳定或预防疾病、病理状况或病症的患者的医学管理。该术语包括活性治疗，即特异性旨在疾病、病理状况或病况的改善，和还包括病因治疗，即旨在消除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持治疗，即用于补充另一种针对改善相关疾病、病理状况或病症的特定治疗的治疗。64.如本文所用，“施用”可以指口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、骨内、眼内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、心内、关节内、海绵体内、鞘内、病毒内、脑内和脑室内、鼓室内、耳蜗内、直肠、阴道，通过吸入、通过导管、支架或通过植入式储液器或其他主动或被动(例如通过扩散)施用组合物在血管周围空间和外膜的装置的施用。例如，诸如支架之类的医疗器械可以包含布置在其表面上的组合物或制剂，然后其可以溶解或以其他方式分布到周围的组织和细胞。术语“肠胃外”可包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。施用可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地施用制备物；即，用于治疗现有疾病或病症。在进一步的各个方面，可以预防性地施用制剂；即，为预防疾病或病症而施用。65.如本文所用，术语“烷基”是具有1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环的或非环的。烷基可以是支链的或非支链的。烷基还可以是取代的或非取代的。例如，烷基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇，如本文所述。“低级烷基”是含有一到六个(例如，一到四个)碳原子的烷基。术语烷基也可以是c1烷基、c1-c2烷基、c1-c3烷基、c1-c4烷基、c1-c5烷基、c1-c6烷基、c1-c7烷基、c1-c8烷基、c1-c9烷基、c1-c10烷基等多至并包括c1-c24烷基。66.在整个说明书中，“烷基”通常用于指代未取代的烷基和取代的烷基两者；然而，取代的烷基在本文中也通过识别烷基上的特定取代基来具体提及。例如，术语“卤化烷基”或“卤代烷基”具体是指被一种或多种卤化物例如氟、氯、溴或碘取代的烷基。可替代地，术语“单卤代烷基”具体是指被单个卤化物，例如氟、氯、溴或碘取代的烷基。术语“多卤代烷基”具体是指被两个或更多个卤化物独立取代的烷基，即每个卤化物取代基不必是与另一个卤化物取代基相同的卤化物，卤化物取代基的多个实例也不必在相同的碳上。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个烷氧基取代的烷基，如下所述。术语“氨基烷基”具体是指被一个或多个氨基取代的烷基。术语“羟基烷基”具体是指被一个或多个羟基取代的烷基。当在一种情况下使用“烷基”而在另一种情况下使用特定术语例如“羟烷基”时，这并不意味着术语“烷基”也不指特定术语例如“羟烷基”等.67.这种做法也用于本文所述的其他基团。即，虽然诸如“环烷基”的术语是指未取代的和取代的环烷基部分，但取代的部分可以另外在本文中具体说明；例如，特定取代的环烷基可以称为例如“烷基环烷基”。类似地，取代的烷氧基可以具体地是指例如“卤代烷氧基”，特定的取代的烯基可以是例如“烯基醇”等。同样，使用通用术语(例如“环烷基”)和特定术语(例如“烷基环烷基”)的做法并不意味着该通用术语也不包括特定术语。68.如本文所用，术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的非芳族碳基环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基等。术语“杂环烷基”是一种如上定义的环烷基，并且包括在术语“环烷基”的含义内，其中环的至少一个碳原子被杂原子取代，例如但不限于氮、氧、硫或磷。环烷基和杂环烷基可以是取代的或未取代的。环烷基和杂环烷基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于本文所述的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇。69.如本文所用，术语“杂烷基”是指包含至少一个杂原子的烷基。合适的杂原子包括但不限于o、n、si、p和s，其中氮、磷和硫原子任选被氧化，氮杂原子任选被季铵化。杂烷基可以如上文对烷基所定义的那样被取代。70.如本文所用，术语“杂环烷基”是指脂肪族、部分不饱和或完全饱和的3至14元环系统，包括3至8个原子的单环以及双环和三环系统。杂环烷基环系统包括一到四个独立地选自氧、氮和硫的杂原子，其中氮和硫杂原子任选地可以被氧化并且氮杂原子任选地可以被取代。代表性的杂环烷基包括但不限于吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基和四氢呋喃基。71.如本文所用，术语“芳基”是包含任何基于碳的芳族基团的基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯、蒽等。芳基可以是取代的或未取代的。芳基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于本文所述的烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、-nh2、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇。术语“联芳基”是一种特定类型的芳基，包含在“芳基”的定义中。此外，芳基可以是单环结构或包含多个环结构，这些环结构或者是稠环结构或者通过一个或多个桥接基团例如碳-碳键附接。例如，联芳基与两个芳基通过稠环结构结合在一起，如萘，或通过一个或多个碳-碳键连接，如联苯。还考虑了稠合芳基，包括但不限于茚和萘基。芳基也可以与环烷基稠合。例如，环戊基可以与苯基稠合。72.如本文所用，术语“杂芳基”是指具有至少一个杂原子并入芳族基团环内的芳族基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷，其中n-氧化物、硫氧化物和二氧化物是允许的杂原子取代。杂芳基可以是取代的或未取代的。杂芳基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于本文所述的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇。杂芳基可以是单环或替代地稠环系统。杂芳基包括但不限于呋喃基、咪唑基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、n-甲基吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吡唑基、三唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、异噻唑基、哒唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并二噁唑基、苯并噻吩基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、咪唑并吡啶基、吡唑并吡啶基和吡唑并嘧啶基。杂芳基的其他非限制性实例包括但不限于吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、苯并[d]噁唑基、苯并[d]噻唑基、喹啉基、喹唑啉基、吲唑基、咪唑并[1,2-b]哒嗪基、咪唑并[1,2-a]吡嗪基、苯并[c][1,2,5]噻二唑基、苯并[c][1,2,5]噁二唑基和吡啶并[2,3-b]吡嗪基。[0073]如本文所用，术语“卤代”、“卤素”或“卤化物”可以互换使用，指的是f、cl、br或i。[0074]如本文所述，本发明的化合物可以包含“任选取代的”部分。一般而言，术语“取代的”，无论前面是否有术语“任选”，是指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基取代。除非另有说明，“任选取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置可以被多于一个选自特定基团的取代基取代时，该取代基可以在每个位置都相同或不同。本发明所设想的取代基的组合优选地是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。还预期在某些方面，除非明确指出相反，单个取代基可以进一步任选地被取代(即，进一步被取代或未被取代)。[0075]除非有相反的说明，化学键仅显示为实线而不显示为楔形或虚线的化学式考虑了每种可能的异构体，例如每种对映异构体和非对映异构体，以及异构体的混合物，例如外消旋体或比例异构体混合物。本文所述的化合物可以包含一个或多个不对称中心，因此可能产生非对映异构体和光学异构体。除非另有说明，否则本发明包括所有这些可能的非对映异构体以及它们的外消旋混合物、它们基本上纯的拆分对映异构体、所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。立体异构体的混合物以及分离的特定立体异构体也包括在内。在用于制备此类化合物的合成程序的过程期间，或在使用本领域技术人员已知的外消旋化或差向异构化程序中，此类程序的产物可以是立体异构体的混合物。术语“基本上r”和“基本上s”在本文中定义为具有r或s对映体的至少70％对映体纯度、至少70％对映体纯度、至少70％对映体纯度、至少70％对映体纯度、至少75％对映体纯度、至少80％对映体纯度、至少85％对映体纯度、至少90％对映体纯度、至少95％对映体纯度、至少99％对映体纯度或100％对映体纯度。[0076]如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指用酸或碱制备的活性主剂的盐，所述酸或碱以治疗有效量施用时可被生物系统耐受或被受试者耐受或被生物系统耐受且被生物系统耐受。当本公开的化合物含有相对酸性的官能性时，碱加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足量的所需碱(纯碱或在合适的惰性溶剂中)接触来获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括但不限于：钠、钾、钙、铵、有机氨、镁盐、锂盐、锶盐或类似盐。[0077]当本公开的化合物含有相对碱性的官能性时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触来获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括但不限于：衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的那些，以及衍生自相对无毒有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸盐如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐。[0078]术语“药学上可接受的酯”是指本公开的化合物的酯，其在体内水解并且包括在人体中容易分解以留下母体化合物或其盐的那些。本公开的药学上可接受的无毒酯的实例包括c1至c6烷基酯和c5至c7环烷基酯，但优选c1至c4烷基酯。公开的化合物的酯可以根据常规方法制备。药学上可接受的酯可以通过含有羟基的化合物与酸和烷基羧酸如乙酸或与酸和芳基羧酸如苯甲酸反应而连接到羟基上。在含有羧酸基团的化合物的情况下，药学上可接受的酯由含有羧酸基团的化合物通过该化合物与碱如三乙胺和卤代烷，例如甲基碘、苄基碘、环戊基碘或三氟甲磺酸烷基酯的反应来制备。它们也可以通过化合物与酸如盐酸和醇如乙醇或甲醇的反应来制备。[0079]术语“药学上可接受的酰胺”是指衍生自氨、伯c1至c6烷基胺和仲c1至c6二烷基胺的本公开的无毒酰胺。在仲胺的情况下，胺也可以是含有一个氮原子的5-或6-元杂环的形式。优选衍生自氨、c1至c3烷基伯酰胺和c1至c2二烷基仲酰胺的酰胺。公开的化合物的酰胺可以根据常规方法制备。药学上可接受的酰胺可以由含有伯胺或仲胺基的化合物通过含有氨基的化合物与烷基酸酐、芳基酸酐、酰基卤或芳基卤反应来制备。在含有羧酸基团的化合物的情况下，药学上可接受的酰胺是由含有羧酸基团的化合物通过该化合物与碱例如三乙胺，脱水剂例如二环己基碳二亚胺或羰基二咪唑，和烷基胺、二烷基胺，例如与甲胺、二乙胺和哌啶的反应来制备。它们也可以通过该化合物与酸如硫酸和烷基羧酸如乙酸，或与酸和芳基羧酸如苯甲酸在脱水条件下如加入分子筛的反应来制备。组合物可以包含药学上可接受的前药形式的本公开的化合物。[0080]术语“药学上可接受的前药”或“前药”表示本公开的化合物的那些前药，其在合理的医学判断的范围内，适用于与人类和低等动物的组织接触而没有度毒性、刺激、过敏应答等，与合理的收益/风险比相称，并对其预期用途有效。本公开的前药可以在体内快速转化为具有公开的化合物结构的母体化合物，例如通过在血液中水解。在t.higuchiandv.stella,pro-drugsasnoveldeliverysystems,v.14ofthea.c.s.symposiumseries,和edwardb.roche,ed.,bioreversiblecarriersindrugdesign,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress(1987)中提供了全面的讨论。β-抑制蛋白寡聚化抑制剂显性失活肽[0081]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是显性失活肽，包含突变的β-抑制蛋白或其片段，其可以阻断内源性β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2与肌醇六磷酸(ip6)的结合。β-抑制蛋白的突变形式描述在milanosk,etal.(2006)jbiolchem281(14):9812-9823中，其全文以引用方式并入以用于教导这些突变体。milano等人解决了与ip6复合的抑制蛋白2的晶体结构，确定了两个参与ip6依赖性寡聚化的结构域。在一些实施方案中，突变的β-抑制蛋白在milanosk等人所述的n-结构域和/或c-结构域中的一个或多个赖氨酸和/或精氨酸残基中具有突变。例如，在一些实施方案中，突变的β-抑制蛋白具有对应于野生型抑制蛋白2的残基k158、k161、r162、k232、r234、k252、k326或k328的至少一个氨基酸取代。药理抑制剂[0082]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐其中r1是氢或烷基；ar是芳基；和当r1是烷基时，在ca处的立体化学是外消旋的，基本上是r，或基本上是s。[0083]在一个实施方案中，r1是氢。在一个实施方案中，ar是未取代的或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar是被一个或多个卤素原子取代的苯基。在一个实施方案中，r1是c1至c10烷基，例如甲基、乙基、丙基异丙基或丁基。在一个实施方案中，在ca处的立体化学基本上是r。在另一个实施方案中，在ca处的立体化学基本上是s。在另一个实施方案中，在ca处的立体化学是外消旋的。在一个实施方案中，ar是未取代的或取代的苯基。在一个实施方案中，ar是被一个或多个烷基或卤素原子取代的苯基。在一个实施方案中，苯基被1至3个卤素原子取代。苯环上卤原子的位置可以变化。在另一个实施方案中，ar是与环烷基稠合的苯基。环烷基可具有4至7个碳原子。一方面，与环烷基稠合的苯基具有以下结构[0084]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐其中ar是芳基。[0085]在一个实施方案中，ar是未取代的或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar是被烷基或环烷基取代的苯基。[0086]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐其中r2和r3独立地为氢或烷基；和ar是芳基。[0087]在一个实施方案中，r2是氢。在另一个实施方案中，r3是c1至c10烷基，例如甲基、乙基、丙基异丙基或丁基。在一个实施方案中，ar是未取代的或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar是被烷基或卤素原子取代的苯基。[0088]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐其中ar1和ar2独立地是芳基；和x是ch2或c＝o。[0089]在一个实施方案中，ar1是未取代的或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar1是被烷基或卤素原子取代的苯基。在一个实施方案中，ar1是未取代的或取代的杂芳基。在另一个实施方案中，ar1是未取代的或取代的哌啶基或哒嗪基。在一个实施方案中，ar2是未取代或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar2是被烷基或卤素原子取代的苯基。在一个实施方案中，ar2是未取代的或取代的哌啶基。在另一个实施方案中，ar2是被烷基或卤素原子取代的哌啶基。[0090]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐其中ar1和ar2独立地是芳基。[0091]在一个实施方案中，ar1是未取代或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar1是被烷基或卤素原子取代的苯基。在一个实施方案中，ar2是未取代或取代的苯基。在另一个实施方案中，ar2是被烷基或卤素原子取代的苯基。[0092]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是选自以下组成的组的化合物：(2-[(2,3-二氢-1h-茚-5-基)甲酰胺基]-n-({咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基}甲基)乙酰胺)、n-{2-[(6-甲基哒嗪-3-基)氨基]乙基}-3-苯基-1,2-噁唑-5-甲酰胺、2-[(2,4-二氟苯基)甲酰胺基]-n-({咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基}甲基)乙酰胺、(2s)-n-({咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基}甲基)-3-甲基-2-[(3-甲基苯基)甲酰胺基]丁酰胺、2-[(3-溴苯基)甲酰胺基]-n-({咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基}甲基)乙酰胺、n-({咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基}甲基)-3-[(哌啶-4-基)甲基]苯甲酰胺、2-[(3-氯苯基)甲酰胺基]-n-({咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基}甲基)乙酰胺、n-{2-[(3-甲基吡啶-4-基)氨基]乙基}-3-苯基-1,2-噁唑-5-甲酰胺、1-(4-氟苯基)-4-[3-(4-氟苯基)-1,2-噁唑-5-羰基]哌嗪、2-{[3-(4-甲基苯基)-1,2-噁唑-5-基]甲酰胺基}-n-(2,4,6-三甲基苯基)乙酰胺、n-(2-溴苯基)-2-{[3-(4-甲基苯基)-1,2-噁唑-5-基]甲酰胺基}乙酰胺和3-苯基-n-(丙-2-基)-1,2-噁唑-5-甲酰胺。[0093]在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有由下式表示的结构的化合物：物：药物组合物[0094]在各个方面，本公开涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种公开的化合物，公开的方法的至少一种产品，或其药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的载体”是指一种或多种药学上可接受的稀释剂、防腐剂、抗氧化剂、增溶剂、乳化剂、着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和加香剂以及佐剂。所公开的药物组合物可以方便地以单位剂型呈现并通过药学和药物科学领域公知的任何方法制备。[0095]在另一方面，所公开的药物组合物包含治疗有效量的至少一种所公开的化合物，至少一种所公开方法的产物，或其药学上可接受的盐作为活性成分，药学上可接受的载体，任选地一种或多种其他治疗剂，和任选的一种或多种佐剂。所公开的药物组合物包括那些适合口服、直肠、局部、肺部、鼻腔和肠胃外施用的药物组合物，尽管在任何给定情况下最适合的途径将取决于特定宿主以及活性成分所正在施用的病况的性质和严重程度。在另一方面，所公开的药物组合物可以配制成允许口服、经鼻、经吸入、肠胃外、癌旁、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内施用。[0096]如本文所用，“肠胃外施用”包括通过推注或输注的施用，以及通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输液的施用。[0097]在各个方面，本公开内容还涉及一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体或稀释剂，作为活性成分的治疗有效量的公开的化合物、公开的制备方法的产物、药学上可接受的盐、其水合物、其溶剂化物、其多晶型物或其立体化学异构体形式。在另一方面，所公开的化合物、所公开的制备方法的产物、药学上可接受的盐、其水合物、其溶剂化物、其多晶型物、或其立体化学异构体形式、或者其任何亚组或组合可以是配制成各种药物形式用于施用。[0098]药学上可接受的盐可以从药学上可接受的无毒碱或酸来制备。对于治疗用途，所公开化合物的盐是其中抗衡离子是药学上可接受的那些。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可用于例如制备或纯化药学上可接受的化合物。本公开内容涵盖所有盐，无论是否药学上可接受的。药学上可接受的酸和碱加成盐意在包括所公开的化合物能够形成的治疗活性的无毒酸和碱加成盐形式。[0099]在各个方面，包含酸性基团或部分，例如羧酸基团的公开的化合物可用于制备药学上可接受的盐。例如，这种公开的化合物可以包括分离步骤，包括用合适的无机或有机碱的处理。在某些情况下，在实践中可能需要首先将化合物从反应混合物中分离为药学上不可接受的盐，然后通过用酸性试剂处理将后者简单地转化回游离酸化合物，然后将游离酸转化为药学上可接受的碱加成盐。这些碱加成盐可以使用常规技术容易地制备，例如，通过用含有所需药学上可接受的阳离子的水溶液处理相应的酸性化合物，然后将所得溶液蒸发至干燥，优选在减压下。可替代地，它们也可以通过将酸性化合物的低级链烷醇溶液和所需的碱金属醇盐混合在一起，然后以与之前相同的方式将所得溶液蒸发至干来制备。[0100]可用于制备碱化合物的药学上可接受的碱加成盐的碱是可以形成无毒碱加成盐的那些碱，即含有药学上可接受的阳离子如碱金属阳离子(例如，锂、钾和钠)、碱土金属阳离子(例如钙和镁)、铵或其他水溶性胺加成盐，例如n-甲基葡糖胺-(葡甲胺)、低级链烷醇铵和其他此类有机胺碱的盐。在另一方面，衍生自药学上可接受的有机无毒碱包括伯胺、仲胺和叔胺，以及环状胺和取代胺，例如天然存在的和合成的取代胺。在各个方面，此类药学上可接受的有机无毒碱包括但不限于氨、甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、四种丁胺异构体中的任何一种、甜菜碱、咖啡因、胆碱、二甲胺、二乙胺、二乙醇胺、二丙胺、二异丙胺、二正丁胺、n,n'-二苄基乙二胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、三甲胺、三乙胺、三丙胺、氨丁三醇、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、奎宁环、吡啶、喹啉和异喹啉；苄星、n-甲基-d-葡糖胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、海巴胺盐和与氨基酸的盐，例如，组氨酸、精氨酸、赖氨酸等。上述盐形式可以通过用酸处理转化回游离酸形式。[0101]在各个方面，包含可质子化基团或部分(例如氨基)的公开化合物可用于制备药学上可接受的盐。例如，这种公开的化合物可以包括分离步骤，包括用合适的无机或有机酸的处理。在某些情况下，在实践中可能需要首先将化合物从反应混合物中分离为药学上不可接受的盐，然后通过用碱性试剂处理将后者简单地转化回游离碱化合物，然后将游离碱转化为药学上可接受的酸加成盐。这些酸加成盐可以使用常规技术容易地制备，例如，通过用含有所需药学上可接受的阴离子的水溶液处理相应的碱性化合物，然后将所得溶液蒸发至干燥，优选在减压下进行。可替代地，它们也可以通过用合适的药学上可接受的无毒无机或有机酸处理所公开化合物的游离碱形式来制备。[0102]可用于制备碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是可形成无毒酸加成盐的酸，即含有由其相应的无机酸和有机酸形成的药学上可接受的阴离子的盐。示例性但非限制性的无机酸包括盐酸氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。示例性但非限制性的有机酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙基磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸甲磺酸、粘液酸、帕莫酸、泛酸、琥珀酸、酒石酸、对-甲苯磺酸等。在另一方面，酸加成盐包含由氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸形成的阴离子。[0103]在实践中，本公开的化合物或其药学上可接受的盐可以作为活性成分与药物载体根据常规药物化合技术紧密混合。载体可以采用多种形式，这取决于施用所需的制备物形式，例如口服或肠胃外(包括静脉内)。因此，本公开的药物组合物可以呈现为适合口服施用的离散单元，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每一个都含有预定量的活性成分。此外，组合物可以以粉末、颗粒、溶液、在水性液体中的悬浮液、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液的形式存在。除了上面列出的常见剂型之外，本公开的化合物和/或其药学上可接受的盐也可以通过控释手段和/或递送装置来施用。组合物可以通过任何药学方法制备。通常，此类方法包括使活性成分与构成一种或多种必需成分的载体缔合的步骤。通常，组合物是通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地混合来制备的。然后可以方便地将产品塑造成所需的外观。[0104]将上述药物组合物配制成单位剂型是特别有利的，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的活性成分，经计算产生与所需药物载体相关的所需治疗效果。即，“单位剂型”是指单剂量，其中所有活性和非活性成分在合适的系统中组合，使得患者或向患者施用药物的人可以打开单个容器或包装，其中含有整个剂量，并且不必将来自两个或更多个容器或包装的任何成分混合在一起。单位剂型的典型实例是用于口服施用的片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊或丸剂；用于注射溶液或悬浮液的单剂量小瓶；用于直肠施用的栓剂；粉包；薄片；及其分开的复合物。该单位剂型的清单无意以任何方式进行限制，而仅代表单位剂型的典型实例。[0105]本文公开的药物组合物包含作为活性成分的本公开的化合物(或其药学上可接受的盐)，药学上可接受的载体和任选的一种或多种另外的治疗剂。在各个方面，所公开的药物组合物可以包括药学上可接受的载体和所公开的化合物，或其药学上可接受的盐。在另一方面，所公开的化合物或其药学上可接受的盐也可以与一种或多种其他治疗活性化合物组合包含在药物组合物中。本发明的组合物包括适用于口服、直肠、局部和肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)施用的组合物，尽管在任何给定情况下最合适的途径将取决于特定的宿主，以及施用活性成分所针对的病况的性质和严重程度。药物组合物可以方便地以单位剂型存在并通过药学领域熟知的任何方法制备。[0106]用于制备可用于本文所述材料和方法的剂型的技术和组合物描述于例如以下参考文献中：modernpharmaceutics,chapters9and10(banker&rhodes,editors,1979)；pharmaceuticaldosageforms:tablets(liebermanetal.,1981)；ansel,introductiontopharmaceuticaldosageforms2ndedition(1976)；remington'spharmaceuticalsciences,17thed.(mackpublishingcompany,easton,pa.,1985)；advancesinpharmaceuticalsciences(davidganderton,trevorjones,eds.,1992)；advancesinpharmaceuticalsciencesvol7.(davidganderton,trevorjones,jamesmcginity,eds.,1995)；aqueouspolymericcoatingsforpharmaceuticaldosageforms(drugsandthepharmaceuticalsciences,series36(jamesmcginity,ed.,1989)；pharmaceuticalparticulatecarriers:therapeuticapplications:drugsandthepharmaceuticalsciences,vol61(alainrolland,ed.,1993)；drugdeliverytothegastrointestinaltract(ellishorwoodbooksinthebiologicalsciences.seriesinpharmaceuticaltechnology；j.g.hardy,s.s.davis,cliveg.wilson,eds.)；modernpharmaceuticsdrugsandthepharmaceuticalsciences,vol40(gilberts.banker,christophert.rhodes,eds.)。[0107]本文所述的化合物通常与适当的药物稀释剂、赋形剂、增量剂或载体(carrier)(本文称为药学上可接受的载体或载体)混合施用，其根据预期的施用形式进行合适地选择和与传统制药实践一致。可递送的化合物将是适合口服、直肠、局部、静脉内注射或肠胃外施用的形式。载体包括固体或液体，并且载体的类型根据所使用的给药类型来选择。化合物可以以具有已知量的化合物的剂量进行施用。[0108]由于易于施用，口服施用可以是优选的剂型，并且片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然使用固体药物载体。然而，其他剂型可能是合适的，这取决于临床人群(例如，年龄和临床状况的严重程度)、所使用的具体公开化合物的溶解性等。因此，所公开的化合物可用于口服剂型，例如丸剂、粉末、颗粒、酏剂、酊剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂。在制备口服剂型的组合物时，可以使用任何方便的药物介质。例如，水、甘油、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制备物例如混悬剂、酏剂和溶液；而载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等可用于形成口服固体制备物如粉末、胶囊剂和片剂。由于易于施用，片剂和胶囊剂是优选的口服剂量单位，其中使用了固体药物载体。任选地，片剂可以通过标准的水性或非水性技术进行包衣。[0109]所公开的口服剂型的药物组合物可以包含一种或多种药物赋形剂和/或添加剂。合适的赋形剂和添加剂的非限制性实例包括明胶、天然糖例如粗糖或乳糖，卵磷脂，果胶，淀粉(例如玉米淀粉或直链淀粉)，葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙酸乙烯酯，阿拉伯树胶，海藻酸，泰糖，滑石，石松，硅胶(例如胶体)，纤维素，纤维素衍生物(例如其中纤维素羟基与低级饱和脂肪醇和/或低级饱和脂肪羟基醇部分醚化的纤维素醚，例如甲氧基丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)，脂肪酸以及具有12至22个碳原子的脂肪酸的镁盐、钙盐或铝盐，特别是饱和的(例如硬脂酸盐)，乳化剂，油和脂肪，特别是植物(例如，花生油、蓖麻油、橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油、小麦胚芽油、葵花籽油、鱼肝油，在每种情况下也任选水合)；饱和脂肪酸c12h24o2至c18h36o2的甘油酯和聚甘油酯及其混合物，甘油羟基可以完全或也仅部分酯化(例如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)；药学上可接受的一元或多元醇和聚乙二醇，例如聚乙二醇及其衍生物，脂肪族饱和或不饱和脂肪酸(2-22个碳原子，特别是10-18个碳原子)与一价脂肪醇(1-20个碳原子)或多元醇，例如二醇、甘油、二甘醇、季戊四醇、山梨糖醇、甘露醇等的酯，其也可以任选地被醚化，柠檬酸的酯与伯醇、乙酸、脲、苯甲酸苄酯、二氧戊环、甘油缩甲醛、四氢糠基醇、具有c1-c12-醇的聚乙二醇醚、二甲基乙酰胺、乳酰胺、乳酸盐、碳酸乙酯、硅氧烷(特别是中等粘度的聚二甲基硅氧烷)、碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸钠、碳酸镁等。[0110]用于制备口服剂型的其他辅助物质是那些引起崩解的物质(所谓的崩解剂)，例如：交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠或微晶纤维素。常规的包衣物质也可用于生产口服剂型。例如，可以考虑的是：丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物以及共聚物；具有较低铵基含量的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物(例如eudragitrrs)，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯与甲基丙烯酸三甲基铵的共聚物(例如eudragitrrl)；聚醋酸乙烯酯；脂肪、油、蜡、脂肪醇；羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或乙酸琥珀酸酯；乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸淀粉以及聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、羧甲基纤维素；邻苯二甲酸甲基纤维素、琥珀酸甲基纤维素、邻苯二甲酸琥珀酸甲基纤维素以及邻苯二甲酸甲基纤维素半酯；玉米醇溶蛋白；乙基纤维素以及乙基纤维素琥珀酸酯；虫胶，谷蛋白；乙基羧乙基纤维素；乙基丙烯酸酯-马来酸酐共聚物；马来酸酐-乙烯基甲基醚共聚物；苯乙烯-马来酸共聚物；2-乙基-己基丙烯酸酯马来酸酐；巴豆酸-醋酸乙烯酯共聚物；谷氨酸/谷氨酸酯共聚物；羧甲基乙基纤维素单辛酸甘油酯；醋酸琥珀酸纤维素；聚精氨酸。[0111]在所公开的口服剂型中可被视为包衣物质的增塑剂是：柠檬酸酯和酒石酸酯(乙酰基柠檬酸三乙酯、乙酰基三丁基、三丁基、柠檬酸三乙酯)；甘油和甘油酯(甘油二乙酸酯、-三乙酸酯、乙酰化甘油单酯、蓖麻油)；邻苯二甲酸酯(邻苯二甲酸二丁酯、二戊酯、二乙酯、二甲酯、二丙酯)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基或2-乙氧基乙基)酯、邻苯二甲酰乙醇酸乙酯、邻苯二甲酰乙醇酸丁酯和乙醇酸丁酯；醇类(丙二醇、各种链长的聚乙二醇)、己二酸酯(己二酸二乙酯、己二酸二(2-甲氧基或2-乙氧基乙基)酯；二苯甲酮；癸二酸二乙酯和癸二酸二丁酯、琥珀酸二丁酯、酒石酸二丁酯；二甘醇二丙酸酯；乙二醇二乙酸酯、-二丁酸酯、-二丙酸酯；磷酸三丁酯、三丁酸甘油酯；聚乙二醇脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯，例如polysorbar50)；脱水山梨糖醇单油酸酯。[0112]此外，可以包括合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、流动诱导剂和熔化剂作为载体。所用的药物载体可以是例如固体、液体或气体。固体载体的实例包括但不限于乳糖、白土、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇滑石、淀粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油和水。气态载体的实例包括二氧化碳和氮气。[0113]在各个方面，粘合剂可以包括例如淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶例如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。在另一方面，崩解剂可以包括例如淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。[0114]在各个方面，口服剂型，例如固体剂型，可以包含作为可靶向药物载体或作为前药附接至聚合物的公开化合物。用于实现药物控释的合适的可生物降解聚合物包括例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰酰化物和水凝胶，优选共价交联的水凝胶。[0115]片剂可以包含与适合于制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。[0116]含有所公开化合物的片剂可以通过压制或模制来制备，任选地与一种或多种辅助成分或佐剂一起。压制片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分来制备，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合。模压片剂可通过在合适的机器中模压粉末状化合物的混合物与惰性液体稀释剂润湿而制成。[0117]在各个方面，固体口服剂型，例如片剂，可以用肠溶衣包衣以防止在胃中容易分解。在各个方面，肠溶衣剂包括但不限于邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯-邻苯二甲酸酯和乙酸邻苯二甲酸纤维素。akihikohasegawa“applicationofsoliddispersionsofnifedipinewithentericcoatingagenttoprepareasustained-releasedosageform”chem.pharm.bull.33:1615-1619(1985)。可以根据测试选择各种肠溶衣材料，以实现从头开始设计的肠溶衣剂型，以具有溶出时间、包衣厚度和径向压碎强度的优选组合(例如，参见s.c.porteretal.“thepropertiesofenterictabletcoatingsmadefrompolyvinylacetate-phthalateandcelluloseacetatephthalate”,j.pharm.pharmacol.22:42p(1970))。在另一方面，肠溶衣可包含羟丙基-甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯-邻苯二甲酸酯和乙酸邻苯二甲酸纤维素。[0118]在各个方面，口服剂型可以是具有水溶性或水不溶性载体的固体分散体。水溶性或水不溶性载体的实例包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、磷脂酰胆碱、聚氧乙烯氢化蓖麻油、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素或羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素或硬脂酸。[0119]在各个方面，口服剂型可以是液体剂型，包括那些被摄入的，或者替代地作为漱口剂或漱口剂施用的那些。例如，液体剂型可以包括水性混悬剂，其包含与适合于制造水性混悬剂的赋形剂混合的活性物质。此外，可以通过将活性成分悬浮在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油或矿物油例如液体石蜡中来配制油性混悬剂。油性混悬剂也可能含有各种赋形剂。本公开的药物组合物还可以是水包油乳剂的形式，其还可以包含赋形剂，例如甜味剂和调味剂。[0120]对于溶液或悬浮液的制备，例如，可以使用水，特别是无菌水，或生理上可接受的有机溶剂，例如醇类(乙醇、丙醇、异丙醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇和它们的衍生物、脂肪醇、甘油偏酯)、油(例如花生油、橄榄油、芝麻油、杏仁油、葵花油、大豆油、蓖麻油、牛蹄油)、石蜡、二甲基亚砜、甘油三酯和类似。[0121]在液体剂型例如可饮用溶液的情况下，以下物质可用作稳定剂或增溶剂：具有2-4个碳原子的低级脂肪族一元和多元醇，例如乙醇、正丙醇、甘油、分子量在200-600之间的聚乙二醇(例如1至40％水溶液)、二甘醇单乙醚、1,2-丙二醇、有机酰胺，例如脂肪族c1-c6-羧酸与氨或者伯、仲或叔c1-c4-胺或者c1-c4-羟基胺的酰胺，例如脲、氨基甲酸酯、乙酰胺、n-甲基乙酰胺、n,n-二乙基乙酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、具有2-6个碳原子的低级脂肪胺和二胺，例如乙二胺、羟乙基茶碱、氨丁三醇(例如作为0.1至20％的水溶液)、脂肪族氨基酸。[0122]在制备所公开的液体剂型中可以包含增溶剂和乳化剂，例如可以使用以下非限制性实例：聚乙烯吡咯烷酮，山梨聚糖脂肪酸酯例如山梨聚糖三油酸酯，磷脂例如卵磷脂，阿拉伯胶，黄蓍胶，聚氧乙基化山梨聚糖的单油酸酯和山梨聚糖的其他乙氧基化脂肪酸酯，聚氧乙基化脂肪，聚氧乙基化甘油三酯，亚麻油化甘油三酯，脂肪醇、烷基酚或脂肪酸的聚环氧乙烷缩合产物或还有1-甲基-3-(2-羟乙基)咪唑烷酮-(2)。在本文中，聚氧乙烯化是指所讨论的物质包含聚氧乙烯链，其聚合度通常在2和40之间，特别是在10和20之间。这种聚氧乙烯化的物质可以例如通过含羟基化合物(例如甘油单酯或甘油二酯或不饱和化合物，例如含有油酸基的那些)与环氧乙烷(例如每1摩尔甘油酯40摩尔环氧乙烷)的反应获得的。甘油三酯的实例是橄榄油、花生油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油、玉米油。另见dr.h.p.fiedler“lexikonderhillsstoffefürpharmazie,kostnetikundangrenzendegebiete”1971,pages191-195。[0123]在各个方面，液体剂型可以进一步包含防腐剂、稳定剂、缓冲物质、调味剂、甜味剂、着色剂、抗氧化剂和复合物形成剂等。可以考虑的络合物形成剂例如是：螯合形成剂，例如乙二胺逆曲酸、次氮基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐。[0124]可以任选需要用生理学上可接受的碱或缓冲剂将液体剂型稳定化到大约6至9的ph范围。可以优选将ph值设为中性或弱碱性(最高至ph8)。[0125]为了增强所公开的化合物在所公开的液体剂型、肠胃外注射剂型或静脉内注射剂型中的溶解度和/或稳定性，有利的是使用α-、β-或γ-环糊精或其衍生物，特别是羟烷基取代的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精。诸如醇的共溶剂也可以改进根据本公开的化合物在药物组合物中的溶解度和/或稳定性。[0126]在各个方面，所公开的液体剂型、肠胃外注射剂型或静脉内注射剂型可进一步包含脂质体递送系统，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂，例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。[0127]本公开的药物组合物适合注射，例如肠胃外施用，例如静脉内、肌内或皮下施用。注射用药物组合物可以制备成活性化合物在水中的溶液或悬浮液。可以包括合适的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散体。此外，可以包括防腐剂以防止微生物的有害生长。[0128]适用于肠胃外施用的本公开的药物组合物可以包括无菌水性或油性溶液、悬浮液或分散体。此外，组合物可以是用于临时制备这种无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末形式。在一些方面，最终的可注射形式是无菌的并且必须是有效的流体以便在注射器中使用。药物组合物应在生产和储存条件下稳定；因此，优选应保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物。[0129]例如，可制备可注射溶液，其中载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或盐和葡萄糖溶液的混合物。也可以制备可注射的悬浮液，在这种情况下可以使用合适的液体载体、悬浮剂等。在一些方面，所公开的肠胃外制剂可包含约0.01-0.1m，例如约0.05m，磷酸盐缓冲液。在另一方面，所公开的肠胃外制剂可包含约0.9％的盐水。[0130]在各个方面，所公开的肠胃外药物组合物可以包含药学上可接受的载体，例如水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括但不限于水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物可以包括甘露醇、正常血清白蛋白、氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏和不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂、惰性气体等。在另一方面，所公开的肠胃外药物组合物可包含少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂和防腐剂。对于可注射药物组合物，还考虑了打算在使用前不久转化为液体形式制剂的固体形式制剂。此外，可以包括其他佐剂以使制剂与受试者或患者的血液等渗。[0131]除了上文所述的药物组合物外，所公开的化合物还可以配制成长效制备物。这种长效制备物可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，可以将化合物与合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂，或作为微溶衍生物，例如，作为微溶盐进行配制。[0132]本公开的药物组合物可以是适合局部施用的形式。如本文所用，短语“局部应用”是指施用到生物表面上，其中生物表面包括例如皮肤区域(例如，手、前臂、肘部、腿、脸、指甲、肛门和生殖器区域)或粘膜。通过选择合适的载体和任选地可以包含在组合物中的其他成分，如下文详述，本发明的组合物可以配制成通常用于局部应用的任何形式。局部药物组合物可以是霜剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、洗剂、乳剂、混悬剂、气雾剂、喷雾剂、泡沫剂、撒粉剂、垫和贴剂的形式。此外，组合物可以是适用于经皮装置的形式。这些制剂可以利用本公开的化合物或其药学上可接受的盐通过常规加工方法来制备。例如，通过混合亲水性材料和水以及约5wt％至约10wt％的化合物来制备乳膏或软膏，以制备具有所需稠度的乳膏或软膏。[0133]在适合经皮施用的组合物中，载体任选地包含渗透增强剂和/或适合的润湿剂，任选地与任何性质的适合的添加剂以小比例组合，这些添加剂不会对皮肤产生显著的有害影响。所述添加剂可以促进对皮肤的施用和/或可以有助于制备所需的组合物。这些组合物可以多种方式施用，例如作为透皮贴剂、作为点涂剂、作为软膏。[0134]软膏是半固体制备物，通常基于凡士林或石油衍生物。要使用的特定软膏基质是为给定制剂选择的活性剂提供最佳递送的一种，并且优选地，还提供其他所需特性(例如，润肤剂)。与其他载体或媒介物一样，软膏基质应该是惰性的、稳定的、无刺激性和无致敏性。正如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,19thed.,easton,pa.:mackpublishingco.(1995),pp.1399-1404中所解释的，软膏基质可分为四类：油质基质；可乳化基质；乳液基质；和水溶性基质。油性软膏基质包括例如植物油、获自动物的脂肪和获自石油的半固体烃。可乳化软膏基质，也称为吸收性软膏基质，几乎不含或不含水，包括例如硫酸羟基硬脂精、无水羊毛脂和亲水性凡士林。乳液软膏基质是油包水(w/o)乳液或水包油(o/w)乳液，包括例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏基质由不同分子量的聚乙二醇制备。[0135]洗剂是在没有摩擦的情况下应用于皮肤表面的制备物。洗剂通常是液体或半液体制备物，其中包括活性剂的固体颗粒存在于水或醇基中。由于易于应用更具流动性的组合物，洗剂通常优选用于处理大面积的身体区域。洗剂通常是固体的悬浮液，并且通常包含水包油型的液体油性乳液。通常需要将洗剂中的不溶物细分。洗剂通常含有悬浮剂以产生更好的分散体，以及用于将活性剂定位和保持与皮肤接触的化合物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。[0136]乳膏是粘性液体或半固体乳液，水包油或油包水。乳膏基质通常是可水洗的，并且包含油相、乳化剂和水相。油相，也称为“内”相，通常由凡士林和/或脂肪醇如鲸蜡醇或硬脂醇组成。水相通常但不是必须地在体积上超过油相，并且通常含有保湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。可参考remington：thescienceandpracticeofpharmacy，同上，以获取更多信息。[0137]糊剂是半固体剂型，其中生物活性剂悬浮在合适的基质中。根据基质的性质，糊剂分为脂肪糊剂或由单相水凝胶制成的糊剂。脂肪膏剂中的基质一般为凡士林、亲水凡士林等。由单相水凝胶制成的糊剂通常包含羧甲基纤维素等作为基质。进一步参考remington:thescienceandpracticeofpharmacy，以获取更多信息。[0138]凝胶制剂是半固体、悬浮型系统。单相凝胶包含基本均匀分布在整个载体液体中的有机大分子，该载体液体通常是水性的，但还优选地包含醇和任选的油。优选的有机大分子，即胶凝剂，是交联的丙烯酸聚合物，例如卡波姆聚合物家族，例如可以以商标carbopoltm商购获得的羧基聚亚烷基。在本文中，其他类型的优选聚合物是亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；改性纤维素，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和甲基纤维素；胶如黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。为了制备均匀的凝胶，可加入分散剂如醇或甘油，或可通过研磨、机械混合或搅拌或它们的组合来分散胶凝剂。[0139]喷雾剂通常在水和/或醇溶液中提供活性剂，其可以雾化到皮肤上用于递送。这样的喷雾剂包括那些配制为在递送后在施用部位提供活性剂溶液浓度的喷雾剂，例如，喷雾剂溶液可以主要由醇或其中可以溶解活性剂的其他类似挥发性液体构成。在递送至皮肤后，载体蒸发，在施用部位留下浓缩的活性剂。[0140]泡沫组合物通常被配制成单相或多相液体形式并容纳在合适的容器中，任选地连同促进组合物从容器中排出的推进剂一起，从而在应用时将其转化为泡沫。其他泡沫形成技术包括例如“罐装袋”配方技术。如此配制的组合物通常含有低沸点烃，例如异丙烷。在体温下应用和搅拌这种组合物导致异丙烷蒸发并产生泡沫，其方式类似于加压气溶胶发泡系统。泡沫可以是水基的或含水链烷醇的，但通常配制有高酒精含量，一旦应用至使用者的皮肤，就会迅速蒸发，从而将活性成分通过皮肤上层到达治疗部位。[0141]皮肤贴片通常包括背衬，含有活性剂的储库附接至该背衬。例如，储库可以是其中分散或浸泡有活性剂或组合物的垫，或者是液体储库。贴片通常还包括正面的水可渗透粘合剂，其将装置粘附并固定到治疗区域。可替代地使用具有自粘性的硅橡胶。在这两种情况下，保护性可渗透层可用于在其使用前保护贴片的粘合面。皮肤贴片还可以包括可移除的覆盖物，用于在储存时对其进行保护。[0142]可以与本发明一起使用的贴片构造的实例包括单层或多层粘合剂包药系统，其特征在于将药物直接包含在与皮肤接触的粘合剂中。在这样的透皮贴剂设计中，粘合剂不仅用于将贴剂贴附在皮肤上，而且还用作制剂基础，将药物和所有赋形剂包含在单个背膜下。在多层粘合剂包药贴剂中，膜放置在两个不同的粘合剂包药层之间，或者多个粘合剂包药层掺入在单个背衬膜下。[0143]适用于局部应用的药物组合物的药学上可接受的载体的实例包括众所周知的用于化妆品和医学领域作为例如乳剂、乳膏、水溶液、油、软膏、糊剂、凝胶剂、洗剂、乳剂、泡沫剂、悬浮剂、气雾剂等的基质的载体材料，取决于组合物的最终形式。因此，根据本发明的合适载体的代表性实例包括但不限于水、液体醇、液体乙二醇、液体聚亚烷基二醇、液体酯、液体酰胺、液体蛋白质水解物、液体烷基化蛋白质水解物、液体羊毛脂和羊毛脂衍生物，以及在化妆品和药物组合物中常用的类似材料。根据本发明的其他合适的载体包括但不限于醇，例如一元和多元醇，例如乙醇、异丙醇、甘油、山梨糖醇、2-甲氧基乙醇、二甘醇、乙二醇、己二醇、甘露醇和丙二醇；醚，例如乙醚或二丙醚；聚乙二醇和甲氧基聚氧乙烯(分子量范围为200至20,000的碳蜡)；聚氧乙烯甘油、聚氧乙烯山梨糖醇、硬脂酰二醋精等。[0144]如果需要，本公开的局部组合物可以存在于包装或分配装置中，例如fda批准的试剂盒，其可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，分配器装置可以包括管。包装或分配装置可以附有施用说明。包装或分配装置还可以附有管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构对人用或兽用施用的组合物形式的批准。例如，此类通知可以包括美国食品和药物管理局批准的处方药或批准产品插页的标签。还可以制备包含在药学上可接受的载体中配制的本发明的局部组合物的组合物，将其置于适当的容器中，并针对治疗指定病况的治疗加标签。[0145]本发明可以使用的另一种贴片系统配置是储库透皮系统设计，其特征在于包含液体隔室，该液体隔室包含药物溶液或悬浮液，该药物溶液或悬浮液通过半透膜和粘合剂与释放衬垫隔开。该贴片系统的粘合剂组分可以作为连续层掺入在膜和释放衬垫之间，或者以同心构型掺入在膜周围。本发明可利用的另一种贴片系统配置是基质系统设计，其特征在于包含与释放衬垫直接接触的含有药物溶液或悬浮液的半固体基质。负责皮肤粘附的组分被掺入覆盖层中，并在半固体基质周围形成同心结构。[0146]本公开的药物组合物可以是适合于直肠施用的形式，其中载体是固体。优选混合物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域常用的其他材料。通过首先将组合物与软化或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和成型，可以方便地形成栓剂。[0147]含有本公开的化合物和/或其药学上可接受的盐的药物组合物也可以制备成粉末或液体浓缩物形式。[0148]药物组合物(或制剂)可以多种方式包装。通常，用于分配的物品包括容器，该容器包含适当形式的药物组合物。合适的容器是本领域技术人员熟知的并且包括诸如瓶子(塑料和玻璃)、小袋、箔泡罩包装等材料。容器还可以包括防篡改组件，以防止不慎接触包装内的物品。此外，容器通常在其上放置描述容器内容物和任何适当警告或说明的标签。[0149]如果需要，所公开的药物组合物可存在于包装或分配装置中，其可包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。该包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配装置可以附有施用说明。包装或分配装置还可以附有管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构对人用或兽用施用的组合物形式的批准。例如，此类通知可能包括美国食品和药物管理局批准的处方药或批准产品插页的标签。还可以制备包含在药学上可接受的载体中配制的本发明的局部组合物的组合物，将其置于适当的容器中，并针对治疗指定病况的治疗加标签。[0150]施用的确切剂量和频率取决于具体公开的化合物、公开的制备方法的产物、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物，或其立体化学异构形式；正在治疗的特定病况和正在治疗的病况的严重程度；特定于施用剂量的受试者的病史的各种因素，例如年龄；特定受试者的体重、性别、疾病程度和一般身体状况，以及该个体可能正在服用的其他药物；如本领域技术人员所熟知的。此外，很明显，所述有效每日量可以降低或增加，这取决于治疗受试者的应答和/或取决于开出本公开化合物的医生的评价。[0151]根据施用模式，药物组合物将包含按重量计0.05％至99％、优选按重量计0.1％至70％、更优选按重量计0.1％至50％的活性成分，以及按重量计1至99.95％，优选按重量计30至99.9％，更优选按重量计50至99.9％的药学上可接受的载体，所有百分比均基于组合物的总重量。[0152]在本文公开的治疗条件下，合适的剂量水平将通常为每天每kg患者体重约0.01至1000mg，并且可以单剂量或多剂量施用。在各个方面，剂量水平将为每天约0.1至约500mg/kg、每天约0.1至250mg/kg或每天约0.5至100mg/kg。合适的剂量水平可以是每天约0.01至1000mg/kg、每天约0.01至500mg/kg、每天约0.01至250mg/kg、每天约0.05至100mg/kg、或每天约0.1至50mg/kg。在这个范围内，剂量可以是每天0.05至0.5、0.5至5.0或5.0至50mg/kg。对于经口施用，组合物优选以含有1.0至1000mg活性成分，特别是1.0、5.0、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900和1000mg的活性成分的片剂形式提供，用于对待治疗患者的剂量进行对症调整。化合物可以每天1至4次，优选每天一次或两次的方案施用。可以调整该给药方案以提供最佳治疗应答。[0153]如上文和下文所述的此类单位剂量可以施用每天一次以上，例如每天2、3、4、5或6次。在各个方面，此类单位剂量可以施用每天1或2次，使得70kg成人的总剂量在每次施用的0.001至约15mg/kg受试者范围内。在另一方面，剂量是每次使用的0.01至约1.5mg/kg受试者体重，并且这种疗法可以持续数周或数月，并且在一些情况下，数年。然而，应当理解，任何特定患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性；接受治疗的个人的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的时间和途径；排泄率；之前施用的其他药物；以及接受治疗的特定疾病的严重程度，正如本领域技术人员所熟知的。[0154]典型的剂量可以是每天服用一次的1mg至约100mg片剂或1mg至约300mg，或每天服用多次，或每天服用一次一个定时释放胶囊或片剂，并含有比例较高含量的活性成分。可以通过在不同ph值下溶解的胶囊材料、通过渗透压缓慢释放的胶囊或通过任何其他已知的控释方式来获得定时释放效果。[0155]在某些情况下可能需要使用这些范围之外的剂量，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。此外，值得注意的是，临床医生或治疗医生将知道如何与个体患者应答结合以及何时开始、中断、调整或终止治疗。[0156]本公开进一步涉及一种用于制备用于治疗哺乳动物(例如，人)中的tau蛋白病的药物的方法，包括将一种或多种公开的化合物、产品或组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合。因此，在一个方面，本公开进一步涉及一种制备药物的方法，该方法包括将至少一种公开的化合物或至少一种公开的产品与药学上可接受的载体或稀释剂组合。[0157]所公开的药物组合物还可包含其他治疗活性化合物，其通常用于治疗上述病理或临床病况。[0158]应当理解，公开的组合物可以由公开的化合物制备。还应理解，所公开的组合物可用于所公开的使用方法中。[0159]如已经提到的，本公开涉及药物组合物，其包含治疗有效量的公开的化合物、公开的制备方法的产物、药学上可接受的盐、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物和药学上可接受的载体。此外，本公开涉及制备这种药物组合物的方法，其特征在于药学上可接受的载体与治疗有效量的根据本公开的化合物紧密混合。[0160]如已经提到的，本公开还涉及药物组合物，其包含公开的化合物、公开的制备方法的产物、药学上可接受的盐、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物和一种或多种其他药物，治疗、预防、控制、缓解或降低公开的化合物或其他药物可用的疾病或病况风险以及此类组合物用于制备药物的用途。本公开还涉及公开的化合物、公开的制备方法的产物、药学上可接受的盐、其水合物、其溶剂合物或其多晶型物的组合。本公开还涉及用作药物的这种组合。本公开还涉及一种产品，其包含(a)公开的化合物、公开的制备方法的产品、药学上可接受的盐、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物，和(b)另外的治疗剂，作为用于同时、单独或顺序用于治疗或预防哺乳动物(包括人)的病况的组合制备物，病况的治疗或预防受公开的化合物和另外的治疗剂的调节作用影响或促进。这种组合或产品的不同药物可以与药学上可接受的载体或稀释剂组合在单一制备物中，或者它们可以各自与药学上可接受的载体或稀释剂一起存在于单独的制备物中。使用化合物的方法[0161]在另一方面，本公开提供了治疗tau蛋白病的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的β-抑制蛋白寡聚化抑制剂。[0162]tau蛋白病是以个体的细胞、组织或体液中tau的异常水平为特征的病症。在一些情况下，tau蛋白病的特征在于在细胞、组织或液体中存在升高(高于正常)水平的tau或tau多肽和/或病理形式的tau。例如，在一些情况下，tau蛋白病的特征在于脑组织和/或脑脊液中存在升高水平的tau或tau多肽和/或病理形式的tau。细胞、组织或流体中tau的“高于正常”水平表示组织或流体中的tau水平高于正常对照水平，例如高于同一年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。参见，例如，blombergetal.(2001)“cerebrospinalfluidtaulevelsincreasewithageinhealthyindividuals”dement.geriatr.cogn.disord.12:127。在一些情况下，患有tau蛋白病的个体表现出tau蛋白病的一种或多种其他症状(例如，认知能力下降)。[0163]在其他情况下，tau蛋白病的特征在于在细胞、组织或流体中存在低于正常水平的tau蛋白。组织或流体中tau的“低于正常”水平表示细胞、组织或流体中的tau水平低于正常对照水平，例如低于同一年龄组的个体或个体群的正常对照水平。[0164]阿尔茨海默病和某些形式的额颞叶痴呆(皮克病、散发性额颞叶痴呆和额颞叶痴呆伴与17染色体连锁的帕金森氏症)是tau蛋白病的最常见形式。本公开提供了一种如上所述的治疗方法，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病、皮克病、散发性额颞叶痴呆和额颞叶痴呆伴与17染色体连锁的帕金森氏症。其他tau蛋白病包括但不限于进行性核上性麻痹(psp)，皮质基底节变性(cbd)和亚急性硬化性全脑炎。[0165]神经退行性tau蛋白病包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森病-痴呆复合体、嗜银颗粒性痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克雅氏病、拳击性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征,额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶痴呆伴与17号染色体连锁的帕金森病额、额颞叶变性,格斯特曼-施特劳斯勒-谢因克病、哈勒沃登-斯帕茨疾病、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-匹克病c型、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、皮克病、脑炎后帕金森病、朊蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生症、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结性痴呆、多发性梗塞性痴呆、缺血性中风、慢性创伤性脑病(cte)、创伤性脑损伤(tbi)和中风。公开的方面[0166]通过阅读不应与权利要求混淆的以下编号的方面，将更好地理解本公开。在某些情况下，下面描述的每个编号的方面可以与上面描述的附加方面组合。[0167]方面1.一种治疗受试者的tau蛋白病的方法，该方法包括向人类受试者施用治疗有效量的β-抑制蛋白寡聚化抑制剂。[1678]方面2.方面1的方法，其中所述tau蛋白病选自由阿尔茨海默病、皮克病、额颞叶痴呆、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、亚急性硬化性全脑炎、肌萎缩侧索硬化/帕金森-痴呆复合征、嗜银颗粒性痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、克雅氏病、拳击性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、额颞叶变性、格斯特曼-施特劳斯勒-谢因克病、哈勒沃登-斯帕茨疾病、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-匹克病c型、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、脑炎后帕金森病、朊蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生症、缠结性痴呆、多发性梗死痴呆、缺血性中风、慢性创伤性脑病、创伤性脑损伤和中风组成的组。[0169]方面3.方面2的方法，其中tau蛋白病是额颞叶变性。[0170]方面4.方面1至3中任一项的方法，其中β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是β-抑制蛋白1或β-抑制蛋白2的显性失活突变体，其阻断内源性β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2结合肌醇六磷酸(ip6)。[0171]方面5.方面1至3中任一项的方法，其中β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：其中r1是氢或烷基；ar是芳基；和当r1是烷基时，在ca处的立体化学是外消旋的，基本上是r，或基本上是s。[0172]方面6.方面5的方法，其中r1是氢。[0173]方面7.方面5或6的方法，其中ar是未取代的或取代的苯基。[0174]方面8.方面5或6的方法，其中ar是被一个或多个卤素原子取代的苯基。[0175]方面9.方面5的方法，其中r1是c1至c10烷基。[0176]方面10.方面9的方法，其中在ca处的立体化学基本上是r。[0177]方面11.方面9的方法，其中在ca处的立体化学基本上是s。[0178]方面12.方面9的方法，其中在ca处的立体化学是外消旋的。[0179]方面13.方面9至12中任一项的方法，其中ar是未取代的或取代的苯基。[0180]方面14.方面9至12中任一项的方法，其中ar是被一个或多个卤素原子取代的苯基。[0181]方面15.方面9至12中任一项的方法，其中ar是具有与环烷基稠合的苯基。[0182]方面16.方面1至3中任一项的方法，其中化合物是c1、c1a、c1b、c1c或c1e。[0183]方面17.方面1至3中任一项的方法，其中β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：其中ar是芳基。[0184]方面18.方面17的方法，其中ar是未取代的或取代的苯基。[0185]方面19.方面17的方法，其中ar是被烷基或环烷基取代的苯基。[0186]方面20.方面1至3中任一项的方法，其中化合物是c1d。[0187]方面21.方面1至3中任一项的方法，其中β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：其中r2和r3独立地为氢或烷基；和ar是芳基。[0188]方面22.方面121的方法，其中r2是氢。[0189]方面23.方面21或22的方法，其中r3是c1至c10烷基。[0190]方面24.方面21至23中任一项的方法，其中ar是未取代的或取代的苯基。[0191]方面25.方面21至23中任一项的方法，其中ar是被烷基或卤素原子取代的苯基。[0192]方面26.方面1至3中任一项的方法，其中化合物是c2e。[0193]方面27.方面1至3中任一项的方法，其中β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：其中ar1和ar2独立地是芳基；和x是ch2或c＝o。[0194]方面28.方面27的方法，其中ar1是未取代的或取代的苯基。[0195]方面29.方面27的方法，其中ar1是被烷基或卤素原子取代的苯基。[0196]方面30.方面27的方法，其中ar1是未取代的或取代的杂芳基。[0197]方面31.方面27的方法，其中ar1是未取代的或取代的哌啶基或哒嗪基。[0198]方面32.方面27至31中任一项的方法，其中ar2是未取代的或取代的苯基。[0199]方面33.方面27至31中任一项的方法，其中ar2是被烷基或卤素原子取代的苯基。[0200]方面34.方面27至31中任一项的方法，其中ar2是未取代的或取代的哌啶基。[0201]方面35.方面27至31中任一项的方法，其中ar2是被烷基或卤素原子取代的哌啶基。[0202]方面36.方面27至35中任一项的方法，其中x是ch2。[0203]方面37.方面27至35中任一项的方法，其中x是c＝o。[0204]方面38.方面1至3中任一项的方法，其中化合物是c2、c2a、c2c或c2d。[0205]方面39.方面1至3中任一项的方法，其中β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：t,etal.(1987)procnatlacadsciusa84(20):6975-6979；yamakik,etal.(1987)biochembiophysrescommun142(3):904-910)，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2普遍表达，并在脑和脾中表现出最高水平的表达。β-抑制蛋白在细胞中以三种不同的状态存在：(1)游离未结合，(2)gpcr结合，和(3)微管结合，每种都具有不同信号传导能力的潜力(hansonsm,etal.(2006)jbiolchem281(14):9765-9772；hansonsm,etal.(2007)jmolbiol368(2):375-387；nairks,etal.(2004)jbiolchem279(39):41240-41248；gaoh,etal.(2004)molcell14(3):303-317；songx,etal.(2007)jneurochem103(3):1053-1062；wun,etal.(2006)jmolbiol364(5):955-96)。先前的研究表明，β-抑制蛋白2在ad脑中增加(thathiaha,etal.(2013)natmed19(1):43-49)。此外，遗传学研究表明，内源性β-抑制蛋白2通过与将β-抑制蛋白2与aβ发病机制联系起来的γ-分泌酶复合物(27)的aph-1亚基物理相互作用来促进aβ的产生和沉积(thathiaha,etal.(2013)natmed19(1):43-49)。然而，在目前的工作之前，尚不清楚β-抑制蛋白2是否或如何在ad或没有aβ积累的ftld中致病性地影响tau蛋白病和神经变性。[0214]方法[0215]小鼠[0216]arrb2-/-、taup301s和wt小鼠都在c57bl6背景中繁殖至少三代，然后相互杂交。arrb2-/-小鼠(bohnlm,etal.(1999)science286(5449):2495-24980)和taup301s小鼠(yoshiyamay,etal.(2007)neuron53(3):337-351)之前已经得到表征。所有涉及小鼠的实验均按照institutionalanimalcareandusecommittee(iacuc)批准的方案在usfhealth进行。[0217]患者样品[0218]冷冻额叶皮层组织样品获自埃默里大学的阿尔茨海默病研究中心。使用了来自ftld-tau诊断患者(经病理证实)的样品和来自未受影响(对照)患者的样品，这些患者在性别、年龄和apoe基因型方面尽可能匹配。[0219]原代神经元培养物[0220]先前描述了原代小鼠海马和皮质神经元培养物(wooja,etal.(2019)communbiol2:112；wooja,etal.(2017)hummolgenet26(20):3973-3988；wooja,etal.(2015)celldeathdiffer22(6):1069-1070)。简而言之，从p0小鼠制备初级神经元。在hbss中分别解剖海马和皮质两者，并用胰蛋白酶消化。将神经元铺板在涂覆有聚-d-赖氨酸(sigma-aldrich,stlouis,mo,usa)的玻璃盖玻片上，并在含有glutamax(invitrogen,carlsbad,ca,usa)和b27补充剂(invitrogen,carlsbad,ca,usa)的神经基础培养基中维持，[0221]抗体和试剂[0222]抗体，针对总tau(taua10，1:1000用于western印迹，1:200用于细胞/组织染色，santacruzbiotechnology,dallas,tx,usa)、phf1(kindgiftfromdr.peterdavies,1:20,alberteinsteincollegeofmedicine)、tau-ps199/ps202(1:1000用于western印迹,1:200用于组织染色,invitrogen,carlsbad,ca,usa)、ht7(1:200用于细胞/组织染色,invitrogen,carlsbad,ca,usa)、突触素(1:200,invitrogen,carlsbad,ca,usa)、脑发育调节蛋白(1:400,abcam,cambridge,ma,usa)、肌动蛋白(1:5000,sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)、flag-m2(1:1000用于western印迹,1:200用于细胞染色,sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)、myc(1:1000,细胞信号传导,danvers,ma,usa)、ha(1:1000,细胞信号传导,danvers,ma,usa)、gfp(1:1000,细胞信号传导,danvers,ma,usa)。[0223]dna构建体、sirna、shrna慢病毒[0224]β-抑制蛋白2、β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n构建体是来自s.marullo(institutcochin,paris,france)的礼物。pcdna-β-抑制蛋白2-ha来自x.xin(上海药物研究所，中国上海)。以下是从addgene获得的：β-抑制蛋白2gfpwt质粒#35411(68)、ha-p62质粒#28027(69)、pmxs-purogfp-p62质粒#38277(itakurae&mizushiman(2011)jcellbiol192(1):17-27)、pmrfp-lc3质粒#21075(kimuras,nodat,&yoshimorit(2007)autophagy3(5):452-460)。β-抑制蛋白2on-targetplussmartpoolsirna购自dharmacon(lafayette,co,usa)。β-抑制蛋白2shrna质粒获自abm(richmond,bc,canada)。使用聚乙烯亚胺(pei)在hek293t细胞中将慢病毒载体与pvsvg和pax2共转染过夜。第二天除去培养基并用无血清培养基替换。孵育72小时后，收集培养基并离心以去除细胞碎片。通过注射器过滤器(0.2-0.45um)过滤病毒。[0225]邻近连接测定法(pla)[0226]使用市售试剂(duolink,sigma-aldrich,stlouis,mo)进行测定法，用wtβ-抑制蛋白2-flag和β-抑制蛋白2-myc，没有和有突变β-抑制蛋白2δip6c或β-抑制蛋白2δip6n构建体，来转染helav5-tau细胞。细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15min，然后用0.2％triton的tbs溶液洗涤。洗涤后，在室温下用3％正常山羊血清中的0.2％triton封闭细胞1小时。在4℃应用一抗过夜后，洗涤细胞并在37℃下与pla探针一起孵育(1h)，用缓冲液a洗涤，在37℃下与连接溶液一起孵育(30min)，用洗涤缓冲液a洗涤，与扩增溶液在37℃下孵育(100min)，并在安装前用洗涤缓冲液b洗涤。[0227]免疫细胞化学和免疫组织化学[0228]细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15min，用tbs中的0.2％triton洗涤，用3％bsa和0.1％tritonx-100封闭1hr，在4℃下用一抗孵育过夜和在室温下用荧光二抗孵育45min。对于免疫组织化学，小鼠用pbs灌注并用4％多聚甲醛固定。使用普通山羊血清封闭25微米切片1h，并在4℃下用一抗孵育过夜，然后在固定前在室温下用二抗孵育1h。使用olympusfv10i共聚焦显微镜(tokyo，japan)捕获图像，并使用imagej软件(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md)定量免疫反应性。从通过整个海马体的每第12个连续切片对免疫反应性进行定量。在icc和ihc实验中，所有比较图像均使用相同的激光强度、曝光时间和滤光片获得。对亮度/对比度的调整同样适用于所有比较图像。目标区域是随机选择的，研究人员在图像采集和定量过程中对实验条件不知。[0229]细胞裂解、免疫印迹和月桂酰肌氨酸提取[0230]用ripa缓冲液(50mmtrisph7.4、150mmnacl、2mm乙二胺四乙酸、1％np-40、0.1％十二烷基硫酸钠)加上蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解脑匀浆和培养的细胞。提取蛋白质并在4℃下以15000rpm离心15min，用5％sds和1％β-巯基乙醇、50mmtris-hclph6.8、12.5mmedta、10％甘油和0.02％溴酚蓝对ripa不溶部分进行裂解。上清液用于western印迹分析。上清液用于western印迹分析。co-ip实验是从np40裂解物或指示缓冲液中进行的，用igg珠预清除，然后用单独的igg珠或igg珠 指示抗体进行ip，用原始缓冲液进行广泛洗涤(5x)，并在sds-page上进行western印迹。如前所述(hasegawam,etal.(2007)brain130(pt5):1386-1394)进行月桂酰肌氨酸提取。简而言之，用含有10mmtris-hcl、ph7.4、0.8mnacl、10％蔗糖、1mmegta的a68缓冲液裂解脑匀浆。将样品在4℃下以400g离心20min，向收集的上清液中加入1％月桂酰肌氨酸。将样品孵育1.5h并在室温下以80,000g离心30min。将沉淀重悬于100ul的50mmtris-hcl，ph7.4中。[0231]定量实时rt-pcr[0232]使用roche96system(lifescience,sanfrancisco,ca,usa)进行定量实时rt-pcr。使用trizol试剂(invitrogen,ca,usa)从人脑或细胞系中分离总rna，逆转录(superscriptiii,invitrogen,ca,usa)，并使用sybergreenmastermix(invitrogen,ca,usa)进行定量pcr分析。使用比较阈值循环(ct)值用于计算扩增因子，并将β-抑制蛋白2的相对量归一化至gapdh。[0233]raav9的产生和立体定向注射[0234]通过在hek293细胞中共转染表达目标基因的血清型载体与paav9和pxx6产生重组raav9病毒，并如前所述进行纯化(cartyn,etal.(2010)jneuroscimethods194(1):144-153)。对于脑部注射，异氟醚麻醉的小鼠在以下坐标处用连接到10‑□l注射器(hamilton，reno，nv，usa)的26号针头双侧注射：前后2.7mm、横向2.7mm和垂直3.0mm。使用对流增强递送方法在2分钟内注射总体积2□l纯化的raav9(1x1012vg/ml)。注射后2个月处死小鼠。[0235]电生理学[0236]电生理记录如前所述进行(67)。简而言之，海马切片由3个月大的wt、taup301s、taup301s/arrb2 /-和taup301s/arrb2-/-小鼠制备，并进行输入/输出(io)曲线、配对脉冲促进(ppf)和长长期增强(ltp)记录。刺激电极放置在海马的schaffer侧支中。载有acsf的记录玻璃电极位于锥体细胞层下方的ca1辐射层。[0237]原子力显微成像[0238]在水溶液中制备具有/不具有重组β-抑制蛋白2(0.2μg)的重组p62(4μg)。样品在30μl水溶液中在rt下孵育2hr。将10μl的溶液滴注在新鲜切割的云母表面上。吸附20min后，用过滤后的蒸馏水轻轻地从云母表面洗去多余的溶液。云母在室温下放置，直到完全干燥，然后进行afm成像。具有42n/m标称弹簧常数和330khz共振频率的商用ppp-nchaud悬臂(nanosensors,switzerland)用于afm成像。[0239]重组蛋白[0240]his-taubl21由l.blair提供。将tauwt(4r0n)亚克隆到pet28a载体中并转化到bl21感受态细胞中。将his-β-抑制蛋白2转化到rosetta感受态细胞中。用蛋白酶抑制剂将细胞重新悬浮在冰冷的裂解缓冲液(tris20mm、ph8.0、nacl150mm、咪唑10mm)中。将pfast-p62-his构建体转化到dh10bac感受态细胞中。蓝白筛选后，选择dh10bac菌株以表达和扩增重组杆粒。用sf900iisfm培养基将转染bacmid(来自dh10bac感受态细胞的中提)的sf9昆虫细胞培养3天，然后收集培养基中的p1代病毒并添加到新的sf9细胞中。培养2天后，收获sf9细胞并用裂解缓冲液(tris20mm、ph7.4、nacl150mm、triton-x1001％、10mm咪唑和蛋白酶抑制剂)裂解。对细胞进行超声处理后，将细胞以14,000g离心15min，并将上清液与nisepharose一起孵育。重组蛋白用冰冷的洗脱缓冲液(tris20mm、nacl150mm、200mm咪唑)洗脱，然后在透析缓冲液(tris20mm、nacl150mm、dtt1mm)中在4度下透析过夜。[0241]统计分析和图表[0242]统计分析由prism6.0软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)使用配对或非配对学生t检验和1路或2路anova进行。anova之后是指定的事后检验。数据显示为代表性实验、均值±均值标准误差(sem)图或显示每个数据点、中位数、四分位间距(iqr)以及最大值和最小值的箱线图。[0243]结果[0244]ftld-tau患者和taup301s转基因小鼠脑中的β-抑制蛋白2水平增加[0245]比较年龄匹配的对照受试者(n＝12)和患有ftld和tau蛋白病的患者(ftld-tau，n＝10)的额叶皮层的β-抑制蛋白2的表达。与健康对照组相比，ripa可溶性β-抑制蛋白2的western印迹显示ftld-tau患者额叶皮层中的β-抑制蛋白2蛋白增加约1.8倍(图1a-1b)。同样，与非ftld-tau对照相比，qrt-pcr显示ftld-tau脑样品中β-抑制蛋白2mrna的增加相似(图1c)。还证实了ripa不溶性β-抑制蛋白2蛋白水平与ftld-tau脑中的tau水平正相关(图1d和8)。接下来，评估了taup301s转基因小鼠中β-抑制蛋白2的表达。该小鼠在神经元中过表达与疾病相关的p301stau，并表现出类似ftld的病理生理学和行为，而没有aβ积累(yoshiyamay,etal.(2007)neuron53(3):337-351)。与非转基因同窝仔相比，taup301s转基因小鼠脑中的β-抑制蛋白2蛋白和mrna显著升高(图1e-1g)。为了以不同的方式证实这些结果，对来自taup301s和野生型同窝仔猪的培养的div21原代海马神经元针对β-抑制蛋白2进行染色(图1h)。β-抑制蛋白2的定量证实了在目标细胞类型中在同质脑组织中观察到的情况(图1i)。[0246]β-抑制蛋白2增加tau稳定性[0247]接下来确定在这些tau蛋白病模型中观察到的β-抑制蛋白2增加是否可以以负(补偿)或正(疾病增强)方式调节tau。在稳定表达tau的hela细胞(v5标记的4r0ntau，称为hela-v5-tau细胞)中，转染的β-抑制蛋白2显著增加总tau和磷酸化的tau(图2a-2d)，并且β-抑制蛋白2sirna转染显著降低总tau和磷酸-tau(图2e，2f)。同样，通过免疫细胞化学成像(图2g-2i)和免疫印迹(图8a、8b)评估，与对照腺病毒(对照-ad，controladenovirus)条件相比，用β-抑制蛋白2包装的腺病毒感染taup301s皮质原代神经元也增加了总tau和磷酸-tau强度。相反，通过成像(图2j、2k)和免疫印迹(图8c、8d)评估，β-抑制蛋白2的慢病毒介导的shrna敲低降低了总tau。通过β-抑制蛋白2过表达或敲低(图8e，8f)观察到taumrna水平没有显著差别。上述研究是在没有任何gpcr激动剂的情况下进行的，重点关注β-抑制蛋白2与tau或其他伙伴相互作用以诱发表型的非受体机制。然后将tau周转作为增加的β-抑制蛋白2增加稳定状态下tau的有效水平的潜在机制进行检查。用放线菌酮处理hela-v5-tau细胞以阻断蛋白质翻译表明转染的β-抑制蛋白2显著延迟了tau的周转(图2l，2m)，这与β-抑制蛋白2通过支架蛋白稳定化tau：蛋白质相互作用一致。[0248]β-抑制蛋白2的遗传减少减轻了taup301s小鼠的tau蛋白病和突触功能障碍[0249]上述数据表明，增加的tau增加了β-抑制蛋白2，其进而通过稳定化蛋白质进一步增强tau介导的事件，因此表明恶性正致病反馈循环。这启发一个治疗攻击点，当β-抑制蛋白2得到遗传减少时，小鼠是否会表现出预期的病理表型。因此，为了评估内源性β-抑制蛋c,etal.(2007)procnatlacadsciusa104(46):18061-1806)。[0253]使用β-抑制蛋白2n-末端结构域突变体(k158a、k161a和r162a，称为β-抑制蛋白2δip6n)和c-末端结构域突变体(k232a、r234a、k252a、k326a和k328a，称为β-抑制蛋白2δip6c)来测试β-抑制蛋白2自寡聚化影响tau稳定性和tau病变的假设；通过bret和免疫共沉淀测定法来确定这些突变体不能够形成寡聚物(milanosk,etal.(2006)jbiolchem281(14):9812-9823；storezh,etal.(2005)jbiolchem280(48):40210-40215)，但仍以wt亲和力结合激活的gpcp(gaidarovi,etal.(1999)emboj18(4):871-881)。[0254]当用β-抑制蛋白2δip6c或δip6n慢病毒转导div18taup301s皮质原代神经元时，与对照相比，明显的是tau减少约50％(图4a、4b)，这代表了与作用机制和潜在的治疗策略相关的关键发现。与这些发现一致，通过免疫细胞化学评估，hela-v5-tau细胞中的yfp-β-抑制蛋白2δip6c和yfp-β-抑制蛋白2δip6n表达也导致tau的显著减少(图11a)。为了显示这些突变体作为寡聚化的显性失活，进行了邻近连接测定法(pla)，以检查在对照载体或β-抑制蛋白2δip6c或β-抑制蛋白2δip6n存在的情况下β-抑制蛋白2-flag和β-抑制蛋白2-myc之间的相互作用。实际上，β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n显著降低了β-抑制蛋白2-flag和β-抑制蛋白2-myc相互作用(图11b，11c)。这些结果证实了wtβ-抑制蛋白2在对照环境中的寡聚化，并且显示了通过表达δip6c或δip6n突变体从寡聚体中置换出wtβ-抑制蛋白2(图11b，11c)。还研究了在几个模型中使用这些突变体破坏寡聚化是否需要β-抑制蛋白2寡聚化来减缓tau周转。对β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n突变体的研究表明，在放线菌酮追踪实验中tau周转增强(图4c-4e)。为了确定β-抑制蛋白2寡聚化状态是否会改变tau聚集本身，对转染了β-抑制蛋白2变体的hela-v5-tau细胞进行了过滤捕集测定法，其中来自洗涤剂可溶性和不溶性裂解物的tau聚集体被醋酸纤维素捕获膜并通过免疫印迹进行评估。虽然去污剂可溶性裂解物显示很少或没有聚集体，但与对照载体转染细胞相比，源自β-抑制蛋白2δip6c或δip6n转染细胞的去污剂不溶性裂解物显示出显著减少的tau聚集体(图11d、11e)。[0255]β-抑制蛋白2寡聚体与p62相互作用并抑制p62自缔合[0256]过度磷酸化(因此更“有序”)的tau被认为通过自噬-溶酶体途径进行清除(dolanpj&johnsongv(2010)jbiolchem285(29):21978-21987；wonges,etal.(2008)hummolgenet17(16):2570-2582；kims,etal.(2016)scirep6:24933；krugeru,etal.(2012)neurobiolaging33(10):2291-2305；wangy,etal.(2010)neurodegenerdis7(1-3):103-107)。为了了解β-抑制蛋白2在tau稳定化和积累中的机制基础，使用已知激活自噬并促进lc3阳性自噬体的积累的溶酶体抑制剂巴弗洛霉素a来测试β-抑制蛋白2是否影响自噬。有趣的是，hela-v5-tau细胞中β-抑制蛋白2的过表达显著抑制了巴弗洛霉素a(bafa)诱导的lc3阳性斑点的增加(图5a、5b)，表明β-抑制蛋白2抑制了lc3处或上游的自噬。[0257]p62/sqstm1是一种关键的自噬货物受体，它通过将其货物(即错误折叠的tau或aβ)连接到lc3阳性自噬体来调节自噬体形成。事实上，p62与神经原纤维缠结有关(caccamoa,etal.(2017)molpsychiatry22(6):865-873；kinga,etal.(2013)actaneuropathol125(2):303-310；kuusistoe,etal.(2002)neuropatholapplneurobiol28(3):228-237；ternib,etal.(2007)actaneuropathol113(4):403-416)，并且可溶性细胞质p62水平在ad脑中显著降低(caccamoa,etal.(2017)molpsychiatry22(6):865-873；zhengx,etal.(2012)neuralregenres7(17):1304-1311)。增加的p62表达通过增强自噬诱导来改善ad动物模型中的认知障碍，p62的遗传缺失导致tau的明显积累和神经变性(caccamoa,etal.(2017)molpsychiatry22(6):865-873；zhengx,etal.(2012)neuralregenres7(17):1304-1311；rameshbabuj,etal.(2008)jneurochem106(1):107-120)。此外，最近的一项研究表明，p62表达与不溶性tau的清除有关(xuy,etal.(2019)autophagy15(4):583-598)。[0258]p62经由其n-末端pb1结构域通过自相互作用形成颗粒，这对其活性至关重要并且可观察到在细胞中不同大小的斑点(wurzerb,etal.(2015)elife4:e08941；itakurae&mizushiman(2011)jcellbiol192(1):17-27)。在用gfp-p62转染的helav5-tau细胞中，预期在巴弗洛霉素a(bafa)处理后gfp-p62斑点会增加(图5c、5d)，然而，β-抑制蛋白2的过表达显著降低了两种稳定状态下和巴弗洛霉素之后的gfp-p62斑点，使得巴弗洛霉素a不再增加gfp-p62斑点(图5c、5d)。这表明β-抑制蛋白2抑制p62颗粒从其靶底物到溶酶体的流动。为了直接检验这一假设，使用了mcherry-egfp-p62自噬流通报告子。该报告子利用了gfp对低ph的敏感性(它淬灭信号)和mcherry对低ph的不敏感性。因此，共定位的红色和绿色斑点指示处于稳定状态的非溶酶体p62。然而，在与溶酶体(自溶酶体)融合后，红色斑点会持续存在，而绿色斑点会变暗并消失(larsenkb,etal.(2010)autophagy6(6):784-793；pankivs,etal.(2007)jbiolchem282(33):24131-24145)。在用对照或β-抑制蛋白变体慢病毒和高滴度raav9mcherry-egfp-p62转导的原代神经元中，β-抑制蛋白2表达显著地降低了仅mcherry(mcherry-仅)与总斑点的比率(图5e、5f)。重要的是，β-抑制蛋白2δip6c和δip6n突变体，作为wtβ-抑制蛋白2寡聚化的显性失活，显著地增加了这种测量(图5e、5f)。因此，这些不能自寡聚化(并抑制wt-β-抑制蛋白2寡聚化)的β-抑制蛋白2突变体未能减少流通，证实了寡聚化的、非gpcr结合的β-抑制蛋白2正在起到促进tau蛋白病的观点。在hela-v5-tau细胞中观察到p62自噬流通与β-抑制蛋白2和β-抑制蛋白2δip6n的类似结果(图12a、12b)。[0259]鉴于对p62自噬流通的影响，测试了β-抑制蛋白2是否与p62物理相互作用。免疫共沉淀(co-ip)实验确实表明β-抑制蛋白2与p62形成复合物(图12c)。p62通过其n末端pb1结构域的自缔合对于其货物受体活性至关重要，通过使得其泛素化货物有更多的相互作用位点(多重结合)以及同时与多个lc3蛋白结合(wurzerb,etal.(2015)elife4:e08941；itakurae&mizushiman(2011)jcellbiol192(1):17-27)。因此，通过使用ha-p62和gfp-p62构建体的co-ip实验测试β-抑制蛋白2是否影响p62自相互作用。通过gfp-p62和ha-p62的co-ip检测到β-抑制蛋白2减少了p62自结合(图5g、5h)。鉴于β-抑制蛋白2寡聚突变体δip6c和δip6n通过减慢tau周转减少tau聚集体，接下来通过邻近连接测定法(pla)以及co-ip测试β-抑制蛋白2δip6c和δip6n突变体是否影响p62自缔合。虽然β-抑制蛋白2显著降低了ha-p62/gfp-p62复合pla信号(p62自相互作用)，但β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n均未减少ha-p62/gfp-p62pla斑点(图5i、5j)。还证实，虽然β-抑制蛋白2显著降低了ha-p62和gfp-p62相互作用，但单独的β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n通过co-ip都不能减少ha-p62和gfp-p62相互作用(图12d)。事实上，与β-抑制蛋白2相比，β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n两者与p62的相互作用要少得多(图12e、12f)。最近的研究表明，纯化的重组p62自发形成球状寡聚体(zaffagninig,etal.(2018)emboj37(5))。为了测试β-抑制蛋白2是否可以在体外直接影响p62寡聚化，用原子力显微镜观察纯化的重组p62、β-抑制蛋白2和与β-抑制蛋白2混合的p62。重组p62自发形成直径在5-100nm之间的可见球状颗粒(图5k)，而在相同条件下只有非常少的小的β-抑制蛋白2颗粒可见(图5k)。当p62与β-抑制蛋白2混合在一起时，颗粒的大小显著减小(图5k、l)，表明β-抑制蛋白2对p62自缔合的抑制降低了p62颗粒的大小。接下来测试的是巴弗洛霉素a诱导的p62斑点形成是否需要β-抑制蛋白2寡聚化。正如预期的那样，在对照载体转染的细胞中，巴弗洛霉素a(bafa)处理后gfp-p62斑点增加(图5m、5n)。然而，β-抑制蛋白2在稳定状态和巴弗洛霉素a后均显著降低了gfp-p62斑点(图5m、5n)。有趣的是，β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n转染的细胞均显示在稳定状态时增加的gfp-p62斑点，表明β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n增加了p62颗粒的流通，从而增加了自噬流通(图5m、5n)。[0260]突变体β-抑制蛋白2病毒疗法在体内抑制tau蛋白病[0261]鉴于上述结果，表明在tau蛋白病中需要β-抑制蛋白2的寡聚形式，以及不能寡聚化的突变体β-抑制蛋白2的显性失活效应，测试了β-抑制蛋白2δip6c和β-抑制蛋白2δip6n突变体是否减少体内环境中的tau蛋白病，作为一种潜在的治疗策略。产生并纯化表达gfp对照、gfp-β-抑制蛋白2δip6n和gfp-β-抑制蛋白2δip6c的高滴度(》1×1012vgml-1)raav9。然后将aav立体定向地双侧地注射到5个月大的taup301s小鼠的海马体中。注射后两个月，探测小鼠脑以检测gfp和tau。这些研究表明，与gfp对照相比，注射gfp-β-抑制蛋白2δip6n或gfp-β-抑制蛋白2δip6c明显降低了月桂酰肌氨酸不溶性tau(图6a、6c)。然而，月桂酰肌氨酸可溶性tau没有被β-抑制蛋白2突变体显著改变(图6a、6b)。此外，与表达gfp的对照或邻近的未感染神经元相比，表达gfp-β-抑制蛋白2δip6n和gfp-β-抑制蛋白2δip6c神经元显示ht7免疫反应性tau显著减少(图6d、6e)。鉴于这些突变体的显性失活效应(图4a、4b、11b、11c)，这些结果与其治疗机制一致，即有效减少taup301s小鼠中增加的内源性神经元β-抑制蛋白2的寡聚化。并且，由于注射是在5个月大时进行的，此时tau积累在顺利进行，很明显这种方法可以减少预先存在的tau缠结病理。[0262]讨论[0263]ftld代表不同的临床和病理性痴呆，但经常被误诊为ad，或以与ad相似的方式治疗。ad和ftld的病理学最明显的区别是在ftld中没有aβ积累。在其最常见的形式中，ftld-tau具有tau的积累作为尖锐的特征。鉴于tau水平(在ad中)似乎是认知缺陷的更好预测指标，ftld中的tau积累被认为也是这种疾病中神经退行性变的关键因素。几种gpcr的激动剂和拮抗剂已被提议作为ad的潜在疗法(niy,etal.(2006)natmed12(12):1390-1396；melanconbj,etal.(2013)drugdiscovtoday18(23-24):1185-1199；anguloe,etal.(2003)brainpathol13(4):440-451；mogim&horiuchim(2009)hypertensres32(9):738-740)，并鉴于tau参与ad和ftld，因此考虑了通过与大多数gpcr相关的两种β-抑制蛋白来调节gpcr信号传导的方法。人类ftld脑和tau过表达细胞中β-抑制蛋白2的增加表明，这可能是了解发病机制和定位治疗阻断点的有效方法。进一步的研究揭示了一些意想不到的发现。首先，很明显β-抑制蛋白2可以上调tau，而tau可以上调β-抑制蛋白2。这表明人类ftld脑中β-抑制蛋白2的上调是不适应的，而不是可能消除tau积累的补偿或有益事件。因此，这种影响是一个正反馈循环，一旦启动，它就会助长进一步的有害影响。此外，很明显，寡聚化的β-抑制蛋白2(不与gpcr相互作用)是tau积累的原因，这使我们在ftld的背景下检查了β-抑制蛋白2的非受体功能。值得注意的是，β-抑制蛋白2先前已被证明通过与aph-1相互作用来调节app的γ-分泌酶加工，从而正向调节aβ生成(thathiaha,etal.(2013)natmed19(1):43-49)。相同的研究表明，β-抑制蛋白2在ad脑和app转基因小鼠中显著增加(thathiaha,etal.(2013)natmed19(1):43-49)。目前的工作表明，在tau升高的细胞和小鼠中，β-抑制蛋白2升高。而且，当β-抑制蛋白2过表达时，tau水平会升高。基于taumrna水平不变，tau蛋白清除被认为是β-抑制蛋白2调节其水平的机制。数据表明β-抑制蛋白2通过削弱p62介导的自噬来降低tau清除，这是由β-抑制蛋白2的寡聚形式发挥的作用。具体来说，结果表明β-抑制蛋白2寡聚体通过阻断p62的自相互作用来增加tau水平，这是p62介导的自噬流通中必不可少的初始步骤。β-抑制蛋白2的遗传减少或消除显著降低了月桂酰肌氨酸不溶性tau并减轻了体内tau蛋白病。此外，不能形成寡聚体的β-抑制蛋白2突变体实际上减少了不溶性tau。这些作用被证明是由于这些突变体的显性失活“抗寡聚体”特性，减少了培养的模型细胞和神经元，以及体内的ftld-tau小鼠模型中的tau蛋白病。这些数据突出了β-抑制蛋白2调节tau的新机制，并提供了概念验证策略，通过靶向β-抑制蛋白2寡聚化来减轻tau蛋白病(图7)。[0264]boularan及其同事发现β-抑制蛋白2□ip6n和□ip6c突变体不形成寡聚体，但相反在定位和与gpcr及其他伙伴例如ap2、filamina、和mapk结合(和介导其内化)方面是正常的。迄今为止，之前没有研究表明寡聚β-抑制蛋白2参与p62介导的自噬。这些发现表明β-抑制蛋白2减少了p62的自相互作用、p62颗粒的数量并改变了tau清除。并且，β-抑制蛋白2δip6n和δip6c突变体的表达通过削弱wt(内源性)β-抑制蛋白2的寡聚化来增加p62的自相互作用和p62颗粒的数量。这些变化与tau的周转和不溶性tau的积累直接相关，这与p62在优先降低不溶性tau中的作用一致(xuy,etal.(2019)autophagy15(4):583-598)。此外，不溶性p62本身与神经原纤维缠结有关(caccamoa,etal.(2017)molpsychiatry22(6):865-873；kinga,etal.(2013)actaneuropathol125(2):303-310；kuusistoe,etal.(2002)neuropatholapplneurobiol28(3):228-237；ternib,etal.(2007)actaneuropathol113(4):403-416),whilesolublecytoplasmicp62levelsaresignificantlyreducedinadbrains(caccamoa,etal.(2017)molpsychiatry22(6):865-873；zhengx,etal.(2012)neuralregenres7(17):1304-1311)。增加的p62表达通过增强自噬诱导来改善ad动物模型中的认知障碍，并且sqstm1/p62的遗传缺失导致tau积累和神经变性脑(caccamoa,etal.(2017)molpsychiatry22(6):865-873；zhengx,etal.(2012)neuralregenres7(17):1304-1311；rameshbabuj,etal.(2008)jneurochem106(1):107-120)。p62自相互作用代表了p62颗粒形成的第一步，这对于p62介导的自噬至关重要。β-抑制蛋白2在这一步对p62的调节为治疗干预提供了机会。两种ip6结合突变体均增强p62自相互作用并减少不溶性tau的观察表明，虽然β-抑制蛋白2寡聚体阻断p62介导的自噬，但β-抑制蛋白2单体促进p62介导的自噬。如果是这样，β-抑制蛋白2寡聚体到单体的转变，反之亦然，可以作为一个可调节的分子开关来切换p62介导的自噬。[0265]在当前的实验中，突变的β-抑制蛋白2蛋白在减少神经元中的tau方面非常有效。在δip6n或δip6c的表达被证实(通过它们的gfp标签)的脑单个细胞中，tau水平基本上检测不到，这与具有高水平tau的其余细胞形成对比。对于人类ftld-tau的基因治疗，可能需要具有某种程度降低的这种抑制能力的突变体，以便存在某些水平的寡聚体来执行其他功能。实际上，已显示寡聚β-抑制蛋白2促进蛋白质的核质穿梭(boularanc,etal.(2007)procnatlacadsciusa104(46):18061-18066)。类似地，β-抑制蛋白2寡聚化的小分子抑制剂，用于治疗或预防ftld-tau，可以设计成避免细胞中寡聚体的完全损失。重要的是，这些策略预计不会改变神经元gpcr信号传导通路，因为β-抑制蛋白2的单体形式将被保留。基于这些发现，预计抑制β-抑制蛋白2寡聚化的作用不仅会抑制新tau缠结的发展，而且由于这种增强tau清除的机制，还可以清除现有的tau积累。因此，这种治疗策略可以通过减少现有的tau缠结来预防那些有风险或有轻度认知障碍的人，也可以治疗那些有明显ftld-tau的人。除了tau蛋白病，可以想象，这种策略也可以证明对其他具有通过p62清除的蛋白病的神经退行性疾病有益。实施例2：β-抑制蛋白1通过破坏微管稳定性和削弱p62/sqstm1介导的tau清除来驱动tau蛋白病。[0266]简介[0267]阿尔茨海默病(ad)的定义病理特征是淀粉样蛋白β(aβ)和过度磷酸化的tau在脑中的积累。多种g蛋白偶联受体(gpcr)已显示在ad发病机制中发挥不可或缺的作用(ni,y.etal.natmed(2006)12:1390-1396；abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6566-6574；abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6554-6565；thathiah,a.etal.science(2009)323:946-951；bakshi,p.,etal.acschembiol(2008)3:777-789；alley,g.m.etal.jneuroscires(2010)88:143-154；minkeviciene,r.,etal.jpharmacolexpther(2004)311:677-682；dobarro,m.,etal.intjneuropsychopharmacol(2013)16:2245-2257；wisely,e.v.,etal.hummolgenet(2014)23:4024-4034；luong,k.&nguyen,l.t.amjalzheimersdisotherdemen(2013)28:427-439；lee,h.g.etal.actaneuropathol(2004)107:365-371；lee,h.g.etal.brainres(2009)1249:244-250；sun,l.etal.febslett(2005)579:251-258)。然而，尚不清楚的是不同的gpcr如何相似地影响aβ和tau的发病机制。gpcr通过抑制蛋白支架信号传导复合物具有共同的作用机制，该复合物通过内溶酶体途径的内化和降解使gpcr脱敏(lohse,m.j.,etal.science(1990)248:1547-1550)。此外，抑制蛋白(抑制蛋白1、抑制蛋白2、抑制蛋3和抑制蛋白4)(wilden,u.,etal.procnatlacadsciusa(1986)83:1174-1178；moore,c.a.,etal.annurevphysiol(2007)69:451-482；gurevich,v.v.&gurevich,e.v.pharmacolther(2006)110:465-502)充当调节各种不同信号传统通路的多功能衔接蛋白(lefkowitz,r.j.,etal.molcell(2006)24:643-652；lefkowitz,r.jprogmolbioltranslsci(2013)118:3-18)。虽然抑制蛋白1和抑制蛋白4仅与少数受体(视紫红质和颜色视蛋白)结合并在特定细胞类型中表达(shinohara,t.etal.procnatlacadsciusa(1987)84:6975-6979；yamaki,k.,etal.biochembiophysrescommun(1987)142:904-910)，抑制蛋白2(β-抑制蛋白1)和抑制蛋白3(β-抑制蛋白2)在脑和脾脏中表现出最高的表达，但也普遍表达(lohse,m.j.,etal.science(1990)248:1547-1550；attramadal,h.etal.jbiolchem(1992)267:17882-17890)。[0268]微管相关蛋白tau(mapt)在许多神经退行性疾病中发挥重要作用(goedert,m.,etal.procnatlacadsciusa(1988)85:4051-4055；vonbergen,m.etal.jbiolchem(2001)276:48165-48174；lashley,t.,etal.neuropatholapplneurobiol(2015)41:858-881)，并且tau的致病物质形成神经毒性聚集体，其与tau蛋白病的人类和动物模型中认知缺陷和神经变性相关(wang,y.&mandelkow,e.natrevneurosci(2016)17:5-21；ward,s.m.,etal.biochemsoctrans(2012)40:667-671；patterson,k.r.etal.jbiolchem(2011)286:23063-23076)。因此，减少致病性tau代表了有吸引力的治疗策略。[0269]有趣的是，β-抑制蛋白1(liu,x.etal.cellres(2013)23:351-3650)和β-抑制蛋白2(thathiah,a.etal.natmed(2013)19:43-49)在ad脑中显著增加，并通过与β-分泌酶亚基aph-1相互作用在促进aβ产生中发挥重要作用(liu,x.etal.cellres(2013)23:351-365；thathiah,a.etal.natmed(2013)19:43-49)，从而将β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2与aβ发病机制联系起来。最近的一项研究表明，额颞叶变性(ftld-tau)患者的β-抑制蛋白2也增加，并且β-抑制蛋白2的遗传减少显著减轻了体内tau病变。[0270]然而，不知道β-抑制蛋白1是否以及如何促成tau蛋白病的病理进展。此外，尚不清楚gpcr刺激对tau蛋白病的影响是否需要β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2。在这项研究中，发现β-抑制蛋白1在额颞叶变性-tau(ftld-tau)患者中显著增加，这是一种退行性疾病，定义为缺乏aβ沉积物的tau蛋白病，升高的β-抑制蛋白1通过两种不同的机制促进体外和体内的tau积累和tau蛋白病。此外，已证实β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2均介导gpcr对tau蛋白病的刺激作用。因此，减少β-抑制蛋白1或β-抑制蛋白2足以阻断gpcr刺激对tau蛋白病的影响。β-抑制蛋白2通过削弱自噬流通来增加致病性tau。在这里，通过证明β-抑制蛋白1不仅诱导tau从微管解离，而且抑制tau诱导的微管组装，进一步确定了tau蛋白病中β-抑制蛋白1的分子机制基础。此外，发现β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2具有共同的机制，通过阻断自噬货物受体p62来促进致病性tau的聚集。事实上，β-抑制蛋白1的遗传减少明显恢复了突触功能障碍，并显著减轻了体内taup301s转基因小鼠的tau蛋白病。[0271]结果[0272]β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2是mglur2和β2ar介导的致病性tau中增加所必需的[0273]迄今为止，两种gpcr与tau磷酸化和积累有关：β2-肾上腺素能受体(β2ar)(dobarro,m.,etal.intjneuropsychopharmacol(2013)16:2245-2257；wisely,e.v.,etal.hummolgenet(2014)23:4024-4034；luong,k.&nguyen,l.t.amjalzheimersdisotherdemen(2013)28:427-439)和代谢型谷氨酸受体2(mglur2)(lee,h.g.etal.actaneuropathol(2004)107:365-371；lee,h.g.etal.brainres(2009)1249:244-250)。与对照相比，ad脑的额叶皮层和海马中的β2ar显著增加(kalaria,r.n.etal.jneurochem(1989)53:1772-1781；kalaria,r.n.&harik,s.i.neuroscilett(1989)106:233-238)。遗传学研究表明，β2ar中的多态性与发生散发性ad的风险较高有关(rosenberg,p.b.etal.amjgeriatrpsychiatry(2008)16:883-892；yu,j.t.etal.brainres(2008)1210:216-222)，并且β2ar的遗传减少显著减轻了体内tau蛋白病(wisely,e.v.,etal.hummolgenet(2014)23:4024-4034)。经典的β2ar激动剂异丙肾上腺素明显增加tau磷酸化，从而诱导大鼠的记忆缺陷(sun,l.etal.febslett(2005)579:251-258)。mglur2在ad中也显著增加，并且mglur2表达与过度磷酸化的tau沉积密切相关(lee,h.g.etal.actaneuropathol(2004)107:365-371；lee,h.g.etal.brainres(2009)1249:244-250)。据报道，mglur2激动剂ly-379,628通过erk激活增加tau磷酸化(lee,h.g.etal.brainres(2009)1249:244-250)。基于这些先前的观察，目标是在taup301s转基因原代神经元和稳定表达tau的hela细胞(v5标记的4r0ntau、hela-v5-tau细胞)中确认这些发现。正如预期的那样，10μm异丙肾上腺素(iso)处理显著增加了taup301s皮质初级神经元中的磷酸-tau(图21a、21b)。10μmly-379,628处理还增加了taup301s皮质神经元中的磷酸-tau(图21c、21d)。[0274]目前，尚不清楚不同的gpcr，例如β2ar和mglur2，以及它们的激动剂如何改变tau磷酸化。这些gpcr之间的下游信号传导的一个共同点是β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2，它们最初是根据其使gpcr(包括β2ar)内化和脱敏的功能被鉴定和表征的(lohse,m.j.etal.jbiolchem(1992)267:8558-8564)和mglur2(iacovelli,l.etal.molpharmacol(2009)75:991-1003)。为了测试β2ar介导的tau调节是否需要β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2，用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染hela-v5-tau细胞并用媒介物或10μmiso处理。虽然iso预期会增加对照sirna转染的细胞中的tau磷酸化，但β-抑制蛋白1sirna转染的细胞未能对iso作出应答，表明β-抑制蛋白1是iso诱导的磷酸-tau增加所必需的(图13a、13b)。有趣的是，还发现β-抑制蛋白1sirna显著降低了总tau水平(图13a、13b)。接下来，评估了mglur2介导的tau磷酸化是否需要β-抑制蛋白1。ly-379,268处理增加了磷酸-tau；然而，sirna介导的β-抑制蛋白1敲低再次导致对ly-379,268的应答失败，因此无论是否使用ly-379,268处理，总的和磷酸-tau水平均同样降低(图13c、13d)。接下来，用对照sirna或β-抑制蛋白2sirna转染hela-v5-tau细胞，并用媒介物、10μmiso或ly-379,268处理。正如预期的那样，iso和ly-379,268处理均增加了tau磷酸化；然而，sirna介导的β-抑制蛋白1敲低未能增加tau磷酸化(图13e、13f)。这些数据表明，mglur2和β2ar介导的致病性tau增加需要β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2两者。[0275]ftld-tau中升高的β-抑制蛋白1和与致病性tau(at8)共定位[0276]β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2介导响应gpcr刺激的致病性tau增加的发现促使我们评估ftld-tau患者中的β-抑制蛋白1水平。与对照受试者相比，ftld-tau患者额叶皮层中的β-抑制蛋白2水平显著增加。然而，尚未检查β-抑制蛋白1水平。因此，与对照受试者的额叶皮层(n＝12)相比，在ftld-tau患者(n＝10)中评估了β-抑制蛋白1水平。有趣的是，与对照受试者(n＝12)相比，ftld-tau脑(n＝10)在ripa可溶性提取物(图14a、14b)和ripa不溶性提取物(图14c、14d)显示β-抑制蛋白1的》50％增加。有趣的是，不溶性β-抑制蛋白1的水平密切反映了ftld-tau中不溶性tau的水平，因此通过线性回归分析，不溶性β-抑制蛋白1和tau水平与r2＝0.4874的系数显著相关(图14e，14f)，表明脑中β-抑制蛋白1和tau之间存在功能联系。为了评估β-抑制蛋白1和tau之间的空间关系，接下来对ftld-tau额叶回针对磷酸-tau(at8抗体：ps202/pt205-tau)和β-抑制蛋白1进行染色。令人惊讶的是，at8 tau聚集体和β-抑制蛋白1的共聚焦图像几乎完美共定位(图14g)，如以1微米为增量的z堆叠图像所证实的(图14g)。尽管在相同切片中显著存在β-抑制蛋白1染色(图22a)，而仅二抗染色未显示任何免疫反应性(图22b)但证实了对照脑中不存在at8 tau病理学。[0277]β-抑制蛋白1促进原代神经元中致病性tau的积累[0278]鉴于β-抑制蛋白1在ftld-tau患者中显著增加，接下来评估的是内源性β-抑制蛋白1是否增加了tau水平。用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染hela-v5-tau细胞。如免疫印迹所示，β-抑制蛋白1消耗显著降低tau(图13a、13c、23a、23b)。为了证实这些结果在神经元中的相关性，在taup301s海马原代神经元中使用慢病毒介导的shrna敲低β-抑制蛋白1。与对照shrna转导的神经元相比，β-抑制蛋白1shrna转导的taup301s神经元显示神经元细胞体和过程中tau的免疫反应性显著降低约50％(图15a、15b)。还证实，通过western印迹，β-抑制蛋白1shrna转导的taup301s皮质原代神经元表现出显著降低的tau水平(图15c、15d)。随着ftld-tau中β-抑制蛋白1水平的增加，接下来要确定的是增加的β-抑制蛋白1是否会反过来提高tau水平。hela-v5-tau细胞中β-抑制蛋白1(β-arr1)的瞬时转染显著增加了总tau约50％(图15e、15f)和磷酸-tau近2倍(图15e、15g)。这些结果共同表明，β-抑制蛋白1不仅增加并与ftld-tau脑中的致病性tau共定位，而且β-抑制蛋白1介导的tau调节是稳定状态和gpcr(β2ar和mglur2)激动剂诱导的tau增加的基础。[0279]β-抑制蛋白1的遗传减少缓解体内tau蛋白病[0280]上述数据显示增加的β-抑制蛋白1增加tau并且减少的β-抑制蛋白1减少tau。因此，接下来评估的是减少内源性β-抑制蛋白1对体内tau蛋白病的生理影响。将半合子taup301s转基因小鼠与β-抑制蛋白1 /(arrb1 /-)小鼠杂交以产生taup301s和taup301s；arrb1 /-小鼠。taup301s小鼠在4个月大时开始表现出tau蛋白病，其逐渐恶化(yoshiyama,y.etal.neuron(2007)53:337-351)。首先进行免疫组织化学以检测来自7个月大的taup301s和taup301s；arrb1 /-同窝仔的海马体的磷酸-tau(ps199/202)。实际上，与taup301s同窝仔相比，taup301s/arrb1 /-小鼠表现出磷酸-tau免疫反应性降低了约60％(图16a、16b)。使用月桂酰肌氨酸提取物进一步证实了这一发现。与免疫组织化学结果一致，与taup301s同窝仔相比，taup301s/arrb1 /-中的月桂酰肌氨酸不溶性的tau显著减少了约40％(图16c、16e)。与taup301s同窝仔相比，taup301s/arrb1 /-中的月桂酰肌氨酸可溶性tau也显著降低了约40％(图16c、16d)。[0281]β-抑制蛋白1的遗传减少挽救了taup301s小鼠的功能性突触缺陷[0282]taup301s小鼠的初始表征证明在6个月大时受损的配对脉冲促进(ppf)和长期增强(ltp)(yoshiyama,y.etal.neuron(2007)53:337-351)。后来的研究表明，taup301s小鼠即使在3个月大时也表现出明显的ltp缺陷(woo,j.a.etal.hummolgenet(2017)26:3973-3988；woo,j.a.etal.communbiol(2019)2:112)。为了评估突触可塑性的功能变化，对4个月大的野生型、taup301s和taup301；arrb1 /-小鼠的急性脑切片的ca3-ca1schaffer侧支通路进行电生理记录。初始输入-输出(io)分析表明wt、taup301s、taup301s/arrb1 /-同窝仔切片之间没有显著差异(图16f)。在ppf实验中，与野生型切片相比，在所有刺激间隔中观察到taup301s切片中fepsp斜率的显著降低，这在早期刺激间隔中更加突出(图16g)，这与先前报道的相似(woo,j.a.etal.hummolgenet(2017)26:3973-3988；woo,j.a.etal.communbiol(2019)2:112)。在taup301s；arrb1 /-切片中，与taup301s相比，在20-120ms范围的刺激间隔pff明显更强，表明部分挽救。与野生型切片相比，使用θ爆发刺激的长期增强(ltp)记录显示taup301s切片在ltp的诱导和维持方面受到严重损害(图16h)。然而，与taup301s同窝同伴相比，taup301s/arrb1 /-切片显示出显著恢复的ltp，几乎达到野生型切片的水平(图16h)。这些功能性突触可塑性结果在针对突触素染色的成熟div21原代海马神经元中得到证实。具体而言，taup301s海马原代神经元(对照gfp转导的)与野生型神经突(对照gfp转导的)相比，在原代神经突中表现出显著降低的突触素免疫反应性。相反，用β-抑制蛋白1-shrna-gfp转导的taup301s神经元显著恢复突触素免疫反应性，接近野生型对照水平(图16i，16j)[0283]β-抑制蛋白1促进tau从微管中解离并抑制tau诱导的微管组装[0284]tau是稳定化微管的微管相关蛋白(cleveland,d.w.,etal.jmolbiol(1977)116:207-225)。然而，在包括ad在内的tau蛋白病中，tau首先从微管解离，从体轴突错误定位到体树突区室(ballatore,c.,etal.natrevneurosci(2007)8:663-672；biernat,j.&mandelkow,e.m.molbiolcell(1999)10:727-740)并逐渐变得不溶以最终形成丝状聚集体(alonso,a.d.,etal.procnatlacadsciusa(1997)94:298-303)。抑制蛋白在细胞中以三种不同的状态存在：(1)游离未结合，(2)gpcr结合，和(3)微管结合，每种都具有不同的信号传导能力(hanson,s.m.etal.jmolbiol(2007)368:375-387；gao,h.etal.molcell(2004)14:303-317；song,x.,etal.jneurochem(2007)103:1053-1062)。具体来说，β-抑制蛋白1直接与微管结合并募集mdm2和erk2(hanson,s.m.etal.jmolbiol(2007)368:375-387；gurevich,v.v.&gurevich,e.v.currprotocpharmacol(2014)67,unit21011-19)。因此，首先评估了β-抑制蛋白1与微管的结合是否会改变tau与微管的结合。因此，使用重组蛋白进行微管结合实验。将1μg重组his-tau(4r)与纯化的微管加bsa对照或重组β-抑制蛋白1一起孵育30分钟。孵育后，将样品以100,000g离心。上清液含有微管未结合的蛋白质，沉淀含有微管结合的蛋白质。值得注意的是，β-抑制蛋白1显著降低了与微管沉淀结合的tau量约45％，同时增加了上清液中游离tau的量(图17a、17b)。β-抑制蛋白1对tau与微管结合的抑制作用是剂量依赖性的，因为增加β-抑制蛋白1的量逐渐减少与微管结合的tau(图17c)。接下来，评估了β-抑制蛋白1是否会在体外改变tau诱导的微管组装。正如预期的那样，单独的微管蛋白表现出时间依赖性聚合成微管，这随着重组tau的添加而大大加速(图17d)。然而，与tau一起添加β-抑制蛋白1完全抑制了tau诱导的微管组装加速(图17d)。与单独的微管蛋白相比，单独添加β-抑制蛋白1与微管蛋白也弱降低了微管蛋白聚合，表明β-抑制蛋白1/微管蛋白结合可能在微管组装中具有较小的抑制作用。[0285]为了确定是否可以在细胞中观察到β-抑制蛋白1在体外tau依赖性微管组装中的这种抑制作用，用对照sirna或β-抑制蛋白1sirna转染hela-v5-tau细胞。转染后，用诺考达唑处理细胞30min，这诱导微管的快速分解(woo,j.a.etal.communbiol(2019)2:112)。30分钟后，洗掉含有诺考达唑的培养基，让细胞恢复1小时。在诺考达唑处理后，在对照或β-抑制蛋白1sirna转染条件下，针对微管蛋白的染色都显得高度杂乱无章(图17e)。在诺考达唑洗掉1小时后，微管的重新组装很容易看到，如核周区域中显著的丝状微管染色所见，与对照sirna转染的细胞相比，在β-抑制蛋白1sirna转染的细胞中显著增加了近3倍(图17e、17f)。因此，转染细胞和体外的这些结果表明β-抑制蛋白1促进tau从微管中解离，这既抑制微管组装，又使tau错配。[0286]β-抑制蛋白1不改变taumrna，但通过破坏p62自相互作用和阻碍p62流通来增加tau稳定性[0287]尽管tau从微管的解离解除了微管动力学的调控，并且对于tau错配和聚集是必需的(wang,y.&mandelkow,e.natrevneurosci(2016)17:5-21)，但是这种机制并不能轻易解释继发于β-抑制蛋白1增加的总tau增加。因此，通过taumrna的qrt-pcr测试了β-抑制蛋白1是否改变taumrna水平。然而，在β-抑制蛋白1过表达或敲低后，没有观察到taumrna的变化(图18a、18b)。接下来评估的是内源性β-抑制蛋白1是否会改变tau周转。事实上，放线菌酮(chx)追踪实验表明β-抑制蛋白1sirna显著促进了tau的周转(图18c、18d)，表明内源性β-抑制蛋白1通过增加其稳定性来增强tau水平。[0288]多项研究表明，微管不稳定会损害自噬体成熟和自噬介导的蛋白质降解(fass,e.,etal.jbiolchem(2006)281:36303-36316；aplin,a.,etal.jcellphysiol(1992)152:458-466)，因为将自噬体递送至溶酶体需要基于微管的运输(farfel-becker,t.etal.cellrep(2019)28:51-64e54；boecker,c.a.&holzbaur,e.l.curropinneurobiol(2019)57:94-101)。为了通过自噬清除错误折叠的蛋白质，自噬货物受体例如p62/sqstm1必须首先隔离货物并将多泛素化货物与lc3 自噬体连接，然后将它们共同递送至溶酶体进行融合和降解(katsuragi,y.,etal.febsj(2015)282:4672-4678；pankiv,s.etal.jbiolchem(2007)282:24131-24145)。由于β-抑制蛋白1将tau从微管中置换出来，使微管不稳定并增加tau稳定性，最初假设β-抑制蛋白1介导的微管去稳定化可能会破坏p62向lc3 自噬体的递送，从而增加tau稳定性。hela-v5-tau细胞用gfp-p62与对照载体或β-抑制蛋白1一起转染，并用媒介物或诺考达唑处理细胞30分钟。在对照载体转染的细胞中，存在不同大小的gfp-p62斑点(绿色)，而内源性lc3(品红色)被观察为小斑点染色(图18e)。gfp-p62通常与lc3共定位(白色斑点)(图18e)。正如所料，诺考达唑处理显著降低了载体对照转染的细胞中gfp-p62与内源性lc3阳性斑点的共定位(图18e，18f)。然而，β-抑制蛋白1过表达细胞在稳定状态下显示出惊人的强大破坏gfp-p62与lc3共定位，其程度相当于诺考达唑处理(图18e、18f)。因此，对β-抑制蛋白1表达细胞的诺考达唑处理没有进一步破坏gfp-p62/lc3共定位(图18e、18f)。这表明β-抑制蛋白1介导的微管去稳定化与诺考达唑处理一样严重(不太可能)，或者其他因素可能在p62-lc3共定位的这种强烈破坏中起作用。为了以不同的方式检查lc3和p62，β-抑制蛋白1对lc3和gfp-p62斑点的影响在有或没有巴弗洛霉素a1处理的情况下进行了评估，巴弗洛霉素a1是一种有效的溶酶体抑制剂，已知可促进lc3和p62斑点两者的积累(yamamoto，a.etal.cellstructfunct(1998)23:33-42；mauvezin,c.&neufeld,t.p.autophagy(2015)11:1437-1438；yoshimori,t.,etal.jbiolchem(1991)266:17707-17712)。helav5-tau细胞中β-抑制蛋白1的过表达不仅降低了稳定状态的lc3斑点，而且还显著减弱了巴弗洛霉素a1诱导的lc3斑点的增加(图24a、24b)，表明β-抑制蛋白1在lc3或上游水平上阻断了自噬。同样，β-抑制蛋白1的过表达也降低了稳定状态的gfp-p62斑点，并显著减弱了巴弗洛霉素a1诱导的gfp-p62斑点的增加(图18g，18h)。此外，虽然巴弗洛霉素a处理显著增加了载体对照转染的细胞中gfp-p62与lc3的共定位，但β-抑制蛋白1转染显著减弱了gfp-p62/lc3共定位的增加(图18g、18i)，共同表明β-抑制蛋白1在p62或上游水平阻断自噬，可能不直接在lc3上。[0289]p62与神经原纤维缠结相关(king,a.etal.actaneuropathol(2013)125:303-310；kuusisto,e.,etal.neuropatholapplneurobiol(2002)28:228-237)，和ad脑中可溶性细胞质p62水平显著降低(caccamo,a.,etal.molpsychiatry(2017)22:865-873；zheng,x.etal.neuralregenres(2012)7:1304-1311)。增加的p62表达通过增强自噬诱导来改善ad动物模型中的认知障碍(caccamo,a.,etal.molpsychiatry(2017)22:865-873；zheng,x.etal.neuralregenres(2012)7:1304-1311；rameshbabu,j.etal.jneurochem(2008)106:107-120)。为了进一步研究β-抑制蛋白1诱导的p62变化，使用mcherry-gfp-p62报告子评估p62流通。该报告子利用gfp(绿色)的敏感性和mcherry(对洋红色的伪着色)对低ph的不敏感性，从而可以跟踪p62向溶酶体的流通(pankiv,s.etal.jbiolchem(2007)282:24131-24145；larsen,k.b.etal.autophagy(2010)6:784-793)。因此，完美共定位的mcherry和gfp(白色或浅绿色)表示非溶酶体lc3。然而，在与酸化溶酶体(自溶酶体)融合后，mcherry斑点持续存在，而gfp斑点消失(因此只有洋红色)。hela-v5细胞与mcherry-gfp-p62与对照sirna或β-抑制蛋白1sirna共转染，并定量总mcherry gfp斑点(白色/浅绿色)和仅mcherry(洋红色)斑点。正如所料，巴弗洛霉素a(bafa)处理增加了载体对照(veh)转染的细胞中的总mcherry gfp斑点(图18j、18k)。然而，β-抑制蛋白1sirna转染的细胞在稳定状态下显示出显著增加的总mcherry gfp斑点，并且巴弗洛霉素a处理没有显著进一步增加该测量值(图18j、18k)。与对照sirna转染的细胞相比，β-抑制蛋白1sirna中酸化的仅mcherry(mcherry-only)(品红色)斑点在总p62斑点中的百分比增加了约2倍，几乎所有这些都被4h巴弗洛霉素a处理所消除，表明β-抑制蛋白1的缺失促进了p62流通(图18j、18l)。在来自hela-v5-tau细胞的免疫共沉淀(co-ip)实验中，β-抑制蛋白1与ha-p62形成特异性复合物(图24c)，表明β-抑制蛋白1可能通过物理相互作用直接改变p62活性。为了质疑这种可能性，利用了p62通过其n末端pb1结构域由自相互作用形成颗粒的已知能力，这允许形成以头尾构型排列的p62螺旋丝(ciuffa,r.etal.cellrep(2015)11:748-758)，这是一个对其货物受体活性至关重要的步骤(wurzer,b.etal.elife(2015)4:e08941；itakura,e.&mizushima,n.jcellbiol(2011)192:17-27)。因此，测试了β-抑制蛋白1/p62相互作用是否会改变p62使用ha-p62和gfp-p62构建体形成自相互作用复合物的能力。观察到ha-p62免疫复合物中gfp-p62的特异性存在，在ha免疫复合物中类似量的ha-p62被拉下的条件下，其由于β-抑制蛋白1过表达显著降低了》60％(图18m、18n)。因此，这些结果表明增加的β-抑制蛋白1，如在ftld-tau和ad的脑中所见，强烈阻断p62的自相互作用，这是p62介导的货物(包括错误折叠的tau)清除所需的初始步骤(caccamo,a.,etal.molpsychiatry(2017)22:865-873；zheng,x.etal.neuralregenres(2012)7:1304-1311；rameshbabu,j.etal.jneurochem(2008)106:107-120；wurzer,b.etal.elife(2015)4:e08941；itakura,e.&mizushima,n.jcellbiol(2011)192:17-27)。[0290]方法[0291]患者样品[0292]从emoryadrc(p50ag025688)获得病理证实的ftld-tau和年龄匹配的非痴呆对照的额叶皮层组织样品。[0293]动物模型[0294]在该研究中使用了以下小鼠品系：wtc57bl/6、taup301s和arrb1 /-小鼠。c57bl/6j(jacksonlaboratoryline000664)、taup301s(jacksonlaboratoryline008169)和arrb1-/-(jacksonlaboratoryline011131)均获自jackson实验室。arrb1-/-小鼠(abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6554-6565)和taup301s(yoshiyama,y.etal.neuron(2007)53:337-351)小鼠已得到表征。小鼠在无病原体条件下饲养，所有涉及小鼠的实验均按照南佛罗里达大学的institutionalanimalcareandusecommittee(iacuc)批准的方案进行。[0295]原代神经元培养物[0296]原代神经元获自出生后第0天的小鼠。在冷的hbss中解剖皮质和海马体，并用0.25％胰蛋白酶进行消化。如前所述(woo,j.a.etal.natcommun(2017)8:15558)，将神经元铺板在涂有聚d-赖氨酸的平板或盖玻片上，并用glutamax和b27补充剂维持在神经基底培养基中。[0297]dna转染、构建体和sirna[0298]pcdna3β-抑制蛋白1-ha(addgene,14693)(luttrell,l.m.etal.science(1999)283:655-661)、pcdna3β-抑制蛋白1-flag(addgene,14687)(luttrell,l.m.etal.science(1999)283:655-661)、pmxs-purogfp-p62(addgene,38277)(itakura,e.&mizushima,n.jcellbiol(2011)192:17-27)获自addgene。获得了β-抑制蛋白1-gfp和β-抑制蛋白1-myc构建体。β-抑制蛋白1on-targetplussmartpoolsirna购自dharmacon。用lipofectamine2000和opti-mem瞬时转染dna构建体和sirna。[0299]重组蛋白[0300]pfast-tau-his、pfast-β-抑制蛋白1-his构建体被转化到dh10bac感受态细胞中。蓝白筛选后，选择dh10bac菌株以表达重组杆粒。用bacmid转染的sf9昆虫细胞用sf900iisfm培养基培养3天，然后收集培养基中的p1代病毒并添加到新的sf9细胞中。培养2天后，收获sf9细胞并用裂解缓冲液(tris20mm，ph7.4、nacl150mm、triton-x1001％、10mm咪唑和蛋白酶抑制剂)裂解。以12,000g离心15分钟后，收集上清液并在4℃下用gehealthcarenisepharose摇动1小时。琼脂糖上的结合蛋白用冰冷的裂解缓冲液洗涤3次，重组蛋白用冰冷的洗脱缓冲液(tris20mm、nacl150mm、200mm咪唑)洗脱，然后在透析缓冲液(tris20mm、nacl150mm，dtt1mm)在4℃对蛋白质透析过夜。[0301]sds-page和western印迹[0302]用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在ripa缓冲液(1％np-40、0.1％十二烷基硫酸钠、50mmtrisph7.4、150mmnacl、2mm乙二胺四乙酸)中裂解小鼠脑提取物或细胞。用bca测定法平衡蛋白质浓度后，将裂解物与4xlds样品缓冲液混合并加载到sds-page凝胶上。在室温下用含5％牛奶的tbs-t封闭膜1小时。封闭后，用指定的一抗在4℃下探测膜过夜，并在室温下与辣根过氧化物酶连接的二抗孵育2-4小时。[0303]免疫沉淀[0304]用带有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的chaps缓冲液(30mmtris-clph7.5、150mmnacl、1％chaps)裂解细胞。平衡蛋白质浓度后，将裂解物与igg珠预孵育1小时，并用chaps缓冲液进行洗涤。裂解物在4℃下与指定的一抗和igg珠一起孵育过夜，然后用4xlds样品缓冲液洗脱蛋白质，煮沸用于随后的sds-page和western印迹。[0305]月桂酰肌氨酸不溶性和可溶性提取[0306]月桂酰肌氨酸提取如前所述进行(woo,j.a.etal.communbiol(2019)2:112)。简而言之，用含有10mmtris-hcl，ph7.4、0.8mnacl、10％蔗糖、1mmegta的a68缓冲液裂解脑匀浆。样品在4℃下以400g离心20min。离心后，向上清液中加入1％月桂酰肌氨酸。将样品孵育1小时30分钟并在室温下以80,000g离心30min。将沉淀重新悬浮在100ul的50mmtris-hcl，ph7.4中并进行sds-page。[0307]微管蛋白聚合测定法[0308]使用微管蛋白聚合测定法试剂盒(cytoskeletoninc.,denver,co,usa)通过在340nm处的吸光度读数测量微管蛋白聚合。微管蛋白在0.5mmegta、2mmmgcl2、1mmgtp、80mmpipesph6.9中的浓度为3mg/ml，总聚合体积为100μl。[0309]微管结合测定法[0310]微管结合测定法通过微管结合蛋白降速测定法试剂盒(cytoskeletoninc.,denver,co,usa)进行。长度在5-10μm之间的稳定微管用于测定法。将稳定的微管与重组蛋白一起孵育后，微管相关蛋白在100,000×g被拉下。[0311]免疫荧光[0312]用冰冷的pbs洗涤细胞并在室温下用4％多聚甲醛进行固定。固定后，用tbs中的0.2％triton洗涤细胞。用pbs灌注小鼠并用4％多聚甲醛进行固定。用tbs中的0.2％triton洗涤25μm切片。洗涤后，在室温下用3％正常山羊血清和0.1％tritonx-100封闭细胞和组织切片1小时，并与指定的一抗在4℃下孵育过夜。用pbs洗涤3次后，将细胞和组织切片与二抗在室温下孵育45min。使用olympusfv10i共聚焦显微镜(tokyo,japan)或zeisslsm880共聚焦显微镜(germany)获得图像。使用imagej软件(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)对免疫反应性进行定量。所有比较图像均以相同的激光强度和曝光时间获得。研究人员在图像采集和量化过程中对实验条件不知。[0313]β-抑制蛋白1shrna慢病毒的产生[0314]β-抑制蛋白1shrna质粒获自abm(richmond,bc,canada)。使用聚乙烯亚胺(pei)在hek293细胞中将慢病毒载体与pvsvg和pax2共转染过夜。第二天除去培养基并用无血清培养基替换。孵育72小时后，收集培养基并离心以去除细胞碎片。通过注射器过滤器(0.2-0.45μm)过滤病毒。[0315]电生理学[0316]电生理记录如所述进行(woo,j.a.etal.hummolgenet(2017)26:3973-3988；woo,j.a.etal.communbiol(2019)2:112；woo,j.a.,etal.celldeath&differentiation(2015)2015feb20)。简而言之，从4个月大的wt、taup301s和taup301s/arrb1 /-小鼠制备脑切片。测量输入/输出(io)曲线、成对脉冲促进(ppf)和长时程增强(ltp)。[0317]定量实时rt-pcr[0318]使用roche96system(lifescience,sanfrancisco,ca,usa)进行定量实时rt-pcr。使用trizol试剂(invitrogen，ca，usa)分离总rna后，将总rna逆转录并使用sybergreenmastermix(invitrogen，ca，usa)进行定量pcr分析。比较阈值循环(ct)值用于计算放大因子，并将tau的相对量归一化至gapdh。[0319]统计分析和数据呈现[0320]统计分析由graphpadprism7.0软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)使用配对或非配对学生t检验和具有指定事后检验的1路或2路anova进行。数据显示为代表性实验。箱线图和须线图代表所有数据点，平均值为±s.e.m。p《0.05被认为具有统计学意义。[0321]讨论[0322]先前的研究已经涉及ad发病机制中的多个gpcr途径(ni,y.etal.natmed(2006)12:1390-1396；abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6566-6574；abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6554-6565；thathiah,a.etal.science(2009)323:946-951；bakshi,p.,etal.acschembiol(2008)3:777-789；alley,g.m.etal.jneuroscires(2010)88:143-154；minkeviciene,r.,etal.jpharmacolexpther(2004)311:677-682；dobarro,m.,etal.intjneuropsychopharmacol(2013)16:2245-2257；wisely,e.v.,etal.hummolgenet(2014)23:4024-4034；luong,k.&nguyen,l.t.amjalzheimersdisotherdemen(2013)28:427-439；lee,h.g.etal.actaneuropathol(2004)107:365-371；lee,h.g.etal.brainres(2009)1249:244-250；sun,l.etal.febslett(2005)579:251-258),includingβar2(dobarro,m.,etal.intjneuropsychopharmacol(2013)16:2245-2257；wisely,e.v.,etal.hummolgenet(2014)23:4024-4034；luong,k.&nguyen,l.t.amjalzheimersdisotherdemen(2013)28:427-439；kalaria,r.n.etal.jneurochem(1989)53:1772-1781；kalaria,r.n.&harik,s.i.neuroscilett(1989)106:233-238)andmglur2(lee,h.g.etal.actaneuropathol(2004)107:365-371；lee,h.g.etal.brainres(2009)1249:244-250)。然而，尚不清楚不同类别的gpcr如何相似地作用于影响ad发病机制。[0323]由于β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2最初是基于其通过激动剂诱导的受体内化和脱敏来终止gpcr信号传导的能力而被鉴定和命名的(lohse,m.j.,etal.science(1990)248:1547-1550；wilden,u.,etal.procnatlacadsciusa(1986)83:1174-1178；moore,c.a.,etal.annurevphysiol(2007)69:451-482；gurevich,v.v.&gurevich,e.v.pharmacolther(2006)110:465-502)，第一个目标是确定β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2是否代表β2ar和mglur2激动剂改变tau磷酸化的共同收敛点。研究结果表明，β-抑制蛋白1或β-抑制蛋白2的缺失消除了β2ar或mglur2激动剂增加磷酸-tau的能力，表明β-抑制蛋白1/2是对于gpcr介导的tau调节的收敛的重要节点。尽管仍有待确定是否有其他ad牵连的gpcr(即adrb、gpr3、at2r、cxcr2等)(abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6566-6574；abdalla,s.etal.jbiolchem(2009)284:6554-6565；thathiah,a.etal.science(2009)323:946-951；bakshi,p.,etal.acschembiol(2008)3:777-789)需要β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2的致病活性，这些初步观察使我们检查ftld-tau患者的脑中β-抑制蛋白1水平的变化。有趣的是，先前的研究报道了β-抑制蛋白1(liu,x.etal.cellres(2013)23:351-365)和β-抑制蛋白2(thathiah,a.etal.natmed(2013)19:43-49)在ad患者的脑中显著增加，并且β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2两者与□‑分泌酶复合物的aph-1亚基相互作用以增加aβ产生，从而将β-抑制蛋白1/2与aβ发病机制联系起来。ftld-tau患者的脑中β-抑制蛋白2显著升高，并且在没有gpcr刺激的情况下，增加的β-抑制蛋白2促进tau聚集。如本文所公开，ftld-tau患者的脑中β-抑制蛋白1水平高度升高，这表明β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2两者在ad和ftd患者的脑中均升高。尚未研究β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2水平是否在衰老过程中增加。此外，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2是否有助于其他神经退行性疾病的进展，例如肌萎缩侧索硬化症(als)和帕金森病，需要加以利用。[0324]ftld-tau患者的脑中β-抑制蛋白1水平也高度升高，这是一种病理上由缺乏aβ沉积物的tau蛋白病定义的疾病(irwin,d.j.etal.actaneuropathol(2015)129:469-491)表明ad病理学中的tau而非aβ组分是提高脑中β-抑制蛋白1水平所必需的。此外，观察到不溶性tau水平与不溶性β-抑制蛋白1水平密切相关，并且at8阳性磷酸-tau聚集体与β-抑制蛋白1几乎完美共定位，这表明ftld-tau中β-抑制蛋白1和tau发病机制之间存在功能性致病关系。[0325]上述发现使我们假设增加的β-抑制蛋白水平促进tau积累和tau蛋白病，而降低的β-抑制蛋白水平抵消原代神经元和体内的这种表型。事实上，通过β-抑制蛋白1过表达和rnai介导的沉默实验在原代神经元中证实了这一假设。在体内，β-抑制蛋白1的遗传减少不仅减轻了taup301s转基因小鼠的tau蛋白病，而且也在功能上挽救了taup301s急性切片和神经元中突触可塑性(即ppf和ltp)和突触完整性中的显著缺陷。因此，这些研究结果表明，致病性tau积累通过尚不清楚的机制上调β-抑制蛋白1，这进而又通过在进行性发病机制的不适应正反馈循环中增加β-抑制蛋白1而进一步驱动tau蛋白病。因此，观察到β-抑制蛋白1的50％减少缓解tau蛋白病和相关的突触功能障碍，这证明了β-抑制蛋白1代表了一个可行的治疗阻断点以打破这种致病性前馈循环。然而，由于本研究中未使用纯合β-抑制蛋白1无效突变体，因此仍有待确定完全不存在β-抑制蛋白1是否在tau蛋白病的情况下提供进一步的益处。[0326]tau的主要生物学功能归因于其结合和稳定化微管以及促进其组装的能力(cleveland,d.w.,etal.jmolbiol(1977)116:207-225)。然而，在ad和其他tau蛋白病中，tau与微管解离，导致其从体轴突错配到体树突区(ballatore,c.,etal.natrevneurosci(2007)8:663-672；biernat,j.&mandelkow,e.m.molbiolcell(1999)10:727-740；hoover,b.r.etal.neuron(2010)68:1067-1081)。该事件发生在疾病过程的早期，被认为是其过度磷酸化和自组装成聚集体所必需的(wang,y.&mandelkow,e.natrevneurosci(2016)17:5-21)。由于大量β-抑制蛋白1直接与微管结合(hanson,s.m.etal.jmolbiol(2007)368:375-387；gurevich,v.v.&gurevich,e.v.currprotocpharmacol(2014)67,unit21011-19)，与微管结合的β-抑制蛋白1显示以剂量依赖性方式促进tau从微管中解离，从而在体外和转染的细胞中有效抑制tau介导的微管组装。β-抑制蛋白1的这种作用让人想起肌动蛋白结合蛋白丝切蛋白(cofilin)从微管中置换tau、抑制tau诱导的微管组装和促进tau病变的方式(woo,j.a.etal.communbiol(2019)2:112)。有趣的是，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2结合丝切蛋白并支架与丝切蛋白激活磷酸酶chronophin的相互作用以增强丝切蛋白激活(zoudilova,m.etal.jbiolchem(2007)282:20634-20646；zoudilova,m.etal.jbiolchem(2010)285:14318-14329)。β-抑制蛋白2与丝切蛋白的相互作用还在激活的丝切蛋白易位至树突棘以调节脊柱形态中起重要作用(pontrello,c.g.etal.procnatlacadsciusa(2012)109:e442-451)。然而，β-抑制蛋白1在缺乏丝切蛋白的纯化重组蛋白环境中抑制tau微管结合和tau诱导的微管组装。因此，β-抑制蛋白1的这种抑制作用本身不需要丝切蛋白，并支持以下观点，即β-抑制蛋白1从微管(有或没有丝切蛋白)中置换tau的能力有助于tau错误定位和随后自组装成聚集体的倾向。[0327]微管动力学和自噬机制在细胞中，特别是在神经元中错综复杂地联系在一起，因为在远端神经突或轴突中形成的自噬体必须与在体细胞中相对富集的成熟溶酶体结合在一起(lee,s.,etal.jneurosci(2011)31:7817-7830；maday,s.,etal.jcellbiol(2012)196:407-417；cheng,x.t.,etal.autophagy(2015)11:1434-1436；wang,t.etal.jneurosci(2015)35:6179-6194)。因此，这种空间差异需要基于微管的自噬体和溶酶体在相对较长的距离上的运输。实际上，受损的微管动力学破坏自噬清除(fass,e.,etal.jbiolchem(2006)281:36303-36316；aplin,a.,etal.jcellphysiol(1992)152:458-466；farfel-becker,t.etal.cellrep(2019)28:51-64e54；boecker,c.a.&holzbaur,e.l.curropinneurobiol(2019)57:94-101)，并且自噬的缺陷导致ad发病机制(nixon,r.a.etal.jneuropatholexpneurol(2005)64:113-122；yang,d.s.etal.amjpathol(2008)173:665-681；sanchez-varo,r.etal.actaneuropathol(2012)123:53-70)通过促进aβ和tau的积累(caccamo,a.,etal.molpsychiatry(2017)22:865-873；zheng,x.etal.neuralregenres(2012)7:1304-1311；rameshbabu,j.etal.jneurochem(2008)106:107-120；xu,y.,etal.autophagy(2019)15:583-598)。观察到β-抑制蛋白1不改变taumrna但增加tau蛋白的稳定性，最初的重点是p62-lc3自噬机制，因为基于微管的转运促进了p62结合的货物与lc3 自噬体的接近(lee,s.,etal.jneurosci(2011)31:7817-7830；maday,s.,etal.jcellbiol(2012)196:407-417；cheng,x.t.,etal.autophagy(2015)11:1434-1436；wang,t.etal.jneurosci(2015)35:6179-6194)。此外，β-抑制蛋白2破坏p62介导的tau清除。因此，假设β-抑制蛋白1可以抑制p62介导的tau清除，因为它们以78％的序列同一性共有多种生物学功能。[0328]p62/sqstm1敲除小鼠表现出严重的神经变性以及过度磷酸化的tau和神经原纤维缠结(rameshbabu,j.etal.jneurochem(2008)106:107-120)，并且p62过表达强烈降低转染的细胞中和体内的致病性tau(xu,y.,etal.autophagy(2019)15:583-598)。单独的β-抑制蛋白1过表达与诺考达唑处理(有效的微管去稳定剂)一样有效地破坏在稳态下p62-lc3的共定位，这表明β-抑制蛋白1在去稳定化微管(这不太可能)或也导致这种强大破坏的其他机制与诺考达唑一样有效。事实上，β-抑制蛋白1降低lc3和p62斑点两者并显著减弱巴弗洛霉素诱导的lc3和p62斑点两者积累的发现表明β-抑制蛋白1在p62本身或上游水平抑制自噬。p62流通和co-ip实验证实β-抑制蛋白1在p62水平上抑制自噬，因为β-抑制蛋白1不仅阻碍p62流通，而且与p62结合并干扰p62自缔合，这是形成p62体的必要步骤(ciuffa,r.etal.cellrep(2015)11:748-758)。p62通过其n末端pb1结构域的这种自缔合对于其货物受体活性至关重要，通过使得能够与其泛素化的货物建立更强的连接(多重结合)以及同时与多个lc3蛋白结合(wurzer,b.etal.elife(2015)4:e08941；itakura,e.&mizushima,n.jcellbiol(2011)192:17-27)，这有助于解释β-抑制蛋白1过表达导致的p62斑点丢失。此外，货物结合的p62通过增强lc3向其活性脂化形式lc3-ii的转化来促进自噬体的形成(cha-molstad,h.etal.natcommun(2017)8:102)，这可能解释观察到β-抑制蛋白1过表达也降低lc3斑点并降低p62-lc3共定位。β-抑制蛋白1与p62结合并干扰p62自寡聚化以及微管的不稳定化的这种机制与观察到的β-抑制蛋白1在阻碍p62流通和损害错误折叠tau的清除中的作用一致。[0329]迄今为止，没有先前的研究表明β-抑制蛋白1与tau蛋白病、微管动力学或p62介导的自噬有关。这些发现共同表明β-抑制蛋白1参与了微管的不稳定化、促进tau错误定位以及抑制p62介导的tau清除。除了本研究中发现的这些活性之外，β-抑制蛋白1还促进在体内的aβ产生和沉积(liu,x.etal.cellres(2013)23:351-365)。因此，靶向β-抑制蛋白1代表了有希望的治疗干预点，可以同时减轻aβ和tau发病机制。尽管β-抑制蛋白1-/-小鼠在心脏中表现出对β-肾上腺素能受体刺激的脱敏受损，但它们大体上正常、有生育能力，并且没有表现出任何身体或行为异常(conner,d.a.etal.circres(1997)81:1021-1026)。因此，降低β-抑制蛋白1水平或活性可能是减轻包括ad在内的tau致病性疾病的有益策略。实施例3：药理抑制剂[0330]β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2形成同源和异源寡聚体，肌醇六磷酸(ip6)促进这些寡聚体。因此，在一些实施方案中，β-抑制蛋白寡聚化抑制剂是阻断ip6结合从而减少β-抑制蛋白2的寡聚化的分子，例如肽。在一些实施方案中，寡聚化抑制剂是β-抑制蛋白突变体，其作为β-抑制蛋白1和/或β-抑制蛋白2的同源-异源寡聚化的显性失活。[0331]所提供的数据还表明，用于β-抑制蛋白寡聚化的药理学抑制剂可以代表一种可以减轻ad和tau蛋白病的有希望的治疗策略。因此，使用ftmap分析进行分子对接筛选以筛选阻断β-抑制蛋白2和β-抑制蛋白2之间界面的数百万种化合物。使用基于细胞的测定法测试了大约30种预测的抑制性化合物，产生了一些减少致病性tau的小分子化合物及其类似物。接下来，我们测试了这些减少致病性tau的抑制剂是否也消除了β-抑制蛋白2的寡聚化。免疫共沉淀、荧光共振能量转移(fret)和邻近连接测定法(pla)数据表明，这些化合物确实阻断了β-抑制蛋白2的寡聚化。[0332]图24a至24d显示β-抑制蛋白2寡聚化突变体损害β-抑制蛋白1同源寡聚体和β-抑制蛋白1/β-抑制蛋白2异源寡聚体。hela-v5-tau细胞与载体对照或β-抑制蛋白2寡聚化突变体(δip6c或δip6n)与β抑制蛋白1-gfp β抑制蛋白1-myc或β抑制蛋白2-myc一起共转染。然后使用针对gfp和myc的抗体对细胞进行邻近连接测定法(pla)，以检测β抑制蛋白1同源寡聚体(图24a、24b)和β抑制蛋白1/β抑制蛋白2异源寡聚体和dapi染色(图24c、24d)(斑点)。结果显示β-抑制蛋白2寡聚化突变体(δip6c或δip6n)显著降低β抑制蛋白1同源寡聚体(图24a、24b)以及β抑制蛋白1/β抑制蛋白2异源寡聚体(n＝4，1路anova，事后dunnett's，#p《0.0001)。仅接受1个探针或排除一抗的细胞显示没有红色pla斑点(阴性对照)。[0333]图25显示了用于筛选阻断β-抑制蛋白寡聚化和减少病理性tau的化合物的工作流程。基于β-抑制蛋白2的晶体结构，我们对可以对接在β-抑制蛋白2三聚体结合界面上的数百万种化合物进行了电脑模拟计算筛选。然后对前30种化合物测试其降低病理性tau的能力。然后对下表中提供的降低tau的化合物(由molport合成)测试其阻断β-抑制蛋白2寡聚化的能力：[0334]图26显示c1和c2化合物降低tau水平hela-v5-tau细胞用10μm潜在的β-抑制蛋白2寡聚化抑制剂处理6小时并进行western印迹。c1和c2显著降低hela-v5-tau细胞中的总tau水平(n＝4，1路anova，事后dunnett's，**p《0.005，***p《0.0005)。[0335]图27a和27b显示c1和c2化合物减少致病性tau。图27a显示用20μm的o1、cl或c2化合物处理6小时的hela-v5-tau细胞，并进行月桂酰肌氨酸可溶性和不溶性分级。c1和c2显著降低hela-v5-tau细胞中的月桂酰肌氨酸不溶性tau水平。(n＝4，1路anova，事后dunnett's，**p《0.005，***p《0.0005)。图27b显示源自tau-p301s小鼠的div21海马原代神经元用20μm的o1、c1或c2化合物处理6小时，并针对ht7(人总tau)染色。c1和c2显著降低ht7免疫反应性(n＝3，1路anova，事后dunnett's，*p《0.05，***p《0.0005。[0336]图28a和28b显示化合物c2和c2抑制β-抑制蛋白2寡聚化。用gfp-β抑制蛋白2和flag-β抑制蛋白2转染hela-v5-tau细胞并用20μm的o1、c1或c2处理6小时。图28a显示使用针对gfp和flag(m2)的抗体来检测gfp-β抑制蛋白2/flag-β抑制蛋白2复合物的邻近连接测定法(pla)显示β抑制蛋白2寡聚化的显著降低(n＝3，1路anova，事后dunnett's，*p《0.05,***p《0.0005)。仅包含1个pla探针作为阴性对照显示没有pla红色斑点。图28b显示了对gfp-β抑制蛋白2/flag-β抑制蛋白2复合物进行裂解和免疫共沉淀(co-ip)的细胞，表明c1和c2化合物将β抑制蛋白2自相互作用降低到与单独的抗小鼠igg珠相似的背景水平。[0337]图29显示化合物c2抑制β抑制蛋白2寡聚化。用cfp-β抑制蛋白2和yfp-β抑制蛋白2转染hela-v5-tau细胞并用媒介物或20μmc2处理30min。通过fret测定法来检测β抑制蛋白2寡聚化，显示c2化合物而不是媒介物将cfp降低到yfpfret信号。[0338]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和引用它们的材料通过以引用方式特别地并入。[0339]本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施例的许多等效物。这些等效物旨在被以下权利要求所涵盖。当前第1页12当前第1页12