一种体液免疫系统再生的方法及其应用

技术特征：
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码runx1基因、hoxa9基因和lhx2基因的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码runx1基因、hoxa9基因和lhx2基因的核苷酸序列采用编码2a肽的核苷酸序列进行串联连接；优选地，所述2a肽包括t2a、p2a、e2a或f2a中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述表达载体上，编码runx1基因的核苷酸序列、编码hoxa9基因的核苷酸序列和编码lhx2基因的核苷酸序列顺次连接，且所述编码runx1基因的核苷酸序列和编码hoxa9基因的核苷酸序列之间采用p2a核苷酸序列进行连接，所述编码hoxa9基因的核苷酸序列和编码lhx2基因的核苷酸序列之间采用t2a核苷酸序列进行连接。3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1或2所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为多能干细胞，包括诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系；优选地，所述多能干细胞包括基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系。4.一种体液免疫系统再生的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将如权利要求1或2所述的表达载体整合到多能干细胞中，并进行抗性克隆化筛选；(2)将步骤(1)所得的多能干细胞定向分化为诱导生血内皮；(3)将步骤(2)所述诱导生血内皮与骨髓基质细胞共培养，得到b谱系种子细胞；(4)将步骤(3)所述b谱系种子细胞转至动物模型中，分化产生b细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将所述表达载体整合到多能干细胞的位点包括rosa26位点、aavs1位点、ccr5位点、h11位点、col1a1位点或tigre位点；优选地，步骤(1)所述整合的方法包括同源重组、crispr/cas9、talen、转染或病毒感染中的任意一种或至少两种的组合，优选为同源重组；优选地，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素b；优选地，步骤(2)所述定向分化的方法为：依次采用d0培养基、d2.5培养基和d6培养基培养所述多能干细胞，得到所述诱导生血内皮；优选地，步骤(3)所述骨髓基质细胞包括op9-dl1细胞、op9-dl4细胞、op9细胞、ms5细胞、ms5-dl1细胞、ms5-dl4细胞、hs-5细胞、hs-5-dl1细胞、hs-5-dl4细胞、msc细胞、msc-dl1细胞、msc-dl4细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，步骤(3)所述共培养的过程中采用强力霉素进行诱导；优选地，步骤(3)所述共培养的方法为：将所述诱导生血内皮与op9-dl1细胞采用d11培养基进行共培养，得到所述b谱系种子细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，优选地，所述d0培养基为含有3～8ng/ml骨形态发生蛋白4的基础分化培养基；优选地，所述d2.5培养基为含有3～8ng/ml骨形态发生蛋白4和3～8ng/ml血管内皮生长因子的基础分化培养基；优选地，所述d6培养基为含有10～30ng/ml白介素3、10～30ng/ml白介素6、10～30ng/ml干细胞因子、10～30ng/ml fms样酪氨酸激酶3配体和1～2μg/ml强力霉素的基础分化培养基；
优选地，所述基础分化培养基为含有10～20％胎牛血清、180～220μg/ml铁饱和转铁蛋白、4
×
10-4
～5
×
10-4
m硫代甘油、1～3mm glutamax
tm-i添加剂和30～70μg/ml抗坏血酸的imdm培养基；优选地，所述d11培养基为含有10～30ng/ml白介素3、10～30ng/ml干细胞因子、10～30ng/ml fms样酪氨酸激酶3配体、1～2μg/ml强力霉素、10～20％胎牛血清、180～220μg/ml铁饱和转铁蛋白、4
×
10-4
～5
×
10-4
m硫代甘油、1～3mm glutamax
tm-i添加剂和30～70μg/ml抗坏血酸的α-mem培养基。7.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述分化产生的b细胞包括b220

b细胞和/或cd19

b细胞；优选地，所述分化产生的b细胞包括pro-b细胞、pre-b细胞、b1细胞、b2细胞或浆细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述b1细胞包括b1a细胞和/或b1b细胞；优选地，所述b2细胞为滤泡b细胞和/或边缘区b细胞。8.如权利要求4～7任一项所述的方法制备得到的b谱系种子细胞或b细胞。9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的表达载体、权利要求3所述的宿主细胞、权利要求8所述的b谱系种子细胞或b细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。10.如权利要求9所述的药物组合物在制备增强免疫响应的药物、预防和/或治疗疾病的药物、b细胞免疫疗法治疗肿瘤的药物、b细胞疫苗或b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物中的应用；优选地，所述增强免疫响应的药物包括增强b细胞免疫响应和/或t细胞免疫响应的药物；优选地，所述预防和/或治疗疾病的药物包括预防和/或治疗b细胞免疫缺陷、感染性疾病、肿瘤的药物；优选地，所述b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物包括预防和/或治疗自身免疫病、基因遗传性疾病的药物；优选地，所述b细胞分泌治疗性蛋白包括抗体；优选地，所述基因遗传性疾病包括血友病、溶酶体贮积症、低磷酸酯酶症或苯丙酮尿症中的任意一种或至少两种的组合。

技术总结
本发明提供了一种体液免疫系统再生的方法及其应用。所述方法中多能干细胞表达RUNX1基因、HOXA9基因和LHX2基因，在体外诱导分化后可高效获得B细胞种子，移植后可以在体液免疫系统缺失的动物体内再生完备的体液免疫系统，是一种高效的体液免疫系统再生的方法，能够实现抗原特异性抗体免疫应答，针对抗原产生特异性高亲和力抗体，并产生免疫记忆。同时，所述方法重建的免疫系统安全，未见致瘤性风险。未见致瘤性风险。未见致瘤性风险。


技术研发人员：王金勇 张琪 吴冰燕 胡房晓 翁启童 彭欢 王瑶 刘丽娟 刘晓飞 夏成祥 耿阳 吴红玲
受保护的技术使用者：中国科学院广州生物医药与健康研究院
技术研发日：2022.03.10
技术公布日：2022/12/1