一种新型冠状病毒疫苗多肽及其纳米乳制剂在预防新冠野毒株和突变株感染中的应用

1.本发明涉及多肽药物和多肽疫苗领域，具体地，涉及新型冠状病毒多肽疫苗、多肽组合物及其纳米乳制剂在预防新冠野毒株和突变株感染中的应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)在世界范围大规模传播，其不受控的流行严重威胁着全球公共卫生安全和经济发展，开发并应用安全、经济和高效的新冠疫苗以达成群体免疫，是阻遏疫情的根本途径。
3.现有的新冠疫苗主要采取以下技术路线：减毒活疫苗、灭活疫苗、重组病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗和核酸疫苗。这些疫苗技术路线目前主要为针对sars-cov-2野毒株设计。
4.然而新冠肺炎疫情的持续失控，病毒在快速传播的同时也在快速进化，目前已有多种病毒突变株出现并流行，包括d614g突变、n501.v1(b.1.1.7)突变株、n501.v2(b.1.351)突变株和p.1突变株等。一些突变株已表现出对现有疫苗和中和抗体药物的免疫逃逸，例如研究显示，科兴的灭活疫苗coronavac针对b.1.1.7突变株的抗体有显著下降，而辉瑞和阿斯利康的新冠疫苗对b.1.351突变株的中和活性下降8-9倍。新冠病毒的快速突变可能导致已开发的疫苗产品接种后难以预防新冠病毒突变株的感染，从而难以实现群体免疫控制新冠疫情。
5.因此，目前急需开发安全、高效、经济且可应对新冠病毒突变的第二代新冠疫苗，以最低经济代价实现大规模生产供给世界范围人民的疫苗接种需求，应对突变株的流行，实现世界范围群体免疫，有效控制新冠疫情。


技术实现要素：

6.本发明目的就是提供一种新型冠状病毒多肽疫苗及其疫苗纳米乳制剂，该疫苗可在接种者中产生阻断型的抗sars-cov-2抗体，并可应对sars-cov-2野毒株和突变株感染。
7.在本发明的第一方面，提供了一种新型冠状病毒肺炎的疫苗多肽，所述的疫苗多肽具有衍生自sars-cov-2野毒株和突变株的s蛋白的氨基酸序列；
8.所述的疫苗多肽选自下组：
9.(a)具有seq id no:1-15中任一所示的氨基酸序列的多肽；
10.(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
11.在另一优选例中，所述的“基本相同的功能”指所述的衍生多肽具有基本相同的激发细胞免疫和体液免疫反应的免疫原性，以及可诱导灵长动物产生野生型rbd特异性的结合抗体和阻断野生型和/或突变型rbd与ace2结合的中和抗体。
12.在另一优选例中，所述的sars-cov-2突变株包括但不限于d614g突变株、突变株
b.1.1.7、突变株b.1.351、突变株p.1和突变株b.1.617。
13.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可诱导灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。
14.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可诱导灵长动物产生野生型rbd特异性的结合抗体和阻断野生型rbd与ace2结合的中和抗体。
15.在另一优选例中，所述的野生型rbd为sars-cov-2野毒株的s蛋白的受体结合结构域。
16.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生突变的rbd特异性的结合抗体和阻断突变的rbd与ace2结合的中和抗体。
17.在另一优选例中，所述的突变的rbd为sars-cov-2突变株的s蛋白的受体结合结构域。
18.在另一优选例中，所述的突变的rbd为在野生型rbd基础上发生了一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或一个或多个氨基酸缺失所形成的突变rbd蛋白。
19.在另一优选例中，所述的突变的rbd发生的突变包括但不限于以下的一种或多种：k417n、k417t、n439k、l452r、y453f、s447n、e484q、e484k和n501y。
20.在另一优选例中，所述的疫苗多肽免疫灵长动物后的抗血清可阻断sars-cov-2野毒株侵入细胞。
21.在另一优选例中，所述的疫苗多肽免疫灵长动物后的抗血清可阻断sars-cov-2突变株侵入细胞。
22.在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物(如猴)。
23.在另一优选例中，所述疫苗多肽的长度为8-100个氨基酸，较佳地10-80个氨基酸。
24.在另一优选例中，所述的疫苗多肽为人工合成的或重组的疫苗多肽。
25.在另一优选例中，所述的疫苗多肽的结构如式ⅰ所示：
26.x1-x-x2
ꢀꢀꢀ
(ⅰ)，
27.式中，
28.(a)x为核心片段,其中，所述的核心片段的序列选自seq id no:1-15(见表a)中的一个或多个；
29.(b)x1、x2各自独立地为无、1、2或3个氨基酸，且x1和x2的氨基酸个数总和≤4，较佳地，3、2、1，更佳地为0或1；
30.(c)
“‑”
表示肽键、肽接头、或其他连接子(即x1与x之间和/或x与x2之间，以肽键、肽接头(如1-15个氨基酸构成的柔性接头)或其他连接子相连)。
31.在另一优选例中，所述疫苗多肽选自表a：
32.表a疫苗多肽
[0033][0034]
其中，seq id no:3和5中的“c(c)”表示肽链上的半胱氨酸与另一个非肽链上的半胱氨酸形成二硫键。
[0035]
具体地，pss的主链上的半胱氨酸的巯基与一个半胱氨酸的巯基形成二硫键结构，其结构和示意图见图1。
[0036]
lpss(也称为lp67-1)中主链上的3个半胱氨酸的巯基分别与半胱氨酸的巯基形成二硫键结构，其结构和示意图见图2。
[0037]
在另一优选例中，seq id no:6、7和8所示的三种疫苗多肽被组合使用，其中，seq id no:6-8中的任何一种、二种或三种还可基于sars-cov-2的变异情况，及时引入相应的突变位点(例如图19中所示的落于seq id no:6-8序列中的突变位点)，从而形成能够及时应对sars-cov-2的变异株(或突变株)，从而提高本发明疫苗对突变株的保护力。
[0038]
一种代表性的更适合应对突变株的疫苗多肽集合(或组合)包括：seq id no:9、10和11所示的疫苗多肽(分别引入了突变株的突变氨基酸)。
[0039]
此外，本发明对应于野生型病毒株的如eq id no:6、7和8所示的一种或多种疫苗多肽，也可与对应于突变株的一种或多种疫苗多肽(如seq id no:9、10和11所示的疫苗多肽)进行组合，形成例如seq id no:9、7和11所示的疫苗多肽集；或seq id no:9、10和8所示的疫苗多肽集。
[0040]
在另一优选例中，x1、x2各自独立地为无、k、c、g、l、a。
[0041]
在另一优选例中，x1为无、k、或c。
[0042]
在另一优选例中，x2为无、k、或c。
[0043]
在另一优选例中，所述疫苗多肽具有sars-cov-2s蛋白的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位。
[0044]
在另一优选例中，所述疫苗多肽具有sars-cov-2s蛋白rbd区的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位。
[0045]
在另一优选例中，所述疫苗多肽具有sars-cov-2s蛋白rbm区的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位。
[0046]
在另一优选例中，所述疫苗多肽具有sars-cov-2s蛋白ntd区的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位。
[0047]
在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有至少一个t细胞表位，较佳地1、2、3或4个t细胞表位，更佳地1或2个t细胞表位。
[0048]
在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有至少一个b细胞表位，较佳地1、2、3或4个b细胞表位，更佳地1或2个b细胞表位。
[0049]
在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有1-2个t细胞表位和0-2个b细胞表位，较佳地1-2个t细胞表位和0-1个b细胞表位。
[0050]
在本发明的第二方面，提供了一种分离的肽集合，所述的肽集合包括至少两种的本发明第一方面所述的新型冠状病毒肺炎的疫苗多肽。
[0051]
在另一优选例中，所述的肽集合中至少含有2-15种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种)所述的疫苗多肽。
[0052]
在另一优选例中，所述的肽集合包括选自下组的疫苗多肽：
[0053]
(z1)选自seq id no:1和12中的1或2种疫苗多肽，和选自seq id no:2-5中的1、2、3或4种疫苗多肽；
[0054]
(z2)选自seq id no:6和9中的1或2种疫苗多肽，选自seq id no:7和10中的1或2种疫苗多肽，和选自seq id no:8和11中的1或2种疫苗多肽；
[0055]
(z3)选自seq id no:1-12中的一种或多种(如1、2、3、4或5种)疫苗多肽，和选自seq id no:13-15中的1、2或3种疫苗多肽。
[0056]
在另一优选例中，所述的肽集合包括选自下组的疫苗多肽(或由自下组的疫苗多肽构成)：
[0057]
(s1)seq id no:1所示的疫苗多肽，和选自seq id no:2所示的疫苗多肽；
[0058]
(s2)选自seq id no:1和12中的1或2种疫苗多肽，和选自seq id no:2-5中的1、2、3或4种疫苗多肽，并且所述肽集合至少包括选自seq id no:3、4、5和12的一种或多种疫苗多肽；
[0059]
(s3)seq id no:6、7和8所示的疫苗多肽；
[0060]
(s4)seq id no:9、10和11所示的疫苗多肽；
[0061]
(s5)seq id no:6、10和11所示的疫苗多肽；
[0062]
(s6)seq id no:9、7和11所示的疫苗多肽；
[0063]
(s7)seq id no:9、10和8所示的疫苗多肽；
[0064]
(s8)seq id no:2、9、10和11所示的疫苗多肽；
[0065]
(s9)seq id no:2、6、7和8所示的疫苗多肽。
[0066]
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的新型冠状病毒肺炎的疫苗多肽或本发明第二方面所述的肽集合和药学上可接受的载体。
[0067]
在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
[0068]
在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。
[0069]
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂，所选用的佐剂包括但不限于铝盐、titermax、乳剂、脂质体、病毒载体。
[0070]
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
[0071]
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
[0072]
在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
[0073]
在本发明的第四方面，提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含本发明第一方面所述的新型冠状病毒肺炎的疫苗多肽或第二方面所述的肽集合或第三方面所述的药物组合物，所述的疫苗制剂优选纳米乳制剂。
[0074]
在另一优选例中，所述的疫苗制剂包含以角鲨烯、乳化剂为基础的纳米乳剂。
[0075]
在另一优选例中，所述角鲨烯来源于鲨鱼肝脏，所述乳化剂是磷脂，聚山梨酯80，或者是聚山梨酯80和磷脂的组合，及蔗糖酯、柠檬酸脂肪酸甘油酯类、脂肪酸甘油脂类、脂肪酸山梨坦类、环糊精、聚氧乙烯脂肪酸酯类等的一种或多种。
[0076]
在另一优选例中，所述的疫苗制剂包含0-20％的其他注射剂型中可接受的原辅料。所述的疫苗佐剂组合物包含α-生育酚，所述α-生育酚用量不超过15wt％；所述的疫苗佐剂组合物包含嵌段共聚物，所述嵌段共聚物可为甲氧基聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物、甲氧基聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸、泊洛沙姆中的一种或多种，含量不超过5％；还含有等渗调节剂，所述的等渗调节剂为0.1-8％(w/w)；所述的疫苗佐剂组合物还含有ph调节剂，所述的ph调节剂不超过1％(w/w)。
[0077]
在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的新型冠状病毒肺炎的疫苗多肽或第二方面所述的肽集合或第三方面所述的药物组合物或第四发明所述的制剂的用途，用于制备预防冠状病毒sars-cov-2野毒株和突变株感染或其相关疾病的药物。
[0078]
在另一优选例中，所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
[0079]
在另一优选例中，所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病为新型冠状病毒肺炎(covid-19)。
[0080]
在本发明的第六方面，提供了一种细胞制剂，所述的细胞制剂包括(a)用本发明第一方面所述的疫苗多肽或本发明第二方面所述的肽集合免疫激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
[0081]
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：树突状细胞、自然杀伤细胞nk、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、或其组合。
[0082]
在另一优选例中，所述的激活为体外激活。
[0083]
在另一优选例中，所述的体外激活包括：在所述的疫苗多肽存在下，培养所述的免
疫细胞一段时间(如6-48小时)，从而获得经免疫激活的免疫细胞。
[0084]
在另一优选例中，所述的细胞制剂为含活细胞的液态制剂。
[0085]
在另一优选例中，所述的细胞制剂通过静脉给药方式回输。
[0086]
在本发明的第七方面，提供了一种产生针对冠状病毒sars-cov-2野毒株和突变株的免疫反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的疫苗多肽、第二方面所述的肽集合、第三方面所述的药物组合物、或第四方面所述的制剂。
[0087]
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
[0088]
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。
[0089]
在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对冠状病毒sars-cov-2野毒株和突变株的中和抗体。
[0090]
在另一优选例中，所述中和抗体阻断冠状病毒sars-cov-2野毒株和突变株与人ace2蛋白的结合。
[0091]
在本发明的第八方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括载体蛋白以及与所述融合蛋白融合的本发明第一方面所述的疫苗多肽。
[0092]
在另一优选例中，所述的融合蛋白具有式ⅲa或ⅲb结构：
[0093]
p1-p2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ⅲa)
[0094]
p2-p1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ⅲb)
[0095]
式中，p1为本发明第一方面所述的疫苗多肽，p2为载体蛋白。
[0096]
在另一优选例中，所述的p1可以是单个疫苗多肽，也可以是串联的多个相同或不同的疫苗多肽(或抗原多肽)。
[0097]
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，它包括(a)用本发明第七方面所述的融合蛋白或被其免疫激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
[0098]
在本发明的第十方面，提供了本发明第七方面所述的融合蛋白或第八方面所述的药物组合物的用途，它们被用于制备预防冠状病毒sars-cov-2感染或其相关疾病的药物。
[0099]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0100]
图1显示了多肽pss的具体结构。
[0101]
图2显示了多肽lpss的具体结构。
[0102]
图3显示了sars-cov-2的rbd区域的mhc二类分子表位分析结果。
[0103]
图4显示了sars-cov-2的rbd区域的mhc一类分子表位分析结果。
[0104]
图5显示了衍生自野生型rbd的疫苗多肽ly54、ly54mut、p67、pss、lpss和lp67在rbd蛋白中的定位。
[0105]
图6显示了衍生自突变rbd的疫苗多肽mp1、mp2、mp3、mp477、mp484和mp501在rbd蛋白中的定位。
[0106]
图7显示了疫苗多肽免疫食蟹猴后在第34天后产生了高水平的rbd特异性结合抗体。
[0107]
图8显示了疫苗多肽免疫食蟹猴后在第34天后产生了高水平的可阻断rbd与ace2作用的中和抗体。
[0108]
图9显示了疫苗多肽免疫食蟹猴后在第105天后仍旧保留高水平的rbd特异性结合抗体。
[0109]
图10显示了疫苗多肽免疫食蟹猴后在第105天后仍旧保留高水平的可阻断rbd与ace2作用的中和抗体。
[0110]
图11显示了多肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后在第42天产生高水平的结合抗体。
[0111]
图12显示了多肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后在第42天后产生高水平的可阻断rbd与ace2作用的中和抗体。
[0112]
图13显示了多肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后的抗血清具有阻断野毒株假病毒侵入细胞的高中和活性。
[0113]
图14显示了疫苗多肽免疫食蟹猴后的抗血清具有阻断野毒株活病毒侵入细胞的高中和滴度。
[0114]
图15显示了多肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后产生了高水平的突变rbd特异性结合抗体。
[0115]
图16显示了多肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后的抗血清具有阻断突变株b.1.1.7假病毒侵入细胞的高中和活性。
[0116]
图17显示了衍生自突变rbd的疫苗多肽mp477、mp484、mp501和p67混合免疫食蟹猴后产生了高水平的针对b.1.351和p.1突变株关键的rbd突变位点的特异性结合抗体。
[0117]
图18显示了衍生自突变rbd的疫苗多肽mp477、mp484、mp501和p67混合免疫食蟹猴后产生了高水平的针对b.1.617突变株关键的rbd突变位点的特异性结合抗体。
[0118]
图19显示了几种新冠突变株的s蛋白区域相较于野毒株的突变氨基酸位点和突变类型。
具体实施方式
[0119]
本发明人通过广泛而深入的研究，基于对sars-cov-2野毒株和多种突变株的s蛋白序列分析和s蛋白与宿主ace2作用结构分析，分析了野毒株和突变株s蛋白的免疫原性，且分析了野毒株和突变株s蛋白与宿主ace2蛋白作用的关键区域。本发明筛选并确定了可有效诱导灵长动物机体产生针对冠状病毒sars-cov-2的免疫反应的疫苗多肽。实验表明，本发明的疫苗多肽可使食蟹猴产生针对sars-cov-2的高水平且持久的体液免疫反应。本发明的疫苗多肽及多肽纳米乳疫苗制剂免疫食蟹猴后的抗血清具有高滴度的rbd结合抗体和阻断rbd与ace2结合的中和抗体，并在sars-cov-2假病毒模型和活病毒模型上均显示出高水平的阻断作用。同时，与野生型rbd相比，食蟹猴抗血清针对s477n、e484k和n501y等多种rbd突变蛋白的结合活性不受影响，且在b.1.1.7突变株假病毒模型显示高水平阻断作用，说明本发明的多肽疫苗可用于预防新型冠状病毒野毒株和b.1.1.7和b.1.351等多种突变株的感染。在此基础上完成了本发明。
[0120]
术语
[0121]
冠状病毒sars-cov-2
[0122]
冠状病毒(coronavirus，cov)属于套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科
(coronaviridae)，是一种有包膜的正链rna病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。目前已知的感染人的冠状病毒中，hcov-229e和hcov-nl63属于α属冠状病毒，hcov-oc43、sars-cov、hcov-hku1、mers-cov和sars-cov-2均为β属冠状病毒。
[0123]
2019年年底爆发的新型冠状病毒(sars-cov-2)与sars-cov有约80％相似性、与mers-cov有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。
[0124]
该类病毒的基因组是一条单股正链rna，是基因组最大的rna病毒之一，编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如rna聚合酶和解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
[0125]
s蛋白是冠状病毒sars-cov-2的一种主要的结构蛋白，其中，rbd负责与人ace2受体结构，而rbm区域含有与人ace2结合的基序(motif)。一种典型的s蛋白的氨基酸序列如seq id no:16所示。
[0126]
》s蛋白
[0127]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seq id no:16)
[0128]
冠状病毒sars-cov-2的rbd区域位于s蛋白的第333-527位，一种代表性的氨基酸序列如seq id no:16中第333-527位所示。
[0129]
》rbd(333-527)
[0130]
tnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgp(seq id no:17)
[0131]
冠状病毒sars-cov-2的rbm区域位于s蛋白的第438-506位，一种代表性的氨基酸序列如seq id no:17中第438-506位所示。
[0132]
》rbm(438-506)
[0133]
snnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyq(seq id no:18)
[0134]
应理解，在本发明中，s蛋白、rbd区域和rbm区域均包括野生型和突变型。
[0135]
目前，sars-cov-2已出现区别于野毒株wuhan-hu-1的多种突变株并广泛流行。例如一种突变株称为b.1.1.7或501y.v1，该突变株已在世界许多国家中检测到，可能具有更强的传染性和增加的死亡风险。另一种突变株称为b.1.351或501y.v2，该突变株开始在南非以外国家流行，并表现出强力的疫苗和中和抗体免疫逃逸能力。突变株p.1，该突变株的免疫逃逸能力似乎还要强于突变株b.1.351。
[0136]
部分突变株与野毒株的s蛋白区域对比的突变位置和突变类型如图19所示。
[0137]
疫苗多肽
[0138]
在本发明中，“本发明表位肽”、“本发明疫苗多肽”、“本发明抗原多肽”、“本发明多肽”可互换使用，指符合本发明第一方面中所述的疫苗多肽。应理解，所述术语不仅包括一种本发明疫苗多肽，还包括多种本发明的疫苗多肽所形成的肽集合(或肽组合)。
[0139]
在本发明中，疫苗多肽还包括其他形式，例如药学上可接受的盐、偶联物、或融合蛋白。
[0140]
在本发明中，疫苗多肽包括对seq id no:1-15中任一序列进行一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸添加、一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸的取代和/或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
[0141]
优选地，疫苗多肽包括对seq id no:1-15中任一序列经过1-3个氨基酸添加(优选添加在n端或c端)、和/或1-2个氨基酸的取代(优选保守性氨基酸替换)并仍具有与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
[0142]
优选地，所述的保守性氨基酸替换根据表c进行氨基酸替换。
[0143]
表c
[0144]
[0145][0146]
在另一优选例中，seq id no:6、7和8所示的三种疫苗多肽被组合使用，其中，seq id no:6-8中的任何一种、二种或三种还可基于sars-cov-2的变异情况，及时引入相应的突变位点(例如图19中所示的落于seq id no:6-8序列中的突变位点)，从而形成能够及时应对sars-cov-2的变异株(或突变株)，从而提高本发明疫苗对突变株的保护力。
[0147]
一种代表性的更适合应对突变株的疫苗多肽集合(或组合)包括：seq id no:9、10和11所示的疫苗多肽(分别引入了突变株的突变氨基酸)。
[0148]
此外，本发明对应于野生型病毒株的如eq id no:6、7和8所示的一种或多种疫苗多肽，也可与对应于突变株的一种或多种疫苗多肽(如seq id no:9、10和11所示的疫苗多肽)进行组合，形成例如seq id no:9、7和11所示的疫苗多肽集；或seq id no:9、10和8所示的疫苗多肽集。
[0149]
如本文所用，术语“肽集合”所述的肽集合由至少两种本发明疫苗多肽或其衍生多肽构成。
[0150]
优选地，本发明所述的肽集合中至少含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自本发明第一方面所述的疫苗多肽或其衍生多肽(包括偶联肽)；更优选地，所述肽集合至少含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自seq id no:1-15的疫苗多肽或其衍生多肽。此外，所述的肽集合还包括可以除seq id no:1-15以外的其他冠状病毒sars-cov-2的抗原肽或蛋白。
[0151]
在另一优选例中，所述的肽集合包括选自下组的疫苗多肽：
[0152]
(z1)选自seq id no:1和12中的1或2种疫苗多肽，和选自seq id no:2-5中的1、2、3或4种疫苗多肽；
[0153]
(z2)选自seq id no:6和9中的1或2种疫苗多肽，选自seq id no:7和10中的1或2种疫苗多肽，和选自seq id no:8和11中的1或2种疫苗多肽；
[0154]
(z3)选自seq id no:1-12中的一种或多种(如1、2、3、4或5种)疫苗多肽，和选自seq id no:13-15中的1、2或3种疫苗多肽。
[0155]
在另一优选例中，所述的肽集合包括选自下组的疫苗多肽(或由自下组的疫苗多肽构成)：
[0156]
(s1)seq id no:1所示的疫苗多肽，和选自seq id no:2所示的疫苗多肽；
[0157]
(s2)选自seq id no:1和12中的1或2种疫苗多肽，和选自seq id no:2-5中的1、2、3或4种疫苗多肽，并且所述肽集合至少包括选自seq id no:3、4、5和12的一种或多种疫苗多肽；
[0158]
(s3)seq id no:6、7和8所示的疫苗多肽；
[0159]
(s4)seq id no:9、10和11所示的疫苗多肽；
[0160]
(s5)seq id no:6、10和11所示的疫苗多肽；
[0161]
(s6)seq id no:9、7和11所示的疫苗多肽；
[0162]
(s7)seq id no:9、10和8所示的疫苗多肽；
[0163]
(s8)seq id no:2、9、10和11所示的疫苗多肽；
[0164]
(s9)seq id no:2、6、7和8所示的疫苗多肽。
[0165]
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的，但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0166]
如本文所用，“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
[0167]
本发明的多肽可以是重组多肽、或合成多肽，优选合成多肽。
[0168]
在本发明中，当疫苗多肽的序列较短(如≤70aa，更佳地≤60aa时)，可用化学方法直接合成相关肽序列。
[0169]
当疫苗多肽的序列较长或以融合蛋白形式提供疫苗多肽时，也可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将编码所述抗原多肽或其融合蛋白的编码序列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关的抗原多肽或融合蛋白。
[0170]
药物组合物和给药方式
[0171]
本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的(如疫苗)。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的疫苗多肽或肽集合、或用该疫苗多肽激活的免疫细胞(例如用本发明疫苗多肽致敏的树突状细胞或用树突状细胞诱导的t细胞)，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0172]
在本发明中，这些(疫苗)组合物包含免疫性抗原(包括本发明疫苗多肽、肽集合或其衍生物)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体的例子包括(但并不限于)蛋白质、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
[0173]
此外，本发明的(疫苗)组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括(但并不限于)以下种类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、
矿物油、植物油等。
[0174]
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
[0175]
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
[0176]
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、口服、或局部给药。
[0177]
使用(疫苗)组合物时，是将安全有效量的本发明疫苗多肽或肽集合施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克肽/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克肽/千克体重，较佳地该剂量是约1微克-1毫克肽/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0178]
本发明的主要优点包括：
[0179]
(a)本发明所采用的疫苗多肽以及多肽纳米乳疫苗制剂能够在灵长动物的机体内产生高水平且持久的野生型和多种突变的rbd特异性结合抗体，和阻断野生型和突变的rbd与ace2结合的中和抗体。
[0180]
(b)本发明所采用的多肽纳米乳疫苗制剂免疫灵长动物后的抗血清具有阻断野毒株假病毒和活病毒侵入细胞的高水平中和活性。
[0181]
(c)本发明所采用的多肽纳米乳疫苗制剂免疫灵长动物后的抗血清具有阻断突变株b.1.1.7假病毒侵入细胞的高水平中和活性。
[0182]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0183]
实施例1基于sars-cov-2野毒株和突变株s蛋白的抗原多肽确定
[0184]
在本实施例中，本发明人以野毒株和突变株sars-cov-2的s蛋白中与人ace2相互作用的rbd区域作为分析对象，预测了其免疫显性的抗原部位。
[0185]
本发明人利用软件预测综合分析了rbd序列的免疫原性情况，主要包括mhc二类分子结合表位(图3)和mhcⅰ类分子结合表位(图4)。
[0186]
根据以上针对野毒株和突变株sars-cov-2的s蛋白免疫原性分析，以及肽段的空间位置等，本发明人最终筛选到15条多肽，氨基酸序列如seq id no:1-15所示，筛选得到的疫苗多肽主要对应于rbd区以及邻近区域，在野毒株和突变株sars-cov-2的rbd上的代表性定位分别如图5和图6所示。
[0187]
实施例2多肽的制备
[0188]
在本实施例中，应用多肽固相合成仪，制备seq id no:1-15示多肽。合成的多肽经由hplc鉴定和纯化，确保性质正确，且纯度在95％以上。
[0189]
实施例3多肽疫苗的食蟹猴免疫实验
[0190]
在本实施例中，进一步在食蟹猴中验证多肽疫苗对sars-cov-2的免疫效果。
[0191]
以(a)ly54 p67,(b)ly54 lp67,(c)ly54，分别以titermax佐剂制备免疫制剂，采用在第0天和第14天给与食蟹猴肌肉注射多肽疫苗制剂的免疫程序。疫苗多肽的免疫剂量为1mg/只。免疫后的食蟹猴血清用于rbd结合抗体和中和抗体的检测，以及sars-cov-2假病毒和活病毒的入侵阻断测试。
[0192]
实施例4多肽疫苗诱导的体液免疫反应检测
[0193]
为评估多肽疫苗在食蟹猴体内诱导的体液免疫反应水平，需要检测接种后食蟹猴的血清的rbd结合抗体和中和抗体。
[0194]
rbd结合抗体采用标准的桥联elisa方法测定。具体检测方法如下：1μg/ml的rbd-his包被96孔elisa板，4℃过夜。用pbst缓冲液(pbs中含0.05％tween-20)洗涤三次后，用200μl的1％bsa溶液在37℃下封闭elisa板1小时。洗涤后，96孔板加入100μl的血清梯度稀释液，并在37℃孵育1小时。洗涤后，96孔板加入100μl的protein a-hrp(1:5000用)，在37℃下孵育一小时，摇动设置在650rpm。洗涤后，用100μl的四甲基联苯胺(tmb)底物溶液在37℃、650rpm摇动下孵育96孔板20分钟。加入2m的硫酸溶液终止反应，用自动微孔板阅读器spectramax在450nm处测定吸光度值。
[0195]
中和抗体采用竞争elisa方法检测，具体测定方法如下：样品和对照物与hrp-rbd预孵育，使待测中和抗体与hrp-rbd结合。然后将混合物加入到预包被有hace2蛋白的捕获板上。未结合的hrp-rbd以及与非中和抗体结合的hrp-rbd将被捕获在板上，而样品中的中和抗体/hrp-rbd复合物留在上清液中，并在洗涤过程中被去除。洗涤步骤结束后，加入tmb溶液，使颜色变成蓝色。通过加入终止液，反应被淬灭，颜色变成黄色。这个最终的溶液可以在微孔板读数器中在450纳米处读取。样品的吸光度与抗sars-cov-2中和抗体的滴度成反比。
[0196]
结果表明：多肽疫苗免疫后的食蟹猴产生了高水平的rbd特异性结合抗体，在免疫后的第34天，多肽疫苗免疫后食蟹猴的血清中rbd特异性结合抗体滴度高达1:72900(图7)。而且多肽疫苗免疫诱导了高水平的阻断rbd与ace2结合的中和抗体，在免疫后的第34天，多肽疫苗免疫后食蟹猴的血清中中和抗体滴度高达1：160(图8)。意外地，即使在免疫的三个月后(第105天)检测食蟹猴血清抗体，食蟹猴血清中仍保留高达1：24300滴度的rbd特异性结合抗体(图9)。出乎意料的是，三个月后，食蟹猴血清中的中和抗体滴度不降反升，高达1：320(图10)。
[0197]
因此，本发明的多肽疫苗在食蟹猴体内诱导产生了高水平的、sars-cov-2特异性的、具有阻断活性的和持久的体液免疫反应。
[0198]
实施例5多肽疫苗纳米乳制剂的开发
[0199]
在固定量的多肽中，加入2.0-5.0％的角鲨烯，0.0-4.0％乳化剂，0-20％注射剂型中可接受的原辅料，制备纳米乳的液滴粒径小于220nm，以符合过滤除菌要求。
[0200]
其中，最优处方为：
[0201][0202]
并以此配方(命名为f2)进行不同剂量及种类多肽为抗原的纳米乳剂疫苗的制备
(表一)。
[0203]
表1以不同剂量及种类多肽为抗原的纳米乳剂疫苗的处方
[0204][0205]
按照表1中的粒径大小可知，优选处方能够适应不同种类及不同剂量的多肽，制备纳米乳液滴粒径小于220nm，符合过滤除菌要求。
[0206]
实施例6多肽疫苗纳米乳制剂的体内免疫效果评价
[0207]
ly54和p67各1mg，并按照实施例5中的配方(f2)制备成纳米乳剂(ly54 p67(1:1,f2))。将食蟹猴分组进行肌肉注射，在第0、14、28天免疫。
[0208]
食蟹猴免疫后的血清中rbd特异性结合抗体和中和抗体水平检测显示多肽疫苗纳米乳制剂免疫后42天诱导了高水平的体液免疫反应，血清中rbd结合抗体的滴度高达1:24300(图11)，中和抗体的滴度高达1:1280(图12)。这说明，本发明的多肽疫苗纳米乳制剂可在体内诱导高水平保护性的体液免疫反应，预期可保护机体免受病毒感染。
[0209]
实施例7多肽疫苗纳米乳剂免疫食蟹猴的抗血清的假病毒中和实验
[0210]
为了进一步评价多肽疫苗纳米乳剂免疫食蟹猴后诱导的高水平体液免疫反应是否能够阻断病毒入侵宿主细胞，采用了假病毒测试体系评估食蟹猴抗血清的假病毒阻断中和活性。
[0211]
在假病毒中和试验中，将100μl不同稀释度的血清样品与50μl含有sars-cov-2野毒株假病毒的上清液混合。该混合物在37℃下孵育1小时。然后将100微升的huh-7/ace2细胞加入到假病毒和血清样品的混合物中，在37℃下再孵育24小时。然后，取出上清液，将100μl荧光素酶检测液加入到每个孔中。孵育2分钟后，使用微孔板光度计测量荧光素酶活性。
[0212]
结果表明：多肽疫苗纳米乳剂免疫后的食蟹猴血清具有高水平的中和活性，可以阻断野毒株假病毒入侵宿主细胞，滴度高达1：256(图13)。
[0213]
实施例8多肽疫苗纳米乳剂免疫食蟹猴的抗血清的活病毒中和实验
[0214]
在本实施例中，为了进一步真实模拟多肽疫苗纳米乳剂免疫食蟹猴后诱导的高水平体液免疫反应是否能够阻断病毒入侵宿主细胞，采用活病毒的细胞病变法评估食蟹猴抗血清的活病毒阻断中和活性。
[0215]
sars-cov-2野毒株病毒在vero e6细胞中增殖。将血清样品(经多肽疫苗制剂ly54(titermax)免疫食蟹猴后产生的抗血清)在56℃下热灭活30分钟；然后将从1∶4开始的2倍连续稀释液与等体积的含有50％组织培养物的病毒溶液混合。将血清-病毒混合物在37℃、5％co2加湿的环境中孵育1小时。孵育后，将每个稀释度的100μl混合物一式两份加入到含有半融合的vero e6单层的细胞板上。该板在37℃下孵育4天。培养4天后，在显微镜下记录各孔的细胞病变效果(cpe)。取能保护50％以上细胞不受cpe影响的最高血清稀释度作为中和滴度。
[0216]
结果表明：即使在免疫后的三个月，多肽疫苗纳米乳剂免疫后的食蟹猴血清具有高水平的中和活性，可以阻断活病毒入侵宿主细胞，滴度高达1：37(图14)。
[0217]
实施例9多肽疫苗纳米乳剂诱导的体液免疫反应应对sars-cov-2突变株
[0218]
以上结果表明多肽疫苗纳米乳剂可以诱导针对野生型sars-cov-2的高水平、保护性的且持久的体液免疫反应。为了评估多肽疫苗诱导的体液免疫反应能否应对sars-cov-2突变株，本发明采用了多种突变的rbd蛋白和b.1.1.7突变株假病毒体系测试了多肽疫苗的作用。
[0219]
首先，采用基于实施例4的rbd结合抗体检测方法，将野生型rbd替换为n439k突变、y453f突变、s477n突变、n501y突变的多种突变型rbd蛋白进行检测。
[0220]
结果表明，多肽疫苗纳米乳剂ly54 p67(1:1,f2)免疫食蟹猴后(第29天)，食蟹猴的抗血清与野生型rbd的结合能力对比与n439k突变、y453f突变、s477n突变、n501y突变的突变型rbd蛋白的结合能力均无差距(图15)，这说明多肽疫苗免疫食蟹猴诱导的高水平体液免疫反应不受以上rbd蛋白突变的影响，rbd蛋白的多种突变不会针对本发明的多肽疫苗产生免疫逃逸。
[0221]
进一步地，本发明测试了多肽疫苗纳米乳剂免疫食蟹猴后的抗血清对目前广泛流行的突变株b.1.1.7的阻断活性。本发明采用b.1.1.7的假病毒体系，基本方法如实施例5中描述，测试发现食蟹猴的抗血清针对突变株b.1.1.7具有高水平的阻断活性，滴度高达1：512(图16)。对比食蟹猴抗血清对野毒株假病毒的中和作用，说明，突变株b.1.1.7对本发明的多肽疫苗不会产生免疫逃逸，本发明多肽疫苗可保护机体免受该突变株感染。
[0222]
为了进一步提高本发明多肽疫苗纳米乳剂对于新冠病毒突变株的保护作用，采用实施例1中针对sars-cov-2突变株筛选确定的多肽mp477、mp484和mp501与p67混合形成组合表位多肽，制备成纳米乳剂后免疫食蟹猴。在第0天和第14天免疫肌肉注射免疫食蟹猴，在第21天(第二次免疫后7天)取血样，检测血清中的突变型rbd特异性的结合抗体。
[0223]
意外地，针对突变株的疫苗多肽免疫食蟹猴诱导的高水平的rbd结合抗体对具有新冠疫苗和中和抗体药物免疫逃逸作用的e484k突变的rbd也具有高水平的结合活性(图17)，提示多肽疫苗纳米乳剂可保护机体免受具有e484k突变的突变株b.1.351和突变株p.1感染。
[0224]
另外，针对突变株的疫苗多肽免疫食蟹猴后诱导的高水平的rbd结合抗体对具有新冠疫苗和中和抗体药物免疫逃逸作用的b.1.617突变株关键突变位点l452r和e484q突变的rbd也具有高水平的结合活性(图18)，提示多肽疫苗纳米乳剂可保护机体免受具有l452r和e484q突变的b.1.617突变株感染。
[0225]
讨论
[0226]
多肽疫苗是一种可针对病原体蛋白快速设计和大规模工业生产的疫苗类型，且其性质安全，作用特异，成本低廉。因此，多肽疫苗适合于应对突发疫情和病原体突变。
[0227]
目前已经通过临床试验测试的新冠疫苗，均是基于sars-cov-2野毒株设计的。已有研究表明，目前大规模流行的b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株和b.1.617突变株等具有免疫逃逸的性质，这可能使得已有的新冠疫苗和中和抗体药物失效和保护作用减弱。因此，目前急需可以应对新冠突变株的疫苗产品。本发明的多肽疫苗组合的技术路线不同于现有新冠疫苗的技术路线，并且配合有优化的纳米乳佐剂制剂，本发明的多肽纳米乳疫苗的免疫效果针对新冠突变株仍然高效，可阻断效果已在野毒株和突变株的假病毒和活病毒体系上得到验证，具备应对突变株流行的开发前景。
[0228]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0229]
疫苗多肽的序列
[0230]
》seq id no:1 ly54
[0231]
lfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpy
[0232]
》seq id no:2 p67
[0233]
yawnrkrisncvadysvlynsasfstfk
[0234]
》seq id no:3 pss
[0235]
yawnrkrisnc(c)vadysvlynsasfstfk
[0236]
》seq id no:4 lp67
[0237]
isncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnv
[0238]
》seq id no:5 lpss
[0239]
isnc(c)vadysvlynsasfstfkc(c)ygvsptklndlc(c)ftnv
[0240]
》seq id no:6 mp1
[0241]
vggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstp
[0242]
》seq id no:7 mp2
[0243]
disteiyqagstpcngvegfncyfplqsyg
[0244]
》seq id no:8 mp3
[0245]
yfplqsygfqptngvgyqpy
[0246]
》seq id no:9 mp477
[0247]
vggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagntp
[0248]
》seq id no:10 mp484
[0249]
disteiyqagstpcngvkgfncyfplqsyg
[0250]
》seq id no:11 mp501
[0251]
yfplqsygfqptygvgyqpy
[0252]
》seq id no:12 ly54mut
[0253]
lfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpy
[0254]
》seq id no:13 ntd1
[0255]
qcvnlttrtqlppaytnsftrg
[0256]
》seq id no:14 ntd2
[0257]
cndpflgvyyhknnkswmesefrvys
[0258]
》seq id no:15 ntd3
[0259]
lhrsyltpgdsssgwtagaaay
[0260]
(注：seq id no:13-15来自于s蛋白的ntd区域)。