一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒、其制备方法和用途

1.本发明涉及一种纳米递药系统。具体而言，本发明涉及一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒、其制备方法和用途。


背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)是一种难治的慢性胃肠道炎症疾病，目前治疗药物易导致严重的副作用和并发症，因此在临床使用中有较大的局限性。中药有效成分广藿香醇(patchouli alcohol,pa)具有良好的抗炎活性，但由于成药型差使得治疗作用受到限制。


技术实现要素：

3.因此，本研究构建了rgd环肽修饰的广藿香醇纳米粒，通过主动靶向肠道炎症部位，从抗炎与促进屏障修复两个角度治疗ibd。
4.本发明的一个目的在于提供一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒。
5.本发明的另一个目的在于提供一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒的制备方法。
6.本发明的另一个目的在于提供一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒在制备治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
7.根据本发明的一个方面，其提供了一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒，其中，所述广藿香醇与载体丝素蛋白的质量比例是1:1-1:15，载体的粒径为180-350nm。
8.根据本发明的另一个方面，其提供了一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒的制备方法，其中，所述广藿香醇与载体丝素蛋白的质量比例是1:1-1:15，优选1:2-1:5，载体的粒径为180-350nm，优选200-250nm，该方法包括以下步骤：
9.配制浓度为2-10mg/ml的广藿香醇的乙醇溶液，将广藿香醇溶液缓慢滴加至浓度为10-30mg/ml的丝素蛋白水溶液中搅拌5-10min，得到的混合溶液在-10℃至-30℃条件下冷冻20-30h，之后将混合溶液在室温下解冻得到包载广藿香醇的丝素蛋白纳米粒混悬液，使用乙醇溶液稀释以12000-16000g离心洗涤2-3次，将所得的沉淀冷冻干燥，得到广藿香醇丝素蛋白纳米粒。
10.根据本发明的另一个方面，其提供了一种根据上述的广藿香醇丝素蛋白纳米粒在制备治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
11.有益效果
12.根据本发明的广藿香醇丝素蛋白纳米粒，其具有更好的抗炎效果，特别是对于rgd修饰的丝素蛋白纳米粒而言，其抗炎效果特别优异。
附图说明
13.图1为广藿香醇丝素蛋白纳米粒的分子结合模拟结果。
14.图2为rgd环肽的修饰结果评价，图2中a为纳米粒修饰过程的粒径分布变化，图2中
b为纳米粒洗涤上清中rgd环肽的质谱检测结果，图2中c为纳米粒的核磁检测图谱。
15.图3为纳米粒的形貌结构测定，图3中a和b分别为广藿香醇丝素蛋白纳米粒(pasfns)和rgd修饰的广藿香醇丝素蛋白纳米粒(crgd-pasfns)的透射电镜与扫描电镜结果。
16.图4为纳米粒的稳定性研究结果。
17.图5为纳米粒的体外释药及扩散方程。
18.图6为纳米粒的细胞摄取结果。
19.图7为纳米粒对炎症因子表达水平的影响。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
20.图8为纳米粒对紧密连接蛋白和黏蛋白表达的影响。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
21.图9为纳米粒的体内分布结果。图9中a为不同时间点的小动物活体成像结果图，图9中b为荧光强度/时间定量结果统计图。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
22.图10为纳米粒对结肠炎小鼠体重影响结果。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
23.图11为纳米粒对结肠炎小鼠疾病活动指数评分的影响结果。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
24.图12为纳米粒对结肠炎小鼠结肠长度的影响结果。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
25.图13为纳米粒对结肠炎小鼠肠道通透性的影响结果。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
26.图14为小鼠结肠组织he染色结果的切片图。
27.图15为纳米粒对结肠炎小鼠炎症因子的影响结果。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
28.图16为纳米粒对紧密连接蛋白和黏蛋白表达的影响。*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
29.图17为纳米粒的生物安全性结果，图17中a为主要脏器的重量变化，图17中b为主要脏器he染色切片图。
具体实施方式
30.以下将具体描述本发明的实施方式，但以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
31.根据本发明的一个实施方式，其提供了一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒，其中，所述广藿香醇与载体丝素蛋白的质量比例是1:1-1:15，载体的粒径为180-350nm。
32.根据本发明的一个实施方式，其中，所述广藿香醇与载体丝素蛋白的质量比例是1:2-1:5，载体的粒径为200-250nm。
33.根据本发明的一个实施方式，其中，所述纳米粒是通过rgd环肽修饰的纳米粒。
34.根据本发明的一个实施方式，其提供了一种广藿香醇丝素蛋白纳米粒的制备方
法，其中，所述广藿香醇与载体丝素蛋白的质量比例是1:1-1:15，优选1:2-1:5，载体的粒径为180-350nm，优选200-250nm，该方法包括以下步骤：
35.配制浓度为2-10mg/ml的广藿香醇的乙醇溶液，将广藿香醇溶液缓慢滴加至浓度为10-30mg/ml的丝素蛋白水溶液中搅拌5-10min，得到的混合溶液在-10℃至-30℃条件下冷冻20-30h，之后将混合溶液在室温下解冻得到包载广藿香醇的丝素蛋白纳米粒混悬液，使用乙醇溶液稀释以12000-16000g离心洗涤2-3次，将所得的沉淀冷冻干燥，得到广藿香醇丝素蛋白纳米粒。
36.根据本发明的一个实施方式，其中，所述纳米粒是通过rgd环肽修饰的纳米粒，且该方法进一步包括以下步骤：
37.将上述得到的广藿香醇丝素蛋白纳米粒在混悬液中进行离心洗涤后，所得沉淀重悬在碱性缓冲液中，加入戊二醛后搅拌90-120min，反应结束后将纳米粒离心洗涤，并再次将所得沉淀重悬在碱性缓冲液中，加入rgd环肽后以200-300rpm搅拌90-120min，反应结束后将纳米粒离心洗涤，所得沉淀冷冻干燥，得到由rgd环肽修饰的纳米粒。
38.根据本发明的一个实施方式，其提供了所述的广藿香醇丝素蛋白纳米粒在制备治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
39.根据本发明的一个实施方式，其中，所述疾病为溃疡性结肠炎。
40.实施例
41.在以下的制备和表征的实施例中，所使用的仪器和材料如下表1和2所示。
42.表1.仪器
[0043][0044]
表2.材料
[0045][0046]
在以下的生物体外实验的实施例中，所使用的仪器和材料如下表3和4所示。
[0047]
表3.仪器
[0048][0049]
表4.材料
[0050]
[0051][0052]
在生物体外实验的实施例中，使用graphpad prism 7.0软件分析所得数据并绘制统计图，所有数据均以mean
±
sd值的形式呈现。统计学显著性差异为：*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001。使用adobe illustrator 2020软件进行图片整理与文字说明。
[0053]
在以下的生物体内实验的实施例中，所使用的仪器和材料如下表5和6所示。
[0054]
表5.仪器
[0055][0056]
表6.材料
[0057][0058]
在生物体内实验的实施例中，使用graphpad prism 7.0软件分析所得数据并绘制统计图，通过t检验及one-way anova进行数据统计学差异分析，所有数据均以mean
±
sd值的形式呈现。统计学显著性差异为：*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001。使用adobe illustrator 2020软件进行图片整理与文字说明。
[0059]
制备实施例1：广藿香醇丝素蛋白纳米粒和rgd环肽修饰纳米粒的制备
[0060]
1.广藿香醇丝素蛋白纳米粒
[0061]
配制浓度为5mg/ml的广藿香醇乙醇溶液，将广藿香醇溶液缓慢滴加至浓度为15mg/ml的丝素蛋白水溶液中，并以300rpm转速搅拌5min。得到的混合溶液在-20℃条件下冷冻24h。将冷冻处理后的混合溶液室温下解冻得到包载广藿香醇的丝素蛋白纳米粒混悬液，加入乙醇溶液稀释，以13000g离心洗涤3次，每次10min。将所得沉淀冷冻干燥24h，得到广藿香醇丝素蛋白纳米粒冻干粉(pasfns)。
[0062]
2.rgd环肽修饰丝素蛋白纳米粒
[0063]
将上述1.中得到的纳米粒混悬液进行离心洗涤后，所得沉淀重悬在10mm的ph 7.4缓冲液中，加入戊二醛后以300rpm搅拌90min，反应结束后将纳米粒离心洗涤，并再次将所得沉淀重悬在10mm的ph 7.4缓冲液中，加入crgd(fk)肽后以300rpm搅拌90min，反应结束后将纳米粒离心洗涤3次，所得沉淀冷冻干燥24h，得到rgd环肽修饰的丝素蛋白纳米粒冻干粉(crgd-pasfns)。
[0064]
实施例1：广藿香醇丝素蛋白纳米粒的分子结合模拟
[0065]
从rcsb蛋白质数据库获取丝素蛋白的结构(pdb id：3ua0)，并从pubchem数据库获取广藿香醇的分子结构(pubchem cid：10955174)。使用autodock vina 1.1.2程序执行分子自动对接计算。首先，执行能量最小化方案以获取广藿香醇模型。然后，将广藿香醇分子对接至丝素蛋白模型。在对接协议中，使用尺寸为且活动位置为(0.291，24.253，20.748)的网格图，根据主体和客体分子中所有原子类型(包括lennard-范德华相互作用的琼斯电位和静电相互作用的库仑电位)，结合使用拉马克遗传算法与基于网格的能量评估方法，获取能量相对较低的对接结果并用于后续研究。最终结果由visualizer(accelrys inc.)呈现。
[0066]
纳米粒中丝素蛋白与药物的摩尔比为约1:1。根据该比例通过autodock vina软件寻找丝素蛋白上广藿香醇的最佳位置。对接结果表明，广藿香醇的疏水基团被两个对称肽链结构的两个phe84结构分别提供的两个苯环所包围。另外，两端被相同的两个ile86结构提供的两个疏水基团封闭。对接自由能为-8.6kcal/mol。因此，广藿香醇在丝素蛋白纳米粒
中主要位于该部位的可能性很高。参见图1。
[0067]
实施例2：rgd环肽修饰的评价
[0068]
根据实施例1中所述的反应过程，将每一步的纳米混悬液稀释后使用粒径仪检测纳米粒的粒径分布；将最终反应的得到的混悬液洗涤离心去除多余的rgd环肽，并将最后的洗涤液上清使用液相-质谱联用系统定性检测；将最终所得的rgd环肽修饰的纳米粒利用核磁检测仪对rgd环肽的修饰情况进行验证。
[0069]
如图2中a所示，第二步戊二醛交联后的粒径分布相较于交联前有轻微的变化，rgd环肽功能化后其粒径分布出现较为明显的偏移，可间接证明rgd环肽的成功修饰；如图2中b所示，最后一次的洗涤液上清中不存在残留的rgd环肽，在此验证基础上进一步使用核磁检测洗涤后的纳米粒，其结果如图2中c所示，修饰后的纳米粒中出现了rgd环肽的特征峰，从而证明了rgd环肽成功修饰在纳米粒上。
[0070]
实施例3：纳米粒的形态学考察
[0071]
取适量稀释后的pasfns和crgd-pasfns纳米粒混悬液，滴加在透射电镜专用铜网上，静置2min后使用磷钨酸染色两次，每次2min，用滤纸吸干多余液体。待铜网干燥后将其放入透射电镜中观察纳米粒的形态。
[0072]
取适量稀释后的pasfns和crgd-pasfns纳米粒混悬液，滴加在扫描电镜专用抛光硅片表面，待其干燥后置于扫描电镜中观察纳米粒的形态。
[0073]
如图3所示，pasfns和crgd-pasfns呈球形，粒径均一，分散性良好，粒径约为150nm左右，稍小于水合粒径，这种差异可能归因于纳米粒在干燥状态下比分散在水中时收缩得更小。sem结果显示，纳米粒出现了团聚现象，这可能是由于广藿香醇的加入及丝素蛋白的浓度导致丝素蛋白的结构转变过快，从而使纳米粒在形成过程中易于粘结和团聚。
[0074]
实施例4：纳米粒的载药量及包封率的测定
[0075]
称取适量pasfns和crgd-pasfns冻干粉，用1ml二甲基亚砜充分超声破乳，12000g离心两次，每次8min，收集最终上清液。使用气相色谱仪检测上清液中的广藿香醇含量，计算纳米粒的载药量与包封率，计算公式如下：
[0076][0077][0078]
载药量和包封率结果如表7所示：
[0079]
表7.载药量与包封率结果
[0080][0081]
实施例5：纳米粒的稳定性研究
[0082]
将适量pasfns和crgd-pasfns冻干粉重悬在pbs缓冲液(ph 7.4)中7天，每天测量纳米粒的粒径和电位，观察其是否出现显著性变化。
[0083]
如图4所示，pasfns和crgd-pasfns在pbs(ph＝7.4)中7天内粒径及zeta电位无显著性变化，证明pasfns和crgd-pasfns体外稳定性良好。
[0084]
实施例6：纳米粒的体外释药及扩散方程
[0085]
称取适量pasfns和crgd-pasfns冻干粉，将其重悬在含有3％十二烷基硫酸钠的ph6.8缓冲液中，置于37℃恒温空气震荡器中，震荡速度保持为120rpm。分别在0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、24h取样1ml，并补充等量的新鲜释放介质。将所取样品以12000g离心取上清，使用气相色谱仪测定上述各时间点的广藿香醇浓度并计算药物释放量，最后绘制纳米粒的体外释药曲线。根据解离常数k
off
、药物释放所经历单元之间的距离a、以及扩散系数d之间的关系，我们估计该关系方程为d＝a2×koff
。通过求解扩散方程，计算药物的解离自由能，并对释药曲线进行拟合。
[0086]
如图5所示，pasfns和crgd-pasfns相较于游离广藿香醇而言具有明显的缓释作用，纳米粒在8h释放药物达到60％以上，在24h达到75％左右。通过求解扩散方程，最终得出纳米粒中药物的解离自由能约为-21.6kcal/mol，拟合释药曲线后与实验数据吻合良好。
[0087]
实施例7：细胞摄取实验
[0088]
1.载香豆素-6纳米粒的制备
[0089]
将适量香豆素-6溶解在广藿香醇的乙醇溶液中，按照制备实施例1所述的方法制备载有香豆素-6的pasfns和crgd-pasfns以备后续实验使用。
[0090]
2.纳米粒的细胞摄取实验
[0091]
将对数生长期的caco-2进行细胞消化、细胞计数，按每孔约1
×
106细胞密度接种至6孔板中，待生长密度达到90％后进行细胞摄取实验。给药前弃去旧的培养基，并用pbs清洗两遍。之后分别加入含有等量香豆素-6的pasfns和crgd-pasfns的培养基共孵育1h，弃去细胞上清液，用pbs清洗三遍以除去多余的培养基和香豆素-6纳米粒。使用4％的多聚甲醛固定细胞15min，用pbs清洗三遍以去除残留的多聚甲醛；使用dapi进行细胞核染色10min，用pbs清洗三遍去除残留的染色液。最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞对pasfns和crgd-pasfns摄取情况。
[0092]
如图6所示，crgd-pasfns在细胞中的摄取多于pasfns，表明crgd-pasfns可以更好被肠上皮细胞摄取，rgd环肽的修饰达到了增加摄取的效果。
[0093]
实施例8：体外抗炎药效评价
[0094]
将对数生长期的raw 264.7细胞消化，细胞计数，以每孔1
×
105细胞密度接种于6孔板中。待细胞贴壁24h后分为空白对照组、模型组、pa组、pasfns组以及crgd-pasfns组。除空白对照与模型组外，其余各组按照一定浓度给药后与细胞孵育2h，之后模型组与药物组均加入100ng/ml脂多糖诱导细胞炎症，细胞继续培养24h后收集细胞。采用实时定量基因扩增荧光检测系统(q-pcr)检测炎症因子的变化。
[0095]
如图7所示，在脂多糖的诱导下，模型组巨噬细胞中的促炎因子(tnf-α、il-6、il-1β、il-8)的mrna水平均明显高于正常对照组，在给药组中，pa、pasfns和crgd-pasfns均能显著降低促炎因子的mrna水平，并且纳米粒给药组的效果较优于pa给药组，crgd-pasfns的效果最好。以上实验结果证明，pa、pasfns和crgd-pasfns均能有效降低巨噬细胞的促炎因子水平，具有良好的抗炎效果。
[0096]
实施例9：纳米粒对上皮细胞屏障保护作用
[0097]
将对数生长期的caco-2细胞消化，细胞计数，以每孔1
×
105细胞密度接种于6孔板中。待细胞贴壁稳定且密度约为80％左右时开始实验。细胞分为对照组、pa组、pasfns组以及crgd-pasfns组。除对照组外，其余各组按照一定浓度给药后与细胞孵育24h，收集细胞并采用实时定量基因扩增荧光检测系统(q-pcr)和蛋白质免疫印迹法(western blot)检测紧密连接蛋白的变化。
[0098]
如图8所示，pa、pasfns和crgd-pasfns均能显著增加紧密连接蛋白的zo-1、ocln、cldn4和黏蛋白muc-2的mrna水平，并且纳米粒给药组的效果较优于pa给药组，crgd-pasfns的效果最好。western blot的实验结果也再次证明了pa、pasfns和crgd-pasfns均能有效增加肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达，具有良好的肠黏膜屏障保护作用。
[0099]
实施例10：纳米粒的体内分布实验
[0100]
1.dss诱导小鼠急性结肠炎模型
[0101]
取balb/c小鼠(18-20g)50只，随机分为正常对照组、dss组、pa组、pasfns组和crgd-pasfns组，每组10只小鼠。除正常组外，其余各组小鼠给予3％dss溶液自由饮用，dss溶液新鲜配置，隔天更换。正常对照组小鼠正常饮水10天，dss组小鼠3％dss溶液自由饮水7天，从给予dss的第二天开始给药，持续给药6天。至造模第7天，dss组与各药物组更换新鲜的正常饮用水，并持续给药3天。采用灌胃给药的方式，每天一次，灌胃体积为10ml/kg，正常对照组和dss组均灌胃0.25％cmc-na(含有0.1％sds)溶液，其余各给药组分别灌胃以0.25％cmc-na(含有0.1％sds)分散的药物。
[0102]
2.纳米粒的体内分布实验
[0103]
载cy5纳米粒的制备：
[0104]
在含药乙醇溶液中加入一定量cy5，按照与制备实施例1类似的方法制备载有cy5的pasfns和crgd-pasfns以备后续实验使用。
[0105]
纳米粒的小鼠体内分布实验：
[0106]
按照上述方法诱导小鼠急性结肠炎模型，将结肠炎小鼠随机分成pasfns和crgd-pasfns两组，每组三只。分别对每组小鼠灌胃等量的cy5标记的pasfns和crgd-pasfns。分别在0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h使用异氟烷麻醉小鼠，通过小动物活体成像系统对每组小鼠进行拍摄，并在最终点将小鼠安乐死，解剖结肠组织并进行拍摄，将活体成像图片中的荧光强度进行定量，并绘制时间-荧光分布柱状图进行统计学分析。
[0107]
如图9所示，在结肠炎模型小鼠中，纳米粒能有效蓄积在腹腔部位，crgd-pasfns的蓄积效果较优于pasfns。通过对动物离体组织进行荧光成像以及荧光定量后发现，crgd-pasfns在结肠组织的蓄积量高于pasfns。以上实验结果证明，crgd-pasfns具有更好的结肠靶向能力。
[0108]
实施例11：体重变化和疾病活动指数
[0109]
按照实施例10中第一部分所述方法诱导小鼠急性结肠炎。诱导周期内，每日记录小鼠的体重变化，并观察小鼠的粪便性状及便血情况，参考表8的评分标准进行评分。将每日的各指标评分相加，作为疾病活动指数(disease activity index，dai)，分数最高为10分。
[0110]
表8.疾病活动指数(dai)评分标准
[0111][0112]
正常对照组小鼠活泼，毛发光亮，体重平稳增长，大便正常，呈椭圆形或梭形。dss模型组小鼠逐渐开始食欲减退，反应迟缓，精神萎靡，自主活动减少，实验周期内体重呈下降趋势。如图10所示，实验第10天，dss模型组平均体重低于正常对照组，并存在显著性差异。pa组、pasfns组和crgd-pasfns组相较于dss模型组，上述症状明显较轻，且体重下降趋势较缓，其中crgd-pasfns组效果最为显著。
[0113]
动物实验周期内对每只小鼠的稀便、便血情况进行记录以及dai评分，其结果如图11所示。自dss造模第四天开始，小鼠出现半稀便现象，第五天出现稀便，第六天出现明显稀便以及轻微便血，第七天开始便血逐渐严重，并出现脓血便。实验第10天，dss模型组小鼠的dai评分明显升高，而pa组、pasfns组和crgd-pasfns组的dai评分明显低于dss模型组，其中crgd-pasfns评分最低。
[0114]
实施例12：结肠长度
[0115]
动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，解剖分离小鼠结肠组织，用pbs清洗并用滤纸吸干多余液体，测量小鼠结肠长度并拍照。
[0116]
如图12所示，正常对照组小鼠的结肠长度范围约在7-9cm，肠粘膜平整，光滑，无其他异常。dss模型组小鼠结肠可见不同程度的出血，肿胀度较高，且有肉眼可见的溃疡及瘢痕，个别小鼠结肠中残留浸血物质，结肠长度缩短至4-6cm。而pa组、pasfns组和crgd-pasfns组均能不同程度的抑制结肠缩短，crgd-pasfns组的抑制作用最强。
[0117]
实施例13：小鼠肠道通透性分析
[0118]
动物实验周期到达终点前，每组各取5只小鼠并禁食24h，然后按照44mg/100g灌胃荧光标记的葡聚糖(fitc-dextran)(100mg/ml，pbs溶解)。4h后眼眶取血并收集血清，用等量pbs稀释后，各取100μl血清置于96孔板中在485nm波长下检测荧光标记葡聚糖的od值。
[0119]
如图13所示，dss模型组的小鼠血清中的荧光标记葡聚糖含量明显高于正常对照组。相较于dss模型组，pa组、pasfns组和crgd-pasfns组小鼠血清中的荧光标记葡聚糖含量明显较低，其中crgd-pasfns组含量最低，降低结肠炎模型小鼠的肠道通透性作用最强。
[0120]
实施例14：结肠病理检测
[0121]
分离部分结肠组织经4％多聚甲醛溶液固定后，石蜡包埋、切片，经抛蜡后的切片由伊红-苏木素(hematoxylin and eosin，he)染色。使用病理切片扫描仪观察并分析所得切片。
[0122]
如图14所示，正常组大肠粘膜上皮结构完整，腺体排列规则。粘膜层及粘膜下层未见炎症细胞浸润。dss模型组小鼠整个肠段见多处溃疡，溃疡处大肠粘膜上皮缺失，溃疡累及粘膜全层，腺体杯状细胞数量减少，粘膜及粘膜下层炎症细胞浸润；pa组溃疡范围较小，溃疡周围腺体杯状细胞数量减少，尚有局部大肠粘膜上皮缺失、粘膜层炎症细胞浸润的现
象；pasfns组部分粘膜上皮再生，crgd-pasfns组小鼠结肠组织炎症有明显的改善，小鼠结肠黏膜结构均有一定程度的恢复，上皮结构较完整，炎症细胞浸润减少。
[0123]
实施例15：结肠炎症因子检测
[0124]
取适量结肠组织和血清分别采用实时定量基因扩增荧光检测系统(q-pcr)和酶联免疫吸附实验(elisa)检测炎症因子的变化。
[0125]
如图15所示，dss模型组小鼠的结肠组织以及血清中炎症因子含量显著高于正常对照组，在pa，pasfns和crgd-pasfns治疗后，小鼠的结肠组织以及血清中的炎症因子含量明显减少，其中，crgd-pasfns的炎症因子抑制作用最强。
[0126]
实施例16：纳米粒对肠黏膜屏障修复作用的研究
[0127]
取适量小鼠结肠组织，采用实时定量基因扩增荧光检测系统(q-pcr)检测紧密连接蛋白和黏蛋白的表达。如图16所示，dss模型组小鼠的结肠组织中紧密连接蛋白(zo-1、ocln、cldn4)和黏蛋白muc-2含量显著低于正常对照组，在pa，pasfns和crgd-pasfns治疗后，小鼠结肠组织中的紧密连接蛋白和黏蛋白表达明显增加，其中，crgd-pasfns的效果最为显著。
[0128]
实施例17：安全性评价
[0129]
动物实验周期到达终点后将小鼠安乐死，解剖取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾，并称重、计算脏器系数。然后将所取脏器用4％多聚甲醛溶液进行固定、石蜡包埋制片以及he染色，使用组织切片成像仪拍摄，观察并评价。
[0130]
如图17所示，小鼠主要脏器重量并无明显变化。he染色切片结果显示，各药物组的心脏心肌正常未见明显病变；肝、脾均未出现明显病，其中脾白红髓结构清晰，小梁结构清晰，被膜正常；各药物组肺部支气管、肺泡管及肺泡结构清晰，未出现明显病变；肾小球形态正常，未出现异常细胞增生及病变。证明了pa、pasfns和crgd-pasfns生物安全性良好。
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根据以上实验结果可以看出，根据本发明的广藿香醇丝素蛋白纳米粒，其具有更好的抗炎效果，特别是对于rgd修饰的丝素蛋白纳米粒而言，其抗炎效果特别优异。
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以上实施方式本质上仅为辅助说明，且并不欲用以限制申请目标的实施例或这些实施例的应用或用途。在本文中，用语“例示性”代表“作为一个实例、范例或说明”。本文中任一种例示性的实施形态并不必然可解读为相对于其他实施形态而言为优选或较有利者。
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此外，尽管已于前述实施方式中提出至少一例示性实施例或比较例，但应了解本发明仍可存在大量的变化。同样应了解的是，本文所述的实施例并不欲用以通过任何方式限制所请求的申请目标的范围、用途或组态。相反的，前述实施方式将可提供本领域具有普通知识人员一种简便的指引以实施所述的一种或多种实施例。再者，可对要素的功能与排列进行各种变化而不脱离申请专利范围所界定的范围，且申请专利范围包含已知的均等物及在本专利申请案提出申请时的所有可预见均等物。