一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法与流程

1.本发明涉及质粒生产技术领域，特别是涉及一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法。


背景技术：

2.近年来随着基因治疗和细胞治疗获得越来越多的关注和研究，质粒在dna疫苗、基因治疗和细胞治疗有着广泛应用。相比其它拓扑结构的质粒dna，超螺旋结构的质粒在应用治疗中最为有效，转染效率更高。这是因为超螺旋质粒结构极度紧密，更易于进入细胞核，并且是唯一适应于在真核细胞中表现生物活性的天然完整结构。所以获得高含量的超螺旋质粒dna十分重要。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是常规亲和层析中，纯化得到的质粒超螺旋比例低，限制了下游应用。本发明提供一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法，采用不同硫酸铵盐浓度梯度的洗杂缓冲液，达到优先去除开环、线性等结构的质粒，能够有效提高亲和层析后质粒超螺旋的比例，提高质粒质量，满足下游应用，快速易操作，纯化效果好，有效解决现有纯化条件导致的超螺旋比例不高等问题。
4.为实现上述目的及其他相关目的，
5.本发明提供一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法，包括如下步骤：
6.步骤一、将样品混合液上样至生物层析系统的亲和填料上；
7.步骤二、经过第一缓冲液洗杂、第二缓冲液梯度洗杂、洗脱液处理后，即得超螺旋质粒；
8.其中，所述第一缓冲液和第二缓冲液均为包括无机盐的tris-edta溶液。
9.在质粒亲和层析过程中提高超螺旋比例，明通过优化质粒样品上样条件，以及洗杂过程中，增加洗杂溶液中盐浓度梯度，优先将线性、开环等结构质粒洗脱出来，从而提高终产品的超螺旋比例，收集的质粒超螺旋比例为大于95％。
10.于本发明的一实施例中，所述样品混合液的制备过程为：将质粒样品溶解于第三缓冲液中，即可。
11.于本发明的一实施例中，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为包括硫酸铵的tris-edta溶液。
12.于本发明的一实施例中，所述第一缓冲液包括如下组分：1.95～2.02m的硫酸铵，80～120mm的tris，8～12mm的edta；
13.所述第二缓冲液包括如下组分：1.85～2.02m的硫酸铵，80～120mm的tris，8～12mm的edta；所述第三缓冲液包括如下组分：1.95～2.02m的硫酸铵，80～120mm的tris，8～12mm的edta，0.25～0.35m氯化钠。
14.于本发明的一实施例中，所述第一缓冲液包括如下组分：1.98～2.0m的硫酸铵，80
～120mm的tris，8～12mm的edta；
15.所述第二缓冲液包括如下组分：1.90～2.0m的硫酸铵，80～120mm的tris，8～12mm的edta；所述第三缓冲液包括如下组分：1.98～2.0m的硫酸铵，80～120mm的tris，8～12mm的edta，0.28～0.32m氯化钠。
16.于本发明的一实施例中，所述第二缓冲液中相邻梯度溶液的硫酸铵浓度差≤0.02m。
17.于本发明的一实施例中，所述第二缓冲液中硫酸铵浓度梯度递减。
18.于本发明的一实施例中，所述洗脱液包括如下组分：80～120mm的tris，8～12mm的edta。
19.于本发明的一实施例中，所述洗脱液包括如下组分：80～120mm的tris，8～12mm的edta。
20.于本发明的一实施例中，所述亲和填料为巯基吡啶修饰的亲和填料。
21.如上所述，本发明的一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法，具有以下有益效果：本发明通过优化质粒上样的缓冲液条件，以及增加洗杂梯度，可以快速有效将线性、开环等结构质粒优先洗杂出来，从而提高终产品的超螺旋质粒比例，收集的质粒超螺旋比例为大于95％。本发明的操作可行性强，纯化出的质粒质量高。
附图说明
22.图1为对比例1分峰收集的谱图。
23.图2为实施例1分峰收集的谱图。
24.图3为实施例1中两种上样条件的琼脂糖凝胶电泳图。
25.图4为本发明实施例2分峰收集的谱图。
26.图5为本发明实施例2中洗脱峰的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
27.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
28.对比例1
29.国内外填料生产厂家一般都建议上样质粒样品处于含2.1m硫酸铵浓度的tris-edta缓冲液体系，tris-edta缓冲液体系包括10mm tris和1mm edta，tris-edta缓冲液体系的ph为8.0。
30.按照上述tris-edta缓冲液体系进行生物层析清洗，再采用洗脱液洗脱后收集超螺旋质粒样品，并分峰收集，对上样流穿样品进行琼脂糖凝胶电泳跑胶分析。对比例1因为上样没有开环线性结构质粒流穿，必然导致终产品超螺旋比例较低，一般为86％左右。
31.实施例1
32.一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法，包括如下步骤：
33.步骤一、将质粒经分子筛层析后溶解于第三缓冲液中，样品混合液上样至生物层析系统的亲和填料上；其中，第三缓冲液包括如下组分：2.0m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
34.步骤二、质粒经过第一缓冲液洗杂，第一缓冲液包括如下组分：2.0m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
35.步骤三、再经过第二缓冲液梯度冲洗层析柱，第二缓冲液的梯度区别在于硫酸铵浓度(浓度设置为1.99m、1.98m、1.97m、1.96m)；其中，第二缓冲液还包括如下组分：100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
36.步骤四、最终再以洗脱液将超螺旋质粒洗脱收集；其中，洗脱液包括如下组分：1.7m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，0.3m氯化钠，ph7.5。
37.步骤五、洗杂洗脱后收集超螺旋质粒样品，并分峰收集，对上样流穿样品进行琼脂糖凝胶电泳跑胶分析。
38.将实施例1和对比例1进行对比分析，具体如下：
39.图1为对比例1中质粒溶解于含2.1m硫酸铵的tris-edta缓冲液上样亲和层析。可以看出在此条件下上样，在上样过程中，无质粒样品流穿，说明超螺旋和非超螺旋质粒均全部结合到亲和层析柱，不利于区分出超螺旋和非超螺旋质粒，最终影响终产品的超螺旋比例。
40.图2为本发明实施例1中质粒溶解于含2.0m硫酸铵的tris-edta缓冲液上样亲和层析。可以看出在此条件下上样，在上样过程中，有质粒样品流穿，结合图3，可以证明流穿质粒为非超螺旋结构质粒。再通过增加一步第二缓冲液(硫酸铵-tris-edta缓冲液)梯度洗杂，最终一步洗脱得到最终质粒。
41.图3为本发明实施例1中两种上样条件的琼脂糖凝胶电泳图。图3中的泳道均为实施例1中的样品。分别是：泳道1为ac亲和层析上样样品，泳道2为上样流穿峰，泳道3为15％b(即1.96m硫酸铵浓度)洗杂峰，泳道4为亲和层析洗脱液。
42.结合琼脂糖凝胶电泳图可以证明，在含2.0m硫酸铵的tris-edta缓冲液上样至亲和层析填料过程中，线性和开环等结构质粒会流穿出来，可以大大提高终产品中质粒的超螺旋比例。说明本发明的通过优化上样条件，可以优先去除大部分线性和开环等结构质粒，再通过增加一步洗杂，最终提高终产品质粒的超螺旋含量。
43.实施例2：增加洗杂梯度优化洗杂条件
44.在一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法，包括如下步骤：
45.步骤一、将质粒经分子筛层析后溶解于第三缓冲液中，样品混合液上样至生物层析系统的亲和填料上；其中，第三缓冲液包括如下组分：2.0m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
46.步骤二、质粒经过第一缓冲液洗杂，第一缓冲液包括如下组分：2.0m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
47.步骤三、再经过第二缓冲液梯度冲洗层析柱，第二缓冲液的梯度区别在于硫酸铵浓度(浓度设置为1.99m、1.97m、1.96m、1.94m)；其中，第二缓冲液还包括如下组分：100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
48.步骤四、最终再以洗脱液将超螺旋质粒洗脱收集；其中，洗脱液包括如下组分：1.7m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，0.3m氯化钠，ph7.5。
49.步骤五、洗杂洗脱后收集超螺旋质粒样品，并分峰收集，对上样流穿样品进行琼脂糖凝胶电泳跑胶分析。
50.图4为本发明实施例2分峰收集的谱图。
51.图5为本发明实施例2中洗脱峰的琼脂糖凝胶电泳图。可以看出在此优化的洗杂梯度下，开环和线性等结构质粒被优先洗脱，从而提高终产品质粒中超螺旋含量。泳道1为亲和层析上样样品及对应的超螺旋比例为40.5％；泳道2为上样过程的流穿峰；泳道3至泳道6分别对应为1.99m硫酸铵、1.97m硫酸铵、1.96m硫酸铵、1.94m硫酸铵对应的洗杂峰的电泳条带。泳道7为亲和层析洗脱液(洗脱液溶液为含1.7m硫酸铵和0.3m氯化钠缓冲液)。
52.实施例3～8与实施例2的区别在于第一缓冲液、第三缓冲液、洗脱液中硫酸铵的浓度不同，具体如下表：
53.表1
[0054][0055][0056]
实施例8
[0057]
一种提高超螺旋比例的质粒亲和层析方法，包括如下步骤：
[0058]
步骤一、将质粒经分子筛层析后溶解于第三缓冲液中，样品混合液上样至生物层析系统的亲和填料上；其中，第三缓冲液包括如下组分：2.0m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
[0059]
步骤二、质粒经过第一缓冲液洗杂，第一缓冲液包括如下组分：2.0m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
[0060]
步骤三、再经过第二缓冲液梯度冲洗层析柱，第二缓冲液的梯度区别在于硫酸铵浓度(浓度设置为2.0m、1.96m)；其中，第二缓冲液还包括如下组分：100mm的tris，10mm的edta，ph7.5。
[0061]
步骤四、最终再以洗脱液将超螺旋质粒洗脱收集；其中，洗脱液包括如下组分：1.7m的硫酸铵，100mm的tris，10mm的edta，0.3m氯化钠，ph7.5。
[0062]
步骤五、洗杂洗脱后收集超螺旋质粒样品，并分峰收集，对上样流穿样品进行琼脂糖凝胶电泳跑胶分析。
[0063]
综上所述，本发明通过优化质粒上样的缓冲液条件，以及增加洗杂梯度，可以快速有效将线性、开环等结构质粒优先洗杂出来，从而提高终产品的超螺旋质粒比例，收集的质粒超螺旋比例为大于95％。本发明的操作可行性强，纯化出的质粒质量高。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0064]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。