一种火把花根片体内外成分的检测方法与流程

1.本方案属于中药药物分析领域，具体涉及一种火把花根片体内外成分的检测方法。


背景技术：

2.火把花根片为重庆药研院制药有限公司研发的一种以昆明山海棠去皮根部为原料，经水提醇沉工艺制成的雷公藤属单味制剂，为公司独家产品，主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、慢性肾炎等自身免疫性疾病，该制剂于1985年获得四川省卫生厅颁发的“优秀技术科研成果奖”。
3.现在临床中发现该制剂对于改善肾病的严重蛋白尿症状疗效较好。但该药物药效物质基础与作用机制不明确、缺乏安全性评价系统等，使其从整体到分子水平都很难进行全面系统研究，极大阻碍了该产品的发展进程。长期以来，中药的体外试验不能准确的反应药物的体内活性，体内的药物成分性质与体外试验对照存在诸多不一致现象。传统中药为口服中药，口服药进入机体后经历复杂的代谢过程，只有吸收入血的成分才可能发挥药效。中药血清药物化学的概念，为研究中药药效的物质基础研究提供了科学方法。
4.目前，急需一种对于火把花根片的内外成分相对准确的检测方法。


技术实现要素：

5.本方案的目的在于提供一种火把花根片的检测方法，以相对准确的检测其内外成分。
6.为了达到上述目的，本方案提供一种火把花根片体内外成分的检测方法，包括以下步骤：
7.步骤s10：准确称取火把花根片粉末，溶于适量甲醇中；
8.步骤s20：超声提取后，滤过，挥干溶液；
9.步骤s30：用60％的甲醇溶解残留物，用0.22μm微孔滤膜过滤，去续滤液，即得供试品溶液；
10.步骤s40：使用超高压液相色谱飞行时间质谱仪对供试品溶液分别采用正离子模式和负离子模式进行检测分析，其中，质谱扫描范围为m/z 100-1600da；色谱条件为：zorbax eclipse plus c18色谱柱(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；按照梯度系统条件为：0～15min时，采用95％～0％a和5％～100％b的流动相；15～19min，采用95％a和5％b的流动相，其中a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；对得出的化学成分谱进行分析和鉴定，得到火把花根片的体外成分；
11.步骤s50：对实验鼠灌胃给药15g/kg的火把花根片浸膏，
12.步骤s60：2h后通过眼眶静脉丛采血，置于带有肝素钠的离心管内4000rpm离心20min，取上清液于-80℃冻存，得到血清液；
13.步骤s70：使用超高压液相色谱飞行时间质谱仪对血清液分别采用正离子模式和
负离子模式进行检测分析，其中，质谱扫描范围为m/z 100-1600da；色谱条件为：zorbax eclipse plus c18色谱柱(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；按照梯度系统条件为：0～15min时，采用95％～0％a和5％～100％b的流动相；15～19min，采用95％a和5％b的流动相，其中a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；
14.步骤s80：对得出的化学成分谱进行分析和鉴定，得到火把花根片的体内成分。
15.进一步，还包括步骤s90：取检测出的体内成分和体外成分的标准品，并放置于容量瓶中，用甲醇进行定容，即得对照品溶液，将对照品溶液分别与得出的体内成分和体外成分进行比对，判断结果是否正确。
16.进一步，还包括步骤s65：吸取血清液100μl于1.5ml离心管中，加入5倍预冷甲醇沉淀蛋白质，涡旋1min使其充分混匀后12000rpm离心10min；离心后，使用氮吹仪完全干燥并加入100μl甲醇进行复溶，超声10min充分溶解后12000rpm离心10min，取上清液，得到待测试的血清液。
17.通过采用本方案的一种火把花根片的检测方法，顺利的测出火把花根片的14种体外成分，分别是：雷公藤内酯三醇、mayteine、雷公藤春碱、山海棠二萜内酯、雷藤二萜酸、雷公藤对醌a、雷公藤对醌b、雷酚内酯、雷公藤宁碱a、雷公藤次碱、雷公藤三萜酸a、雷公藤三萜酸c、雷公藤甲素、雷公藤红素；
18.以及6种体内成分，雷公藤内酯三醇、雷公藤春碱、雷藤二萜酸、雷酚内酯、雷公藤甲素、雷公藤红素，为研究中药火把花根片药效的物质基础提供了科学方法。
19.本文所述的梯度系统条件是指，a和b的含量比例按照梯度比例进行调整，比如当a为5％时，b则为95％，当a为10％时，b则为90％，依次类推。
附图说明
20.图1是uplc-q-tof-ms法检测火把花根片体外成分的总离子流程图(a、b为正、负离子模式，c～n为14种体外化学成分提取质谱图)。
21.图2是火把花根片体外成分化合物的结构式示意图。
22.图3是uplc-q-tof-ms法检测火把花根片体内血清中化学成分的总离子流程图(a、b为正、负离子模式，c、d为空白血清溶液，e～j为6种体内血清中化学成分提取质谱图)。
23.图4是火把花根片给予大鼠后血清中原型化合物的结构式示意图。
具体实施方式
24.下面通过具体实施方式进一步详细的说明：
25.实施例1
26.本实施例提供一种火把花根片体内外成分的检测方法，包括以下步骤：
27.步骤s10：准确称取火把花根片粉末，溶于适量甲醇中；
28.步骤s20：超声提取后，滤过，挥干溶液；
29.步骤s30：用60％的甲醇溶解残留物，用0.22μm微孔滤膜过滤，去续滤液，即得供试品溶液；
30.步骤s40：使用超高压液相色谱飞行时间质谱仪对供试品溶液分别采用正离子模式和负离子模式进行检测分析，其中，质谱扫描范围为m/z 100-1600da；色谱条件为：
zorbax eclipse plus c18色谱柱(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；按照梯度系统条件为：0～15min时，采用95％～0％a和5％～100％b的流动相；15～19min，采用95％a和5％b的流动相，其中a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；对得出的化学成分谱进行分析和鉴定，得到火把花根片的体外成分；
31.步骤s50：对实验鼠灌胃给药15g/kg的火把花根片浸膏，
32.步骤s60：2h后通过眼眶静脉丛采血，置于带有肝素钠的离心管内4000rpm离心20min，取上清液于-80℃冻存，得到血清液；
33.步骤s65：吸取血清液100μl于1.5ml离心管中，加入5倍预冷甲醇沉淀蛋白质，涡旋1min使其充分混匀后12000rpm离心10min；离心后，使用氮吹仪完全干燥并加入100μl甲醇进行复溶，超声10min充分溶解后12000rpm离心10min，取上清液，得到待测试的血清液；
34.步骤s70：使用超高压液相色谱飞行时间质谱仪对步骤s65中得到的血清液分别采用正离子模式和负离子模式进行检测分析，其中，质谱扫描范围为m/z 100-1600da；色谱条件为：zorbax eclipse plus c18色谱柱(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；按照梯度系统条件为：0～15min时，采用95％～0％a和5％～100％b的流动相；15～19min，采用95％a和5％b的流动相，其中a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；
35.步骤s80：对得出的化学成分谱进行分析和鉴定，得到火把花根片的体内成分；
36.步骤s90：取检测出的体内成分和体外成分的标准品，并放置于容量瓶中，用甲醇进行定容，即得对照品溶液，将对照品溶液分别与得出的体内成分和体外成分进行比对，判断结果是否正确。
37.对比例1
38.本对比例的步骤及原料均与实施例1相同，区别在于，色谱条件为采用的是zorbax eclipse plus c18色谱柱(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；按照梯度系统条件为：0～10min时，采用95％～0％a和5％～100％b的流动相；10～19min，采用95％a和5％b的流动相，其中a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈，其最终检测出的体内成分有雷公藤内酯三醇、mayteine、雷公藤春碱、山海棠二萜内酯、雷藤二萜酸、雷公藤对醌a、雷公藤对醌b、雷公藤红素，体外成分有雷藤内酯三醇、雷公藤春碱、雷藤二萜酸、雷酚内酯、雷公藤红素。
39.对比例2
40.本对比例的步骤及原料均与实施例1相同，区别在于，流动相采用的是zorbax eclipse plus c18色谱柱(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；按照梯度系统条件为：0～15min时，采用95％～0％a和5％～100％b的流动相；15～19min，采用95％a和5％b的流动相，其中a为0.1％甲酸水溶液，b为甲醇，其最终检测出的体内成分有雷公藤内酯三醇、mayteine、雷公藤春碱、山海棠二萜内酯、雷藤二萜酸、雷公藤对醌a、雷公藤对醌b、雷酚内酯、雷公藤宁碱a、雷公藤次碱，体外成分有雷藤内酯三醇、雷公藤春碱、雷藤二萜酸、雷酚内酯。
41.1.1仪器与试剂
42.triple-tof 5600 高分辨质谱仪(美国ab sciex公司)；peak 1.4软件数据处理系统(美国ab sciex公司)；lc-20a超高效液相色谱仪(日本岛津公司，包括自动进样器sil30acxr、柱温仪cto-30ac、脱气器dgu-20a3、控制器cbm-20a)；ynd100-2型干式氮吹仪(上海熙扬仪器有限公司)；xw-80a涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；飞鸽gl-16g-ii高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；sqp quintix224-1cn电子分析天平(赛
多利斯科学仪器有限公司)；
43.1.2试药
44.火把花根片(批号：t210802，重庆市药研院制药有限公司提供)；火把花根片浸膏(批号：t210802，依据《火把花根片质量标准》和《火把花根片检验标准操作规程》检验，固形物含量为68.2％，本品每克浸膏含表儿茶素2.38mg/g，每克浸膏含雷公藤甲素62μg/g，重庆市药研院制药有限公司提供)、雷公藤甲素(纯度≥98％；货号：t3652，sigma-aldrich公司)、雷公藤红素对照品(纯度≥98％；货号：c0869，sigma-aldrich公司)。
45.1.3动物
46.sprague-dawley(sd)大鼠雄性10只，specific pathogen free(spf)级，体重150-170g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号syxk(京)2015-0041。所有动物实验方案均符合中国中医科学院实验动物保护中心的伦理标准，证明编号为erccacms21-2110-01。
47.2.方法
48.2.1火把花根片体外供试品溶液的制备
49.准确称取火把花根片3.6g粉末，溶于50ml甲醇中，超声提取1h后，滤过，挥干溶液，并用60％的甲醇溶解残留物，用0.22μm微孔滤膜过滤，去续滤液，即得体外供试品溶液。
50.2.2火把花根片体内血清供试品溶液的制备
51.灌胃药液以生理盐水为溶剂，将火把花根片浸膏稀释为15g/10ml浓度的混悬液。设置空白组和实验组，每组5只大鼠，实验组给予15g/kg的火把花根浸膏，空白组给予等量的生理盐水。灌胃给药2h后通过眼眶静脉丛采血，置于带有肝素钠的离心管内4000rpm离心20min，取上清液于-80℃冻存。
52.精密吸取大鼠血浆100μl于1.5ml离心管中，加入5倍预冷甲醇沉淀蛋白质，涡旋1min使其充分混匀后12000rpm离心10min。离心后，使用氮吹仪完全干燥并加入100μl甲醇进行复溶，超声10min充分溶解后12000rpm离心10min，取上清液，即得体内血浆供试品溶液。
53.2.3色谱条件
54.色谱柱：zorbax eclipse plus c18(1.8μm，100mm
×
2.1mm)；流动相为0.1％甲酸水溶液(a)-乙腈(b)；梯度系统条件为：0～15min，5％～100b；15～19min，5％ b，柱温度为40℃；流速为0.3ml/min，进样器温度为4℃；进样体积为2μl。
55.2.4质谱条件
56.离子源：电喷雾离子化(esi)；扫描模式：正负离子切换，雷藤二萜酸采用负离子模式，其他活性成分采用正离子模式；离子喷雾电压：-4500v；帘气：35psi；离子源温度：550℃；去簇电压(dp)：-100v，雾化气(gs 1)：55psi，加热气(gs 2)：55psi。质谱扫描范围为m/z 100-1600da；分析软件：peak 1.4软件。
57.3.结果
58.运用uplc-q-tof-ms方法对火把花根片体外化学成分谱进行分析和鉴定，共得到包括雷公藤红素、雷公藤甲素等在内的14种化学成分(图1、2，表1)。其中，雷公藤红素和雷公藤甲素通过相应对照品鉴定得出，其他化合物经由文献检索和质谱片段比对得出。
59.对火把花根片血清成分进行分析，如图3、4、表2所示，得到了火把花根片在大鼠体
内血浆中正、负离子下的质谱数据，经文献查阅以及标准品比对，确定了6种成分，分别为雷藤内酯三醇、雷公藤春碱、雷藤二萜酸、雷酚内酯、雷公藤甲素、雷公藤红素，将火把花根片在大鼠体内血清中的成分与火把花根片体外成分进行对比分析，发现火把花根片中这6种成分均以原型的形式进入大鼠血浆。其中，雷公藤甲素、雷公藤红素有广泛的抗炎免疫药理作用的文献报道。
60.3.1火把花根片体外成分
61.通过uplc-q-tof-ms分析方法，鉴定出14种火把花根片体外成分，分别是雷公藤内酯三醇、mayteine、雷公藤春碱、山海棠二萜内酯、雷藤二萜酸、雷公藤对醌a、雷公藤对醌b、雷酚内酯、雷公藤宁碱a、雷公藤次碱、雷公藤三萜酸a、雷公藤三萜酸c、雷公藤甲素、雷公藤红素，见表1.。
62.表1.火把花根片体外所含主要成分
[0063][0064]
3.2火把花根片在大鼠血清中原型入血成分
[0065]
通过uplc-q-tof-ms分析方法，得到了火把花根片在大鼠体内血清中正、负离子下的质谱数据，经文献查阅以及标准品比对，确定了6种成分，分别为雷藤内酯三醇、雷公藤春碱、雷藤二萜酸、雷酚内酯、雷公藤甲素、雷公藤红素，见表2.。
[0066]
表2.火把花根片体内入血主要成分
[0067][0068]
本实例建立了火把花根片体内外活性成分的uplc-q-tof-ms分析方法，为基于血清化学进一步建立火把花根片含药血清科学性评价系统奠定基础，也为后面确定火把花根片质控指标奠定物质基础和科学依据，并为火把花根片的临床应用提供参考。
[0069]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作
过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。