利用核磁共振氢谱定量检测橘油中柠檬烯含量的方法与流程

1.本发明属于食品检测技术领域，具体涉及利用核磁共振氢谱定量检测橘油中柠檬烯含量的方法。


背景技术：

2.橘油是一种从橘皮中提炼的精油，不但有优雅的甜味，而且还会有橘皮淡淡的味道，另外还会有一种幽幽的香味，可以起到振奋人精神的效果；还具有丰富的维他命c，有抗发炎的功效；与橙花季薰衣草调和使用，可淡化妊娠纹及疤痕；可以治疗肠胃问题，可以调和肠胃、刺激肠胃蠕动、帮助排气以及镇定消化道，刺激食欲等作用。橘皮精油被美国食品和药品管理局(fda)认定为“一般认为安全(gras)的食品添加剂”，是天然的抑菌剂和防腐剂。橘油由两种主要部分组成，含氧化合物和碳烃化合物。含氧化合物(主要包括酯、醛、酮、酚、醇和氧化物)是极性化合物，仅占总量的5％，剩下的碳氢化合物主要为柠檬烯，含量的高低决定了柠檬烯的品质。
3.由于柠檬烯具有多种生理和生物活性，所以在医药工业和农药行业中都有广泛的应用。许多证据支持柠檬烯在癌症预防和治疗中有作用。利用柠檬烯精油作原料生产祛痰止咳、利胆溶石、消炎止痛等药物；在洗涤工业中添加柠檬烯精油将其作为香精增加香气；此外，在农药中它还被用作特殊环保溶剂原料和杀虫剂等。快速准确测定柠檬烯的含量是推动精油市场良好发展的前提保障。
4.目前，对于橘油中柠檬烯的测定方法主要包括气相色谱、液相色谱法等。这些方法都需要柠檬烯的标准样品，比较多的前处理步骤，且气相色谱法需要高纯的载气，液相色谱法需要有毒的流动相，使得测试方法复杂。


技术实现要素：

5.本发明提出一种利用核磁共振氢谱快速定量检测橘油中柠檬烯的方法，此方法简单、快速、准确，无需使用柠檬烯的标准品，无需前处理，也无需有毒的流动相。
6.本发明提出一种利用核磁共振氢谱定量检测橘油中柠檬烯含量的方法，包括如下步骤：
7.利用核磁共振氢谱定量检测橘油中柠檬烯过程中，称取待测橘油样品，往待测橘油样品中加入内标物质后，从待测橘油样品中称取上机样品，通过测定量氢谱，然后根据式(1)、式(2)，计算得待测橘油样品中柠檬烯的含量；
[0008][0009][0010]
其中，m0为上机样品中柠檬烯的质量，ms为柠檬烯的分子量，m
std
为内标物质的分子量，nh
std
为内标物质定量峰代表的氢原子数，nhs为柠檬烯的定量峰代表的氢原子数，as为柠檬烯定量峰积分面积，a
std
为内标物质定量峰积分面积，m
std
为上机样品中内标物质的质量，cs
为橘油中柠檬烯的含量，m为上机样品中橘油的质量。
[0011]
现有技术中从未公开利用核磁共振检测橘油中柠檬烯量。该方法前处理简单，只需要待测物中加入适量的内标物质和锁场试剂，测试定量氢谱就可得到橘油中柠檬烯的含量。方法简单、快速、准确度高。
[0012]
进一步地，检测过程中，待测橘油样品中加入锁场试剂。锁场试剂需要能溶解待测橘油样品和内标物质，氘代残留信号或氟代残留信号不能和柠檬烯和内标物质定量峰重叠。
[0013]
进一步地，所述锁场试剂包括氘代锁场试剂或氟代锁场试剂。例如，所述氘代锁场试剂可以为氘代氯仿、氘代丙酮、氘代二甲基亚砜、六氟苯等。优选的，所述氘代锁场试剂为氘代氯仿。锁场试剂的量需要根据仪器灵敏度来确定，一般对于400m的仪器至少需要50至100μl。
[0014]
进一步地，利用核磁共振氢谱定量检测橘油中柠檬烯过程中，采用内标法进行检测。
[0015]
进一步地，内标物质需满足不与待测物质反应；内标物质定量峰不与待测物质以及基质物质信号峰重叠；定量峰的纵向弛豫时间应尽量小，最好小于待测物定量峰纵向弛豫时间；内标物定量峰与待测物定量峰基线分离的前提下位移尽量相近。优选对苯二甲酸二甲酯或对二甲苯中一种。
[0016]
进一步地，所述内标法包括如下步骤：
[0017]
a)配样：向待测橘油样品中加入内标物质，用锁场试剂溶解待测橘油样品和内标物质的混合物，从中取上机样品，转入核磁管中，待测；
[0018]
b)将步骤a)所得上机样品进样后，首先测定样品中柠檬烯和内标物质的纵向弛豫时间，然后确定内标物质和柠檬烯的定量峰，根据上述纵向弛豫时间和上述定量峰确定上机测试的弛豫延迟时间、激发中间位置，然后测定量的氢谱；
[0019]
c)步骤b)所得测试结果，经傅里叶变换，相位调整，基线校正，并对内标物质和样品定量峰进行积分，然后根据式(1)、式(2)计算得待测橘油样品中柠檬烯的含量；
[0020][0021][0022]
其中，m0为上机样品中柠檬烯的质量，ms为柠檬烯的分子量，m
std
为内标物质的分子量，nh
std
为内标物质定量峰代表的氢原子数，nhs为柠檬烯的定量峰代表的氢原子数，as为柠檬烯定量峰积分面积，a
std
为内标物质定量峰积分面积，m
std
为上机样品中内标物质的质量，cs为橘油中柠檬烯的含量，m为上机样品中橘油的质量。
[0023]
本发明具有以下优势：
[0024]
本发明提出利用核磁共振氢谱定量检测橘油中柠檬烯的含量。该方法对样品无破坏性，前处理简单，不需要待测物质的标准品，且除使用少量的锁场试剂外，无需大量使用有毒试剂，可简单、快速、准确的实现橘油中柠檬烯的定量检测。
附图说明
[0025]
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实
施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0026]
图1为本发明实施例中加入内标物质对苯二甲酸二甲酯的橘油核磁共振氢谱图。
具体实施方式
[0027]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0028]
下面将结合实施例详细阐述本发明。
[0029]
实施例1利用核磁共振内标法定量检测橘油中柠檬烯
[0030]
1所用试剂材料及仪器设备
[0031]
1.1所用试剂：橘油由各大购物平台购买或由柑橘或橙皮自制；柠檬烯(95％)，北京百灵威科技有限公司；氘代氯仿(99.8atom％d,with 0.03％(v/v)tms)，北京伊诺凯科技有限公司；对苯二甲酸二甲酯(99％)，北京伊诺凯科技有限公司。
[0032]
1.2所用仪器：bruker avanceⅲhd 400m波谱仪(bruker biospin，rheinstetten，德国)；bruker自动进样器(samplejet)；bruker samplejet 5mm高通量核磁管(bruker biospin，rheinstetten，德国)；涡旋混合器(mx-s)，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司。
[0033]
2样品配制和测试步骤
[0034]
2.1果皮中精油提取：将水果洗净，剥取外果皮用剪刀剪碎称取60g，加入600ml石油醚，采用索氏提取法提取2h，过滤，将滤液进行低温旋蒸(不超过50℃)，浓缩至浅棕色，得橘油备用。
[0035]
2.2内标物质对苯二甲酸二甲酯的氘代氯的仿溶液配制：准确称取100mg对苯二甲酸二甲酯于10ml的容量瓶，用氘代氯仿定容并充分摇匀，得对苯二甲酸二甲酯的氘代氯仿溶液待用。
[0036]
2.3d-柠檬烯样品上机系列溶液配制，用于验证实验
[0037]
2.3.1准确称取300mg柠檬烯于10ml容量瓶中，用氘代氯仿定容，并摇匀，得d-柠檬烯溶液待用；准确量取500μl以上配置的d-柠檬烯溶液，再准确量取500μl步骤(2.2)配置的对苯二甲酸二甲酯氘代氯仿溶液加入其中，充分摇匀，取0.6ml于核磁管中待测；
[0038]
2.3.2准确量取400μl步骤(2.3.1)配置的d-柠檬烯溶液，再准确量取500μl步骤(2.2)配置的对苯二甲酸二甲酯氘代氯仿溶液加入其中，充分摇匀，取0.6ml于核磁管中待测；
[0039]
2.3.4准确量取300μl步骤(2.3.1)配置的d-柠檬烯溶液，再准确量取500μl步骤(2.2)配置的对苯二甲酸二甲酯氘代氯仿溶液加入其中，充分摇匀，取0.6ml于核磁管中待测；
[0040]
2.3.5准确量取200μl步骤(2.3.1)配置的d-柠檬烯溶液，再准确量取500μl步骤(2.2)配置的对苯二甲酸二甲酯氘代氯仿溶液加入其中，充分摇匀，取0.6ml于核磁管中待测；
[0041]
2.3.6准确量取100μl步骤(2.3.1)配置的d-柠檬烯溶液，再准确量取500μl步骤(2.2)配置的对苯二甲酸二甲酯氘代氯仿溶液加入其中，充分摇匀，取0.6ml于核磁管中待测。
[0042]
2.4上机样品配制：取250mg橘油样品于10ml的容量瓶中，再加入50mg对苯二甲酸
二甲酯，用氘代氯仿定容，充分摇匀后，取0.6ml于核磁管中待测。每天测试5次，连续测定5天，计算精密度。
[0043]
2.5回收率测定样品配置，用于验证实验
[0044]
2.5.1准确量取1ml精油样品溶液于2ml离心管中，加入1.3mg d-柠檬烯样品，确保充分溶解，取600μl加入核磁管中待测。检测3次。
[0045]
2.5.2准确量取1ml精油样品溶液于2ml离心管中，加入2.5mg d-柠檬烯样品，确保充分溶解，取600μl加入核磁管中待测。检测3次。
[0046]
2.5.3准确量取1ml精油样品于溶液2ml离心管中，加入5mg d-柠檬烯样品，确保充分溶解，取600μl加入核磁管中待测。检测3次。
[0047]
2.5.4准确量取1ml精油样品溶液于2ml离心管中，加入10mg d-柠檬烯样品，确保充分溶解，取600μl加入核磁管中待测。检测3次。
[0048]
2.6调整测试参数并测试：首先用2.4所配置样品进样，然后用氘代氯仿锁场和匀场，测试待测样品中柠檬烯和内标物质对苯二甲酸二甲酯的信号的纵向弛豫时间，确定柠檬烯的定量峰为δ4.70(tmsδ0)，对苯二甲酸二甲酯的定量峰为δ3.95(tmsδ0)，激发中间位置(定量峰化学位移平均值)为4.33。测试温度为300k(
±
0.1)，弛豫延迟时间d1＝20s。然后开始采样。2.3、2.5所配置样品测试参数相同。
[0049]
2.7数据处理及结果计算：2.6得到的测试结果，设置线宽因子lb＝0.3hz，傅里叶变换，相位校正，基线校正，对样品定量峰δ4.70的信号和内标物对苯二甲酸二甲酯定量峰δ3.95进行积分，得到定量峰积分面积。
[0050]
根据式(1)、(2)计算得到橘油中柠檬烯的含量。具体见表1。
[0051][0052][0053]
其中，m0为上机样品中柠檬烯的质量，ms为柠檬烯的分子量，m
std
为内标物质的分子量，nh
std
为内标物质定量峰代表的氢原子数，nhs为柠檬烯的定量峰代表的氢原子数，as为柠檬烯定量峰积分面积，a
std
为内标物质定量峰积分面积，m
std
为上机样品中内标物质的质量，cs为橘油中柠檬烯的含量，m为上机样品中橘油的质量。
[0054]
表1样品检测结果
[0055][0056]
3方法验证
[0057]
3.1线性关系考察
[0058]
以上述步骤(2.3)中柠檬烯的实际浓度为纵坐标，上述步骤(2.3)中柠檬烯样品实际测试得到的浓度为横坐标，做线性回归，得线性方程为y＝1.0626x 0.0003，r2＝0.9993，可见，线性关系良好。
[0059]
3.2橘油中柠檬烯测定的精密度试验
[0060]
随机取一个橘油样品，按照上述步骤(2.4)的方法配置上机样品，每天测5次，连续检测5天，计算日内和日间精密度。由表2可知，日内和日间精密度均小于5％，说明方法具有良好的精密度。
[0061]
表2方法日内精密度试验
[0062][0063]
4橘油中柠檬烯测定加标回收率分析
[0064]
橘油样品分别添加50g/kg、100g/kg、150g/kg、200g/kg 4个不同水平的柠檬烯溶液，每个水平重复测3次，结果取平均值，如表3所示，平均回收率为104.29％～106.27％之间。
[0065]
表3方法的加标回收率试验
[0066][0067]
5结论
[0068]
本发明建立了核磁共振氢谱定量测定橘油中柠檬烯的方法，橘油不需要前处理，测试简单、快速，准确性、重复性好，定量限可达到0.5mg/l(s/n＝10)，检测限可到0.2mg/l(s/n＝3)，对于扫描时间更长，灵敏度更高的核磁共振仪器定量限和检测限可以更低。
[0069]
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，但本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。