一种含有msc细胞的制剂
技术领域
1.本发明属于细胞制剂领域，涉及一种含有msc细胞的制剂。
背景技术：
2.msc细胞(msc，mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞。
3.msc细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
4.大量研究表明msc在用于心血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和骨髓神经损伤、老年痴呆以及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗方面具有重大作用；并在美容、保健、抗衰老等方面有巨大的发展前景。如中国专利cn104136034b间充质基质细胞及其相关用途、cn102008507b人脐带msc细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法
……
但现有技术总结的msc制剂在输入治疗后，会有不良反应，如发烧，文献中的最高发生率大概为39%；分析原因主要是人类 msc (hmsc) 的确切特性可能会因多种参数（包括组织来源、分离方法和培养基成分）而有很大差异【文献1】。
5.人脐静脉内皮祖细胞分离自脐带组织；它是脐静脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。
6.文献1：isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. mushahary d, spittler a, kasper c, weber v, charwat v. cytometry a. 2018 jan;93(1):19-31.。
技术实现要素：
7.本技术基于现状提供一种含有msc细胞的制剂，从msc细胞的培养过程中，避免动物源性成份的引入；同时，调控脐带获取msc过程中携带内皮祖细胞的含量，实现对msc细胞最优性能的保持；最终，本技术获得的含有msc细胞的制剂成份简单明确，无毒副作用，且具有好的稳定性能。
8.为实现上述技术目的，本技术采取的技术方案为，一种含有msc细胞的制剂，所述制剂包括来源于脐带的msc细胞和来源于脐带的内皮祖细胞；其中，所述制剂中msc细胞的浓度是0.1
×
10
6-12
×
106细胞/ml；所述msc细胞的含量≥90%，且所述内皮祖细胞的含量≤10%。
9.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞的浓度是0.6
×
10
6-4
×
106细胞/ml。
10.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞的含量≥95%，且所述内皮祖细胞的含量≤5%。
11.作为本技术改进的技术方案，所述制剂还包括注射液，所述来源于脐带的msc细胞与来源于脐带的内皮祖细胞均悬浮于注射液中。
12.作为本技术改进的技术方案，在用于静脉注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或右旋糖酐40葡萄糖注射液。
13.作为本技术改进的技术方案，在用于局部关节腔注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或透明质酸注射液。
14.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中的细胞是对脐带组织采用组织块贴壁法分离获得，并采用无动物源性的重组细胞解离酶消化，并采用dpbs中和后进行传代培养获得。
15.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞为脐带提取msc细胞并传代6-8代的细胞；所述内皮祖细胞为脐带提取内皮祖细胞并传代6-8代的细胞。
16.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中的细胞在传代过程中的接种密度0.5
×
103/cm
2-7
×
103/cm2。
17.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中的细胞传代过程中时长设为96-144h。
18.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞进行传代培养过程中收集细胞的离心速度不大于300g/10min。
19.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞在进行传代培养时采取的培养基为mem-α，并添加5%的血清替代物。
20.作为本技术改进的技术方案，所述血清替代物包括elitegro-adv、ultragro-advanced、knockoutserum replacement、cts knockout sr、xenofree kit中的一种。
21.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞在进行传代培养时采取的培养基还含有≤10%的内皮祖细胞培养基，所述ecm为添加human bfgf、human egf和human vegf的mem-α，ecm为内皮祖细胞培养基，human bfgf、human egf和human vegf终浓度均为10ng/ml。
22.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中细胞冻存方式选择为：设计含有msc细胞的制剂中细胞的冻存密度为1.3
×
107/ml-3.3
×
107/ml;冻存液选择为：基础培养基为mscm，添加剂为体积浓度为7.5%的dmso；所述mscm为添加5%的血清替代物的mem-α培养基，所述血清替代物包括elitegro-adv、ultragro-advanced、knockoutserum replacement、cts knockout sr、xenofree kit中的一种；冻存工艺条件为：在-80℃保存16h后，转至液氮罐。
23.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞制剂可用于多发性硬化、骨质疏松症、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、gvhd、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生、葡萄膜炎或其组合。
24.有益效果
本技术的msc细胞与内皮祖细胞均来源于脐带，即具有来源丰富，无创取材，免疫原性低以及避免伦理争议等优点。本技术含有msc细胞的制剂低温下具有好的短期稳定性，在冻存条件下具有好的长期稳定性。
25.本发明实施例提供的含有msc细胞的制剂制备方法步骤简单，重复率高，适用于大规模生产。
26.本技术的含有msc细胞的制剂能够广泛适用于多类疾病，对多类疾病具有好的改善作用；并且经过动物模型实验验证不具有毒性；尤其是能够适应于现有技术已经验证的msc细胞所适用的病症。
27.应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。
附图说明
28.图1 去势手术后0-12周 假手术和造模组体重均持续增长图；图2 去势手术后0-12周 造模组相对体重增长率显著高于假手术组相对体重增长率（***，p《0.01)；图3 给药期间 假手术组动物、模型对照组动物、msc治疗组动物体重均增长；图4 去势手术后12周 假手术和造模组动物股骨远端骨小梁骨密度比较：相较于假手术组，造模组动物股骨远端骨小梁骨密度（trabeculae mean bmd）有降低趋势，但不具有显著性差异；图5 去势手术后12周 假手术和造模组动物股骨骨小梁数比较：相较于假手术组，造模组动物骨小梁数(tb.n)显著降低（***p《0.05）；图6 去势手术后12周 假手术和造模组动物股骨骨小梁连接密度比较：相较于假手术组，造模组动物骨小梁连接密度（conn.d）显著降低（**p《0.05）；图7 实验终点 假手术组、模型对照组和msc治疗组动物股骨干bmd change% 比较：模型对照组动物股骨干骨密度bmd change%显著低于假手术组bmd change%（*p＜0.05），msc治疗组股骨干骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（##p＜0.01）。
29.图8 实验终点 假手术组、模型对照组和msc治疗组动物股骨颈bmd change%比较，msc治疗组股骨颈骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（#p＜0.05）。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
31.定义：稳定性，终产品注射前稳定性：msc终产品需要在与注射溶液混合均匀后，方可通
过静脉注射进行给药；在msc与注射溶液混合、直到msc注射给药完毕的时间里，msc产品的细胞数量和活率必须符合质量标准规定，以确保安全和有效。
32.脐带msc细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低。故本技术的msc来源于脐带组织。
33.注射液：供注入体内的无菌溶液，用于悬浮来源于脐带的msc细胞与来源于脐带的内皮祖细胞均悬浮于注射液中。为保证药效，在用于静脉注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或右旋糖酐40葡萄糖注射液。在用于局部关节腔注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或透明质酸注射液。
34.本文所用氯化钠注射液：0.9 %，生产厂家：四川科伦药业股份有限公司，批号：m19051004-2 ；注射用盐酸博莱霉素（博莱霉素），生产单位：日本化药株式会社，批号：790670。
35.cd34是由位于1q32的基因编码的相对分子质量为110000的单链跨膜糖蛋白，可表达干正常的内皮祖细胞、脾边缘带细胞、环绕于血管、神经、肌束、皮肤附属器和乳腺小叶基质周围的树突状间质细胞。但脐带来源的细胞在经过消化、分离后与msc细胞最接近的细胞则为内皮祖细胞。
36.本技术主要从脐带分离同时获取msc与内皮祖细胞，并进行条件式扩增培养，以研究脐带来源的msc与内皮祖细胞之间在培养与药用过程中的相互关系。
37.下面将结合具体实施方式对本技术的技术方案做清楚完整的说明。
38.一、含有msc细胞的制剂中脐带来源的msc细胞与脐带来源的内皮祖细胞的获取方式a）原代细胞获取为了提高细胞的纯度以及避免动物源成份的引入，本技术在获取原代细胞（p0细胞，包括msc细胞与内皮祖细胞）时主要采用组织块贴壁法，以物理手段移除羊膜、血管等，其在不使用胰酶等物料的前提下能获得高纯度细胞，也更好的保持细胞自身活性，相对于酶消化法更适合临床应用。
39.b）原代细胞的传代培养由于本技术方案细胞制剂的最终用途是药用，故在消化、传代、冻存等过程中均必须避免使用动物源性试剂。
40.故本技术方案采用的是无动物源性的重组细胞解离酶：如tryple产品，tryple可适用于血清替代物和无血清条件下解离细胞，其在室温下稳定，并且消化完成后无需使用特定的蛋白酶抑制剂灭活；又如hyrtryp细胞分离试剂产品，其符合cgmp、iso 9001:2015、iso13485:2016等标准，无论从法规安全性还是从下游纯化难度的角度都是更优的选择。
41.本技术的实施例主要选用tryple（在实际应用中也对hyrtryp进行验证，其具有与tryple同样的效果，出于文本节约原则，本文不再重复进行验证及验证结论的描述）。中和溶液的选择：为确保工艺中不引进动物源性成分，放弃使用任何含血清或动物蛋白的中和溶液，本技术方案选择组分明确的dpbs。
42.传代培养基的选择：原代细胞在进行传代培养时采取的培养基为mem-α，并添加5%
的血清替代物，本技术中血清替代物包括elitegro-adv，ultragro-advanced（helios）、knockoutserumreplacement（gibco）、ctsknockoutsr、xenofreekit（gibco）中的一种。
43.为确保可同时获得一定比例的的内皮细胞，传代培养基中还加有ecm培养基（内皮祖细胞培养基），ecm的比例可以是0-10%，近似和内皮细胞的含量比例对应。本技术在培养基中还加入含有≤10%的内皮祖细胞培养基，所述ecm为添加humanbfgf、humanegf和humanvegf的mem-α，ecm为内皮祖细胞培养基，humanbfgf、humanegf和humanvegf终浓度均为10ng/ml。
44.培养基验证：接种密度为6.0
×
103/cm2，培养时间为120h进行培养基的验证；细胞培养过程中，培养基为mem-α，并添加5%的elitegro-adv（其他种类的血清替代物在实验验证过程中具有近似的效果，本文不再重复描述），探讨内皮细胞培养基含量的变化对内皮祖细胞与msc细胞量的影响。见表1，结果显示在≤10%的内皮祖细胞培养基时，二种细胞含量比满足要求。
45.表1培养基设计对细胞量的影响实验组内皮细胞培养基含量细胞形态cd90、cd73与cd105cd3410纤维细胞状全部≥95%≤1!%纤维细胞状全部≥95%≤1.53%纤维细胞状全部≥95%≤2E%纤维细胞状全部≥95%≤5X%纤维细胞状全部≥95%≤8a0%纤维细胞状全部≥90%≤10q2%纤维细胞状全部≥85%≤15%后续实验中，选用培养基为mem-α，并添加5%的elitegro-adv，内皮细胞培养基含量为3%的培养基进行细胞传代与细胞增殖。
46.p0细胞（原代细胞）经tryple孵育5分钟并以dpbs进行中和后，大多数细胞从培养皿脱落；将p0细胞以300g/10分钟离心后重悬于mscm并计算活率，结果显示绝大多数细胞成功离心，细胞活率不低于80%，符合预期。
47.p0细胞以不同接种密度接种于100mm培养皿进行扩增，扩增效果见表2。
48.表2原代细胞不同接种密度下扩增后平均细胞总数
接种密度0.1
×
103/cm20.5
×
103/cm
21×
103/cm22
×
103/cm24
×
103/cm26
×
103/cm210
×
103/cm272h0.01
×
1060.7
×
10
62×
1063.3
×
1063.8
×
1063.5
×
1063.9
×
10696h0.04
×
1061.2
×
1062.5
×
1064.1
×
1064.8
×
1065.1
×
1064.1
×
106120h0.08
×
10
62×
1063.6
×
1064.8
×
1065.1
×
1065.5
×
1064.3
×
106144h0.1
×
1062.3
×
1063.7
×
1065.1
×
1065.2
×
1065.8
×
1064.9
×
106168h0.07
×
1061.8
×
1063.3
×
1065.7
×
1065.0
×
1065.3
×
1063.9
×
106经tryple孵育5分钟并以dpbs进行中和后，大多数细胞从培养皿脱落，室温以300g/5分钟离心后重悬于mscm并计算活率，结果显示细胞活率均不低于90%。
49.本实施例验证了在接种密度为0.5
×
103/cm
2-6
×
103/cm2，培养时间为96h-144h时，细胞具有好的融合率与细胞增殖倍数，获得了预期数量的细胞总数。更优选的是接种密度为1.0
×
103/cm
2-6.0
×
103/cm2，培养时间为120h-144h时，可以将细胞产量最大化，同时确保细胞的高活率，避免过于频繁的消化传代，代表了合适的接种密度和培养时长。
50.c）细胞增殖传代在基于前述实验的基础上细胞培养120h后进行消化传代，对细胞进行计数。以6x103/cm2密度接种，并培养120小时后传代，当培养120h并进行消化传代时，细胞数量对比接种时增加少于10倍；或细胞形态出现明显变化；或任何一个msc阳性标志物的阳性率低于80%时，终止试验。
51.其中，msc细胞阳性标志物为cd90、cd73、cd105；内皮祖细胞阳性标志物cd34。
52.表3 细胞极限传代测试
传代次数接种时细胞数量（100mm培养皿）传代时细胞数量增殖倍数细胞形态cd90、cd73与cd105cd3410.32x1065.3x10616.6纤维细胞状全部≥95%≤2 .32x1066.0x10618.8纤维细胞状全部≥95%≤20.32x1065.3x10616.6纤维细胞状全部≥95%≤2@.32x1065.4x10616.9纤维细胞状全部≥95%≤2P.32x1067.0x10621.8纤维细胞状全部≥95%≤2`.32x1065x10615.6纤维细胞状全部≥95%≤2p.32x1064.6x10614.4纤维细胞状全部≥95%≤2�.32x1064.1x10612.8纤维细胞状全部≥95%≤2�.32x1063.8x10611.9纤维细胞状全部≥95%≤20.32x1062.8x1068.8纤维细胞状（体积增大）全部≥95%≤2%
试验结果显示，细胞在传代9次后，增殖倍数、细胞形态以及阳性标志物的表达都符合要求。传代10次后，细胞体积明显增大，但增殖倍数和阳性标志物的表达都符合要求。
53.根据结果，判定细胞在0.32x106的接种量、120小时的传代间培养时间下，最大传代次数为9次。细胞传代1-8次，平均每次传代细胞增殖16.7倍。为了保证细胞制剂的最大效率的利用与最大活性的保持，本技术msc细胞制剂选用传代6-8代的细胞。
54.为了简化文本描述，后续实验均采用：接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106、传代8次后细胞数量4.1x106的细胞，进行冻存、细胞毒性、含有msc细胞的制剂的稳定性以及动物性模型验证。一般而言，当传代8次的细胞能够无毒性、且具有治疗用途时，其传代3次、4次、5次、6次、7次的细胞也是能够满足相关要求的。
55.d）细胞的冻存冻存溶液测试和冻存步骤确认：以1.0x107/ml、1.3x107/ml、2x107/ml、2.5x107/ml、3.3x107/ml和4x107/ml的密度将细胞分别重悬于mscm（7.5%dmso）、prime-xvf reezis、prime-xvm scf reezis dmso-free三种冻存溶液；灌注冻存管后放进程序降温盒，在-80℃保存16小时后转移至液氮罐内；细胞在液氮保存48小时后，在37℃水浴锅复苏，将复苏后的细胞悬液缓慢加入已装有4ml mscm的15ml离心管后300g/5分钟离心，再将细胞以mscm重悬至1ml并根据质量标准进行检测。具体数据见表4。
56.表4 经过不同冻存液冻存并复苏后细胞的活率 1.0x107/ml1.3x107/ml2x107/ml2.5x107/ml3.3x107/ml4x107/mlmscm（7.5%dmso）88�����%prime-xvfreezis90�����%prime-xvmscfreezisdmso-free89�����%
结果显示3种冻存溶液冻存的细胞复苏后质量都合格，但以1.3x107/ml-3.3x107/ml的冻存密度，在mscm（7.5%dmso）中冻存的细胞活率最高。
57.四）短期稳定性验证短期稳定性：以37℃水浴锅复苏工作库细胞后与注射溶液混合均匀并放置在2-8
℃，在复苏后0、1、2、4、8、12、16、24、32h小时检测细胞活率，为msc终产品（含有msc细胞的制剂）在2-8℃的稳定时间提供依据，预期活率为不低于95%。
58.检测方法：细胞的冻存密度为1.3x107/ml（样本一）、2.0x107/ml（样本二）、2.5x107/ml（样本三）、3.3x107/ml（样本四）、1x107/ml（样本五）和4.3x107/ml（样本六）。在2-8℃环境下，在复苏后0、1、2、4、8、12、16、24、32小时检测细胞活率，结果显示样本一至样本四在32h甚至更长时间内的活率均能满足使用要求。结果显示样本五至样本六在放置16小时后，细胞数量和活率依然符合质量要求，结果见表5。
59.表5 含有msc细胞的制剂短期稳定性时间点0h1h2h4h8h12h16h24h32h样本一活率（%）99.999.799.099.098.598.097.096.095.0样本二活率（%）99.999.098.798.398.197.897.396.495.3样本三活率（%）99.999.198.998.598.097.697.096.095.5样本四活率（%）99.999.398.79897.397.296.896.195.7样本五活率（%）99.899.198.095.093.090.084.080.070.0样本六活率（%）99.999.097.096.095.093.089.086.080.0本技术未公开的实施例即在2℃、3℃、5℃、6℃、7℃、8℃环境下，在复苏后0、1、2、4、8、12、16、24小时检测细胞活率，与4℃环境下检测细胞活率仅有
±
0.4%的误差，此处出于文本节约的原则不再详述，如有需要申请人可以补充。
60.五）长期稳定性验证长期稳定性：确认细胞（msc细胞与内皮祖细胞）在低温冻存下的最长稳定时间（产品有效期），以确定产品的保质期。
61.在-80℃保存16h后，转至液氮罐储存3年后，复苏检测细胞的性能。
62.本实验采用的冻存密度为1.3
×
107/ml。
63.复苏方式：细胞在37℃水浴锅复苏，将复苏后的细胞悬液缓慢加入已装有4ml mscm的15ml离心管后300g/5分钟离心，再将细胞以mscm重悬至1ml并根据质量标准进行检测。
64.表6 含有msc细胞的制剂产品长期稳定性
检测指标检测项目检测方法检测结果物理性质外观目测msc细胞制剂产品稳定性细胞鉴别细胞形态显微镜观察细胞贴壁生长，呈纤维细胞样并且大小均一msc细胞纯度cd90/cd73/cd105流式细胞仪分析各表面标记物均≥95%内皮祖细胞纯度cd34流式细胞仪分析≤2%细胞生长活性细胞存活率细胞计数仪配合台盼蓝拒染法96%免疫原性hla-dr流式细胞仪分析≤2%一般安全性细菌培养法阴性一般安全性真菌培养法阴性一般安全性支原体培养法阴性一般安全性内毒素凝胶法≤0.5eu/ml
当然申请人也对冻存密度为2.3
×
107/ml、冻存密度为3.3
×
107/ml进行验证，其长期稳定性的效果与冻存密度为1.3
×
107/ml基本无区别，本文为了节约文本不再另述。
65.六）细胞毒性实验
本实验设计对照组与试验组，每组20只ncg小鼠，雌雄各半。ncg小鼠每2天给药1次、连续1周（共4次）静脉注射hmsc100并观察4周，观察该供试品可能引起毒性反应的性质、程度、量效和时效关系及可逆性。
66.hmsc100是采用接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106，传代8次后细胞数量4.1x106的细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂。
67.表7 毒性试验剂量设计表
组别给药途径给药剂量（细胞/kg）给药浓度（细胞/ml）给药体积（ml/kg）雌动物（只）雄动物（只）对照组静脉注射
‑‑
51010hmsc100低剂量组静脉注射3
×
1060.6
×
10651010hmsc100高剂量组静脉注射1
×
10
74×
10651010
毒性检测指标：血液生化：观察期结束，hmsc100各组雌、雄鼠alb、tp、a/g、ast、alt、tbil、ck、 chol、tg、crea、urea、glu、ggt、alp、ldh、na 、k 、cl-等血生化指标均未见明显异常改变，代表正常。
68.大体解剖观察：观察期结束，各组雌、雄鼠大体解剖肉眼观察脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠 道、生殖系统等主要脏器，其形态、颜色、质地等均未见明显异常改变，代表正常。
69.综上所述，在本试验条件下，ncg小鼠每2天1次、连续1周（共4次）静脉注射3
×
106、1
×
107细胞/kg的hmsc100并观察4周，各组小鼠一般观察、体重、摄食量、血液学、血生化、大体解剖观察等均未见明显异常改变。
70.七）msc细胞制剂对博莱霉素致肺纤维化模型大鼠的药效研究实验分组：本试验共用55只雄性sd大鼠：首次随机分为正常对照组（10只）和模型组（45只）；肺纤维化模型构建后，再次随机分为供试品低剂量组（2
×
106cells/只/次，1.5ml/只，11只）、供试品高剂量组（6
×
106cells/只/次，1.5ml/只，11只）、市售对照组（吡非尼酮胶囊，批号：191006，240mg/kg，5ml/kg，11只）、模型对照组（氯化钠注射液，12只）及正常对照组（氯化钠注射液，10只）。
71.d1、d5模型组动物均气道内雾化给予博来霉素（5mg/kg，1ml/kg）进行模型构建，正常对照组动物气道内雾化给予氯化钠注射液（1ml/kg）。其中，hmsc100是采用接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106，传代8次后细胞数量4.1x106的细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂。
72.正常对照组、模型对照组、供试品低剂量和高剂量组动物均于d6、d8、d10静脉注射各给予相应药物1次，共给药3次；市售对照组每天灌胃给药1次，共23次（d6-d28）。
73.d28各组动物均进行肺功能检测、称重肺脏重量，计算肺重指数；剪取左肺进行羟脯氨酸含量测定，剩余右肺灌注10%中性缓冲福尔马林溶液后再置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片、制片、he染色进行肺组织炎症细胞浸润程度评价、masson染色进行肺组织纤维化程度评价。
74.结果：造模情况，试验过程中，动物于d1、d5分别气道内雾化博来霉素诱导肺纤维化，显微镜下主要可见肺脏出现不同程度的炎细胞浸润及纤维化等病理学改变，表明肺纤维化模型构建成功。
75.存活率：模型对照组分别于给药d6、d11各死亡1只，供试品低剂量组于d14天死亡1只。正常对照组、模型对照组、hmsc100低剂量组、hmsc100高剂量组及市售对照组动物存活率分别为100%、83%、91%、100%、100%，供试品各组及市售对照组动物存活率均高于模型对照组。
76.肺重指数：与模型对照组动物比较，正常对照组、供试品低剂量组、供试品高剂量组及市售对照组动物的肺重指数均值均降低，且正常对照组具有统计学差异；供试品低剂量组和高剂量组具有剂量依赖性降低。肺羟脯氨酸含量：与模型对照组动物比较，正常对照组、供试品低剂量组、供试品高剂量组动物的羟脯氨酸含量均值均降低，且供试品低剂量组和高剂量组具有统计学差异，且具有剂量依赖性降低。
77.八）hmsc100治疗卵巢切除大鼠骨质疏松药效评价hmsc100是采用接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106，传代8次后细胞数量4.1x106的细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂。假手术组：sham group、模型对照组：model group、msc治疗组：msc group。
78.表8 动物分组信息
组别给药制剂剂量cells/kg给药浓度cells/ml给药体积ml/kg给药途径给药频率和周期动物数量假手术组细胞溶媒//5静脉注射每周一次，四周10模型对照组细胞溶媒//5静脉注射每周一次，四周20msc治疗组hmsc1003
×
1060.6
×
1065静脉注射每周一次，四周20
检测指标：试验期间，各组动物每天观察一次行为状态、摄食量；一周测定一次动物体重；去势手术后3个月及最后一次给药后1周，动物取材，通过micro-ct分析动物股骨骨密度和骨微结构。
79.试验结果1.一般观察及体重所有动物在实验期间，未见异常表现。
80.去势手术后3个月，假手术和造模组动物体重均持续增长。假手术组动物相对体重增长率为20.42%，造模组动物相对体重增长率为35.44%。动物模型满足去势后体重增长规律。具体体重变化趋势见图1、2。
81.给药期间，假手术组动物体重轻度增长，而模型对照组动物体重明显增长，msc治疗组动物体重增长未见明显增长。具体体重变化见图3。
82.2. 骨密度及骨微结构通过micro-ct分析动物股骨骨密度和骨微结构。
83.去势手术后3个月，相较于假手术组，造模组动物股骨远端骨小梁骨密度（trabeculae mean bmd）有降低趋势，骨小梁数(tb.n)显著降低（p《0.05），骨小梁连接密度（conn.d）显著降低（p《0.05）。结果显示造模组符合骨质疏松变化趋势。具体数据见图4、5、6。骨小梁具有支持造血组织以及增加骨的强度的作用，骨小梁数目、质量、方向和厚度等都会骨的强度造成较大影响。
84.治疗期结束后，以各组个体骨密度数值与假手术组骨密度平均值的差值的百分比进行分析（bmd change%=（各组个体bmd数值-假手术组bmd平均值）%；change，变化率），模型
对照组动物股骨干骨密度bmd change%显著低于假手术组bmd change%（p＜0.05），msc治疗组股骨干骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（p＜0.01）。msc治疗组股骨颈骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（p＜0.05）。具体数据见图7、8，结果显示，经去势手术诱导骨质疏松sd大鼠在经hmsc100治疗4周后股骨干和股骨颈骨密度有明显提高，提示msc对骨质疏松症具有较好的治疗效果。
85.九）不同成分的hmsc100治疗卵巢切除大鼠骨质疏松药效评价区别于“hmsc100治疗卵巢切除大鼠骨质疏松药效评价”，本实施例验证的是hmsc100成分与含量对动物股骨干骨密度变化率的影响。不同成分的hmsc100中细胞数量均为4.1x106，采用的均是细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂，给药浓度0.6
×
106cells/ml，给药体积5ml/kg。数据显示的为实验组（msc治疗组）相对于造模组（无治疗组）股骨干骨密度的变化率（表8）。
86.表9 hmsc100成分与含量对动物股骨干骨密度的影响
实验组msc细胞占比内皮足细胞含量fermoralsharftbmdchange%（实验组vs造模组）组一98%2% 6%组二96%4% 4%组三95%5% 3%组四94%6% 1.5%组五90% 1%组六85% 0.5%
实验验证，所述制剂中msc细胞的含量≥90%，且内皮祖细胞的含量≤10%,对骨质疏松的治疗具有好的效果。
87.实际应用时，本技术的msc制剂还具有用于多发性硬化、骨质疏松症、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、gvhd、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生、葡萄膜炎或其组合的治疗。本技术的技术文本出于文本简约原则，仅列举部分的药效评价。
88.虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
技术领域
1.本发明属于细胞制剂领域，涉及一种含有msc细胞的制剂。
背景技术：
2.msc细胞(msc，mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞。
3.msc细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
4.大量研究表明msc在用于心血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和骨髓神经损伤、老年痴呆以及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗方面具有重大作用；并在美容、保健、抗衰老等方面有巨大的发展前景。如中国专利cn104136034b间充质基质细胞及其相关用途、cn102008507b人脐带msc细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法
……
但现有技术总结的msc制剂在输入治疗后，会有不良反应，如发烧，文献中的最高发生率大概为39%；分析原因主要是人类 msc (hmsc) 的确切特性可能会因多种参数（包括组织来源、分离方法和培养基成分）而有很大差异【文献1】。
5.人脐静脉内皮祖细胞分离自脐带组织；它是脐静脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。
6.文献1：isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. mushahary d, spittler a, kasper c, weber v, charwat v. cytometry a. 2018 jan;93(1):19-31.。
技术实现要素：
7.本技术基于现状提供一种含有msc细胞的制剂，从msc细胞的培养过程中，避免动物源性成份的引入；同时，调控脐带获取msc过程中携带内皮祖细胞的含量，实现对msc细胞最优性能的保持；最终，本技术获得的含有msc细胞的制剂成份简单明确，无毒副作用，且具有好的稳定性能。
8.为实现上述技术目的，本技术采取的技术方案为，一种含有msc细胞的制剂，所述制剂包括来源于脐带的msc细胞和来源于脐带的内皮祖细胞；其中，所述制剂中msc细胞的浓度是0.1
×
10
6-12
×
106细胞/ml；所述msc细胞的含量≥90%，且所述内皮祖细胞的含量≤10%。
9.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞的浓度是0.6
×
10
6-4
×
106细胞/ml。
10.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞的含量≥95%，且所述内皮祖细胞的含量≤5%。
11.作为本技术改进的技术方案，所述制剂还包括注射液，所述来源于脐带的msc细胞与来源于脐带的内皮祖细胞均悬浮于注射液中。
12.作为本技术改进的技术方案，在用于静脉注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或右旋糖酐40葡萄糖注射液。
13.作为本技术改进的技术方案，在用于局部关节腔注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或透明质酸注射液。
14.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中的细胞是对脐带组织采用组织块贴壁法分离获得，并采用无动物源性的重组细胞解离酶消化，并采用dpbs中和后进行传代培养获得。
15.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞为脐带提取msc细胞并传代6-8代的细胞；所述内皮祖细胞为脐带提取内皮祖细胞并传代6-8代的细胞。
16.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中的细胞在传代过程中的接种密度0.5
×
103/cm
2-7
×
103/cm2。
17.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中的细胞传代过程中时长设为96-144h。
18.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞进行传代培养过程中收集细胞的离心速度不大于300g/10min。
19.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞在进行传代培养时采取的培养基为mem-α，并添加5%的血清替代物。
20.作为本技术改进的技术方案，所述血清替代物包括elitegro-adv、ultragro-advanced、knockoutserum replacement、cts knockout sr、xenofree kit中的一种。
21.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞在进行传代培养时采取的培养基还含有≤10%的内皮祖细胞培养基，所述ecm为添加human bfgf、human egf和human vegf的mem-α，ecm为内皮祖细胞培养基，human bfgf、human egf和human vegf终浓度均为10ng/ml。
22.作为本技术改进的技术方案，所述含有msc细胞的制剂中细胞冻存方式选择为：设计含有msc细胞的制剂中细胞的冻存密度为1.3
×
107/ml-3.3
×
107/ml;冻存液选择为：基础培养基为mscm，添加剂为体积浓度为7.5%的dmso；所述mscm为添加5%的血清替代物的mem-α培养基，所述血清替代物包括elitegro-adv、ultragro-advanced、knockoutserum replacement、cts knockout sr、xenofree kit中的一种；冻存工艺条件为：在-80℃保存16h后，转至液氮罐。
23.作为本技术改进的技术方案，所述msc细胞制剂可用于多发性硬化、骨质疏松症、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、gvhd、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生、葡萄膜炎或其组合。
24.有益效果
本技术的msc细胞与内皮祖细胞均来源于脐带，即具有来源丰富，无创取材，免疫原性低以及避免伦理争议等优点。本技术含有msc细胞的制剂低温下具有好的短期稳定性，在冻存条件下具有好的长期稳定性。
25.本发明实施例提供的含有msc细胞的制剂制备方法步骤简单，重复率高，适用于大规模生产。
26.本技术的含有msc细胞的制剂能够广泛适用于多类疾病，对多类疾病具有好的改善作用；并且经过动物模型实验验证不具有毒性；尤其是能够适应于现有技术已经验证的msc细胞所适用的病症。
27.应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。
附图说明
28.图1 去势手术后0-12周 假手术和造模组体重均持续增长图；图2 去势手术后0-12周 造模组相对体重增长率显著高于假手术组相对体重增长率（***，p《0.01)；图3 给药期间 假手术组动物、模型对照组动物、msc治疗组动物体重均增长；图4 去势手术后12周 假手术和造模组动物股骨远端骨小梁骨密度比较：相较于假手术组，造模组动物股骨远端骨小梁骨密度（trabeculae mean bmd）有降低趋势，但不具有显著性差异；图5 去势手术后12周 假手术和造模组动物股骨骨小梁数比较：相较于假手术组，造模组动物骨小梁数(tb.n)显著降低（***p《0.05）；图6 去势手术后12周 假手术和造模组动物股骨骨小梁连接密度比较：相较于假手术组，造模组动物骨小梁连接密度（conn.d）显著降低（**p《0.05）；图7 实验终点 假手术组、模型对照组和msc治疗组动物股骨干bmd change% 比较：模型对照组动物股骨干骨密度bmd change%显著低于假手术组bmd change%（*p＜0.05），msc治疗组股骨干骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（##p＜0.01）。
29.图8 实验终点 假手术组、模型对照组和msc治疗组动物股骨颈bmd change%比较，msc治疗组股骨颈骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（#p＜0.05）。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
31.定义：稳定性，终产品注射前稳定性：msc终产品需要在与注射溶液混合均匀后，方可通
过静脉注射进行给药；在msc与注射溶液混合、直到msc注射给药完毕的时间里，msc产品的细胞数量和活率必须符合质量标准规定，以确保安全和有效。
32.脐带msc细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低。故本技术的msc来源于脐带组织。
33.注射液：供注入体内的无菌溶液，用于悬浮来源于脐带的msc细胞与来源于脐带的内皮祖细胞均悬浮于注射液中。为保证药效，在用于静脉注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或右旋糖酐40葡萄糖注射液。在用于局部关节腔注射时，所述注射液包括生理盐水、复方电解质注射液或透明质酸注射液。
34.本文所用氯化钠注射液：0.9 %，生产厂家：四川科伦药业股份有限公司，批号：m19051004-2 ；注射用盐酸博莱霉素（博莱霉素），生产单位：日本化药株式会社，批号：790670。
35.cd34是由位于1q32的基因编码的相对分子质量为110000的单链跨膜糖蛋白，可表达干正常的内皮祖细胞、脾边缘带细胞、环绕于血管、神经、肌束、皮肤附属器和乳腺小叶基质周围的树突状间质细胞。但脐带来源的细胞在经过消化、分离后与msc细胞最接近的细胞则为内皮祖细胞。
36.本技术主要从脐带分离同时获取msc与内皮祖细胞，并进行条件式扩增培养，以研究脐带来源的msc与内皮祖细胞之间在培养与药用过程中的相互关系。
37.下面将结合具体实施方式对本技术的技术方案做清楚完整的说明。
38.一、含有msc细胞的制剂中脐带来源的msc细胞与脐带来源的内皮祖细胞的获取方式a）原代细胞获取为了提高细胞的纯度以及避免动物源成份的引入，本技术在获取原代细胞（p0细胞，包括msc细胞与内皮祖细胞）时主要采用组织块贴壁法，以物理手段移除羊膜、血管等，其在不使用胰酶等物料的前提下能获得高纯度细胞，也更好的保持细胞自身活性，相对于酶消化法更适合临床应用。
39.b）原代细胞的传代培养由于本技术方案细胞制剂的最终用途是药用，故在消化、传代、冻存等过程中均必须避免使用动物源性试剂。
40.故本技术方案采用的是无动物源性的重组细胞解离酶：如tryple产品，tryple可适用于血清替代物和无血清条件下解离细胞，其在室温下稳定，并且消化完成后无需使用特定的蛋白酶抑制剂灭活；又如hyrtryp细胞分离试剂产品，其符合cgmp、iso 9001:2015、iso13485:2016等标准，无论从法规安全性还是从下游纯化难度的角度都是更优的选择。
41.本技术的实施例主要选用tryple（在实际应用中也对hyrtryp进行验证，其具有与tryple同样的效果，出于文本节约原则，本文不再重复进行验证及验证结论的描述）。中和溶液的选择：为确保工艺中不引进动物源性成分，放弃使用任何含血清或动物蛋白的中和溶液，本技术方案选择组分明确的dpbs。
42.传代培养基的选择：原代细胞在进行传代培养时采取的培养基为mem-α，并添加5%
的血清替代物，本技术中血清替代物包括elitegro-adv，ultragro-advanced（helios）、knockoutserumreplacement（gibco）、ctsknockoutsr、xenofreekit（gibco）中的一种。
43.为确保可同时获得一定比例的的内皮细胞，传代培养基中还加有ecm培养基（内皮祖细胞培养基），ecm的比例可以是0-10%，近似和内皮细胞的含量比例对应。本技术在培养基中还加入含有≤10%的内皮祖细胞培养基，所述ecm为添加humanbfgf、humanegf和humanvegf的mem-α，ecm为内皮祖细胞培养基，humanbfgf、humanegf和humanvegf终浓度均为10ng/ml。
44.培养基验证：接种密度为6.0
×
103/cm2，培养时间为120h进行培养基的验证；细胞培养过程中，培养基为mem-α，并添加5%的elitegro-adv（其他种类的血清替代物在实验验证过程中具有近似的效果，本文不再重复描述），探讨内皮细胞培养基含量的变化对内皮祖细胞与msc细胞量的影响。见表1，结果显示在≤10%的内皮祖细胞培养基时，二种细胞含量比满足要求。
45.表1培养基设计对细胞量的影响实验组内皮细胞培养基含量细胞形态cd90、cd73与cd105cd3410纤维细胞状全部≥95%≤1!%纤维细胞状全部≥95%≤1.53%纤维细胞状全部≥95%≤2E%纤维细胞状全部≥95%≤5X%纤维细胞状全部≥95%≤8a0%纤维细胞状全部≥90%≤10q2%纤维细胞状全部≥85%≤15%后续实验中，选用培养基为mem-α，并添加5%的elitegro-adv，内皮细胞培养基含量为3%的培养基进行细胞传代与细胞增殖。
46.p0细胞（原代细胞）经tryple孵育5分钟并以dpbs进行中和后，大多数细胞从培养皿脱落；将p0细胞以300g/10分钟离心后重悬于mscm并计算活率，结果显示绝大多数细胞成功离心，细胞活率不低于80%，符合预期。
47.p0细胞以不同接种密度接种于100mm培养皿进行扩增，扩增效果见表2。
48.表2原代细胞不同接种密度下扩增后平均细胞总数
接种密度0.1
×
103/cm20.5
×
103/cm
21×
103/cm22
×
103/cm24
×
103/cm26
×
103/cm210
×
103/cm272h0.01
×
1060.7
×
10
62×
1063.3
×
1063.8
×
1063.5
×
1063.9
×
10696h0.04
×
1061.2
×
1062.5
×
1064.1
×
1064.8
×
1065.1
×
1064.1
×
106120h0.08
×
10
62×
1063.6
×
1064.8
×
1065.1
×
1065.5
×
1064.3
×
106144h0.1
×
1062.3
×
1063.7
×
1065.1
×
1065.2
×
1065.8
×
1064.9
×
106168h0.07
×
1061.8
×
1063.3
×
1065.7
×
1065.0
×
1065.3
×
1063.9
×
106经tryple孵育5分钟并以dpbs进行中和后，大多数细胞从培养皿脱落，室温以300g/5分钟离心后重悬于mscm并计算活率，结果显示细胞活率均不低于90%。
49.本实施例验证了在接种密度为0.5
×
103/cm
2-6
×
103/cm2，培养时间为96h-144h时，细胞具有好的融合率与细胞增殖倍数，获得了预期数量的细胞总数。更优选的是接种密度为1.0
×
103/cm
2-6.0
×
103/cm2，培养时间为120h-144h时，可以将细胞产量最大化，同时确保细胞的高活率，避免过于频繁的消化传代，代表了合适的接种密度和培养时长。
50.c）细胞增殖传代在基于前述实验的基础上细胞培养120h后进行消化传代，对细胞进行计数。以6x103/cm2密度接种，并培养120小时后传代，当培养120h并进行消化传代时，细胞数量对比接种时增加少于10倍；或细胞形态出现明显变化；或任何一个msc阳性标志物的阳性率低于80%时，终止试验。
51.其中，msc细胞阳性标志物为cd90、cd73、cd105；内皮祖细胞阳性标志物cd34。
52.表3 细胞极限传代测试
传代次数接种时细胞数量（100mm培养皿）传代时细胞数量增殖倍数细胞形态cd90、cd73与cd105cd3410.32x1065.3x10616.6纤维细胞状全部≥95%≤2 .32x1066.0x10618.8纤维细胞状全部≥95%≤20.32x1065.3x10616.6纤维细胞状全部≥95%≤2@.32x1065.4x10616.9纤维细胞状全部≥95%≤2P.32x1067.0x10621.8纤维细胞状全部≥95%≤2`.32x1065x10615.6纤维细胞状全部≥95%≤2p.32x1064.6x10614.4纤维细胞状全部≥95%≤2�.32x1064.1x10612.8纤维细胞状全部≥95%≤2�.32x1063.8x10611.9纤维细胞状全部≥95%≤20.32x1062.8x1068.8纤维细胞状（体积增大）全部≥95%≤2%
试验结果显示，细胞在传代9次后，增殖倍数、细胞形态以及阳性标志物的表达都符合要求。传代10次后，细胞体积明显增大，但增殖倍数和阳性标志物的表达都符合要求。
53.根据结果，判定细胞在0.32x106的接种量、120小时的传代间培养时间下，最大传代次数为9次。细胞传代1-8次，平均每次传代细胞增殖16.7倍。为了保证细胞制剂的最大效率的利用与最大活性的保持，本技术msc细胞制剂选用传代6-8代的细胞。
54.为了简化文本描述，后续实验均采用：接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106、传代8次后细胞数量4.1x106的细胞，进行冻存、细胞毒性、含有msc细胞的制剂的稳定性以及动物性模型验证。一般而言，当传代8次的细胞能够无毒性、且具有治疗用途时，其传代3次、4次、5次、6次、7次的细胞也是能够满足相关要求的。
55.d）细胞的冻存冻存溶液测试和冻存步骤确认：以1.0x107/ml、1.3x107/ml、2x107/ml、2.5x107/ml、3.3x107/ml和4x107/ml的密度将细胞分别重悬于mscm（7.5%dmso）、prime-xvf reezis、prime-xvm scf reezis dmso-free三种冻存溶液；灌注冻存管后放进程序降温盒，在-80℃保存16小时后转移至液氮罐内；细胞在液氮保存48小时后，在37℃水浴锅复苏，将复苏后的细胞悬液缓慢加入已装有4ml mscm的15ml离心管后300g/5分钟离心，再将细胞以mscm重悬至1ml并根据质量标准进行检测。具体数据见表4。
56.表4 经过不同冻存液冻存并复苏后细胞的活率 1.0x107/ml1.3x107/ml2x107/ml2.5x107/ml3.3x107/ml4x107/mlmscm（7.5%dmso）88�����%prime-xvfreezis90�����%prime-xvmscfreezisdmso-free89�����%
结果显示3种冻存溶液冻存的细胞复苏后质量都合格，但以1.3x107/ml-3.3x107/ml的冻存密度，在mscm（7.5%dmso）中冻存的细胞活率最高。
57.四）短期稳定性验证短期稳定性：以37℃水浴锅复苏工作库细胞后与注射溶液混合均匀并放置在2-8
℃，在复苏后0、1、2、4、8、12、16、24、32h小时检测细胞活率，为msc终产品（含有msc细胞的制剂）在2-8℃的稳定时间提供依据，预期活率为不低于95%。
58.检测方法：细胞的冻存密度为1.3x107/ml（样本一）、2.0x107/ml（样本二）、2.5x107/ml（样本三）、3.3x107/ml（样本四）、1x107/ml（样本五）和4.3x107/ml（样本六）。在2-8℃环境下，在复苏后0、1、2、4、8、12、16、24、32小时检测细胞活率，结果显示样本一至样本四在32h甚至更长时间内的活率均能满足使用要求。结果显示样本五至样本六在放置16小时后，细胞数量和活率依然符合质量要求，结果见表5。
59.表5 含有msc细胞的制剂短期稳定性时间点0h1h2h4h8h12h16h24h32h样本一活率（%）99.999.799.099.098.598.097.096.095.0样本二活率（%）99.999.098.798.398.197.897.396.495.3样本三活率（%）99.999.198.998.598.097.697.096.095.5样本四活率（%）99.999.398.79897.397.296.896.195.7样本五活率（%）99.899.198.095.093.090.084.080.070.0样本六活率（%）99.999.097.096.095.093.089.086.080.0本技术未公开的实施例即在2℃、3℃、5℃、6℃、7℃、8℃环境下，在复苏后0、1、2、4、8、12、16、24小时检测细胞活率，与4℃环境下检测细胞活率仅有
±
0.4%的误差，此处出于文本节约的原则不再详述，如有需要申请人可以补充。
60.五）长期稳定性验证长期稳定性：确认细胞（msc细胞与内皮祖细胞）在低温冻存下的最长稳定时间（产品有效期），以确定产品的保质期。
61.在-80℃保存16h后，转至液氮罐储存3年后，复苏检测细胞的性能。
62.本实验采用的冻存密度为1.3
×
107/ml。
63.复苏方式：细胞在37℃水浴锅复苏，将复苏后的细胞悬液缓慢加入已装有4ml mscm的15ml离心管后300g/5分钟离心，再将细胞以mscm重悬至1ml并根据质量标准进行检测。
64.表6 含有msc细胞的制剂产品长期稳定性
检测指标检测项目检测方法检测结果物理性质外观目测msc细胞制剂产品稳定性细胞鉴别细胞形态显微镜观察细胞贴壁生长，呈纤维细胞样并且大小均一msc细胞纯度cd90/cd73/cd105流式细胞仪分析各表面标记物均≥95%内皮祖细胞纯度cd34流式细胞仪分析≤2%细胞生长活性细胞存活率细胞计数仪配合台盼蓝拒染法96%免疫原性hla-dr流式细胞仪分析≤2%一般安全性细菌培养法阴性一般安全性真菌培养法阴性一般安全性支原体培养法阴性一般安全性内毒素凝胶法≤0.5eu/ml
当然申请人也对冻存密度为2.3
×
107/ml、冻存密度为3.3
×
107/ml进行验证，其长期稳定性的效果与冻存密度为1.3
×
107/ml基本无区别，本文为了节约文本不再另述。
65.六）细胞毒性实验
本实验设计对照组与试验组，每组20只ncg小鼠，雌雄各半。ncg小鼠每2天给药1次、连续1周（共4次）静脉注射hmsc100并观察4周，观察该供试品可能引起毒性反应的性质、程度、量效和时效关系及可逆性。
66.hmsc100是采用接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106，传代8次后细胞数量4.1x106的细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂。
67.表7 毒性试验剂量设计表
组别给药途径给药剂量（细胞/kg）给药浓度（细胞/ml）给药体积（ml/kg）雌动物（只）雄动物（只）对照组静脉注射
‑‑
51010hmsc100低剂量组静脉注射3
×
1060.6
×
10651010hmsc100高剂量组静脉注射1
×
10
74×
10651010
毒性检测指标：血液生化：观察期结束，hmsc100各组雌、雄鼠alb、tp、a/g、ast、alt、tbil、ck、 chol、tg、crea、urea、glu、ggt、alp、ldh、na 、k 、cl-等血生化指标均未见明显异常改变，代表正常。
68.大体解剖观察：观察期结束，各组雌、雄鼠大体解剖肉眼观察脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠 道、生殖系统等主要脏器，其形态、颜色、质地等均未见明显异常改变，代表正常。
69.综上所述，在本试验条件下，ncg小鼠每2天1次、连续1周（共4次）静脉注射3
×
106、1
×
107细胞/kg的hmsc100并观察4周，各组小鼠一般观察、体重、摄食量、血液学、血生化、大体解剖观察等均未见明显异常改变。
70.七）msc细胞制剂对博莱霉素致肺纤维化模型大鼠的药效研究实验分组：本试验共用55只雄性sd大鼠：首次随机分为正常对照组（10只）和模型组（45只）；肺纤维化模型构建后，再次随机分为供试品低剂量组（2
×
106cells/只/次，1.5ml/只，11只）、供试品高剂量组（6
×
106cells/只/次，1.5ml/只，11只）、市售对照组（吡非尼酮胶囊，批号：191006，240mg/kg，5ml/kg，11只）、模型对照组（氯化钠注射液，12只）及正常对照组（氯化钠注射液，10只）。
71.d1、d5模型组动物均气道内雾化给予博来霉素（5mg/kg，1ml/kg）进行模型构建，正常对照组动物气道内雾化给予氯化钠注射液（1ml/kg）。其中，hmsc100是采用接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106，传代8次后细胞数量4.1x106的细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂。
72.正常对照组、模型对照组、供试品低剂量和高剂量组动物均于d6、d8、d10静脉注射各给予相应药物1次，共给药3次；市售对照组每天灌胃给药1次，共23次（d6-d28）。
73.d28各组动物均进行肺功能检测、称重肺脏重量，计算肺重指数；剪取左肺进行羟脯氨酸含量测定，剩余右肺灌注10%中性缓冲福尔马林溶液后再置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片、制片、he染色进行肺组织炎症细胞浸润程度评价、masson染色进行肺组织纤维化程度评价。
74.结果：造模情况，试验过程中，动物于d1、d5分别气道内雾化博来霉素诱导肺纤维化，显微镜下主要可见肺脏出现不同程度的炎细胞浸润及纤维化等病理学改变，表明肺纤维化模型构建成功。
75.存活率：模型对照组分别于给药d6、d11各死亡1只，供试品低剂量组于d14天死亡1只。正常对照组、模型对照组、hmsc100低剂量组、hmsc100高剂量组及市售对照组动物存活率分别为100%、83%、91%、100%、100%，供试品各组及市售对照组动物存活率均高于模型对照组。
76.肺重指数：与模型对照组动物比较，正常对照组、供试品低剂量组、供试品高剂量组及市售对照组动物的肺重指数均值均降低，且正常对照组具有统计学差异；供试品低剂量组和高剂量组具有剂量依赖性降低。肺羟脯氨酸含量：与模型对照组动物比较，正常对照组、供试品低剂量组、供试品高剂量组动物的羟脯氨酸含量均值均降低，且供试品低剂量组和高剂量组具有统计学差异，且具有剂量依赖性降低。
77.八）hmsc100治疗卵巢切除大鼠骨质疏松药效评价hmsc100是采用接种时细胞数量（100mm培养皿）0.32x106，传代8次后细胞数量4.1x106的细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂。假手术组：sham group、模型对照组：model group、msc治疗组：msc group。
78.表8 动物分组信息
组别给药制剂剂量cells/kg给药浓度cells/ml给药体积ml/kg给药途径给药频率和周期动物数量假手术组细胞溶媒//5静脉注射每周一次，四周10模型对照组细胞溶媒//5静脉注射每周一次，四周20msc治疗组hmsc1003
×
1060.6
×
1065静脉注射每周一次，四周20
检测指标：试验期间，各组动物每天观察一次行为状态、摄食量；一周测定一次动物体重；去势手术后3个月及最后一次给药后1周，动物取材，通过micro-ct分析动物股骨骨密度和骨微结构。
79.试验结果1.一般观察及体重所有动物在实验期间，未见异常表现。
80.去势手术后3个月，假手术和造模组动物体重均持续增长。假手术组动物相对体重增长率为20.42%，造模组动物相对体重增长率为35.44%。动物模型满足去势后体重增长规律。具体体重变化趋势见图1、2。
81.给药期间，假手术组动物体重轻度增长，而模型对照组动物体重明显增长，msc治疗组动物体重增长未见明显增长。具体体重变化见图3。
82.2. 骨密度及骨微结构通过micro-ct分析动物股骨骨密度和骨微结构。
83.去势手术后3个月，相较于假手术组，造模组动物股骨远端骨小梁骨密度（trabeculae mean bmd）有降低趋势，骨小梁数(tb.n)显著降低（p《0.05），骨小梁连接密度（conn.d）显著降低（p《0.05）。结果显示造模组符合骨质疏松变化趋势。具体数据见图4、5、6。骨小梁具有支持造血组织以及增加骨的强度的作用，骨小梁数目、质量、方向和厚度等都会骨的强度造成较大影响。
84.治疗期结束后，以各组个体骨密度数值与假手术组骨密度平均值的差值的百分比进行分析（bmd change%=（各组个体bmd数值-假手术组bmd平均值）%；change，变化率），模型
对照组动物股骨干骨密度bmd change%显著低于假手术组bmd change%（p＜0.05），msc治疗组股骨干骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（p＜0.01）。msc治疗组股骨颈骨密度bmd change%显著高于模型对照组bmd change%（p＜0.05）。具体数据见图7、8，结果显示，经去势手术诱导骨质疏松sd大鼠在经hmsc100治疗4周后股骨干和股骨颈骨密度有明显提高，提示msc对骨质疏松症具有较好的治疗效果。
85.九）不同成分的hmsc100治疗卵巢切除大鼠骨质疏松药效评价区别于“hmsc100治疗卵巢切除大鼠骨质疏松药效评价”，本实施例验证的是hmsc100成分与含量对动物股骨干骨密度变化率的影响。不同成分的hmsc100中细胞数量均为4.1x106，采用的均是细胞悬浮于生理盐水中获得的制剂，给药浓度0.6
×
106cells/ml，给药体积5ml/kg。数据显示的为实验组（msc治疗组）相对于造模组（无治疗组）股骨干骨密度的变化率（表8）。
86.表9 hmsc100成分与含量对动物股骨干骨密度的影响
实验组msc细胞占比内皮足细胞含量fermoralsharftbmdchange%（实验组vs造模组）组一98%2% 6%组二96%4% 4%组三95%5% 3%组四94%6% 1.5%组五90% 1%组六85% 0.5%
实验验证，所述制剂中msc细胞的含量≥90%，且内皮祖细胞的含量≤10%,对骨质疏松的治疗具有好的效果。
87.实际应用时，本技术的msc制剂还具有用于多发性硬化、骨质疏松症、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、gvhd、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生、葡萄膜炎或其组合的治疗。本技术的技术文本出于文本简约原则，仅列举部分的药效评价。
88.虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
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