有机室温磷光纳米颗粒及其应用

1.本发明涉及磷光材料技术领域，尤其是涉及一种有机室温磷光纳米颗粒及其应用。


背景技术：

2.由于抗生素药物的过度使用，抗生素的多重耐药菌株不断出现。为了应对这一问题，人们研究了纳米颗粒以克服抗生素的耐药性。然而，大多数抗菌纳米颗粒是基于银、铜和钛金属纳米颗粒的氧化物，这些金属纳米材料通常存在长期毒性、高成本等问题，这严重限制了其应用。因此，开发具有非细胞毒性的新型抗菌材料对公共健康和安全具有重要意义。
3.近年来，多功能有机纳米材料，特别是光学活性有机功能材料，由于其分子设计的灵活性、无创性、低成本和低毒性，在光动力治疗方面显示出巨大的潜力。在光照射下，分子被激发至激发单线态，激子返回基态的路径决定了材料的功能。在这些过程中，高三重态激子是产生用于光动力抗菌处理的活性氧(ros)的先决条件。有机室温磷光材料由于其高的三重态激子而具有提供高ros效率的潜力，但目前还没有充分利用有机室温磷光材料的高三重态激子的方案。
4.关节感染、脊柱感染、人工关节置换术后感染、脊柱内固定术后感染及骨折内固定术后感染等骨科感染疾病严重影响患者的健康和预后，如早期未能及时诊断和治疗，常常会导致不良后果。骨科感染疾病的常见致病菌为金黄色葡萄球菌。针对金黄色葡萄球菌的特异性抗菌材料是实现骨科感染疾病早诊断和早治疗的有效工具。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供有机室温磷光材料，具有优异的磷光性能。
7.本发明的另一目的在于提供有机纳米颗粒，可控制三重态激子能量衰减路径，得到更高产量的ros。
8.本发明的又一目的在于提供有机纳米颗粒在制备抗菌材料中的应用。
9.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
10.有机室温磷光材料，包括主体材料和客体材料；所述客体材料具有如下结构式：
[0011][0012]
在本发明的具体实施方式中，所述主体材料包括二苯甲酮。
[0013]
在本发明的具体实施方式中，所述主体材料和所述客体材料的摩尔比为(10～1000)﹕1。
[0014]
本发明还提供了有机纳米颗粒，主要是由上述任意一种所述有机室温磷光材料采用微流控的方法制备得到。
[0015]
在本发明的具体实施方式中，所述微流控的方法包括：含有机室温磷光材料和表面活性剂的有机溶液作为分散相，水作为连续相，在微通道为y型结构的微反应器内进行组装。
[0016]
在本发明的具体实施方式中，所述分散相中，所述有机室温磷光材料的浓度为0.8～1.2mg/ml，所述表面活性剂的浓度为8～12mg/ml；所述表面活性剂为环氧丙烷与环氧乙烷的共聚物；所述有机溶液的溶剂为thf。
[0017]
在本发明的具体实施方式中，所述y型结构为不对称的y型结构，分散相的流入通道尺寸为0.15mm*0.15mm*15mm，通道横截面为0.15mm*0.15mm，通道长度为15mm，连续相的流入通道尺寸为0.3mm*0.3mm*30mm，通道横截面为0.3mm*0.3mm，通道长度为30mm；流出通道尺寸为0.15mm*0.15mm*10mm，通道横截面为0.15mm*0.15mm，通道长度为10mm。
[0018]
溶解有有机室温磷光材料的分散相从分散相的通道流入，水从连续相的通道流入，当分散相中的有机室温磷光材料在通道中遇水后进行了自组装，然后通过流出通道流出，分散相的有机溶剂通过蒸发去除，得到有机纳米颗粒。
[0019]
在本发明的具体实施方式中，所述分散相的流速为0.1～1ml/h，所述连续相的流速为0.5～10ml/h。
[0020]
在实际操作中，分散相和连续相的流速可通过泵进行调控，进而调控纳米颗粒的尺寸。
[0021]
在本发明的具体实施方式中，所述纳米颗粒的尺寸为80～600nm。
[0022]
在实际操作中，可采用传统的软平板印刷制备得到的微流控芯片制备所述纳米颗粒。
[0023]
通过调节纳米颗粒的粒径和分子堆积，有效控制能量衰减，将磷光发射转化为光照射下的ros的生成。
[0024]
本发明还提供了上述任意一种所述有机纳米颗粒在制备抗菌材料中的应用。
[0025]
在本发明的具体实施方式中，所述菌包括革兰氏阳性菌。
[0026]
在本发明的具体实施方式中，所述菌为金黄色葡萄球菌。
[0027]
本发明还提供了上述任意一种所述有机纳米颗粒在制备用于治疗或预防骨科感染疾病的制剂中的应用。
[0028]
在本发明的具体实施方式中，所述骨科感染疾病包括关节感染和/或脊柱感染。
[0029]
在本发明的具体实施方式中，所述骨科感染疾病包括人工关节置换术后感染、脊柱内固定术后感染和骨折内固定术后感染中的至少一种。
[0030]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0031]
(1)本发明的有机室温磷光材料在结晶态下具有强磷光，磷光量子产率可达15.64％；
[0032]
(2)本发明通过微流控芯片技术将有机室温磷光材料组装成纳米颗粒，通过微流控芯片技术控制三重态激子能量衰减路径，以得到更高产量的ros；
[0033]
(3)本发明得到的有机纳米颗粒对金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌性能，且不存在细胞毒性和耐药性问题，可作为抗菌材料或制剂用于骨科感染疾病中。
附图说明
[0034]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0035]
图1为本发明实施例1制得的bp/bqd的磷光光谱图(a)和磷光寿命图(b)；
[0036]
图2为本发明实施例提供的组装bp/bqd nps的微流体装置示意图；
[0037]
图3为本发明实施例2中的1#的bp/bqd nps的tem照片；
[0038]
图4为本发明实施例3中的1#的bp/bqd nps-pre的tem照片；
[0039]
图5为本发明实施例2中的1#的bp/bqd nps的选区电子衍射图；
[0040]
图6为本发明实施例3中的1#的bp/bqd nps-pre的选区电子衍射图；
[0041]
图7为本发明通过微流控技术组装得到的部分bp/bqd nps以及通过纳米沉淀得到的部分bp/bqd nps-pre的总ros的生成效率对比；
[0042]
图8为在有光照和无光照的情况下使用dmpo对bp nps、bqd nps和bp/bqd nps的epr光谱；
[0043]
图9为bp nps、bqd nps和不同粒径的bp/bqd nps在紫外光照射下的单线态氧生成效率图；
[0044]
图10为bp nps、bqd nps和不同粒径的bp/bqd nps在紫外光照射下的总ros生成效率图；
[0045]
图11为bp nps、bqd nps和bp/bqd nps的抑菌性；其中，(a)为bp nps、bqd nps和bp/bqd nps在白光下的细菌抑制率；(b)为bp/bqd nps在白光(5mw/cm2)或紫外光(5mw/cm2)照射下的细菌抑制率，照射时间为15min；(c)为与未处理组比较，采用bp/bqd nps处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌形态变化的sem图像；(d)为用bp nps、bqd nps和bp/bqd nps分别处理后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的平板计数琼脂菌落的照片；
[0046]
图12为bp/bqd nps对金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)的抗菌活性的尺寸依赖性；(c)为用不同尺寸的bp/bqd nps分别处理后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的平板计数琼脂菌落的照片；
[0047]
图13为bp/bqd nps与金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)孵育后的共聚焦激光扫描显微镜图像；
[0048]
图14为125nm的bp/bqd nps的抗菌活性的浓度依赖性。
具体实施方式
[0049]
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保
护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050]
有机室温磷光材料，包括主体材料和客体材料；所述客体材料(bqd)具有如下结构式：
[0051][0052]
在本发明的具体实施方式中，所述主体材料包括二苯甲酮。
[0053]
在本发明的具体实施方式中，所述主体材料和所述客体材料的摩尔比为(10～1000)﹕1。
[0054]
如在不同实施方式中，所述主体材料和所述客体材料的摩尔比可以为10﹕1、20﹕1、50﹕1、80﹕1、100﹕1、120﹕1、150﹕1、180﹕1、200﹕1、300﹕1、400﹕1、500﹕1、600﹕1、700﹕1、800﹕1、900﹕1、1000﹕1等等；优选的，所述主体材料和所述客体材料的摩尔比为(50～150)﹕1，优选为100﹕1。
[0055]
在本发明的具体实施方式中，所述客体材料的制备方法，包括如下步骤：1,8-萘酐和丁胺在乙酸作用下，于115～125℃条件下反应，然后于水中沉淀，收集固体。
[0056]
在本发明的具体实施方式中，1,8-萘酐和丁胺的摩尔比为1﹕(1～3)，如1﹕2。
[0057]
在本发明的具体实施方式中，所述反应的时间为10～20h。
[0058]
在实际操作中，所述反应的时间根据实际情况进行调整，可根据tlc监测反应程度调整反应时间。
[0059]
在本发明的具体实施方式中，所述水为冷水。将反应后的物料倒入冷水中进行沉淀，通过离心的方式收集固体，然后采用乙醚洗涤固体，通过柱层析分析纯化，得到客体材料纯品。
[0060]
本发明还提供了有机纳米颗粒，主要是由上述任意一种所述有机室温磷光材料采用微流控的方法制备得到。
[0061]
根据单重态和三重态激子的形成和衰变路径可知，激子主要通过三个竞争过程回到基态，即磷光跃迁、扩散淬灭过程和非辐射衰变。如果三重态激子通过将能量转移至周围的分子氧而衰变至基态，则可以得到ros。因而，为了提高有机室温磷光材料中的ros效率，应控制衰变过程同时抑制其它两个衰变路径。
[0062]
本发明通过微流控技术调节有机室温磷光材料的分子堆积和尺寸，操纵三重态激子的衰减途径，通过降低结晶度和缩小有机纳米颗粒的尺寸将用于发出磷光的三重态激子的能量衰减用于生成ros。纳米颗粒的组装优化通过调节流体动力学参数和通道尺寸来实现，由于反应物液体在微通道中快速连续混合，微流控技术确保了对纳米颗粒聚集和结构演变的高度控制。同时，纳米颗粒的尺寸和结构高度影响光性质及其与生物系统的相互作用，例如，尺寸较小的纳米颗粒比尺寸较大的纳米颗粒具有更大的毒性，表面带有纳米柱和纳米针状物的纳米颗粒由于接触面积增大，更容易破裂细胞壁。本发明通过微流控技术精
确调节有机纳米颗粒的尺寸与结构以增强其与细菌之间的有效相互作用。
[0063]
在本发明的具体实施方式中，所述微流控的方法包括：含有机室温磷光材料和表面活性剂的有机溶液作为分散相，水作为连续相，在微通道为y型结构的微反应器内进行组装。
[0064]
在本发明的具体实施方式中，所述分散相中，所述有机室温磷光材料的浓度为0.8～1.2mg/ml，所述表面活性剂的浓度为8～12mg/ml；所述表面活性剂为环氧丙烷与环氧乙烷的共聚物；所述有机溶液的溶剂为thf。
[0065]
如在不同实施方式中，所述分散相中，所述有机磷光材料的浓度可以为0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml等等；所述表面活性剂的浓度可以为8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml等等。所述表面活性剂可以为f127。
[0066]
在本发明的具体实施方式中，所述y型结构为不对称的y型结构，分散相的流入通道尺寸为0.15mm*0.15mm*15mm，连续相的流入通道尺寸为0.3mm*0.3mm*30mm；流出通道尺寸为0.15mm*0.15mm*10mm。
[0067]
溶解有有机室温磷光材料的分散相从分散相的通道流入，水从连续相的通道流入，当分散相中的有机室温磷光材料在通道中遇水后进行了自组装，然后通过流出通道流出，分散相的有机溶剂通过蒸发去除，得到有机纳米颗粒。
[0068]
在本发明的具体实施方式中，所述分散相的流速为0.1～1ml/h，所述连续相的流速为0.8～10ml/h。
[0069]
如在不同实施方式中，所述分散相的流速可以为0.1ml/h、0.2ml/h、0.3ml/h、0.4ml/h、0.5ml/h、0.6ml/h、0.7ml/h、0.8ml/h、0.9ml/h、1ml/h等等；所述连续相的流速可以为0.5ml/h、1ml/h、2ml/h、3ml/h、4ml/h、5ml/h、6ml/h、7ml/h、8ml/h、9ml/h、10ml/h等等。
[0070]
在本发明的具体实施方式中，所述分散相与所述连续相的流速比为1﹕(8～10)，如可以为1﹕8、1﹕8.5、1﹕9、1﹕9.5、1﹕10等等。
[0071]
在实际操作中，分散相和连续相的流速可通过泵进行调控，进而调控纳米颗粒的尺寸。
[0072]
在本发明的具体实施方式中，所述纳米颗粒的尺寸为80～600nm。如可以为80～300nm，100～250nm等等。粒径分布可以为0.1～0.2，如可以为0.1～0.16等等。
[0073]
在实际操作中，可采用传统的软平板印刷制备得到的微流控芯片制备所述纳米颗粒。
[0074]
通过调节纳米颗粒的粒径和分子堆积，有效控制能量衰减，将磷光发射转化为光照射下的ros的生成。
[0075]
本发明还提供了上述任意一种所述有机纳米颗粒在制备抗菌材料中的应用。
[0076]
在本发明的具体实施方式中，所述菌包括革兰氏阳性菌。
[0077]
在本发明的具体实施方式中，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌。
[0078]
本发明还提供了上述任意一种所述有纳米颗粒在制备用于治疗或预防骨科感染疾病的制剂中的应用。
[0079]
本发明通过调节有机纳米颗粒的粒径和分子堆积，有效控制能量衰减，将磷光发射转化为光照射下的ros的生成，从而发挥抗菌作用。
[0080]
在本发明的具体实施方式中，所述骨科感染疾病包括关节感染和/或脊柱感染。
[0081]
在本发明的具体实施方式中，所述骨科感染疾病包括人工关节置换术后感染、脊柱内固定术后感染和骨折内固定术后感染中的至少一种。
[0082]
骨科感染疾病是一类难以治疗的疾病。部分患者是由于机体其他部位感染经血液循环播散导致，比如关节感染和脊柱感染，还有部分患者是由于接受了骨科手术而导致，比如人工关节置换手术、脊柱内固定手术、骨折切开复位内固定手术等，一旦发生感染，大多数情况下会导致患者预后不佳。在骨科感染疾病中，以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌是主要常见致病菌。近年来，由于耐药菌株的出现，给骨科感染疾病的治疗造成了巨大困难。本发明的有机纳米颗粒可以通过与革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌的高结合力和ros的高产率，在骨科感染疾病中充分发挥抗菌作用。不仅如此，由于本发明的有机纳米颗粒不会导致耐药性和细胞毒性，因此作为预防感染使用同样具有良好作用，可以大大减少骨科手术术后感染的发生。
[0083]
本发明的具体实施方式中采用的革兰氏阴性大肠杆菌e.coli(atcc25922)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌s.aureus(atcc 25923)购自上海复祥生物科技有限公司。这些菌株用于抗菌实验，储存在-80℃下。将微生物在37℃的luria bertani(lb)肉汤培养基中复苏过夜，并通过平板划线法在琼脂固体培养基表面纯化菌株。将lb固体琼脂板上的单个金黄色葡萄球菌菌落培养到10ml液体lb肉汤培养基中，并在37℃下以180rpm的速度在摇动培养箱中培养过夜。收获已生长到对数生长期的细菌，并通过离心(8000rpm，3min)用pbs(10mm，ph＝7.4)洗涤3次。丢弃上清液，将剩余的金黄色葡萄球菌重新悬浮在pbs中。通过使用multiskan skyhigh微孔板分光光度计(美国赛默飞世尔科学公司)在600nm处测量细菌悬浮液的光密度来确定细菌细胞的浓度，并在使用前用pbs调节至所需浓度。大肠杆菌的实验条件和操作与金黄色葡萄球菌相同。
[0084]
有机纳米颗粒对不同细菌的抗菌实验操作：
[0085]
将细菌用pbs稀释至108cfu/ml。将不同粒径的10-6
m的纳米颗粒添加到细菌悬浮液中。将混合物在37℃下培养1h，然后暴露于白光(5mw/cm2)照射15min，并用pbs将细菌悬浮液连续稀释105倍。然后，将100μl稀释后的溶液涂抹在直径为90mm的lb琼脂板上，并在37℃生化培养箱中再培养24h，以形成菌落，然后进行计数和拍照。通过标准平板计数法测定稀释微生物溶液的菌落形成单位(cfu)数。根据以下等式计算细菌抑菌率(ir)：ir＝(c
0-c)/c0×
100％；其中，c为经过纳米颗粒处理的实验组的cfu，c0是未与纳米颗粒孵育的对照组的cfu。
[0086]
不同浓度的纳米颗粒的抑菌效果的实验条件和操作与上述基本相同。
[0087]
dcfh-da作为ros指示剂，以验证纳米颗粒悬浮液中ros的生成，具体操作如下：
[0088]
通过将dcfh-da(1mg)加入无水乙醇(2ml)中制备dcfh-da溶液(最终浓度为1mm)。将dcfh-da的乙醇溶液(500μl，1mm)和naoh的水溶液(2ml，10mm)在室温下在黑暗中混合30min。随后，添加10.0ml的pbs(25mm)以获得40μm 2
′
,7
′‑
二氯二氢荧光素(dcfh)溶液。向活化的dcfh溶液(1μm最终浓度)中加入不同粒径的纳米颗粒的悬浮液(10μm最终密度)。将溶液在室温下在黑暗中摇动1min，然后以1min的时间间隔进行uv光照射(5mw/cm2)。以1min为时间间隔的uv光照射活化的dcfh溶液作为对照。在ros存在下，非荧光dcfh可进一步氧化为荧光2
′
,7
′‑
二氯荧光素(dcf)。因此，dcf的荧光强度可以表示ros的量。然后用480nm的激发波长测量dcf的荧光光谱(500～700nm)。然后绘制525nm处的相对发射强度(i/i
0-1，i0为
初始发射强度，i为处理后的发射强度)与辐照时间的关系图，以比较ros的生产能力。
[0089]
白光(5mw/cm2)照射下ros的测量与上述实验条件和操作基本一致。
[0090]
扫描电子显微镜分析：
[0091]
为了确认掺杂纳米颗粒的抗菌性能和细菌细胞的形态变化，进行了sem研究。将1ml含有106cfu/ml的对数生长期细菌细胞溶液与浓度为10-6
m的等体积纳米颗粒悬浮液混合。然后，将细菌悬浮液在37℃恒温摇瓶中培养2h。将对照组培养在37℃的lb肉汤中培养相同时长，通过离心(6000rpm，持续3min)收集细菌，并在4℃下用2.5％戊二醛固定过夜。固定后用pbs冲洗微生物三次。随后，用不同浓度的乙醇(30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％)对细菌进行梯度脱水20min。脱水后，将细菌悬浮液置于干净的硅片上，然后进行空气干燥。样品完全干燥后，进行喷金，然后在15kv加速电压下，在扫描电子显微镜(sem，日本，reguluss8230)观察。
[0092]
实施例1
[0093]
本实施例提供了有机室温磷光材料的制备方法，包括如下步骤：
[0094]
按摩尔比为1﹕100称取客体材料bqd和二苯甲酮(bp)，将两者加热熔融混合，冷却结晶后得到有机室温磷光材料bp/bqd，其磷光光谱图和磷光寿命图见图1。
[0095]
制得的bp/bqd在550nm和590nm处有两处主峰，磷光量子产率为15.64％，磷光寿命为154ms。
[0096]
实施例2
[0097]
本实施例提供了有机纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0098]
(1)取按照实施例1的方法制得的bp/bqd 10.00mg，溶解于10ml四氢呋喃中，然后取100.00mg表面活性剂f127加入前述四氢呋喃溶液中，得到分散相。
[0099]
(2)参照图2的示意图，将步骤(1)得到的分散相通过特氟龙管泵入微流控芯片的一个通道入口(通道横截面的尺寸为150μm*150μm，通道长度为1.5cm)，去离子水通过特氟龙管泵入微流控芯片的另一个通道入口(通道横截面的尺寸为300μm*300μm，通道长度为3cm)。当分散相中的有bp/bqd在微流控芯片的分叉处遇去离子水后，bp/bqd自组装，并从微流控芯片的出口(通道横截面的尺寸为150μm*150μm，通道长度为1cm)流出，四氢呋喃在通风柜中蒸发过夜，得到有机纳米颗粒(bp/bqd nps)悬浮液。
[0100]
本实施例不同组别的微流控操作条件见表1。
[0101]
表1不同组别的微流控操作条件
[0102]
[0103][0104]
实施例3
[0105]
本实施例提供了有机纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0106]
纳米沉淀法：取按照实施例1的方法制得的bp/bqd 1.00mg和10.00mg表面活性剂f127，溶解于1ml四氢呋喃中，得到thf溶液。然后，在超声条件下将前述thf溶液快速注入10ml去离子水中，持续超声以去除有机溶剂，得到bp/bqd nps-pre悬浮液。
[0107]
表2不同组别的操作条件
[0108]
组别超声功率(w)超声时间(min)1#300302#10020
[0109]
比较例1
[0110]
比较例1参考实施例2的制备方法，区别在于：
[0111]
步骤(1)不同。比较例1的步骤(1)包括：
[0112]
(1)取二苯甲酮10.00mg，溶解于10ml四氢呋喃中，然后取100.00mg表面活性剂f127加入前述四氢呋喃溶液中，得到分散相。
[0113]
制备得到有机纳米颗粒bp nps。
[0114]
比较例2
[0115]
比较例2参考实施例2的制备方法，区别在于：
[0116]
步骤(1)不同。比较例2的步骤(1)包括：
[0117]
(1)取客体材料bqd 10.00mg，溶解于10ml四氢呋喃中，然后取100.00mg表面活性剂f127加入前述四氢呋喃溶液中，得到分散相。
[0118]
制备得到有机纳米颗粒bqd nps。
[0119]
实验例1
[0120]
采用动态光散射(dls)对实施例2不同组别制得的有机纳米颗粒的悬浮液中的bp/bqd nps、实施例3不同组别制得的有机纳米颗粒的悬浮液中的bp/bqd nps-pre、比较例1制得的bp nps和比较例2制得的bqd nps的粒径及粒径分布进行测试，测试结果见表3。
[0121]
表3实施例2不同组别制得的bp/bqd nps的粒径及粒径分布
[0122][0123]
从上表可知，采用本发明实施例2的方法制得的bp/bqd nps的尺寸分布很窄。采用实施例3的方法制备得到的bp/bqd nps-pre，平均粒径为105nm，其多分散指数为0.52。
[0124]
实施例2中的1#的bp/bqd nps和实施例3中的1#的bp/bqd nps-pre的tem照片分别见图3和图4，从图中可知，采用本发明实施例2的方法制得的bp/bqd nps接近球形。图5和图6分别为实施例2中的1#的bp/bqd nps和实施例3中的1#的bp/bqd nps-pre的选区电子衍射图，从图中可知，本发明实施例2的方法制得的bp/bqd nps没有明显的衍射，说明本发明制得的bp/bqd nps具有松散的分子间堆积和多孔结构。多孔结构有助于纳米颗粒与周围氧气之间的接触，以促进ros的生成。
[0125]
本发明实施例2制得的bp/bqd nps的磷光基本消失了，而实施例3制得的bp/bqd nps-pre具有良好的室温磷光发射。相对而言，本发明实施例2制得的bp/bqd nps通过指示剂明确检测到的ros，而实施例3制得的bp/bqd nps-pre由于良好的结晶性及较差的孔隙率，很难产生ros。以2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)作为探针，在uv光照射下，实施例2通过微流控技术组装得到的部分bp/bqd nps以及实施例3通过纳米沉淀得到的bp/bqd nps-pre的总ros的生成效率对比具体见图7。
[0126]
进一步通过sosg(单线态氧绿色荧光探针)和自旋捕获epr测量验证bp/bqd nps产生两种类型的ros。自旋捕获epr证明了在光照期间bp/bqd nps上产生了超氧阴离子和羟基自由基(ⅰ型ros)的存在，因为清晰的观测到dmpo-·o2-和dmpo-·
oh，具体见图8。sosg指示剂显示bp/bqd nps产生的单线态氧1o2(ⅱ型ros)，具体见图9。此外，与bp nps和bqd nps相比，bp/bqd nps的总ros的生产效率显著提高，具体见图10。由此可知，借助bp/bqd nps的多孔结构，长寿命的三重态激子与周围的氧有效接触，促进了ⅰ型和ⅱ型ros的产生。
[0127]
从图10中可进一步得出不同尺寸的bp/bqd nps的ros生成效率，尺寸为105nm的bp/bqd nps显示出最大的ros生成效率，这说明了尺寸较小的bp/bqd nps具有更高的ros生成效率。较小的纳米颗粒具有较大的表面积与体积比，这显著增大了分子与周围氧之间的接触面积，从而促进了ros的生成。
[0128]
实验例2
[0129]
对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌进行体外抗菌实验
[0130]
未经处理的细菌设为对照组，bp/bqd nps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均显示出抗菌效果，具体见图11中的(a)和(b)，粒径为125nm的bp/bqd nps对金黄色葡萄球菌具有高选择性，抑制率高达95％。实验结果表明，粒径相似的bp nps和bqd nps没有抗菌活性。使用紫外光照射bp/bqd nps可以提高其对细菌的抑制率。通过扫描电镜观察bp/bqd nps诱导的细菌的破坏，如图11中(c)所示，sem图像显示在白光照射下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与bp/bqd nps孵育后均有严重的形态学变化。金黄色葡萄球菌的原始形态被完全破坏，并观察到细胞碎片。大肠杆菌由正常杆状变为不规则形状，经bp/bqd nps处理后，细菌的细胞壁变得模糊，表明细菌细胞壁发生了降解。纳米颗粒的附着和ros的局部毒性协同实现抗菌性能。由于ros仅在bp/bqd nps与细菌足够接近时生效，因此，bp/bqd nps和细菌之间的相互作用对于有效的抗菌性能非常重要。从图11中的(c)，观察到bp/bqd nps附着在细菌细胞壁上，不仅使细菌表面弯曲并使膜丧失完整性，而且确保了足够的ros对细菌的局部毒性。图11中(d)是用bp nps、bdq nps和bp/bdq nps处理后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的平板计数琼脂菌落的照片，bp nps、bdq nps和bp/bdq nps粒径控制在125nm左右，浓度为10-6
m，孵育时间为1h，误差是平均值的标准偏差，星号表示显著差异(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001，下图星号同理)。
[0131]
对不同尺寸的bp/bqd nps的体外抗菌效果进行评价
[0132]
由图12可知，尺寸较小的bp/bqd nps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有更好的细菌抑制率。这一结构也通过荧光显微镜进行了验证，具体见图13，其中(a)和(b)分别为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与浓度约为10-6
m的140nm和220nm的bp/bqd nps孵育1h，然后用碘化丙啶和syto 9染色的细菌悬浮液的共聚焦激光扫描显微镜图像，pi(红色)表示不存活细菌细胞，syto 9(绿色)表示存活细菌细胞。荧光图像显示，不存活细菌的百分比(红色)随着bp/bqd nps尺寸的减小而增加，表明当减小纳米颗粒尺寸时，抗菌效果增强。125nm的bp/bqd nps与不同浓度的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别孵育1h，测试其抗菌活性，测试结果见图14。从图中可知，125nm的bp/bqd nps的最小抑制浓度(mic)约为10-7
m，其中对金黄色葡萄球菌的抑制率可达50％。
[0133]
bp/bqd nps的抗菌性能的选择性主要是由于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞壁的结构和化学组成不同。大肠杆菌被具有独特结构的脂多糖分子包裹，这些分子增加了带负电荷的区域，从而组织了外源化合物的吸附，也阻碍了ros的渗透。相反的，由于金黄色葡萄球菌外表面有多孔肽聚糖层，对ros更敏感。因此，大肠杆菌对bp/bqd nps相对耐受。
[0134]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。