包含核酸寡聚物的组合物的制作方法

1.本专利申请基于日本专利申请2020-072234号(于2020年4月14日提出申请)主张巴黎公约规定的优先权及利益，上述申请中记载的全部内容通过引用并入本说明书中。
2.本发明涉及包含核酸寡聚物的组合物。本发明进一步详细地涉及包含含有硫代磷酸酯的核酸寡聚物的组合物。


背景技术：

3.近年来，对核酸寡聚物在医疗领域的应用的兴趣不断高涨。例如可举出反义核酸、适配体、核酶及sirna等诱导rna干扰(rnai)的核酸等，它们被称作核酸药物。
4.已知核酸寡聚物利用固相合成法合成，具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物也作为由固相法合成的有用的化合物而为人所知(专利文献1)。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：国际公开第2017/068377号公报


技术实现要素：

8.发明所要解决的课题
9.具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物在其制造过程中的稳定性成为问题。本发明的目的在于提供包含具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物的稳定的组合物、其制造方法，以及由该组合物制造前述核酸寡聚物的高效的制造方法。
10.用于解决课题的手段
11.本技术发明人为了达成上述目的而反复进行了认真研究，结果果发现，将核酸寡聚物与烷基铵盐、水溶性有机溶剂、水及某添加剂进行混合而得到的组合物能够稳定化，前述核酸寡聚物是通过对利用固相合成法中的亚磷酰胺法生成的、具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物的粗产物进行反相层析处理而得到的核酸寡聚物。因此，本发明提供该组合物、其制造方法，以及由该组合物制造核酸寡聚物的高效的制造方法。
12.本发明包括以下方式，但不限定于此。
13.项1.组合物，前述组合物包含：
14.式(1)所示的具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物、烷基铵盐、水溶性有机溶剂、水及添加剂，该添加剂为包含选自由下述式(3)或(4)所表示的化合物组成的组中的至少1种化合物的添加剂，
15.[化学式1]
[0016][0017]
式(1)中，
[0018]bc
各自独立地表示相同或彼此不同的核酸碱基，
[0019]
r相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、氟原子或oq基，
[0020]
q相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、甲基、2-甲氧基乙基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，
[0021]
x相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
[0022]
y表示氢原子或羟基的保护基，
[0023]
g表示铵离子、烷基铵离子、碱金属离子、氢离子或羟基烷基铵离子，
[0024]
n为满足式(2)的整数，
[0025]
15≤n
ꢀꢀꢀꢀ
(2)；
[0026]
式(3)所示的化合物：
[0027]
ra(rc)ch-l-ch(rd)rbꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0028]
式(3)中，
[0029]
l表示-s-、或-ss-，
[0030]
ra及rb相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、或可被选自由下述z1及z2组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基，
[0031]
z1：-ch(nhr1)cor2[0032]
z2：-cor2[0033]
z1及z2中，
[0034]
r1表示氢原子、氨基的保护基、或c(o)-r
11
基，
[0035]r11
表示可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基、或可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的苯基，
[0036]
r2表示可以被可经保护的羧基取代的c1-6的烷基亚氨基、或-or
20
基，r
20
表示氢原子或羧基的保护基，
[0037]
rc及rd相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、或c1-6的烷基；
[0038]
式(4)所示的化合物：
[0039]
[化学式2]
[0040][0041]
式(4)中，
[0042]
l与前述含义相同，
[0043]
re及rf相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、c1-6烷氧基-羰基、羧基，或者可被c1-6烷氧羰基或羧基取代的c1-6的烷基，x、l及它们所键合的碳原子形成五元或六元的环结构，并且，
[0044]
x表示选自ch2、ch2ch2、(ch3)chch2、(ch3ch2)chch2、ch2ch2ch2、(ch3)chch2ch2、ch2(ch3)chch2、ch＝n、(ch3)c＝n、ch2nh、(ch3)chnh、(ch3)2cnh、(cooh)chnh、ch2och2、ch2nhch2及ch2coch2中的任意基团。
[0045]
项2.如前项1所述的组合物，其中，
[0046]
r1表示氢原子、氨基的保护基、或c(o)-r
11
基，
[0047]r11
表示可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基，并且，
[0048]
x表示选自ch2、ch2ch2、(ch3)chch2、(ch3ch2)chch2、ch2ch2ch2、(ch3)chch2ch2、ch2(ch3)chch2、ch＝n、(ch3)c＝n、ch2nh、(ch3)chnh、(cooh)chnh、ch2och2及ch2coch2中的任意基团。
[0049]
项3.如前项1或2所述的组合物，其中，
[0050]
r1表示氢原子、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苄氧羰基、9-芴基甲基氧基羰基、或c(o)-r
11
基，
[0051]r11
表示可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基，
[0052]
r2表示可以被可经甲基、苄基、烯丙基及叔丁基保护的羧基取代的c1-6的烷基亚氨基、或-or
20
基，r
20
表示氢原子、甲基、苄基、烯丙基或叔丁基，并且，
[0053]
x表示选自ch2、ch2ch2、(ch3)chch2、(ch3ch2)chch2、ch2ch2ch2、(ch3)chch2ch2、ch2(ch3)chch2、ch＝n、(ch3)c＝n、ch2nh、(cooh)chnh、ch2och2及ch2coch2中的任意基团。
[0054]
项4.如前项1～3中任一项所述的组合物，其中，
[0055]
re及rf相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、羧基、或c1-6的烷基，并且，
[0056]
x表示选自ch2、(ch3)c＝n、ch2nh、ch2och2及ch2coch2中的任意基团。
[0057]
项5.如前项1～4中任一项所述的组合物，其中，
[0058]
r1表示氢原子、苯甲酰基、甲酰基、乙酰基、苄氧羰基及9-芴基甲基氧基羰基、或c(o)-r
11
基，
[0059]r11
表示可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基，并且，
[0060]
r2表示可以被可经甲基保护的羧基取代的c1-6的烷基亚氨基、或-or
20
基，r
20
表示氢原子或甲基。
[0061]
项6.如前项1～5中任一项所述的组合物，其中，添加剂为选自由下述化合物组成的组中的至少1种化合物：
[0062]
α-硫辛酸、
[0063]
甲硫氨酸、
[0064]
n-甲酰甲硫氨酸、
[0065]
n-乙酰甲硫氨酸、
[0066]
n-苯甲酰甲硫氨酸、
[0067]
n-苄氧羰基-甲硫氨酸、
[0068]
n-fmoc-甲硫氨酸、
[0069]
甲硫氨酸甲酯盐酸盐、
[0070]
二丁基硫醚、
[0071]
二己基硫醚、
[0072]
噻唑烷-2-羧酸、
[0073]
2-异丁基-4,5-二甲基-3-噻唑啉(异构体混合物)、
[0074]
4-硫环己酮、
[0075]
1,4-噻噁烷、及
[0076]
氧化型谷胱甘肽。
[0077]
项7.如前项1～6中任一项所述的组合物，其中，前述添加剂为选自由硫辛酸、氧化型谷胱甘肽及甲硫氨酸组成的组中的至少1种化合物。
[0078]
项8.如前项1～7中任一项所述的组合物，其中，前述烷基铵盐为选自由单烷基铵盐及二烷基铵盐组成的组中的至少1种烷基铵盐。
[0079]
项9.如前项1～8中任一项所述的组合物，其中，前述水溶性有机溶剂为选自由醇系水溶性有机溶剂及腈系水溶性有机溶剂组成的组中的水溶性有机溶剂。
[0080]
项10.如前项1～9中任一项所述的组合物，其中，前述式(1)中，r各自独立地表示羟基或甲氧基。
[0081]
项11.如前项1～9中任一项所述的组合物，其中，前述式(1)中，r为羟基。
[0082]
项12.核酸寡聚物的制造方法，其包括将前项1～11中任一项所述的组合物和具有至少1个氧原子的c1-c4的有机溶剂进行混合，并分离所析出的核酸寡聚物。
[0083]
项13.如前项1～12中任一项所述的组合物的制造方法，其包括将包含式(1)所示的核酸寡聚物、烷基铵盐、水溶性有机溶剂及水的色谱柱洗脱液与添加剂进行混合，前述核酸寡聚物是通过对利用固相合成法合成的式(1)的核酸寡聚物的粗产物进行反相柱层析处理而得到的。
[0084]
发明的效果
[0085]
通过本发明提供包含具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物的稳定的组合物、使用了该组合物的前述核酸寡聚物的高效的制造方法。
附图说明
[0086]
[图1]图1为示出利用亚磷酰胺法合成核酸寡聚物的例子的图。
具体实施方式
[0087]
针对组合物进行说明，其特征在于，前述组合物包含前述式(1)所示的具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物、烷基铵盐、水溶性有机溶剂、水及添加剂，该添加剂为选自由具有二硫键的化合物及具有硫醚键的化合物组成的组中的至少1种化合物。
[0088]
前述式(1)中，bc所表示的核酸碱基(以下也记作“碱基”)可以是天然或非天然的核酸碱基。作为该非天然的核酸碱基，可例示出天然或非天然的核酸碱基的修饰类似物。作为核酸碱基，典型地可例示出嘌呤化合物及嘧啶化合物，例如可例示出美国专利第3,687,808号、“concise encyclopedia of polymer science and engineering”，858～859页，kroschwitz j.i.编、john wiley&sons、1990及englisch等、angewandte chemie、international edition，1991，30卷，p.613中公开的核酸碱基。
[0089]
具体而言，例如可例示出腺嘌呤、异鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤及鸟嘌呤等嘌呤碱基；以及胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等嘧啶碱基等。
[0090]
并且，作为bc所表示的核酸碱基，例如可例示出2-氨基腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤等氨基衍生物；5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、6-甲基嘌呤、2-丙基嘌呤等烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶及5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶及6-氮杂胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8-卤化、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化及其它的8-取代嘌呤；5-三氟甲基化及其它的5-取代嘧啶；6-氮杂嘧啶；n-2、n-6及o-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)；二氢尿嘧啶；3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶；7-脱氮腺嘌呤；n6-甲基腺嘌呤、n6,n6-二甲基腺嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；n3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-羟基吡啶；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；n4-乙酰基胞嘧啶；2-硫代胞嘧啶；n6-甲基腺嘌呤；n6-异戊基腺嘌呤；2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤；n-甲基鸟嘌呤；o-烷基化碱基等。
[0091]
当r表示oq基，q表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基时，该结构如下述式(3)中示出的lna-1、lna-2及lna-3的结构所示。
[0092]
[化学式3]
[0093][0094]
(式中，bc表示与前述相同的核酸碱基。)
[0095]
作为y所示的羟基的保护基，只要能够在酰胺法中作为保护基发挥功能，则能够没有特别制限地使用，例如，能够广泛地使用用于酰胺化合物的已知的保护基。y所示的羟基的保护基优选为以下基团。
[0096]
[化学式4]
[0097][0098]
(式中，r1、r2及r3相同或彼此不同，各自独立地表示氢或烷氧基)
[0099]
作为前述烷氧基，例如可例示出甲氧基。
[0100]
式(1)的核酸寡聚物的链长为n≥15。作为链长的上限，例如可例示出n≤200。前述核酸寡聚物中，n个x中至少1个是硫原子，也可以x都是硫原子。例如，在n＝103的情况下，硫原子的数量可例示出6、12或20。
[0101]
式(1)的核酸寡聚物可以是例如dna或rna寡聚物，或者在这些寡聚物中包含非天然型的核酸碱基而成的寡聚物。前述核酸寡聚物典型地为单链的dna或rna寡聚物。前述式(1)的核酸寡聚物中，取代基r优选各自独立地为羟基或甲氧基。作为前述核酸寡聚物，优选为作为式(1)的核酸寡聚物(取代基r各自独立地为羟基或甲氧基)的rna。进一步详细而言，优选为包含取代基r为羟基的核苷酸和取代基r为甲氧基的核苷酸这两者的核酸寡聚物。
[0102]
前述组合物中的核酸寡聚物的浓度通常为0.05mg/ml～5mg/ml，优选为0.05mg/ml～1mg/ml，更优选为0.1mg/ml～0.5mg/ml。
[0103]
作为前述烷基铵盐，通常使用单烷基铵盐、二烷基铵盐及三烷基铵盐，优选使用单烷基铵盐及二烷基铵盐，更优选使用二烷基铵盐。形成单烷基铵盐的单烷基胺的碳原子数优选为3～10，更优选为4～6，进一步优选为己基胺。形成二烷基铵盐的二烷基胺的碳原子数优选为4～10，更优选为5～9。优选的二烷基胺为二丁基胺。形成三烷基铵盐的三烷基胺
的碳原子数优选为6～12，更优选为6～9，具体可例示出三乙基胺。
[0104]
作为形成前述单烷基铵盐、二烷基铵盐及三烷基铵盐的酸，例如可例示出碳酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸及丙酸。
[0105]
作为前述铵盐的浓度，通常为1～200mm，优选为5～150mm，更优选为20～100mm。
[0106]
作为前述水溶性溶剂，可例示出醇系有机溶剂及腈系有机溶剂。前述组合物中的醇系有机溶剂的量通常为0～20％，优选为0～15％，更优选为0％～10％。利用反相柱层析得到的洗脱液级分中通常包含水、水溶性溶剂(例如，醇系有机溶剂、腈系有机溶剂)、烷基铵盐及式(1)的核酸寡聚物。上述洗脱液中的腈系有机溶剂的量通常为10～70％，优选为20～60％，更优选为30～50％(以上的％均表示质量％)。
[0107]
水的量只要是以满足前述成分的浓度范围的方式取得平衡的量即可，通常为90％～30％，优选为80％～40％，更优选为70％～40％。
[0108]
以下针对前述式(3)所表示的添加剂进行说明。
[0109]
z1中，作为r1所表示的氨基的保护基，没有特别限定，能够使用已知的保护基。作为具体的保护基，例如可例示出苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苄氧羰基及9-芴基甲基氧基羰基(fmoc基)等。作为优选的保护基，可例示出苯甲酰基、甲酰基、苄氧羰基及9-芴基甲基氧基羰基。
[0110]
作为r
11
所表示的、可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基，例如可例示出(ch2)2ch(nh2)(cooh)基，作为可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的苯基，可例示出苯基、氨基苯基及羧基苯基等。
[0111]
优选的r
11
可例示出可被选自由氨基及羧基组成的组中的至少1种基团取代的c1-6的烷基(例如，(ch2)2ch(nh2)(cooh)基)。
[0112]
z1及z2中，作为cor2基，可例示出cooh基及coor
20
基，r
20
所表示的羧基的保护基没有特别限定，能够使用已知的保护基，作为这样的保护基，例如可例示出甲基、苄基、烯丙基及叔丁基等。
[0113]
作为r2所表示的可以被可经保护的羧基取代的c1-6的烷基亚氨基，例如可例示出甲基亚氨基、乙基亚氨基、丙基亚氨基、丁基亚氨基、戊基亚氨基及己基亚氨基，或者这些基团被可经甲基、苄基、烯丙基、或叔丁基保护的羧基取代而得的基团。优选可以被可经甲基保护的羧基取代的c1-6的烷基亚氨基，例如可例示出nhch2co2h基作为优选的基团。
[0114]
作为式(3)所表示的添加剂，具体而言，可例示出甲硫氨酸、氧化型谷胱甘肽、n-甲酰甲硫氨酸、n-乙酰基-dl-甲硫氨酸、n-苯甲酰基-dl-甲硫氨酸、n-苄氧羰基-dl-甲硫氨酸、n-fmoc-l-甲硫氨酸、l-甲硫氨酸甲酯盐酸盐、二丁基硫醚及二己基硫醚。
[0115]
接下来，针对式(4)所表示的化合物的定义进行说明。
[0116]
首先，re及rf所表示的基团中，作为构成c1-6的烷氧羰基及c1-6的烷基的、c1-6的烷基或烷基部分，可例示出甲基、乙基、丙基、异丁基、正丁基、戊基及己基。
[0117]
作为re及rf所表示的基团，优选氢原子、羧基、或c1-6的烷基。
[0118]
作为re或rf所表示的基团的具体例，可例示出羧基、异丁基、(ch2)4co2h及co2c2h5。
[0119]
作为x，可例示出如上所述的式(4)中记载的基团，优选的x为ch2、ch2ch2、(ch3)chch2、(ch3ch2)chch2、ch2ch2ch2、(ch3)chch2ch2、ch2(ch3)chch2、ch＝n、(ch3)c＝n、ch2nh、
(ch3)chnh、(cooh)chnh、ch2och2及ch2coch2，
[0120]
进一步优选为ch2、(ch3)c＝n、ch2nh、ch2och2及ch2coch2。
[0121]
作为式(4)所表示的化合物，具体而言，可例示出α-硫辛酸、噻唑烷-2-羧酸、2-异丁基-4,5-二甲基-3-噻唑啉(异构体混合物)等。
[0122]
这些添加剂通常以水溶液或水溶性有机溶剂的溶液的形式使用。
[0123]
作为前述添加剂的浓度，通常为0.1μm～100mm，优选为1mm～10mm。
[0124]
前述添加剂除了购买以外，例如能够通过日本专利第4,476,386号、日本专利第5,317,836号，以及“fundamentals of modern peptide synthesis”，3～24页，john howl编、muriel amblard，jean-alain fehrentz，jean martinez,methods in molecular biology(商标)book series、卷298、2005中公开的方法获得。
[0125]
本发明的组合物通常通过下述方式得到：向通过对利用固相合成法合成的式(1)的核酸寡聚物的粗产物进行反相柱层析处理(其使用了含有烷基铵盐、水溶性有机溶剂及水的流动相)而得到的色谱柱洗脱液中添加前述添加剂。或者，也可以通过使用预先含有前述添加剂的流动相，以反相柱层析的洗脱级分的形式来配制本发明的组合物。
[0126]
对于利用反相柱层析得到的洗脱级分而言，在通常用于核酸的分离分析的层析的条件下以波长260nm的uv吸收对组成进行分析，并被选择和收集。从收集的级分中得到已纯化的目标物即具有规定量的硫代磷酸酯键的核酸寡聚物。作为前述分析法，例如能够使用非专利文献(handbook of analysis of oligonucleotides and related products,crc press)中记载的方法。
[0127]
关于前述反相柱层析的填充剂，作为成为疏水性的固定相的二氧化硅或聚合物，例如可例示出固定有选自苯基、碳原子数1～20的烷基及氰基丙基中的任1种以上的二氧化硅或聚合物。关于作为该填充剂的二氧化硅或聚合物，例如使用粒径为2μm以上、或5μm以上的二氧化硅或聚合物。
[0128]
作为反相柱层析的流动相，例如使用下述流动相：包含如前述那样的浓度及ph的铵盐的水溶液的流动相，及包含前述水溶性的有机溶剂、并以依次增大其浓度的梯度进行使用的流动相。反相柱层析的温度通常为20～100℃，优选为30～80℃，更优选为40～70℃。本发明的组合物典型地以如前述那样的反相柱层析的洗脱液级分的形式而得到。
[0129]
对于本发明的组合物而言，例如也可以在保存工序之后施加选自用于分离核酸寡聚物的再沉淀工序、分液工序、超滤工序、脱保护工序及冷冻干燥工序这样的后处理工序中的单个或多个工序。保存工序中，也可以通过使用非活性气体来置换保存容器内的气氛。作为非活性气体，例如可例示出氮气、氩气、氦气。
[0130]
再沉淀工序中，使经稳定化的溶液与不良溶剂接触，能够使核酸寡聚物析出并进行分离。如果需要，也可以在由固液分离的状态除去液体部后，通过过滤等收集并分离所析出的核酸寡聚物。作为再沉淀工序的不良溶剂，可举出具有至少1个氧原子的c1-c4的有机溶剂(例如，c1-c4醇、四氢呋喃、二氧杂环己烷)。作为该溶剂，优选乙醇或异丙醇。
[0131]
分液工序中，在经稳定化的溶液中混合乙酸水溶液等酸性水溶液、水及食盐水等之中的至少一种，进一步加入不与水混和的有机溶剂，从而分液为水层和有机层，由此能够获取包含所期望的核酸寡聚物的水层。
[0132]
超滤工序中，能够使用超滤膜将在保存工序后的溶液中存在的核酸寡聚物与所期
望的分子量以下的低分子成分分离。
[0133]
在核酸寡聚物的5’末端部位有保护基的情况下，为了对其进行脱保护，通过在保存工序后的溶液中混合乙酸水溶液等酸性水溶液、或将乙酸等酸性物质溶解于有机溶剂而成的溶液，能够对核酸寡聚物的保护基进行脱保护。
[0134]
冷冻干燥工序中，通过对冷冻的核酸寡聚物的水溶液进行减压而使水升华，从而能够将核酸寡聚物和水分分离。
[0135]
利用亚磷酰胺法进行的核酸寡聚物的合成能够依照已知的方法(例如，前述日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的方法)进行核酸延伸反应。针对利用亚磷酰胺法进行的核酸寡聚物的制造，可举出图1中示出的路线的rna的合成作为例子，参照以下示出的反应路径(缩合反应、氧化、脱保护)对核酸寡聚物的制造方法进行说明。
[0136]
表示反应路径的前述化学式中，ba表示可被保护的核酸碱基；tr表示保护基；x与前述定义相同，sp表示无机多孔载体的核苷结构以外的部分。
[0137]
具有核苷结构的无机多孔载体(sp-nu)及构成酰胺单体(am-1)的核苷的核酸碱基为与前述相同的核酸碱基或被保护基保护的核酸碱基。
[0138]
作为优选的酰胺单体(am-1)的例子，在下述化学式(am-1’)所表示的化合物中，r表示被保护的羟基时，作为具体的保护基，可例示出被叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms基)、双(2-乙酰氧基)甲基(ace基)、(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(tom基)、(2-氰基乙氧基)乙基(cee基)、(2-氰基乙氧基)甲基(cem基)、对甲苯磺酰基乙氧基甲基(tem基)、(2-氰基乙氧基)甲氧基甲基(emm基)等保护的、tbdms酰胺(tbdms rna amidites，商品名，chemgenes corporation)、ace酰胺、tom酰胺、cee酰胺、cem酰胺、tem酰胺(chakhmakhcheva的总论：protective groups in the chemical synthesis of oligoribonucleotides、rus sian journal of bioorganic chemistry,2013,vol.39,no.1,pp.1-21.)、emm酰胺(国际公开第2013/027843号中记载)等。
[0139]
[化学式5]
[0140][0141]
(式中，r表示与前述相同的基团，ba表示可被保护的核酸碱基)
[0142]
[rna的固相合成]
[0143]
对无机多孔载体(sp-nu)的tr基进行脱保护得到固相载体(am-2)。然后，使酰胺单体(am-1)和固相载体(am-2)进行缩合反应，得到反应产物(am-3)。然后，对反应产物(am-3)
进行氧化，得到产物(am-4)。然后，对产物(am-4)进行脱保护(-tr)，得到产物(am-5)。接下来，使酰胺单体(am-1)和产物(am-5)进一步进行缩合反应，从而延伸磷酸二酯键。如此，以成为所期望的序列的方式对延伸的寡核苷酸链末端的5’位的羟基重复进行必要的一系列的脱保护、缩合反应、氧化的循环，然后，从固相载体切出，由此能够制造所期望的序列的核酸分子。该合成也可以使用采用亚磷酰胺法的核酸自动合成装置等进行。此处以rna为例进行说明，但也能够适用于包含核糖核苷酸之外的核苷酸的核酸化合物。
[0144]
对tr基进行脱保护的工序中，对担载于固相载体上的rna链末端的5’位的羟基的保护基进行脱保护。作为保护基，使用三苯甲基系保护基(典型而言，dmtr基)。脱保护能够使用酸来进行。作为脱保护用的酸，例如可举出三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、甲磺酸、盐酸、乙酸及对甲苯磺酸等。
[0145]
缩合工序中，使利用前述脱保护工序进行了脱保护的rna链末端的5’位的羟基与核苷亚磷酰胺键合，生成亚磷酸酯。作为前述核苷亚磷酰胺，使用5’位的羟基被保护基(例如dmtr基)保护的核苷亚磷酰胺。
[0146]
另外，缩合工序能够使用激活前述核苷亚磷酰胺的激活剂来进行。作为激活剂，例如可举出5-苄硫基-1h-四氮唑(btt)、1h-四氮唑、4,5-二氰基咪唑(dci)、5-乙硫基-1h-四氮唑(ett)、n-甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(n-mebit)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(bit)、n-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(n-phimt)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(imt)、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(nbt)、1-羟基苯并三唑(hobt)及5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1h-四氮唑(activator-42)等。
[0147]
在缩合工序之后，也可以适当对未反应的5’位的羟基进行加帽。加帽能够使用乙酸酐-四氢呋喃溶液、苯氧乙酸酐/n-甲基咪唑溶液等已知的加帽溶液来进行。
[0148]
氧化工序是对利用前述缩合工序形成的亚磷酸酯进行氧化的工序。氧化工序能够使用氧化剂进行。作为氧化剂，可举出碘、间氯过氧苯甲酸、叔丁基过氧化氢、2-过氧化丁酮、双(三甲基甲硅烷基)过氧化物、1,1-二氢过氧环十二烷(1,1-dihydroperoxycyclododecane)及过氧化氢等。
[0149]
在将亚磷酸三酯基转化成硫代磷酸三酯基的情况下，作为“氧化剂”，例如能够使用硫、3h-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(beaucage试剂)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(adtt)、5-苯基-3h-1,2,4-二噻唑-3-酮(pos)、[(n,n-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3h-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(ddtt)及苯乙酰二硫化物(pads)。该氧化剂能够以成为0.001～2m的浓度的方式用适宜的溶剂稀释来使用。作为反应中使用的溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，例如可举出二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意比例的混合溶剂。
[0150]
氧化工序可以在前述加帽操作之后进行，反之，也可以在氧化工序之后进行加帽操作，该顺序没有限定。
[0151]
通过在氧化工序后回到脱保护工序并根据应合成的核酸寡聚物的核苷酸序列重复上述的缩合反应、氧化、脱保护这一系列的工序，能够合成具有所期望的序列的rna。
[0152]
在具有所期望的序列的核酸寡聚物的合成结束后，使用氨或胺化合物，从固相载体切断并回收rna链。
[0153]
作为此处的胺化合物，例如可举出甲基胺、乙基胺、异丙基胺、亚乙基二胺、二乙基胺及三乙基胺等。
[0154]
这样得到的核酸寡聚物的链长例如可例示出n≥60、n≥80或n≥100、并且n≤200的链长。优选n≥60。具体而言，例如n＝67、100或120。
[0155]
对磷酸保护基进行脱保护的工序在具有所期望的序列的核酸的合成结束后使胺化合物发挥作用以对磷酸部分的保护基进行脱保护。作为胺化合物，例如可举出记载的二乙基胺等。
[0156]
在有核糖的2’位或3’位的羟基的保护基的情况下，能够依照国际公开第2006/022323号公报)、国际公开第2013/027843号公报、或国际公开第2019/208571号公报中记载的方法来除去。
[0157]
实施例
[0158]
以下，利用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于此。
[0159]
测定方法
[0160]
以下的试验中使用的各测定方法如下所示。
[0161]
(测定方法1：rna的纯度的测定方法)
[0162]
分取后溶液中的rna的纯度的测定利用hplc进行。利用hplc(波长260nm，色谱柱dnapactm pa200、4.0mm
×
250mm、8.0μm)将分取的rna分离为各成分，由得到的色谱图的峰的总面积值中的主产物的峰的面积值计算rna的纯度。将hplc测定条件示于下述表1。
[0163]
[表1]
[0164][0165]
[参考例1]
[0166]
rna的基于酰胺法的固相合成
[0167]
合成具有以下示出的i的核酸序列的rna。该链由103个碱基长度组成。
[0168]
链i：a*u*a*acucaauuuguaaaaaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccgu uau caacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu*u*u*u(5
’‑3’
)(序列号1)
[0169]
前述序列的标注中，核苷酸之间的标记＊表示连接核苷酸的磷酸键为硫代磷酸酯。
[0170]
该rna是基于亚磷酰胺法使用核酸合成仪(akta oligopi lot plus100 ge healthcare公司)从3’侧向5’侧进行合成的。合成以63μmol规模实施。另外，使用下述试剂进行该合成：作为rna酰胺，分别使用下述式的尿苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例2中记载)、胞苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例3中记载)、腺苷emm酰
胺(国际公开第2013/027843号的实施例4中记载)及鸟苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例5中记载)，使用多孔玻璃作为固相载体，使用二氯乙酸甲苯溶液作为脱保护溶液，使用5-苄硫基-1h-四氮唑作为缩合剂，使用碘溶液作为氧化剂，使用3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮作为硫化剂，使用苯氧基乙酸酐溶液和n-甲基咪唑溶液作为加帽溶液。核酸延伸结束后，通过使二乙基胺溶液作用于载体上的核酸从而选择性地对磷酸部分的氰基乙基保护基进行脱保护。此处，emm为(2-氰基乙氧基)甲氧基甲基的缩写。
[0171]
[化学式6]
[0172][0173]
从固相合成后的固相载体的切出和脱保护依照国际公开第2013/027843号中记载的方法。即，加入氨水溶液和乙醇，静置一段时间后，过滤固相载体，蒸馏除去溶剂。然后，使用四丁基氟化铵进行羟基的脱保护。使用注射用蒸馏水以成为所期望的浓度的方式溶解得到的rna。
[0174]
rna的分取纯化
[0175]
在下述表2的条件下进行柱层析纯化。其中，在纯化前，在色谱柱内将流动相a以流速4.7ml/min通液12.5分钟后添加样本。在保留时间94.2分钟-95.8分钟为止进行分取，利用hplc对得到的溶液进行分析。需要说明的是，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。其结果是，纯度为94.2％。使用该分取纯化的rna溶液进行以下实施例及比较例的实验。
[0176]
[表2]
[0177][0178]
[实施例1]
[0179]
将参考例1中利用反相柱层析分取纯化的rna溶液99μl放入容量300ml的聚丙烯制管形瓶(vial)(thermo fisher公司)，混合硫辛酸的乙腈溶液1μl作为添加剂溶液，配制规定浓度的试样。将放入有混合溶液的管形瓶放入调温至60℃的恒温箱(kenis公司)，静置8小时。静置后，将从恒温箱取出的聚丙烯制管形瓶冷却至室温，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。将结果示于表3。
[0180]
根据计算，将硫辛酸的浓度配制为3mm(0.07％)的组合物具有以下的组成。水：63.79％、乙腈：34.89％、二丁基胺0.84％、乙酸：0.39％、(以乙酸二丁基铵计为1.23％)、核酸浓度：0.21mg/ml(0.02％)。
[0181]
[实施例2]
[0182]
作为添加剂溶液，使用甲硫氨酸水溶液并配制成甲硫氨酸的浓度为3mm(0.05％)的溶液来代替实施例1的实验中的硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表3。
[0183]
[实施例3]
[0184]
作为添加剂溶液，添加氧化型谷胱甘肽水溶液并配制成氧化型谷胱甘肽的浓度为0.15mm(0.01％)的溶液来代替实施例1的实验中的硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表3。
[0185]
[比较例1]
[0186]
将参考例1中利用反相柱层析分取纯化的rna溶液100μl放入容量300ml的聚丙烯制管形瓶(thermo fisher公司)，将放入有溶液的管形瓶放入调温至60℃的恒温箱(kenis公司)，静置8小时。静置后，将从恒温箱取出的聚丙烯制管形瓶冷却至室温，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。将结果示于表3。
[0187]
[比较例2]
[0188]
作为添加剂溶液，分别以规定浓度使用半胱氨酸水溶液、n-乙酰半胱氨酸的乙腈
溶液、还原型谷胱甘肽水溶液、二硫苏糖醇水溶液、l-抗坏血酸水溶液、或次亚硫酸钠水溶液来代替实施例1的实验中的硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验。将结果示于表3。
[0189]
[表3]
[0190][0191]
1)表示将参考例1中配制的核酸(纯度为94.2％)于60℃静置8小时后的核酸的纯度。
[0192]
2)核酸的保留率(％)＝静置后的核酸纯度/静置前的核酸纯度
[0193]
[实施例4](从分取纯化的rna溶液回收rna)
[0194]
使用实施例1中以硫辛酸的浓度成为3mm的方式进行混合并于60℃静置8小时后的溶液，进行以下处理。将溶液80μl放入容量15ml的聚丙烯制离心管(corning公司)，追加乙酸钠水溶液(3m，ph＝5.2)40μl、乙醇240μl。以10分钟、3000g、25℃的条件对得到的浆状溶液进行离心，除去上清液。然后，将放入70％乙醇水溶液200μl，以10分钟、3000g、25℃的条件进行离心并除去上清液的操作重复2次，得到rna。将得到的rna溶解于水80μl，利用前述测定方法1中记载的方法计算rna的纯度时，纯度为85.8％。
[0195]
[比较例3]
[0196]
使用比较例1中于60℃静置8小时后的溶液进行以下处理。将溶液80μl放入容量15ml的聚丙烯制离心管(corning公司)，追加乙酸钠水溶液(3m，ph＝5.2)40μl、乙醇240μl。以10分钟、3000g、25℃的条件对得到的浆状溶液进行离心，除去上清液。然后，将放入70％乙醇水溶液200μl，以10分钟、3000g、25℃的条件进行离心并除去上清液的操作重复2次，得到rna。将得到的rna溶解于水80μl，利用前述测定方法1中记载的方法计算级分中的rna的纯度时，纯度为70.9％。
[0197]
[参考例2]
[0198]
rna的基于酰胺法的固相合成
[0199]
合成具有以下示出的ii的核酸序列的rna。该链由67个碱基长度组成。
[0200]
链ii：am*gm*cm*amumamgmcaaguuamaaauaaggmc*u*amg*u*c*cmguuaucaamcmumumgmamamamamamgmumggcacmcmgmagucggmumgmcm*um*um*u(5
’‑
3')(序列号2)
[0201]
前述序列的标注中，核苷酸之间的标记＊表示连接核苷酸的磷酸键为硫代磷酸酯。字母am,um,cm,gm表示2’羟基被替换成甲氧基的核苷酸。该rna是基于亚磷酰胺法使用
核酸合成仪(akta oligopi lot plus100 ge healthcare公司)从3’侧向5’侧进行合成的。合成以53μmol规模实施。另外，使用下述试剂进行该合成：作为rna酰胺，使用尿苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例2中记载)、胞苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例3中记载)、腺苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例4中记载)及鸟苷emm酰胺(国际公开第2013/027843号的实施例5中记载)；和下述式的尿苷2’ome酰胺、胞苷2’ome酰胺、腺苷2’ome酰胺及鸟苷2’ome酰胺，使用多孔玻璃作为固相载体，使用二氯乙酸甲苯溶液作为脱保护溶液，使用5-苄硫基-1h-四氮唑作为缩合剂，使用碘溶液作为氧化剂，使用3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮作为硫化剂，使用苯氧基乙酸酐溶液和n-甲基咪唑溶液作为加帽溶液。核酸延伸结束后，通过使二乙基胺溶液作用于载体上的核酸从而选择性地对磷酸部分的氰基乙基保护基进行脱保护。此处，emm为(2-氰基乙氧基)甲氧基甲基的缩写。
[0202]
[化学式7]
[0203][0204]
从固相合成后的固相载体的切出和脱保护依照国际公开第2013/027843号中记载的方法。即，加入氨水溶液和乙醇，静置一段时间后，过滤固相载体，蒸馏除去溶剂。然后，使用四丁基氟化铵进行羟基的脱保护。使用注射用蒸馏水以成为所期望的浓度的方式溶解得到的rna。
[0205]
rna的分取纯化
[0206]
在下述表4的条件下进行柱层析纯化。其中，在纯化前，在色谱柱内将流动相a以流速4.7ml/min通液12.5分钟后添加样本。在保留时间66.7分钟-70.9分钟为止进行分取，利用hplc对得到的溶液进行分析。需要说明的是，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。其结果是，纯度为94.2％。使用该分取纯化的rna溶液进行以下实施例及比较例的实验。
[0207]
[表4]
[0208][0209]
[实施例5]
[0210]
将参考例2中利用反相柱层析分取纯化的rna溶液99μl放入容量300ml的聚丙烯制管形瓶(thermo fisher公司)，混合l-甲硫氨酸的水溶液1μl作为添加剂溶液，配制l-甲硫氨酸的浓度为1.5mm的试样。将放入有混合溶液的管形瓶放入调温至60℃的恒温箱(kenis公司)，静置8小时。静置后，将从恒温箱取出的聚丙烯制管形瓶冷却至室温，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。将结果示于表5。
[0211]
根据计算，将l-甲硫氨酸的浓度配制为1.5mm(0.02％)的组合物具有以下的组成。水：62.95％、乙腈：32.21％、甲醇：3.59％、二丁基胺0.82％、乙酸：0.38％、(以乙酸二丁基铵计为1.20％)、核酸浓度：0.31mg/ml(0.03％)。
[0212]
[实施例6]
[0213]
作为添加剂溶液，使用n-甲酰基-l-甲硫氨酸的甲醇溶液并配制成n-甲酰基-l-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.06％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0214]
[实施例7]
[0215]
作为添加剂溶液，使用n-乙酰基-dl-甲硫氨酸的甲醇溶液并配制成n-乙酰基-dl-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.06％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0216]
[实施例8]
[0217]
作为添加剂溶液，使用n-苯甲酰基-dl-甲硫氨酸的甲醇溶液并配制成n-苯甲酰基-dl-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.08％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0218]
[实施例9]
[0219]
作为添加剂溶液，使用n-苄氧羰基-dl-甲硫氨酸的甲醇溶液并配制成n-苄氧羰基-dl-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.12％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0220]
[实施例10]
[0221]
作为添加剂溶液，使用将n-fmoc-l-甲硫氨酸溶解于甲醇与乙腈的混合溶剂(混合比50:50(v/v))而成的溶液并配制成n-fmoc-l-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.10％)的溶液来代
替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0222]
[实施例11]
[0223]
作为添加剂溶液，使用l-甲硫氨酸甲酯盐酸盐的水溶液并配制成l-甲硫氨酸甲酯盐酸盐的浓度为3mm(0.07％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0224]
[实施例12]
[0225]
作为添加剂溶液，使用二丁基硫醚的乙腈溶液并配制成二丁基硫醚的浓度为3mm(0.05％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0226]
[实施例13]
[0227]
作为添加剂溶液，使用二己基硫醚的乙腈溶液并配制成二丁基硫醚的浓度为3mm(0.07％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0228]
[实施例14]
[0229]
作为添加剂溶液，使用噻唑烷-2-羧酸的水溶液并配制成噻唑烷-2-羧酸的浓度为3mm(0.04％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0230]
[实施例15]
[0231]
作为添加剂溶液，使用2-异丁基-4,5-二甲基-3-噻唑啉(异构体混合物)的乙腈溶液并配制成2-异丁基-4,5-二甲基-3-噻唑啉(异构体混合物)的浓度为3mm(0.06％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0232]
[实施例16]
[0233]
作为添加剂溶液，使用4-硫环己酮的乙腈溶液并配制成4-硫环己酮的浓度为3mm(0.04％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0234]
[实施例17]
[0235]
作为添加剂溶液，使用1,4-噻噁烷的乙腈溶液并配制成1,4-噻噁烷的浓度为3mm(0.03％)的溶液来代替实施例5的实验中的l-甲硫氨酸的水溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表5。
[0236]
[比较例4]
[0237]
将参考例2中利用反相柱层析分取纯化的rna溶液100μl放入容量300ml的聚丙烯制管形瓶(thermo fisher公司)，将放入有溶液的管形瓶放入调温至60℃的恒温箱(kenis公司)，静置8小时。静置后，将从恒温箱取出的聚丙烯制管形瓶冷却至室温，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。将结果示于表5。
[0238]
[表5]
[0239][0240]
1)表示将参考例2中配制的核酸(纯度为94.2％)于60℃静置8小时后的核酸的纯度。
[0241]
2)核酸的保留率(％)＝静置后的核酸纯度/静置前的核酸纯度
[0242]
[参考例3]
[0243]
rna的分取纯化
[0244]
针对参考例2中得到的使用四丁基氟化铵进行了羟基的脱保护的rna，在下述表6的条件下进行柱层析纯化。其中，在纯化前，在色谱柱内将流动相a以流速4.7ml/min通液12.5分钟后添加样本。在保留时间91.7分-94.2分钟为止进行分取，利用hplc对得到的溶液进行分析。需要说明的是，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。其结果是，纯度为95.1％。使用该分取纯化的rna溶液进行以下实施例及比较例的实验。
[0245]
[表6]
[0246][0247]
[实施例18]
[0248]
将参考例3中利用反相柱层析分取纯化的rna溶液99μl放入容量300ml的聚丙烯制管形瓶(thermo fisher公司)，混合α-硫辛酸的乙腈溶液1μl作为添加剂溶液，配制α-硫辛酸的浓度为3mm的试样。将放入有混合溶液的管形瓶放入调温至60℃的恒温箱(kenis公司)，静置14小时。静置后，将从恒温箱取出的聚丙烯制管形瓶冷却至室温，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。将结果示于表7。
[0249]
根据计算，将α-硫辛酸的浓度配制为3.0mm(0.07％)的组合物具有以下的组成。水：59.69％、乙腈：35.38％、甲醇：3.84％、己基胺0.61％、乙酸：0.36％、(以乙酸己基铵计为0.97％)、核酸浓度：0.35mg/ml(0.04％)。
[0250]
[实施例19]
[0251]
作为添加剂溶液，使用l-甲硫氨酸的水溶液并配制成l-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.05％)的溶液来代替实施例18的实验中的α-硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表7。
[0252]
[实施例20]
[0253]
作为添加剂溶液，使用dl-甲硫氨酸的水溶液并配制成dl-甲硫氨酸的浓度为3mm(0.05％)的溶液来代替实施例18的实验中的α-硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表7。
[0254]
[实施例21]
[0255]
作为添加剂溶液，使用氧化型谷胱甘肽的水溶液并配制成氧化型谷胱甘肽的浓度为3mm(0.01％)的溶液来代替实施例18的实验中的α-硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条件下进行实验，测定实验后的rna的纯度。将结果示于表7。
[0256]
[比较例5]
[0257]
将参考例3中利用反相柱层析分取纯化的rna溶液100μl放入容量300ml的聚丙烯制管形瓶(thermo fisher公司)，将放入有溶液的管形瓶放入调温至60℃的恒温箱(kenis公司)，静置14小时。静置后，将从恒温箱取出的聚丙烯制管形瓶冷却至室温，利用前述测定方法1中记载的方法计算纯度。将结果示于表7。
[0258]
[比较例6]
[0259]
作为添加剂溶液，分别以规定浓度使用异丁烯基硫醚的乙腈溶液或4-叔丁基二苯基硫醚的乙腈溶液来代替实施例18的实验中的硫辛酸的乙腈溶液，除此以外，在同样的条
件下进行实验。将结果示于表7。
[0260]
[表7]
[0261][0262]
1)表示将参考例3中配制的核酸(纯度为95.1％)于60℃静置8小时后的核酸的纯度。
[0263]
2)核酸的保留率(％)＝静置后的核酸纯度/静置前的核酸纯度产业上的可利用性
[0264]
根据本发明，能够得到使具有硫代磷酸酯键的核酸寡聚物稳定化而成的组合物，故而，能够高效地制造该组合物。
[0265]
[序列表自由文本]
[0266]
序列表的序列号1及2表示依照本发明的制造方法制造的寡核苷酸的碱基序列。