海马催产素AVT和IT及其在制备催产药剂中的应用的制作方法

海马催产素avt和it及其在制备催产药剂中的应用
技术领域：
1.本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及海马催产素avt和it及其在制备催产药剂中的应用。


背景技术：

2.海龙科鱼类因其独特的适应性而受到广泛的关注，早在1867年，lockwood就发现海马是通过育儿袋来繁育后代，但无法解释这种现象的生理机制(lockwood,1867)。随着硬骨鱼研究手段的发展，鱼类生殖的调控机理逐步被揭开，包括性腺分化、配子生成和生殖行为特征等方面(lubzens et al.,2010；munakata and kobayashi,2010；zohar et al.,2010)。绝大部分的这些研究都集中在经济鱼类，而对于海龙科鱼类这种独特生殖行为，包括雄性育儿、性角色逆转和交配形式多样化等方面的调控机理尚不清楚。海龙科鱼类的生殖机理研究将有助于解决比较内分泌中的基本问题，揭示激素功能在物种进化中的演变(denver et al.,2009)。
3.神经垂体激素是一个在结构和功能都相对保守的九肽家族，很早在原口动物和原始后生动物的第一神经递质中就有发现，其起源早于脊椎动物(grimmelikhuijzen et al.,2002)。在哺乳动物中，催产素(oxytocin,ot)和抗利尿激素(arginine vasopressin,avp)都属于神经垂体激素但具有不同的功能，催产素具有促进子宫收缩(宫缩)和催乳等功能，而抗利尿激素具有促进肾脏中尿液的重吸收和提高血压等功能(cunningham and sawchenko,1991)。而在硬骨鱼中，有两种催产素基因，分别命名为催产素(isotocin,it)和精氨酸加压催产素(arginine vasotocin,avt)，催产素it是哺乳动物ot的直系同源基因，而精氨酸加压催产素avt是avp的直系同源基因(gwee et al.,2009)。
4.精氨酸加压催产素(avt)在鱼类中可调控多种生理行为，包括渗透压调节、代谢、应激反应、交配、生殖、抚幼以及昼夜和季节节律性的生物行为(balment et al.,2006)。其中，最受关注的是avt在鱼类交配和生殖中的功能，且这些功能已经在一些不同生活史的鱼类中证实(grober et al.,2002)。而在海龙科鱼类中，avt可能参与调控雄性育儿相关的多方面功能，包括育儿袋和精巢肌样细胞的收缩、育儿袋中的渗透压调节及其行为(stolting and wilson,2007)。研究发现，怀孕期的灰海龙(s.floridae)和北方海龙(s.fuscus)大脑中的avt表达水平显著高于分娩后期，表明avt可能在调控海龙科鱼类怀孕过程中起重要作用(ripley and foran,2010)。avt的浓度是通过一种酶联免疫试剂盒(elisa)检测的，这种avt浓度的检测试剂盒将促进对avt在精巢的内分泌调控和育儿袋的功能研究。同时，研究发现avt可以促使机体在产卵中的生殖管道的收缩，推测avt可以诱导交配时卵子和精子的释放，同时参与分娩过程。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供具有催产作用的海马催产素avt和it。
6.所述的海马催产素avt的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.所述的海马催产素it的氨基酸序列如seq id no.4所示。
8.本发明还提供编码海马催产素avt或海马催产素it的核苷酸序列。
9.所述的编码海马催产素avt的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.所述的编码海马催产素it的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.本发明还提供了具有海马催产作用的核心九肽，其氨基酸序列为：cyisncpig。
12.本发明还提供了海马催产素avt、it或核心九肽在制备海马催产药剂中的应用。
13.本发明还提供了海马催产素avt或核心九肽在制备调控海马雌激素水平药剂中的应用。
14.本发明从海马中分离出具有催产作用的海马催产素avt和it，可以将它们用于海马分娩中，调节其催产行为。
附图说明
15.图1是线纹海马avt和it基因的cdna序列和推导出的蛋白序列，信号肽部分为下划线标示，核心九肽区域用方框部分标注；
16.图2是脊椎动物催产素avt和it蛋白的同源性比对；
17.图3是脊椎动物avt和it的系统进化树；
18.图4是腹腔注射avt核心九肽后，海马血清中雌雄激素的变化。
具体实施方式
19.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
20.实施例1：
21.本研究克隆鉴定了线纹海马精氨酸催产素avt和催产素it基因的cdna全长序列，基于海马转录组数据设计中间片段的引物，在海马脑中克隆得到中间片段，然后测序获得中间片段的序列，再通过smart-race获得avt和it的5’utr和3’utr区域，鉴定得到avt基因的cdna全长序列为675bp，开放阅读框(orf框)为477bp，核苷酸序列如seq id no.1所示(atggctcgctcctccgcgttaccccggtgcgtgctgggactcctcgccctctccatcgccctctcctccgcctgctacatccagaactgcccccggggaggcaagcgagccttggccgagacggcactcagacagtgcatgtcatgcggccccggggaaaaaggccgctgctacggcccaaacatctgctgcgtggagggcttcggctgccttctaggctcctcggaaacaactcaatgtgtggaggagaactacctgctgactccctgccaggccggggggcgaccctgcggactggaggggggtcgctgcgccgcttcaggactctgctgtaactctgagagctgtgcagtggactcctcctgtctgggggaggttgagacgaaggatccggccgaaacctctgcagggagctcacctgcagagctgcttctgcgccttctccatgtagccaccagggggcagacagagtactaa)，编码158个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示，n端前24个氨基酸为信号肽，信号肽后面紧接着就是精氨酸催产素avt的核心九肽cyiqncprg和断裂位点gkr；it基因的cdna全长序列为689bp，开放阅读框471bp，核苷酸序列如seq id no.3所示(atgagcggagcagctgtgtccatttacctgtttttcctcctgtctgtatgctcggcatgttacatctccaactgtcccattggcgggaaacgctccatcatggatgccccgttgcgcaagtgcatgtcatgcggccctggggacaggggccgctgctttggccccaatatctgttgcggcgatggctttggttgcctgctcggctccccggaaactgctcactgcctggaggagagctacctgctcaccccctgccaggccggggggagatcctgcggatctgagggcggacactgcgccgcttcaggtctctgttgcgatgcagagagctgcagcgcagaccagtcgtgtctcatggatgaggaggcggatgatcaag
tgggccaatacgacggcggcgaccccggtgacatcatcgtgaggctcctccatctggccgctcacgcaacccctcatcgactcgctcagtga)，编码156个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.4所示，n端前19氨基酸为信号肽，信号肽后面为催产素it的核心九肽cyisncpig和断裂位点(gkr)(图1)。
22.通过与脊椎动物(包括硬骨鱼和人类)avt和it蛋白进行蛋白多重比对(图2)，发现线纹海马avt和it蛋白在功能结构域(包括激素运载蛋白neurophysin和copeptin结构域)非常保守，线纹海马avt蛋白的核心九肽cyiqncprg与其他硬骨鱼一致，同时it蛋白的核心九肽cyisncpig也与其他硬骨鱼类相一致。
23.基于脊椎动物催产素avt和it蛋白序列，进行多重比对后，利用毗邻方法构建nj进化树，结果表明，海马精氨酸催产素avt与其他硬骨鱼类的avt聚为一支，而海马催产素it与其他硬骨鱼类聚为一支(图3)，进一步验证了克隆得到的线纹海马催产素avt和it序列的正确性，且发现海马与青鳉的亲缘关系较近。
24.利用实时荧光定量pcr的方法检测海马催产素avt的表达模式，检测其在雄性海马脑、肝、肠、肾、鳃、性腺、育儿袋和肌肉等组织，发现催产素avt主要在脑中表达，在其他外周组织中表达量较低。
25.合成保守的avt核心九肽，用不同浓度的核心九肽(50ng/g和500ng/g)在体注射怀孕后期的海马，发现注射avt核心九肽6小时后，怀孕海马有提前分娩现象，未发育完全的仔海马被提前从育儿袋中孵化出来(图4)；且发现注射九肽后，怀孕海马血清中的雌激素水平显著上升，而雄激素水平则没有明显变化(图4)，而对非怀孕时期的海马，注射高浓度的核心十肽，海马血清中的雌激素水平没有明显变化，表明精氨酸催产素avt对海马分娩具有重要的调控作用，且是通过调控海马的雌激素来调节其催产行为。