一种层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体的方法及应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体的方法及应用。


背景技术：

2.作为威胁人类健康的重大疾病之一，癌症的发病率逐年递增，且呈现出明显的“年轻化”趋势。近年来，女性生育年龄推迟，多国家的流行病学研究显示，癌症的发病率在孕妇中呈上升趋势，癌症已成为女性生殖年龄死亡的第二大常见病因。根据肿瘤的发生阶段及治疗特性，部分肿瘤不能推迟到孕妇分娩后进行治疗。因此，在胎儿器官分化形成及生长发育阶段，手术、放疗以及化疗等传统肿瘤治疗手段对孕妇和胎儿均有不同程度的影响，甚至造成极其严重的不可逆危害，孕妇面临着终止妊娠或冒险治疗的艰难选择。
3.化疗作为传统癌症治疗中最常用的手段，其最大弊端在于化疗药物的选择识别性往往不够高，会对正常的细胞和组织造成“误伤”。对于胚胎而言，即使有胎盘屏障的保护，但也难以幸免。化疗药物暴露可引起胎儿畸形，包括中枢神经缺损、神经管缺陷、颅面畸形、心血管畸形、四肢缺损、骨骼缺陷、内脏缺陷等，因此，抗癌药物对哺乳动物的胚胎发育毒性日益受到关注，但研究难度较大，相关研究仍较少。依托泊苷(etoposide，vp16)为临床上常用的细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于dna拓扑异构酶ⅱ，形成药物-酶-dna稳定的可逆性复合物，阻碍dna修复。但药物的水溶性差、生物利用度低，毒副作用较强，在一定程度上限制了该药物的应用；更为严重的是，vp16具有较强的致畸、致突变作用，影响人体生殖细胞及胎儿的生长和发育。


技术实现要素：

4.本发明提供的一种层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体，在低剂量的条件下就能起到有效的肿瘤抑制效果，且在妊娠期恶性肿瘤治疗中对胚胎发育具有良好的保护，对临床实践具有重大意义。
5.为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
6.本发明的第一个方面，提供了一种层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体，所述纳米复合体由表面阳离子特性的层状双氢氧化物(ldh)纳米材料和依托泊苷(vp16)制备，粒径为50nm～150nm。
7.优选的，所述ldh为正六边形，由三价金属阳离子、二价金属阳离子和层间阴离子组成。
8.本发明的第二个方面，提供了本发明所述的层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体在制备抗肿瘤制剂中的应用。
9.优选的，所述的肿瘤包括妊娠期肿瘤。
10.本发明通过充分的实验验证了层状双氢氧化物-依托泊苷(ldh@vp16)纳米复合体在妊娠期恶性肿瘤治疗中对胚胎发育保护的应用。所述对胚胎发育的保护作用，包含对胚
胎体重、颅面部发育、四肢发育、骨骼发育、心血管系统发育、中枢神经系统发育等与胚胎发育相关的各个方面。因此，本发明制备的层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体可以适用于妊娠期肿瘤。
11.优选的，所述的肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、皮肤癌。
12.优选的，所述制剂的有效浓度为不小于0.3μg/ml。
13.本发明通过实验验证了，单独使用在vp16浓度达到5μg/ml时，4t-1细胞存活率仍在85％以上；而本发明提供的ldh@vp16浓度为0.3μg/ml时，对4t-1细胞已经具备明显的抑制效果。可见，本技术的ldh@vp16具有更高的药效，且有效剂量使用的药物更低，药物对身体的毒副作用也更少。
14.优选的，所述制剂为注射剂。
15.本发明的第三个方面，提供了本发明的层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体的制备方法，包括以下步骤：
16.s1、向氢氧化钠中加入适量依托泊苷，使依托泊苷完全溶解；
17.s2、硝酸镁和硝酸铝溶解后逐滴加入，氮气保护下搅拌；
18.s3、离心后去离子水洗涤、重悬；
19.s4、置于水热釜中反应一定时间，离心收集，去离子水洗涤，即得层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体。
20.与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：
21.1、本发明提供的一种层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体，能够在妊娠期恶性肿瘤的治疗的过程中，对胚胎发育具有良好的保护作用，对妊娠期患者意义重大；
22.2、本发明提供的一种层状双氢氧化物-依托泊苷纳米复合体有效剂量低，药效高。
附图说明
23.为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。
24.显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
25.图1为本发明实施例1的ldh@vp16纳米复合体的tem图；
26.图2为本发明实施例2的ldh@vp16纳米复合体对乳腺癌4t-1细胞的抑制效果；
27.图3为本发明实施例3的ldh@vp16纳米复合体对妊娠期肿瘤小鼠的治疗效果；
28.图4为本发明实施例3的ldh@vp16纳米复合体对妊娠期肿瘤小鼠胚胎发育的保护作用；
29.图5为本发明实施例3的ldh@vp16纳米复合体治疗后妊娠期肿瘤小鼠的体重增长曲线。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
31.显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.需要理解的是：
33.术语“妊娠期”，是指受孕后至分娩前的生理时期，属生理学名词，亦称怀孕期。自成熟卵受精后至胎儿娩出，一般为266天左右。为便于计算，妊娠通常是从末次月经第一天算起，足月妊娠约为280天(40周)。在妊娠期间母体的新陈代谢、消化系统、呼吸系统、血管系统、神经系统、内分泌系统、生殖系统、骨关节韧带及乳房均发生相应的改变。
34.术语“肿瘤”，是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。
35.术语“制剂”，是以各类具有医研价值的碳基生物为原料，利用传统技术或现代生物技术制造，作用于人体各类生理症状的预防(保健)、治疗和诊断的各种形态制剂。包括生物制剂、药物制剂，其中生物制剂包括保健生物制剂：如乳酸钙、维生素d等；医用生物制剂：如疫苗等。药物制剂是按照一定的剂型要求所制成的，可以最终提供给用药对象使用的药品。
36.术语“纳米复合体”，是以树脂、橡胶、陶瓷和金属等基体为连续相，以纳米尺寸的金属、半导体、刚性粒子和其他无机粒子、纤维、纳米碳管等改性为分散相，通过适当的制备方法将改性剂均匀性地分散于基体材料中，形成一相含有纳米尺寸材料的复合体系，这一体系材料称之为纳米复合材料。
37.对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
38.还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。
39.下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
40.实施例1 ldh@vp16纳米复合体的制备
41.定量取氢氧化钠于三口烧瓶中，加入适量vp16，置于60℃水浴中搅拌使vp16完全溶解；取一定比例硝酸镁和硝酸铝溶解后逐滴加入氢氧化钠溶液中，氮气保护下搅拌；得到的悬浊液离心后去离子水洗涤、重悬，置于水热釜中100℃反应一定时间，离心(10000rpm，20min)收集，去离子水洗涤三次，即得ldh@vp16纳米复合体。
42.本实施例制备的ldh@vp16纳米复合体的tem图，如图1所示。
43.实施例2 ldh@vp16纳米复合体对乳腺癌的抑制效果
44.实验分组：ldh为加入ldh纳米材料组；vp16为加入vp16组；ldh vp16为加入ldh纳米材料和vp16的物理混合物组；ldh@vp16为加入实施例1制备的ldh@vp16纳米复合体组。
45.实验方法：
46.将鼠源乳腺癌4t-1细胞分别以每孔6
×
103个的密度接种在96孔板上培养24h，分别加入本实验分组的试剂，孵育24h后，加入10μl cck8溶液孵育2h，用酶标仪检测450nm处od值，计算肿瘤细胞存活率。
47.实验结果：
48.如图2所示，4t-1细胞经vp16处理后，在0.3～2.5μg/ml浓度范围内细胞存活率几乎无变化，在vp16浓度达到5μg/ml时，4t-1细胞存活率仍在85％以上；而ldh@vp16组在0.3μg/ml时，对4t-1细胞已经具备较好的抑制效果，且其抑制效率随ldh@vp16的浓度递增。
49.实施例3 ldh@vp16纳米复合体对妊娠期肿瘤的治疗效果和对胚胎发育的保护作用
50.实验分组：pbs为加入pbs组；ldh为加入ldh纳米材料组；vp16为加入vp16组；ldh vp16为加入ldh纳米材料和vp16的物理混合物组；ldh@vp16为加入实施例1制备的ldh@vp16纳米复合体组。
51.实验方法：
52.将balb/c雌鼠与雄鼠按一定比例合笼，次日早检查阴道栓阳性的雌鼠取出单独饲养，标记为孕0.5天，并于当天小鼠皮下注射4t-1细胞，即为妊娠期乳腺癌模型小鼠。模型小鼠于孕3.5天起分别腹腔注射本实验分组的试剂，每两天注射一次，直至孕19.5天。
53.实验结果：
54.如图3-5所示，妊娠期乳腺癌模型小鼠经腹腔注射给予ldh@vp16后，瘤体积的增长速度显著低于其他组；此外，与对照组相比ldh@vp16组模型小鼠体重在治疗过程中的稳步增加，胎鼠形态与对照组并无差异，展现出良好的生物安全性和优异的胚胎保护作用。
55.在上述说明书的描述过程中：
56.术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
57.最后应说明的是：
58.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
59.尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。