一种三元低共熔溶剂及其在克氏原螯虾壳甲壳素提取中的应用

1.本发明属于天然产物提取技术领域，涉及一种用于天然产物提取的三元低共熔溶剂，特别涉及一种三元低共熔溶剂及其在克氏原螯虾壳甲壳素提取中的应用。


背景技术：

2.克氏原螯虾（procambarus clarkii）由于生长适应性强、繁殖速度快，成为淡水虾产业中的重要经济类别，近年以来，克氏原螯虾产业发展迅猛，据统计2020年我国克氏原螯虾养殖产量为239.37万吨，该产业带动了当地产业发展和社会进步。但同时，由于克氏原螯虾非可食部位占比较高，外壳大部分被丢弃或低值利用。
3.克氏原螯虾虾壳中含有大量的甲壳素，它是一种天然高分子化合物，不溶于水，它具有无毒、可生物降解、生物相容、化学和热稳定等多种特性，因此这些生物聚合物在农业、医药、食品、纺织等多种形式的工业和研究领域具有吸引力。但因其所特有的分子结构，难以为绝大部分溶剂所溶解，实际中仅在几种强酸溶液中溶解，因此限制了提取效果。
4.近年来，随着对克氏原螯虾甲壳素的精深制备及深度利用，甲壳素产品在农业、食品、生物医药、化工、化妆品等行业中得到了更加广泛的利用。长期以来，工业提取甲壳素采用强酸脱碳酸钙和碱脱蛋白质。此方法对强酸强碱需求量大，后续废水处理成本高，容易产生严重的环境负荷，不利于产业的可持续发展。近年来多种新型绿色溶剂用于甲壳素提取中，其中低共熔溶剂（deep-eutectic solvent，des）有一定的应用，低共熔溶剂是通过氢键受体（hydrogen-bond acceptor，hba）和氢键供体（hydrogen-bond donor，hbd）的氢键作用而形成的一种熔点比其任一组分的熔点都要低，在室温状态下常呈现液体状态的一种液体化合物，由于低共熔溶剂具有良好的溶解性能、组分来源丰富、价格低廉等特点而在化工领域应用广泛，但在甲壳素提取研究中常规的一种氢键受体和一种氢键供体结合而成的溶液体系在提取效率上存在较大困难，不同氢键供体与氢键受体进行低共熔溶剂制备时受到酸性性质、化合物链长、官能团性质、摩尔比组成、制备条件等因素影响，而导致低共熔溶剂在黏度、溶解性能、酸性等性能上存在较大差异，因此提升低共熔溶剂的制备水平，制备出具有显著提升克氏原螯虾甲壳素的低共熔溶剂是当前研究的重点。低共熔溶剂在天然产物提取领域相比常见的溶剂提取法在提取效率和提取效果方面展现出明显优势，然而比提高提取效率更重要的是，获得的提取物可以保持其生物活性并且对人类无害，成为食品、生物、催化等领域开发和利用天然产物的又一发展方向。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种三元低共熔溶剂，将本发明的三元低共熔溶剂应用于克氏原螯虾壳甲壳素提取，在超声和微波处理下使虾壳粉与低共熔溶剂充分溶解，并能对虾壳粉中的杂质和钙质进行去除，最终获得高提取率和高纯度的甲壳素。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：一种三元低共熔溶剂，由氯化胆碱、乳酸、乙酸混合制备而成，所述氯化胆碱、乳酸以及乙酸的摩尔比为1:1:1~1:3:3。其中，氯化胆碱为氢键受体，乳酸、乙酸为氢键供体，混合制备的过程为：在一定温度下加热，磁力持续搅拌一段时间至生成均一透明液体，即得三元低共熔溶剂。
7.进一步的，氯化胆碱、乳酸、乙酸混合制备三元低共熔溶剂时，温度为90℃~150℃，时间为8h~24h。
8.本发明的进一步改进方案为：上述三元低共熔溶剂应用于克氏原螯虾壳甲壳素提取。
9.进一步的，三元低共熔溶剂在克氏原螯虾壳甲壳素提取中的应用，具体步骤如下：s1：收集克氏原螯虾的虾壳，超声清洗，去除异物，浸泡于溶液中加热搅拌一段时间，然后超声处理，用水冲洗，在干燥箱中烘干，高速粉碎机粉碎，过筛得虾壳粉备用；s2：将s1制得的虾壳粉加入三元低共熔溶剂中，在超声和微波处理下加热搅拌一段时间至虾壳粉组织结构充分解离溶解，室温下加入反萃取溶剂去离子水，离心至中性得到沉淀物，将沉淀物用双氧水脱色，烘干后即得到甲壳素。
10.进一步的，s1中浸泡所用溶液为90%-100%乙醇溶液，加热搅拌温度为25 ℃~40 ℃，时间为2 h~8 h。
11.进一步的，s1中烘干温度为90℃-100℃。
12.进一步的，s1中虾壳粉过80～200目的过滤筛。
13.进一步的，s2中所述虾壳粉与三元低共熔溶剂的质量比为1:5~1:20。
14.进一步的，s2中超声和微波处理的超声功率为50w/40khz，微波加热温度为40℃-70℃，处理时间为1 h~5 h。
15.进一步的，s2中采用10% h2o2进行脱色，烘干温度为50℃-90℃。
16.本发明的有益效果为：本发明以氯化胆碱为氢键受体，乳酸、乙酸为氢键供体，制备了一种三元低共熔溶剂，该溶剂对克氏原螯虾甲壳素的提取具有显著提升效果。
17.低共熔溶剂中的酸可以与克氏原螯虾虾壳中矿物质反应，发生脱矿作用，从而使甲壳素与蛋白质结合的原纤维结构发生松动，产生空隙，氢键受体氯化胆碱中的氯具有强负电性，可以形成阴离子、阳离子和中性离子氢键，从而有利于水合离子的形成，导致低共熔溶剂电离和质子化增强，从而提升了脱矿效果。此外，低共熔溶剂可以与甲壳素和蛋白质形成新的氢键，削弱甲壳素重复单元中的强氢键作用，从而能破坏甲壳素与其他大分子连接的价键，从而导致甲壳素和蛋白质的原显微结构发生断裂，有利于低共熔溶剂进一步在上述结构中进行溶胀，蛋白质中丰富的活性官能团结构可以与氢键受体形成新的氢键，从而使得原纤维结构分子内和分子间的氢键被破坏，导致蛋白质从该结构中分离，加速了蛋白质的脱除。甲壳素中的分子内/分子间氢键被低共熔溶剂阻断，同时在甲壳素分子和低共熔溶剂之间形成新的氢键，达到分离甲壳素的目的。
18.本发明的三元低共熔溶剂用于克氏原螯虾壳甲壳素提取，去除矿物质主要是酸的作用，但并非所有的酸或者强酸可以达到本技术的结果，单一酸作为氢键供体时，酸性较弱时的脱矿效果相对较差，但当酸性强时脱矿效果虽好，但还导致甲壳素酸水解为双糖，导致
产率会显著下降，而且强酸可以增加甲壳素的表面改性，还能提高甲壳素的羟基和氢键供体中酸的羧基之间发生了酯化反应，影响最终提取效果和质量。而采用乳酸和乙酸做氢键供体时，形成数量更多和结构更加丰富的氢键，并且维持缓冲平衡的酸性条件更有利于脱矿作用的发挥，目前科学界尚不清楚作为氢键供体的酸度与甲壳素产量和纯度的关系，但本技术的两种氢键供体组合及其配比不但可以促进矿物质的消除，而且采用两种不同性质酸性氢键供体制备的三元低共熔溶剂可以达到更好的脱蛋白和甲壳素提取的效果。
19.本发明采用三元低共熔溶剂的高效提取，通过加热及超声微波处理一锅法获得较高纯度的克氏原螯虾虾壳甲壳素，不使用强酸脱盐，不但能够显著降低生产成本，还能杜绝纯化过程中的化学试剂，降低环境污染，同时能大大提高甲壳素的提取率。
附图说明
20.图1为 三元低共熔溶剂提取的甲壳素（a）、商业化甲壳素（b）和虾壳（c）的sem图。
21.从图1可以看出，与虾壳相比，提取的甲壳素的形态和表面发生了显著变化。由于矿物质和蛋白质的存在，虾壳表面粗糙，没有孔隙。对于低共熔就提取的甲壳素，由于去除了矿物质和蛋白质，表面光滑且有孔隙。
具体实施方式
22.实施例1制备虾壳粉：收集克氏原螯虾的虾壳，超声清洗，去除异物，浸泡于90%-100%乙醇溶液中25 ℃~40 ℃下加热搅拌2 h~8 h，然后超声处理，用水冲洗，在干燥箱中90℃-100℃温度下烘干，高速粉碎机粉碎，过120目的过滤筛得虾壳粉备用。
23.制备三元低共熔溶剂：按照摩尔比1:1:1称取氯化胆碱、乙酸以及乳酸依次加入至烧杯内，置于100 ℃油浴锅中并不断搅拌形成透明液体，即为三元低共熔溶剂。
24.提取甲壳素：按照1:8的质量比称取虾壳粉与三元低共熔溶剂混合，在设定50 ℃温度的超声微波萃取容器中反应2小时，得到反应产物。将冷却至室温的反应物加入蒸馏水并冷却，在高速离心机上进行离心，反复水洗到接近中性，将沉淀物烘干后得到白色片状物，即得到甲壳素。甲壳素称重后经计算提取率为28.06%，灰分含量0.25%，蛋白质含量3.51%。
25.实施例2制备虾壳粉：收集克氏原螯虾的虾壳，超声清洗，去除异物，浸泡于90%-100%乙醇溶液中30 ℃~35 ℃下加热搅拌2 h~8 h，然后超声处理，用水冲洗，在干燥箱中90℃-100℃温度下烘干，高速粉碎机粉碎，过200目的过滤筛得虾壳粉备用。
26.制备三元低共熔溶剂：按照摩尔比1:3:1称取氯化胆碱、乙酸以及乳酸依次加入至烧杯内，置于100 ℃油浴锅中并不断搅拌形成透明液体，即为三元低共熔溶剂。
27.提取甲壳素：按照1:10的质量比称取虾壳粉与三元低共熔溶剂混合，在设定55 ℃温度的超声微波萃取容器中反应4小时，得到反应产物。将冷却至室温的反应物加入蒸馏水并冷却，在高速离心机上进行离心，反复水洗到接近中性，将沉淀物烘干后得到白色片状物，即得到甲壳素。甲壳素称重后经计算提取率为31.26%，灰分含量0.30%，蛋白质含量3.40%。
28.实施例3制备虾壳粉：收集克氏原螯虾的虾壳，超声清洗，去除异物，浸泡于90%-100%乙醇溶液中25 ℃~30 ℃下加热搅拌2 h~8 h，然后超声处理，用水冲洗，在干燥箱中90℃-100℃温度下烘干，高速粉碎机粉碎，过120目的过滤筛得虾壳粉备用。
29.制备三元低共熔溶剂：按照摩尔比1:3:3称取氯化胆碱、乙酸以及乳酸依次加入至烧杯内，置于100 ℃油浴锅中并不断搅拌形成透明液体，即为三元低共熔溶剂。
30.提取甲壳素：按照1:8的质量比称取虾壳粉与三元低共熔溶剂混合，在设定60 ℃温度的超声微波萃取容器中搅拌反应3小时，得到反应产物。将冷却至室温的反应物加入蒸馏水并冷却，在高速离心机上进行离心，反复水洗到接近中性，将沉淀物烘干后得到白色片状物，即得到甲壳素。甲壳素称重后经计算提取率为30.46%，灰分含量0.28%，蛋白质含量3.70%。
31.实施例4制备虾壳粉：收集克氏原螯虾的虾壳，超声清洗，去除异物，浸泡于90%-100%乙醇溶液中30 ℃~40 ℃下加热搅拌2 h~8 h，然后超声处理，用水冲洗，在干燥箱中90℃-100℃温度下烘干，高速粉碎机粉碎，过200目的过滤筛得虾壳粉备用。
32.制备三元低共熔溶剂：按照摩尔比1:1:3称取氯化胆碱、乙酸以及乳酸依次加入至烧杯内，置于100 ℃油浴锅中并不断搅拌形成透明液体，即为三元低共熔溶剂。
33.提取甲壳素：按照1:10的质量比称取虾壳粉与三元低共熔溶剂混合，在设定60 ℃温度的超声微波萃取容器中搅拌反应2小时，得到反应产物。将冷却至室温的反应物加入蒸馏水并冷却，在高速离心机上进行离心，反复水洗到接近中性，将沉淀物烘干后得到白色片状物，即得到甲壳素。甲壳素称重后经计算提取率为29.86%，灰分含量0.31%，蛋白质含量3.45%。
34.对比例1采用摩尔比为1:3的氯化胆碱与乳酸制备的二元低共熔溶剂替代很发明的三元低共熔溶剂，其他操作同实施例1，甲壳素称重后经计算提取率为25.78%，灰分含量0.58%，蛋白质含量4.62%。
35.对比例2采用摩尔比为1:3的氯化胆碱与乙酸制备的二元低共熔溶剂替代很发明的三元低共熔溶剂，其他操作同实施例1，甲壳素称重后经计算提取率为26.12%，灰分含量0.63%，蛋白质含量4.69%。