半边莲中药标准汤剂的特征图谱构建方法、鉴别方法以及化学成分含量检测方法与流程

1.本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种半边莲中药标准汤剂的特征图谱构建方法、鉴别方法以及化学成分含量检测方法。


背景技术：

2.半边莲为桔梗科植物半边莲lobelia chinensis lour.的干燥全草。夏季采收，除去泥沙，洗净，晒干。半边莲又名急解索、细米草、蛇舌草、瓜仁草、山梗菜、六倍利等，其性寒味甘，归心、肺经、小肠，取其全株入药，具有清热解毒，利尿消肿的功效。半边莲作为中药，始见《本草纲目》，《本草纲目》载：“半边莲，小草也。生阴湿塍堑边，就地细梗引蔓，节节而生细叶，秋开小花，淡红紫色，止有半边，如莲花状。”故称为“半边莲”。半边莲多野生于水沟、水田边或潮湿的草地、荒地或阴坡上，分布贵州、安徽、江西、湖南、湖北、河南、广东、广西等地。
3.目前还没有建立有效的半边莲中药标准汤剂质量标准，无法有效控制和较全面的评价半边莲中药标准汤剂的质量。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明实施例的目的之一包括提供半边莲中药标准汤剂特征图谱的构建方法，本发明构建的特征图谱能够全面反映半边莲中药标准汤剂的质量，为半边莲中药标准汤剂的质量控制和质量评价提供有效手段。
6.在本发明的第一方面，提供一种半边莲中药标准汤剂特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
7.取半边莲中药标准汤剂供试品，用提取溶剂提取，收集提取液，制备供试品溶液；
8.采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测，将所得供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，拟定半边莲中药标准汤剂的特征图谱；
9.所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；流动相a为乙腈，流动相b为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.02mol/l～0.06mol/l；
10.采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱的程序包括：0min～24min，所述流动相a的体积百分比为由10％上升到14％，所述流动相b的体积百分比由90％下降到86％，24min～28min，所述流动相a的体积百分比为由14％上升到22％，所述流动相b的体积百分比由86％下降到78％，28min～35min，所述流动相a的体积百分比保持在22％，所述流动相b的体积百分比由保持在78％，35min～41min，所述流动相a的体积百分比为由22％上升到30％，所述流动相b的体积百分比由78％下降到70％，41min～53min，所述流动相a的体积百分比为由30％上升到33％，所述流动相b的体积百分比由70％下降到67％。
11.在本发明的一些实施例中，所述高效液相色谱法的条件还具有如下技术特征中的
一个或者多个：(1)检测波长为330nm～350nm；(2)柱温为33℃～37℃；(3)流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
12.在本发明的一些实施例中，制备所述供试品溶液的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述提取溶剂为甲醇浓度为65％～75％(v/v)的甲醇溶液；(2)提取的方式为超声提取或者加热回流提取，超声提取的条件包括：功率为225w～275w，频率为35khz～45khz，时间为15min～45min；(3)每1g所述半边莲中药标准汤剂供试品对应的所述提取溶剂的用量为40ml～60ml。
13.在本发明的一些实施例中，所述构建方法还包括：
14.制备对照品溶液，所述对照品溶液中的对照品包含木犀草素7-二葡萄糖苷酸、地奥司明和蒙花苷中的一种或者多种；
15.参照上述所述的高效液相色谱法对所述对照品溶液进行检测，将所得对照品色谱图与所述供试品色谱图进行比较，对所述供试色谱图中的共有峰进行标识。
16.在本发明的一些实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含甲醇和二甲基亚砜。
17.在本发明的一些实施例中，所述特征图谱含有11个特征峰，峰1对应木犀草素7-二葡萄糖苷酸，峰10对应地奥司明，峰11对应蒙花苷。
18.在本发明的一些实施例中，所述构建方法还包括联合质谱法对所述特征图谱中的特征峰进行高分辨率质谱指认的步骤；
19.所述质谱法的条件包括：
20.hesi离子源参数包括：鞘气流速为60arb～70arb，辅助气流速为18arb～22arb，喷雾电压为2.2kv～2.8kv，s-lens电压为45v～55v，加热温度为280℃～320℃，毛细管温度为480℃～520℃；
21.质谱扫描参数包括：扫描模式正、负离子模式，扫描范围为120m/z～1000m/z，归一化碰撞能量20v、40v，质谱图类型为峰形图。
22.在本发明的第二方面，提供一种半边莲中药标准汤剂的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：
23.取待测品，用提取溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
24.参照在第一方面中所述的高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，将所得待测品色谱图与第一方面中构建的特征图谱做比较，根据比较结果鉴别所述待测品是否为半边莲中药标准汤剂。
25.在本发明的一些实施例中，制备所述待测品溶液的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述提取溶剂为甲醇浓度为65％～75％(v/v)的甲醇溶液；(2)提取的方式为超声提取或者加热回流提取，超声提取的条件包括：功率为225w～275w，频率为35khz～45khz，时间为15min～45min；(3)每1g所述待测品对应的所述提取溶剂的用量为40ml～60ml。
26.在本发明的第三方面，提供一种半边莲中药标准汤剂中化学成分含量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
27.分别制备待测品溶液和对照品溶液；其中，
28.所述待测品溶液的制备步骤包括：取半边莲中药标准汤剂待测品，用提取溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
29.所述对照品溶液中的对照品包含木犀草素7-二葡萄糖苷酸、地奥司明和蒙花苷中的一种或者多种；
30.采用高效液相色谱法对所述待测品溶液和所述对照品溶液进行检测，确定所述半边莲中药标准汤剂待测品中木犀草素7-二葡萄糖苷酸、地奥司明和蒙花苷中的一种或者多种的含量；
31.所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；流动相a为乙腈，流动相b为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.02mol/l～0.06mol/l；
32.采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱的程序包括：0min～24min，所述流动相a的体积百分比为由10％上升到14％，所述流动相b的体积百分比由90％下降到86％，24min～28min，所述流动相a的体积百分比为由14％上升到22％，所述流动相b的体积百分比由86％下降到78％，28min～35min，所述流动相a的体积百分比保持在22％，所述流动相b的体积百分比由保持在78％，35min～41min，所述流动相a的体积百分比为由22％上升到30％，所述流动相b的体积百分比由78％下降到70％，41min～53min，所述流动相a的体积百分比为由30％上升到33％，所述流动相b的体积百分比由70％下降到67％。
33.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)检测波长为330nm～350nm；(2)柱温为33℃～37℃；(3)流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
34.在其中一个实施例中，制备所述待测品溶液的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述提取溶剂为甲醇浓度为65％～75％(v/v)的甲醇溶液；(2)提取的方式为超声提取或者加热回流提取，超声提取的条件包括：功率为225w～275w，频率为35khz～45khz，时间为15min～45min；(3)每1g所述待测品对应的所述提取溶剂的用量为40ml～60ml。
35.在其中一个实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含甲醇和二甲基亚砜。
36.相对于传统技术，本发明具有如下有益效果：本发明采用采用合适条件的高效液相色谱法构建半边莲中药标准汤剂的特征图谱，该特征图谱能够全面反映半边莲中药标准汤剂的质量，为半边莲中药标准汤剂的质量控制和质量评价提供有效手段。通泉草和叶下珠是常见半边莲伪品，基于本发明构建的特征图谱，能够将半边莲中药标准汤剂与其上述伪品的中药标准汤剂区分开来。
附图说明
37.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案、更完整地理解本技术及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为半边莲中药标准汤剂特征图谱(方法1)；
39.图2为半边莲中药标准汤剂特征图谱(方法2)；
40.图3为半边莲中药标准汤剂特征图谱(方法3)；
41.图4为半边莲中药标准汤剂特征图谱(方法4)；
42.图5为半边莲中药标准汤剂特征图谱全波长扫描图(190nm～400nm)；
43.图6为半边莲中药标准汤剂特征图谱不同提取溶剂考察结果；
44.图7为半边莲中药标准汤剂特征图谱不同提取方式考察结果；
45.图8为半边莲中药标准汤剂特征图谱不同提取时间考察结果；
46.图9为15批半边莲中药标准汤剂特征图谱共有模式；
47.图10为半边莲标准汤剂对照特征图谱；
48.图11为半边莲对照药材特征图谱；
49.图12为半边莲中药标准汤剂供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图；
50.图13为半边莲中药标准汤剂特征图谱特征峰的对照品确证；
51.图14为半边莲中药标准汤剂含量测定峰纯度图；
52.图15为地奥司明标准曲线图；
53.图16为蒙花苷标准曲线图；
54.图17为半边莲标准汤剂与通泉草中药标准汤剂特征图谱对比图；
55.图18为半边莲中药标准汤剂与叶下珠中药标准汤剂特征图谱对比图。
具体实施方式
56.下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
57.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
58.目前，针对半边莲药材，已建立有质量控制方法。已有的半边莲药材的指纹/特征图谱研究，色谱峰整体分离效果较差，峰信息较少，不能全面反映半边莲的内在质量。如：周颖等采用hplc法，建立半边莲药材hplc指纹图谱，该指纹图谱共标识出11个共有峰，均未进行明确指认，且各特征峰的分离效果较差。张倩等采用hplc建立半边莲药材指纹图谱，该指纹图谱共有5个共有峰，指认了3个，该指纹图谱峰信息较少，整体分离效果欠佳。这些传统技术整体尚不能很好地反映半边莲药材的质量，用于半边莲中药标准汤剂质量评价的借鉴意义不大。
59.半边莲中药标准汤剂是由半边莲饮片经水提取、浓缩、干燥等工序而成，与药材饮片相比，失去了固有的形态，在质量标准上缺少性状、鉴别等重要指标，而目前没有建立有效的半边莲中药标准汤剂质量标准，无法有效控制和较全面的评价半边莲中药标准汤剂。
60.为此，本发明的目的之一是构建能全面反映半边莲中药标准汤剂质量的特征图谱并结合高效液相色谱-质谱法(hplc ms/ms)对各特征峰进行归属，并且能够用于鉴别伪品通泉草和叶下珠的中药标准汤剂。
61.本发明中，半边莲中药标准汤剂可以通过以下制备方法制备：
62.1.收集来自湖北、贵州、湖南、江西、河南等产地共15批符合2020年中国药典规定的半边莲药材。
63.2.半边莲饮片的制备：取半边莲原药材，除去杂质，洗净，水洗时间不超过1分钟，切5～15mm的段，置60℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥5～6小时，取出，放凉。
64.3.半边莲标准汤剂的制备：取半边莲饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入12倍量水，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次煎煮加10倍量水，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.10mpa)至300ml；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧上铝盖，即得。
65.本发明实施例中的半边莲标准汤剂可以通过以上制备方法制备，可以理解的是，并不局限于此，也可以在上述制备方法的基础上调整一个或者多个步骤、步骤制备。
66.本发明的第一方面
67.本发明提供一种半边莲中药标准汤剂特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
68.取半边莲中药标准汤剂供试品，用提取溶剂提取，收集提取液，制备供试品溶液；
69.采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测，将所得供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，拟定半边莲中药标准汤剂的特征图谱；
70.所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；流动相a为乙腈，流动相b为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.02mol/l～0.06mol/l；
71.采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱的程序包括：0min～24min，所述流动相a的体积百分比为由10％上升到14％，所述流动相b的体积百分比由90％下降到86％，24min～28min，所述流动相a的体积百分比为由14％上升到22％，所述流动相b的体积百分比由86％下降到78％，28min～35min，所述流动相a的体积百分比保持在22％，所述流动相b的体积百分比由保持在78％，35min～41min，所述流动相a的体积百分比为由22％上升到30％，所述流动相b的体积百分比由78％下降到70％，41min～53min，所述流动相a的体积百分比为由30％上升到33％，所述流动相b的体积百分比由70％下降到67％。
72.本发明中，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l、0.06mol/l。
73.在本发明的一些实施例中，所述高效液相色谱法的条件还具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)检测波长为330nm～350nm；(2)柱温为33℃～37℃；(3)流速为0.8ml/min～1.2ml/min。本发明中，检测波长例如为330nm、332nm、335nm、337nm、339nm、341nm、343nm、347nm、349nm、350nm。柱温例如为33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。流速例如为0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min。
74.在本发明的一些实施例中，制备所述供试品溶液的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述提取溶剂为甲醇浓度为65％～75％(v/v)的甲醇溶液；(2)提取的方式为超声提取或者加热回流提取，超声提取的条件包括：功率为225w～275w，频率为35khz～45khz，时间为15min～45min；(3)每1g所述半边莲中药标准汤剂供试品对应的所述提取溶
剂的用量为40ml～60ml。本发明中：所述提取溶剂中甲醇的浓度例如为65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％(v/v)。超声提取的功率例如为225w、227w、229w、231w、233w、235w、237w、239w、241w、245w、247w、249w、251w、253w、255w、257w、261w、263w、265w、267w、269w、271w、273w、275w。频率例如为35khz、36khz、37khz、38khz、39khz、40khz、41khz、42khz、43khz、44khz、45khz。时间例如为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min。
75.本发明中，每1g所述半边莲中药标准汤剂供试品对应的所述提取溶剂的用量为40ml、42ml、44ml、46ml、48ml、50ml、52ml、54ml、56ml、60ml。
76.在本发明的一些实施例中，所述构建方法还包括：
77.制备对照品溶液，所述对照品溶液中的对照品包含木犀草素7-二葡萄糖苷酸、地奥司明和蒙花苷中的一种或者多种；
78.参照如上所述的高效液相色谱法对所述对照品溶液进行检测，将所得对照品色谱图与所述供试品色谱图进行比较，对所述供试色谱图中的共有峰进行标识。
79.在本发明的一些实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含甲醇和二甲基亚砜。
80.在本发明的一些实施例中，所述特征图谱含有11个特征峰，峰1对应木犀草素7-二葡萄糖苷酸，峰10对应地奥司明，峰11对应蒙花苷。
81.在本发明的一些实施例中，所述构建方法还包括联合质谱法对所述特征图谱中的特征峰进行高分辨率质谱指认的步骤；
82.所述质谱法的条件包括：
83.hesi离子源参数包括：鞘气流速为60arb～70arb，辅助气流速为18arb～22arb，喷雾电压为2.2kv～2.8kv，s-lens电压为45v～55v，加热温度为280℃～320℃，毛细管温度为480℃～520℃；
84.质谱扫描参数包括：扫描模式正、负离子模式，扫描范围为120m/z～1000m/z，归一化碰撞能量20v、40v，质谱图类型为峰形图。
85.本发明中：鞘气流速例如为60arb、61arb、62arb、63arb、64arb、65arb、66arb、67arb、68arb、69arb、70arb。辅助气流速例如为18arb、19arb、20arb、21arb、22arb。喷雾电压例如为2.2kv、2.3kv、2.4kv、2.5kv、2.6kv、2.7kv、2.8kv。s-lens电压例如为45v、46v、47v、48v、49v、50v、51v、52v、53v、54v、55v。加热温度例如为280℃、282℃、284℃、286℃、288℃、290℃、292℃、294℃、296℃、298℃、300℃、302℃、304℃、306℃、308℃、310℃、312℃、314℃、316℃、318℃、320℃。毛细管温度例如为480℃、482℃、484℃、486℃、488℃、490℃、492℃、494℃、496℃、498℃、500℃、502℃、504℃、506℃、508℃、510℃、512℃、514℃、516℃、518℃、520℃。
86.本发明的第二方面
87.本发明提供一种半边莲中药标准汤剂的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：
88.取待测品，用提取溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
89.参照在第一方面中所述的高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，将所得待测品色谱图与第一方面中构建的特征图谱做比较，根据比较结果鉴别所述待测品是否为半边莲中药标准汤剂。
90.在本发明的一些实施例中，制备所述待测品溶液的步骤具有如下技术特征中的一
个或者多个：(1)所述提取溶剂为甲醇浓度为65％～75％(v/v)的甲醇溶液；(2)提取的方式为超声提取或者加热回流提取，超声提取的条件包括：功率为225w～275w，频率为35khz～45khz，时间为15min～45min；(3)每1g所述待测品对应的所述提取溶剂的用量为40ml～60ml。
91.本发明中：所述提取溶剂中甲醇的浓度例如为65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％(v/v)。超声提取的功率例如为225w、227w、229w、231w、233w、235w、237w、239w、241w、245w、247w、249w、251w、253w、255w、257w、261w、263w、265w、267w、269w、271w、273w、275w。频率例如为35khz、36khz、37khz、38khz、39khz、40khz、41khz、42khz、43khz、44khz、45khz。时间例如为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min。每1g所述半边莲中药标准汤剂供试品对应的所述提取溶剂的用量为40ml、42ml、44ml、46ml、48ml、50ml、52ml、54ml、56ml、60ml。
92.本发明的第三方面
93.本发明提供一种半边莲中药标准汤剂中化学成分含量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
94.分别制备待测品溶液和对照品溶液；其中，
95.所述待测品溶液的制备步骤包括：取半边莲中药标准汤剂待测品，用提取溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
96.所述对照品溶液中的对照品包含木犀草素7-二葡萄糖苷酸、地奥司明和蒙花苷中的一种或者多种；
97.采用高效液相色谱法对所述待测品溶液和所述对照品溶液进行检测，确定所述半边莲中药标准汤剂待测品中木犀草素7-二葡萄糖苷酸、地奥司明和蒙花苷中的一种或者多种的含量；
98.所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；流动相a为乙腈，流动相b为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.02mol/l～0.06mol/l；
99.采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱的程序包括：0min～24min，所述流动相a的体积百分比为由10％上升到14％，所述流动相b的体积百分比由90％下降到86％，24min～28min，所述流动相a的体积百分比为由14％上升到22％，所述流动相b的体积百分比由86％下降到78％，28min～35min，所述流动相a的体积百分比保持在22％，所述流动相b的体积百分比由保持在78％，35min～41min，所述流动相a的体积百分比为由22％上升到30％，所述流动相b的体积百分比由78％下降到70％，41min～53min，所述流动相a的体积百分比为由30％上升到33％，所述流动相b的体积百分比由70％下降到67％。
100.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)检测波长为330nm～350nm；(2)柱温为33℃～37℃；(3)流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
101.本发明中：检测波长例如为330nm、332nm、335nm、337nm、339nm、341nm、343nm、347nm、349nm、350nm。柱温例如为33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。流速例如为0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min。
102.在其中一个实施例中，制备所述待测品溶液的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述提取溶剂为甲醇浓度为65％～75％(v/v)的甲醇溶液；(2)提取的方式为超
声提取或者加热回流提取，超声提取的条件包括：功率为225w～275w，频率为35khz～45khz，时间为15min～45min；(3)每1g所述待测品对应的所述提取溶剂的用量为40ml～60ml。本发明中：所述提取溶剂中甲醇的浓度例如为65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％(v/v)。超声提取的功率例如为225w、227w、229w、231w、233w、235w、237w、239w、241w、245w、247w、249w、251w、253w、255w、257w、261w、263w、265w、267w、269w、271w、273w、275w。频率例如为35khz、36khz、37khz、38khz、39khz、40khz、41khz、42khz、43khz、44khz、45khz。时间例如为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min。每1g所述半边莲中药标准汤剂供试品对应的所述提取溶剂的用量为40ml、42ml、44ml、46ml、48ml、50ml、52ml、54ml、56ml、60ml。
103.在其中一个实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含甲醇和二甲基亚砜。
104.具体实施例
105.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
106.下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
107.实施例1
108.一种半边莲中药标准汤剂特征图谱的构建方法，具体实施步骤如下：
109.1.1仪器、试剂与试药
110.仪器：waters高效液相色谱仪(e2695，沃特世公司)，agilent高效液相色谱仪(1290，安捷伦公司)，welch aq-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm，js-281)，kromasil c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm，js-223)，thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm，js-235、js-290、js-247)，万分之一分析电子天平(me204e，梅特勒-托利多公司)，百万分之一分析电子天平(xp26，梅特勒-托利多公司)，电热恒温水浴锅(hws-28，上海一恒科技股份有限公司)，数控超声波清洗器(kq-500de，昆山市超声仪器有限公司)，超纯水系统(milli-q direct，默克股份公司)。
111.试剂：乙醇(西陇科学股份有限公司)、甲醇(西陇科学股份有限公司)、磷酸二氢钾(西陇科学股份有限公司)、二甲基亚砜(阿拉丁)均为分析纯；液相用乙腈(默克股份有限公司)、甲醇(默克股份有限公司)、二甲基亚砜(阿拉丁)为色谱级，水为超纯水(实验室自制)。
112.试药：地奥司明(批号：101348-201802，含量：97.3％，中国食品药品检定研究院)；蒙花苷(批号：111528-201911，含量：98.5％，中国食品药品检定研究院)；木犀草素7-二葡萄糖苷酸(批号：dst210830-206，含量：95.81％，成都德思特生物技术有限公司)；半边莲对照药材(批号：121142-201605，中国食品药品检定研究院)；15批半边莲中药标准汤剂。
113.表1、15批半边莲饮片及其中药标准汤剂的产地信息表
114.序号饮片批号半边莲中药标准汤剂批号产地1gp1905033gt1905033湖北省黄冈市罗田县三里畈镇双庙村2gp1905034gt1905034湖北省黄冈市罗田县三里畈古塘河村
3gp1905035gt1905035湖北省黄冈市罗田县三里畈镇双庙村4gp1905113gt1905113贵州省安顺市西秀区宁谷镇洋海村5gp1905114gt1905114贵州省安顺市西秀区双堡乡新民村6gp1905115gt1905115贵州省安顺市西秀区大龙村7gp1906134gt1906134湖南省邵阳市邵东县8gp1906135gt1906135湖南省邵阳市邵东县9gp1906136gt1906136湖南省邵阳市邵东县10gp1909004gt1909004江西省宜春市樟树市刘公庙镇11gp1909005gt1909005江西省宜春市樟树市昌傅乡12gp1909006gt1909006江西省宜春市樟树市临江镇13gp2010719gt2010719河南省驻马店市确山县竹沟镇14gp2010720gt2010720河南省驻马店市确山县任店镇15gp2010721gt2010721河南省驻马店市确山县滚河镇
115.1.2参照物溶液的制备
116.取半边莲对照药材约0.5g，精密称定，加水50ml，加热回流30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％(v/v)甲醇溶液25ml溶解至具塞锥形瓶中，加热回流30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，作为对照药材参照物溶液。
117.精密称取地奥司明对照品2.336mg、蒙花苷对照品2.027mg、木犀草素7-二葡萄糖苷酸对照品2.324mg，置25ml量瓶中，加dmso(二甲基亚砜)制成每1ml含地奥司明90.917μg、蒙花苷79.864μg、木犀草素7-二葡萄糖苷酸89.065μg的对照品储备液。精密移取对照品储备0.5ml置25ml量瓶中，加甲醇制成每1ml各含地奥司明1.818μg、蒙花苷1.597μg、木犀草素7-二葡萄糖苷酸1.781μg的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。
118.制备供试品溶液：取半边莲中药标准汤剂适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
119.1.3色谱条件优化
120.(1)梯度优化
121.方法1：以thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm；进样体积为10μl。
122.表2、梯度洗脱表(％：体积百分比)
123.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～608
→
4592
→
55
124.方法1结果见图1。实验结果显示，在当前色谱条件下，色谱峰信息较大，各色谱峰分离度较差，基线不稳，且特征峰集中在前半段。下面通过调整有机相与水相的梯度变化斜率，将具有不同保留行为的化合物在更短分析时间内进行有效分离。
125.方法2：以thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b，按表3中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟
1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm；进样体积为10μl。
126.表3、梯度洗脱表(％：体积百分比)
127.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～208
→
2092
→
8020～4020
→
4080
→
60
128.方法2结果见图2。实验结果显示，色谱峰分离度欠佳，在下一步优化将继续调整有机相与水相的梯度变化斜率。
129.方法3：以thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b，按表4中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm；进样体积为10μl。
130.表4、梯度洗脱表(％：体积百分比)
131.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～510
→
1090
→
905～3510
→
2090
→
8035～4020
→
3080
→
7040～5530
→
4570
→
55
132.方法3结果见图3。实验结果显示，在当前色谱条件下，半边莲中药标准汤剂特征图谱部分色谱峰分离度得到了一定程度的改善，但是后半段基线不稳，且部分特征峰分离度较差，因此继续调整有机相与水相的梯度变化斜率。
133.方法4：以thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b，按表5中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm；进样体积为10μl。
134.表5、梯度洗脱表(％：体积百分比)
[0135][0136][0137]
方法4结果见图4。实验结果显示，在当前色谱条件下，半边莲中药标准汤剂特征图谱各色谱峰整体分布合适，峰型对称，分离度较好，因此确定该梯度为半边莲中药标准汤剂特征图谱洗脱梯度。
[0138]
(2)最佳吸收波长的确定
[0139]
以thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b，按表5中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；进样体积为10μl。对半边莲中药标准汤剂特征图谱供试品溶液在190～400nm范围内进行全波长扫描。
[0140]
结果见图5。实验结果显示，在340nm下，所标记的色谱峰分离度较好。因此最终确定，半边莲标准汤剂特征图谱检测波长为340nm。
[0141]
(3)色谱条件的确定
[0142]
选择thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b；按表6中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm；进样量为10μl。理论板数按地奥司明峰计算应不低于3000。
[0143]
表6、梯度洗脱表(％：体积百分比)
[0144]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～2410
→
1490
→
8624～2814
→
2286
→
7828～35227835～4122
→
3078
→
7041～5330
→
3370
→
67
[0145]
1.4供试品溶液制备方法考察
[0146]
对半边莲中药标准汤剂特征图谱构建中的供试品溶液的制备方法进行考察，重点考察提取溶剂、提取方式、提取时间及提取溶剂用量对特征图谱的影响。
[0147]
(1)提取溶剂考察
[0148]
本次实验考察了不同提取溶剂对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响，选取甲醇、甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液、甲醇浓度为50％(v/v)的甲醇溶液、乙醇、乙醇浓度为70％(v/v)的乙醇溶液、乙醇浓度为50％(v/v)的乙醇溶液作为提取溶剂，通过观察暂定的11个特征峰的峰型和分离效果，并计算11个特征峰的“总峰面积/称样量”值来比较不同提取溶剂对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响，选择最佳提取溶剂。
[0149]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905034)适量，研细，取约0.5g，精密称定，平行6组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、甲醇浓度为70％(v/v)甲醇溶液、甲醇浓度为50％(v/v)甲醇溶液、乙醇、乙醇浓度为70％(v/v)乙醇溶液、乙醇浓度为50％(v/v)乙醇溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。按照“1.3”项下确定的色谱条件，进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，结果见表7，图6。
[0150]
表7、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同提取溶剂考察结果表
[0151][0152]
结果显示，除甲醇、乙醇浓度为70％的乙醇溶液外，其余溶剂“总峰面积/称样量”值差异较小，综合考虑，最终选择甲醇浓度为70％的甲醇溶液作为半边莲中药标准汤剂特征图谱供试品溶液的提取溶剂。
[0153]
(2)提取方式考察
[0154]
本次实验考察不同提取方式对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响，通过观察暂定的11个特征峰的峰型和分离效果，并计算11个特征峰的“总峰面积/称样量”值，比较不同
提取方式对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响。
[0155]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905034)适量，研细，取约0.5g，平行2组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟、加热回流30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。按照“1.3”项下确定的色谱条件，进样分析，记录各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，结果见表8，图7。
[0156]
表8、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同提取方式考察结果表
[0157][0158]
结果显示，采用不同的提取方式，各特征峰的峰型、分离效果、“总峰面积/称样量”值都无明显区别，考虑到操作简便，选择超声提取。
[0159]
(3)提取时间考察
[0160]
本次实验考察了不同提取时间对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响，通过计算暂定的11个特征峰的“总峰面积/称样量”值来比较不同的超声时间对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响。
[0161]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905034)适量，研细，取约0.5g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％的甲醇溶液25ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。按照“1.3”项下确定的色谱条件，进样分析，记录峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，结果见表9，图8。
[0162]
表9、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同提取时间考察结果表
[0163][0164]
结果显示，不同的超声时间，11个特征峰的“总峰面积/称样量”值无明显差别，说明超声15分钟已能完全提取，考虑到实验环境的影响，为保证方法的耐用性，选择超声提取时间为30分钟。
[0165]
(4)供试品溶液制备方法的确定
[0166]
根据上述实验结果，半边莲中药标准汤剂特征图谱样品前处理方法确定为：
[0167]
取半边莲中药标准汤剂适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0168]
1.5特征峰的确定
[0169]
取15批半边莲中药标准汤剂样品，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和对照品参照物溶液各10μl，按“1.4”项下色谱条件进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对15批半边莲中药标准汤剂特征
图谱进行共有峰标识，选择其中成分已知，峰型和分离度较好，纯度较高的11个共有峰作为半边莲标准汤剂的特征峰，如图9所示，以其中保留时间较为居中，对照品易得的地奥司明色谱峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，并计算15批半边莲标准汤剂特征图谱各特征峰的相对保留时间均值，利用各特征峰的相对保留时间均值对特征峰进行定位。
[0170]
结果显示，对15批半边莲中药标准汤剂特征图谱进行分析，以地奥司明参照物峰相对应的峰为s峰，各特征峰的相对保留时间均值为：0.19(峰1)、0.27(峰2)、0.29(峰3)、0.31(峰4)、0.40(峰5)、0.43(峰6)、0.47(峰7)、0.63(峰8)、0.67(峰9)、1.24(峰11)。
[0171]
1.6特征图谱的拟定
[0172]
将15批半边莲中药标准汤剂hplc特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行匹配，按平均数法生成对照图谱，建立半边莲标准汤剂对照特征图谱，如图10，该特征图谱共有11个特征峰，并与半边莲对照药材参照物色谱中11个特征峰相对应，半边莲对照药材特征图谱见图11。以地奥司明参照物峰相对应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰11与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.19(峰1)、0.27(峰2)、0.29(峰3)、0.31(峰4)、0.40(峰5)、0.43(峰6)、0.47(峰7)、0.63(峰8)、0.67(峰9)、1.24(峰11)。
[0173]
图10为半边莲中药标准汤剂对照特征图谱，图中，峰1：木犀草素7-二葡萄糖苷酸；峰10(s)：地奥司明；峰11：蒙花苷。
[0174]
图11为半边莲对照药材特征图谱，图中，峰1：木犀草素7-二葡萄糖苷酸；峰10(s)：地奥司明；峰11：蒙花苷。
[0175]
1.7特征峰的高分辨率质谱指认
[0176]
(1)高效液相色谱-质谱条件
[0177]
液相色谱条件：采用thermo acclaim c18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相a，以0.05mol/l乙酸铵溶液为流动相b，按表10中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm。
[0178]
表10、梯度洗脱表
[0179]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～2410
→
1490
→
8624～2814
→
2286
→
7828～35227835～4122
→
3078
→
7041～5330
→
3370
→
67
[0180]
质谱参数：
[0181]
表11、质谱参数表
[0182][0183]
(2)供试品溶液的制备
[0184]
取半边莲中药标准汤剂适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。
[0185]
(3)样品测定
[0186]
精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱-质谱联用仪，采用上述液相色谱条件和质谱条件对供试品溶液进行检测，供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图见图12。
[0187]
(4)结果分析
[0188]
通过质谱精确分子量、碎片离子对比分析，并与赛默飞mzvault标准数据库进行匹配，确认了半边莲标汤特征图谱中木犀草素-7-二葡萄糖苷酸(峰1)、地奥司明(峰10)、蒙花苷(峰11)3个成分，化合物信息见表12，具体分析过程如下：
[0189]
表12、半边莲中药标准汤剂中化合物质谱指认结果
[0190][0191][0192]
1)1号峰：提取1号峰的一级色谱图，时间段为4.97-5.19min。
[0193]
在1号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝637.1057峰的响应值最高，为[m-h]-峰，正离子模式下m/z＝639.1196应为[m h]

峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
27h26o18
；提取m/z＝637.1057峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有351.0572、285.0408、193.0345等；提取m/z＝639.1196峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有463.0873、287.0550等。
[0194]
通过查阅相关文献，1号峰可能为木犀草素-7-二葡萄糖苷酸。
[0195]
2)2号峰：提取2号峰的一级色谱图，时间段为6.27-6.60min。
[0196]
在2号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝621.1111峰的响应值最高，为
[m-h]-峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
27h26o17
；提取m/z＝621.1111峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有269.0460等。
[0197]
通过数据库匹配结果及二级质谱信息分析，2号峰可能为海常黄苷。
[0198]
3)3号峰：提取3号峰的一级色谱图，时间段为7.09-7.43min。
[0199]
在3号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝651.1220峰的响应值最高，为[m-h]-峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
28h28o18
；提取m/z＝651.1220峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有299.0562、284.0327等。
[0200]
通过数据库匹配结果及二级质谱信息分析，3号峰可能为diosmetin-3',7-diglucuronide。
[0201]
4)4号峰：提取4号峰的一级色谱图，时间段为7.47-7.68min。
[0202]
在4号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝799.1388峰应为[m-h]-峰，正离子模式下m/z＝801.1511应为[m h]

峰,从其精确分子量推测其分子式可能为c
33h36o23
；提取m/z＝799.1388峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有513.0892、351.0576、285.0407、245.0456、179.0343等；提取m/z＝801.1511峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有463.0872、287.0550等。
[0203]
通过数据库匹配结果及二级质谱信息分析，4号峰可能为luteolin 7,4'-diglucuronide-3'-glucoside。
[0204]
5)5号峰：提取5号峰的一级色谱图，时间段为10.73-11.07min。
[0205]
在5号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝783.1437峰的响应值最高，为[m-h]-峰，正离子模式下m/z＝785.1568峰应为[m h]

峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
33h36o22
；提取m/z＝783.1437峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有513.0894、351.0569、269.0459等；提取m/z＝785.1568峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有447.0927、271.0601等。
[0206]
通过数据库匹配结果及二级质谱信息分析，5号峰可能为apigenin7-glucosyl-(1
→
2)-glucuronide-4'-glucuronide。
[0207]
6)6号峰：提取6号峰的一级色谱图，时间段为15.79-15.90min。
[0208]
在6号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝813.1541峰的响应值最高，为[m-h]-峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
33h34o24
；提取m/z＝813.1541峰碰撞能量为20的二级图，结果显示，主要离子碎片有285.0406。
[0209]
通过数据库匹配结果及二级质谱信息分析，6号峰可能为luteolin7-glucuronosyl-(1
→
2)-glucuronide-4'-glucuronide。
[0210]
7)7号峰：提取7号峰的一级色谱图，时间段为18.27-18.49min。
[0211]
在8号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝813.1541峰的响应值最高，为[m-h]-峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
27h30o16
；提取m/z＝813.1541峰碰撞能量为40的二级图，结果显示，主要离子碎片有300.0276、271.0247、151.0027等。
[0212]
通过数据库匹配结果及二级质谱信息分析，7号峰可能为香叶木素-葡萄糖基-二葡萄糖苷酸。
[0213]
8)8号峰：提取8号峰的一级色谱图，时间段为12.84-13.14min。
[0214]
在8号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝783.1433峰的响应值最高，为
[m-h]-峰；提取m/z＝783.1433峰碰撞能量为40的二级图，结果显示，主要离子碎片有285.0405等。
[0215]
9)9号峰：提取9号峰的一级色谱图，时间段为17.73-18.21min。
[0216]
在9号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝827.1698峰的响应值最高，为[m-h]-峰；提取m/z＝827.1698峰碰撞能量为40的二级图，结果显示，主要离子碎片有299.0565、284.0330、193.0500等。
[0217]
10)10号峰：提取10号峰的一级色谱图，时间段为21.89-22.16min。
[0218]
在10号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝607.1675峰的响应值最高，为[m-h]-峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
28h32o15
；提取m/z＝607.1675峰碰撞能量为40的二级图，结果显示，主要离子碎片有299.0562、284.0327等。
[0219]
将该信号峰的精确分子量及二级离子碎片信息与本地质谱数据库中的化合物光谱进行匹配，结果显示，m/z＝607.1675峰匹配度最高的化合物为地奥司明，匹配度为83.85％。根据碎片离子对比结果分析，提示该化合物可能为地奥司明。
[0220]
11)11号峰：提取11号峰的一级色谱图，时间段为24.37-24.47min。
[0221]
在11号峰的一级色谱提取图中，负离子模式下m/z＝591.1730峰的响应值最高，为[m-h]-峰；从其精确分子量推测其分子式可能为c
28h32o14
；提取m/z＝591.1730峰碰撞能量为40的二级图，结果显示，主要离子碎片有283.0615、268.0377等。
[0222]
将该信号峰的精确分子量及二级离子碎片信息与本地质谱数据库中的化合物光谱进行匹配，结果显示，m/z＝591.1730峰匹配度最高的化合物为蒙花苷，匹配度为80.13％。根据碎片离子对比结果分析，提示该化合物可能为蒙花苷。
[0223]
1.8特征峰的对照品确认
[0224]
(1)色谱条件：同“1.3”项下。
[0225]
(2)对照品溶液的制备：同“1.2”项下。
[0226]
(3)供试品溶液的制备：同“1.4”项下。
[0227]
(4)测定法
[0228]
分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱柱中，测定，即可。
[0229]
结果见图13。结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的保留时间处显相同的色谱峰，且供试品中该色谱峰的紫外-可见3d光谱吸收曲线与对照品基本一致，从而证实特征峰1为木犀草素7-二葡萄糖苷酸、特征峰10为地奥司明、特征峰11为蒙花苷。
[0230]
1.9方法学验证
[0231]
(1)精密度考察
[0232]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“1.3”项下确定的色谱条件重复进样6次，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值。实验结果见表13、表14。
[0233]
表13、半边莲中药标准汤剂特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)
[0234]
序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰1110.1890.2610.2810.3000.3920.4270.4640.6200.6641.0001.246
20.1890.2620.2810.3010.3930.4270.4640.6200.6631.0001.24730.1880.2600.2790.2990.3910.4260.4620.6190.6631.0001.24640.1890.2610.2800.3000.3930.4270.4640.6200.6641.0001.24550.1890.2610.2810.3010.3920.4270.4640.6200.6641.0001.24560.1880.2600.2800.3000.3910.4260.4640.6210.6661.0001.242rsd(％)0.270.290.290.250.230.120.180.100.160.000.14
[0235]
表14、半边莲中药标准汤剂特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)
[0236][0237][0238]
结果显示，同一份供试品溶液连续进样6次，以地奥司明峰为参照峰s，各特征峰的相对保留时间rsd值在0.12％～0.29％范围内，相对峰面积rsd值在1.12％～2.64％范围内，均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
[0239]
(2)稳定性考察
[0240]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“1.3”项下确定的色谱条件，分别在0、2、6、9、13、20、24小时进样分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值，结果见表15、表16。
[0241]
表15、半边莲中药标准汤剂特征图谱稳定性考察结果表(相对保留时间)
[0242]
稳定性(小时)峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰1100.1910.2630.2830.3030.3960.4310.4670.6230.6681.0001.24320.1890.2600.2800.3000.3920.4280.4640.6210.6661.0001.24160.1900.2620.2830.3020.3950.4310.4670.6240.6681.0001.24290.1890.2620.2810.3010.3930.4280.4650.6220.6671.0001.245130.1890.2610.2810.3010.3930.4280.4650.6210.6651.0001.246200.1880.2600.2790.2990.3900.4250.4620.6190.6641.0001.243240.1880.2590.2780.2980.3900.4250.4610.6180.6631.0001.243rsd(％)0.570.540.670.570.580.570.500.340.290.000.14
[0243]
表16、半边莲中药标准汤剂特征图谱稳定性考察结果表(相对峰面积)
[0244]
稳定性(小时)峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰1102.0420.7911.3560.8300.7240.8480.6400.0890.5871.0000.28622.0130.7801.3470.8230.7190.8580.6560.0870.5901.0000.28461.9910.7781.3370.8180.7140.8540.6600.0880.5861.0000.28492.0990.7311.3410.8360.7210.8420.6600.0860.5901.0000.286132.0950.7551.3720.8300.7200.8580.6620.0890.5821.0000.288202.0930.7481.3670.8260.7250.8550.6780.0850.5901.0000.281242.1120.7511.3720.8360.7230.8590.6750.0900.5871.0000.277rsd(％)2.492.811.090.800.520.731.902.050.500.001.30
[0245]
结果显示，同一份供试品溶液分别在0、2、6、9、13、20、24小时进行分析，以地奥司
明峰为参照峰s，各特征峰的相对保留时间rsd值在0.14％～0.67％范围内，相对峰面积rsd值在0.50％～2.81％范围内，均小于3.0％，表明供试品溶液在24小时内相对稳定性良好。
[0246]
(3)重复性考察
[0247]
取同一批半边莲中药标准汤剂(gt1905035)约0.5g，精密称定，平行6份，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，按“1.3”项下确定的色谱条件，进样分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值，实验结果见表17、表18。
[0248]
表17、半边莲中药标准汤剂特征图谱重复性考察结果表(相对保留时间)
[0249]
序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰1110.1910.2640.2840.3040.3970.4320.4700.6270.6721.0001.24120.1890.2610.2810.3010.3940.4290.4660.6230.6681.0001.24330.1900.2620.2820.3020.3930.4280.4650.6210.6651.0001.24540.1900.2620.2810.3020.3940.4290.4670.6240.6691.0001.24450.1900.2620.2820.3020.3940.4290.4660.6230.6671.0001.24460.1900.2620.2830.3030.3950.4300.4670.6250.6691.0001.244rsd(％)0.330.380.410.340.350.320.370.330.350.000.11
[0250]
表18、半边莲中药标准汤剂特征图谱重复性考察结果表(相对峰面积)
[0251]
序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰1112.0820.7621.2960.8040.6870.8320.6030.0880.5451.0000.28121.9510.7681.2510.8130.6850.8250.6310.0880.5811.0000.28232.0760.7651.2540.8290.6900.8020.6260.0890.5721.0000.28942.0960.7711.2340.8280.6740.8330.6280.0840.5601.0000.28852.1010.7661.2900.8180.6900.8310.6060.0860.5671.0000.28562.0470.7751.2240.8200.6670.8240.6110.0850.5721.0000.277rsd(％)2.730.602.321.151.391.411.982.272.200.001.60
[0252]
结果显示，同一批样品重复测定6次，以地奥司明峰为参照峰s，各特征峰的相对保留时间rsd值在0.11％～0.41％范围内，相对峰面积rsd值在0.60％～2.73％范围内，均小于3.0％，表明该方法重复性良好。
[0253]
(4)中间精密度考察
[0254]
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批半边莲中药标准汤剂(gt1905035)约0.5g，精密称定，平行6份，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，按“1.3”项下确定的色谱条件，进样分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值，实验结果见表19、表20。
[0255]
表19、半边莲中药标准汤剂特征图谱中间精密度考察结果表(相对保留时间)
[0256][0257]
表20、半边莲中药标准汤剂特征图谱中间精密度考察结果表(相对峰面积)
[0258][0259]
备注：操作人员1：冯涌微，操作时间：2021.10.03；色谱仪：waters e2695；设备编码：209002；操作人员2：梁月仪；操作时间：2021.10.08；色谱仪：thermo u3000；设备编码：208034.
[0260]
结果显示，由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，同一批样品重复测定6次，以地奥司明峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.04％～0.26％范围内，相对峰面积rsd值在1.76％～2.94％范围内，均小于3.0％。与重复性试验6个数据对比，各特征峰的相对保留时间rsd值范围为0.12％～1.95％范围内，相对峰面积rsd值范围为1.82％～7.96％范围内，相对保留时间rsd值小于3.0％，相对峰面积rsd值大于5.0％，说明各特征峰的相对保留时间中间精密度良好，而相对峰面积受不同的人员和仪器操作影响较大。
[0261]
(5)耐用性考察
[0262]
①
色谱柱的考察
[0263]ⅰ不同品牌色谱柱
[0264]
比较不同品牌的色谱柱：welch ultimate aq-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，kromasil 100-5-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)对半边莲中药标准汤剂特征图谱耐用性的影响。
[0265]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按“1.4”项
下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，除色谱柱不同外，其他色谱条件均同“1.3”项下的规定，进样分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值。实验结果见表21、表22。
[0266]
表21、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同品牌色谱柱考察结果表(相对保留时间)
[0267]
色谱柱峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰11thermo acclaim c180.1900.2630.2820.3040.3950.4290.4680.6250.6701.0001.241kromasil 100-5-c180.1820.2540.2720.2940.3850.4200.4570.6140.6611.0001.249welchultimate aq-c180.2400.3240.3520.3740.4800.5030.5550.7250.7471.0001.199rsd％15.4113.5814.4313.4512.4310.1110.889.346.820.002.18
[0268]
表22、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同品牌色谱柱考察结果表(相对峰面积)
[0269]
色谱柱峰1(s1)峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s2)峰11thermo acclaim c181.7100.6591.2210.8090.7120.8600.7810.0840.5591.0000.286kromasil 100-5-c181.8880.6311.3680.7900.6660.8600.7770.0850.5571.0000.281welch ultimate aq-c181.8760.6711.2520.7710.6940.8360.7470.0880.5031.0000.272rsd％5.453.146.052.413.361.632.422.435.890.002.54
[0270]
结果显示，使用不同品牌色谱柱进行分析，以地奥司明峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在2.18％～15.41％范围内，相对峰面积rsd值在1.63％～6.05％范围内，各特征峰相对保留时间和相对峰面积差异较大，因此建议固定色谱柱thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)。
[0271]ⅱ同一品牌色谱柱
[0272]
比较3根相同品牌的色谱柱：thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)对半边莲中药标准汤剂特征图谱耐用性的影响。
[0273]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，除色谱柱不同外，其他色谱条件均同“1.3”项下的规定，进样分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值。实验结果见表23、表24。
[0274]
表23、半边莲中药标准汤剂特征图谱相同品牌色谱柱考察结果表(相对保留时间)
[0275]
色谱柱峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰11thermo acclaim c18-10.1930.2660.2860.3070.3990.4330.4710.6290.6731.0001.239thermo acclaim c18-20.1920.2620.2850.3020.3960.4310.4680.6230.6651.0001.237thermo acclaim c18-30.1900.2630.2820.3040.3950.4290.4680.6250.6701.0001.241rsd(％)0.800.790.730.830.520.460.370.490.600.000.16
[0276]
表24、半边莲中药标准汤剂特征图谱相同品牌色谱柱考察结果表(相对峰面积)
[0277]
色谱柱峰1(s1)峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s2)峰11thermo acclaim c18-11.8100.6341.2030.8530.7820.9260.7760.0840.5791.0000.304thermo acclaim c18-21.7630.6881.1180.7870.7420.8810.7610.0860.5911.0000.294thermo acclaim c18-31.7100.6591.2210.8090.7120.8600.7810.0840.5591.0000.286rsd(％)2.844.094.664.124.713.791.351.362.800.003.06
[0278]
结果显示，使用相同品牌不同批号色谱柱进行分析，以地奥司明峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.16％～0.83％范围内，相对峰面积rsd值在1.35％～4.71％范围内，表明该方法相同品牌不同批号色谱柱耐用性良好。
[0279]
②
不同柱温的考察
[0280]
比较不同的柱温，分别为33℃、35℃和37℃对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响。
[0281]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)约0.5g，精密称定，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，除柱温分别为33℃、35℃和37℃之外，其余色谱条件均同“1.3”项下的规定，进行分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值。实验结果见表25、表26。
[0282]
表25、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同柱温考察结果表(相对保留时间)
[0283][0284][0285]
表26、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同柱温考察结果表(相对峰面积)
[0286]
柱温(℃)峰1(s1)峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s2)峰11331.7950.6501.1920.8160.7360.8760.7890.0890.5671.0000.287351.7100.6591.2210.8090.7120.8600.7810.0840.5591.0000.286371.8470.6581.2320.8220.6750.8510.7440.0870.5721.0000.274rsd(％)3.880.751.700.804.341.473.112.901.160.002.56
[0287]
结果显示，不同的柱温下，以地奥司明峰为参照峰s，峰11各特征峰与s2峰的相对保留时间rsd值在0.33％～4.21％范围内，相对峰面积rsd值在0.80％～4.34％范围内，rsd均小于5.0％，说明柱温的较小变动对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响较小。
[0288]
③
不同流速的考察
[0289]
比较不同流速，分别为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min对半边莲中药标准汤剂特征图谱的影响。
[0290]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)约0.5g，精密称定，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，除流速分别为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min之外，其余色谱条件均同“1.3”项下的规定，进样分析，以地奥司明参照物相对应的峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算rsd值。实验结果见表27、表28。
[0291]
表27、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同流速考察结果表(相对保留时间)
[0292]
流速(ml/min)峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰110.90.2020.2770.2980.3190.4120.4480.4850.6430.6881.0001.2261.00.1900.2630.2820.3040.3950.4290.4680.6250.6701.0001.2411.10.1760.2450.2630.2830.3710.4050.4410.5920.6371.0001.258rsd(％)6.876.136.245.995.255.044.784.173.890.001.29
[0293]
表28、半边莲中药标准汤剂特征图谱不同流速考察结果表(相对峰面积)
[0294]
流速(ml/min)峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10(s)峰110.91.7610.6261.2050.8370.7050.8840.7830.0820.5931.0000.2901.01.7100.6591.2210.8090.7120.8600.7810.0840.5591.0000.2861.11.8530.6421.2740.8390.7280.8840.7460.0870.5951.0000.296rsd(％)4.082.572.962.051.681.582.702.983.470.001.73
[0295]
结果显示，在不同的流速下，以地奥司明峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留
时间rsd值在
[0296]
1.29％～6.87％范围内，相对峰面积rsd值在1.58％～4.08％范围内，流速的改变对各特征峰的相对保留时间及相对峰面积影响较小，说明流速的较小变动对半边莲标准汤剂特征图谱的影响较小。
[0297]
实施例2
[0298]
一种半边莲中药标准汤剂的质量检测方法，具体实施步骤如下：
[0299]
2.1仪器、试剂与试药
[0300]
仪器：waters高效液相色谱仪(e2695，沃特世公司)，agilent高效液相色谱仪(1290，安捷伦公司)，welch aq-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm，js-281)，kromasil c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm，js-223)，thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm，js-235、js-290、js-247)，万分之一分析电子天平(me204e，梅特勒-托利多公司)，百万分之一分析电子天平(xp26，梅特勒-托利多公司)，电热恒温水浴锅(hws-28，上海一恒科技股份有限公司)，数控超声波清洗器(kq-500de，昆山市超声仪器有限公司)，超纯水系统(milli-q direct，默克股份公司)。
[0301]
试剂：乙醇(西陇科学股份有限公司)、甲醇(西陇科学股份有限公司)、磷酸二氢钾(西陇科学股份有限公司)、二甲基亚砜(阿拉丁)均为分析纯；液相用乙腈(默克股份有限公司)、甲醇(默克股份有限公司)、二甲基亚砜(阿拉丁)为色谱级，水为超纯水(实验室自制)。
[0302]
试药：地奥司明(批号：101348-201802，含量：97.3％，中国食品药品检定研究院)；蒙花苷(批号：111528-201911，含量：98.5％，中国食品药品检定研究院)；15批半边莲中药标准汤剂。
[0303]
表29、15批半边莲饮片及其中药标准汤剂的产地信息表
[0304][0305][0306]
2.2色谱条件
[0307]
选择thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.05mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相b；按表6中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为340nm；进样量为10μl。
[0308]
2.3对照品溶液的制备
[0309]
取地奥司明对照品2.336mg、蒙花苷对照品2.027mg，精密称定，置25ml量瓶中，加dmso(二甲基亚砜)制成每1ml含地奥司明90.917μg、蒙花苷79.864μg的混合对照品溶液，即得。精密移取上述混合对照品溶液0.5ml置25ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含地奥司明1.818
μg、蒙花苷1.597μg的混合溶液，即得。
[0310]
2.4供试品溶液前处理方法考察
[0311]
对半边莲中药标准汤剂含量测定方法的提取溶剂、提取方式、提取时间以及提取溶剂用量进行考察，确定最佳的样品前处理方法。
[0312]
(1)提取溶剂考察
[0313]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905034)适量，研细，取约0.5g，精密称定，平行5组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液、甲醇浓度为50％(v/v)的甲醇溶液、乙醇浓度为70％(v/v)的乙醇溶液、乙醇浓度为50％(v/v)的乙醇溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见表30。
[0314]
表30、半边莲中药标准汤剂含量测定提取溶剂考察结果表
[0315]
提取溶剂地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)甲醇0.1870.0540.24170％甲醇0.1740.0500.22450％甲醇0.1750.0510.22570％乙醇0.1720.0500.22250％乙醇0.1730.0500.223
[0316]
结果显示，上述五种溶剂对半边莲中药标准汤剂含量测定的影响较小，参考半边莲中药标准汤剂特征图谱供试品溶液制备方法，选择甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液作为提取溶剂。
[0317]
(2)提取方式考察
[0318]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905034)适量，研细，取约0.5g，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液25ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟、加热回流30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见表31。
[0319]
表31、半边莲中药标准汤剂含量测定提取方式考察结果表
[0320]
提取方式地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)加热回流0.1730.0480.222超声处理0.1650.0470.212
[0321]
结果显示，超声与回流两种提取方式测定的半边莲中药标准汤剂含量无显著差别，说明两种方式提取效率相当，从操作方便考虑，选择超声提取。
[0322]
(3)提取时间考察
[0323]
取半边莲中药标准汤剂(gt1905035)适量，研细，取约0.5g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液25ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见表32。
[0324]
表32、半边莲中药标准汤剂含量测定提取时间考察结果表
[0325]
提取时间(分钟)地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)150.2180.0570.275300.2170.0570.274450.2180.0570.275
[0326]
结果显示，不同的提取时间测定的半边莲中药标准汤剂含量无显著差异，考虑到实验环境的影响，为确保充分提取，选取超声时间为30分钟。
[0327]
(4)供试品溶液制备方法的确定
[0328]
根据上述考察结果，供试品溶液制备方法可确定为：
[0329]
取半边莲中药标准汤剂适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0330]
2.5含量测定方法学验证
[0331]
(1)峰纯度考察
[0332]
精密吸取半边莲中药标准汤剂(gt1906135)供试品溶液、混合对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照“2.2”项下色谱条件以dad检测器进行210nm～400nm扫描检测，计算峰纯度。结果见图14。
[0333]
结果显示，供试品溶液中地奥司明和蒙花苷未检测到杂质峰，峰纯度因子在计算出的阈值限值内，说明在该色谱条件下，地奥司明和蒙花苷峰纯度符合要求。
[0334]
(2)线性考察
[0335]
对照品储备液
①
：精密称取地奥司明对照品9.694mg，置20ml量瓶中，加dmso制成每1ml含地奥司明471.613μg的对照品储备液。
[0336]
对照品储备液
②
：精密称取蒙花苷对照品2.478mg，置10ml量瓶中，加dmso制成每1ml含蒙花苷244.083μg的对照品储备液。
[0337]
精密移取上述对照品储备液
①
、对照品储备液
②
各2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含地奥司明94.323μg、蒙花苷48.817μg的混合对照品线性母液。
[0338]
精密量取上述混合对照品线性母液1.0ml，分别置2ml、5ml、10ml、25ml、50ml、100ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含地奥司明47.161μg、18.865μg、9.432μg、3.773μg、1.886μg、0.943μg，蒙花苷24.408μg、9.763μg、4.882μg、1.953μg、0.976μg、0.488μg的混合对照品应用液，分别精密吸取上述混合对照品应用液和混合对照品线性母液，按照“2.2”项下色谱条件依次进样10μl，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)，见表33，并绘制标准曲线，见图15和图16。
[0339]
表33、线性考察结果表
[0340][0341]
实验结果显示，地奥司明的线性回归方程为y＝21468x 4797.3，r2＝0.9996；表明在浓度为0.943μg/ml～94.323μg/ml的范围内，峰面积与地奥司明对照品浓度的线性关系良好。蒙花苷的线性回归方程为y＝22207x 2443.5，r2＝0.9996，表明蒙花苷在进样浓度0.488μg/ml～48.817μg/ml的范围内，峰面积与蒙花苷对照品浓度的线性关系良好。
[0342]
(3)精密度考察
[0343]
精密吸取“2.3”项下对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积rsd值，测定结果见表34。
[0344]
表34、半边莲中药标准汤剂含量测定精密度考察结果表
[0345]
序号地奥司明峰面积蒙花苷峰面积精密度-13969337305精密度-23987237448精密度-33983737315精密度-44012837696精密度-54020537679精密度-64026737769rsd(％)0.580.55
[0346]
结果显示，同一份对照品溶液连续进样6针，地奥司明峰面积rsd值为0.58％，蒙花苷峰面积rsd值为0.55％，均小于3.0％，说明仪器精密度良好。
[0347]
(4)稳定性考察
[0348]
精密吸取半边莲中药标准汤剂(gt1906135)“2.4”项下供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，分别在0、2、8、11、16、21小时进样，进样体积为10μl，记录峰面积，计算峰面积rsd值，测定结果见表35。
[0349]
表35、半边莲中药标准汤剂含量测定稳定性考察结果表
[0350]
时间(小时)地奥司明峰面积蒙花苷峰面积091348399392916333978989114739809119150440055169162840008219217539971
rsd(％)0.380.27
[0351]
结果显示，供试品溶液在0、2、8、11、16、21小时分别进样，地奥司明峰面积rsd值为0.38％，蒙花苷峰面积rsd值为0.27，均小于3.0％，说明供试品溶液在21小时内稳定性良好。
[0352]
(5)重复性考察
[0353]
取同一批半边莲中药标准汤剂(gt1906135)约0.5g，精密称定，平行称定6份，按“2.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。按“2.2”项下色谱条件测定，测定供试品溶液中地奥司明和蒙花苷的含量，并计算rsd值，结果见表36。
[0354]
表36、半边莲中药标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0355]
序号地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)重复性-10.2050.0840.289重复性-20.2060.0840.290重复性-30.2060.0840.290重复性-40.2100.0860.297重复性-50.2070.0850.291重复性-60.2070.0840.291rsd(％)0.830.990.99
[0356]
结果显示，同一批样品重复测定6次，总含量rsd值为0.99％，根据中国药典2020年版“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量0.01％～0.1％时，重复性rsd限度为＜3％，因此，该分析方法的重复性良好。
[0357]
(6)中间精密度考察
[0358]
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批半边莲中药标准汤剂(gt1906135)约0.5g，精密称定，平行6份，按“2.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，测定供试品溶液中地奥司明和蒙花苷的含量，并计算rsd值，与重复性结果比较，结果见表37。
[0359]
表37、半边莲中药标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0360][0361]
注：人员1：操作时间：2020.10.16；色谱仪：waters e2695；设备编码：209002；人员2：操作时间：2020.10.28；色谱仪：thermo u3000；设备编码：208034.
[0362]
结果显示，同一批样品由不同的人员于不同的时间在不同的仪器上操作，重复测定6次，总含量rsd值为0.65％，与重复性试验6个数据的rsd值为1.83％，根据中国药典2020
年版“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量0.01％～0.1％时，中间精密度rsd限度为＜6％，因此，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，该方法中间精密度良好。
[0363]
(7)加样回收率考察
[0364]
对照品储备液
①
：精密称取地奥司明对照品9.694mg，置20ml量瓶中，加dmso制成每1ml含地奥司明471.613μg的对照品储备液。
[0365]
对照品储备液
②
：精密称取蒙花苷对照品2.478mg，置10ml量瓶中，加dmso制成每1ml含蒙花苷244.083μg的对照品储备液。
[0366]
精密移取上述对照品储备液
①
2.8ml、对照品储备液
②
2.2ml，置25ml量瓶中，加甲醇浓度为70％(v/v)的甲醇溶液制成每1ml含地奥司明52.821μg、蒙花苷21.479μg的混合对照品加样母液。
[0367]
采用加样回收法，按对照品加入量与供试品待测成分的含量之比控制在0.5:1、1:1、1.5:1左右设计3组实验，每组平行3份。取已知含量的半边莲中药标准汤剂(gt1906135)约0.25g，精密称定，置9个25ml量瓶中，平行3组，每组3份，分别加入上述混合对照品加样母液0.5ml、1.0ml、1.5ml，再加70％甲醇定容至刻度，按“2.4”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液9份。按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率，见表38。
[0368]
表38、半边莲中药标准汤剂含量测定加样回收率考察结果表
[0369][0370]
结果显示，地奥司明加样回收率均值为98.29％，回收率范围为94.82％～101.26％，rsd值为1.74％；蒙花苷加样回收率均值为96.58％，回收率范围为94.41％～99.07％，rsd值为1.47％；根据中国药典2020年版“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量在0.01％～0.1％或10μg/g～0.01％范围时，回收率限度为92％～105％或85％～110％，表明回收率良好。
[0371]
(8)耐用性考察
[0372]
①
不同色谱柱考察
[0373]
比较了3根不同品牌的色谱柱，分别为welch ultimate aq-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，kromasil100-5-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)对半边莲中药标准汤剂含量测定的影响。
[0374]
取半边莲中药标准汤剂(gt1906135)“2.4”项下供试品溶液，除色谱柱不同外，其
他色谱条件均同“2.2”项下的规定，进样分析，计算半边莲中药标准汤剂含量及rsd值，实验结果见表39。
[0375]
表39、半边莲中药标准汤剂含量测定不同色谱柱考察结果表
[0376]
色谱柱型号及编号地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)thermo acclaim c180.2080.0840.292kromasil 100-5-c180.2060.0830.289welch ultimate aq-c180.1980.0840.282rsd(％)2.590.691.78
[0377]
结果显示，不同品牌的色谱柱，地奥司明和蒙花苷的分离度及纯度均符合定量要求，采用3根色谱柱测定的总含量rsd值为1.78％，小于3.0％，表明该分析方法在不同品牌的色谱柱耐用性良好。
[0378]
②
不同柱温考察
[0379]
比较不同柱温，分别为28℃、30℃和32℃对半边莲中药标准汤剂含量测定的影响。
[0380]
取半边莲中药标准汤剂(gt1906135)“2.4”项下供试品溶液，除柱温分别为28℃、30℃和32℃，其他色谱条件均同“2.2”项下的规定，进样分析，计算半边莲中药标准汤剂含量及rsd值，实验结果表40。
[0381]
表40、半边莲中药标准汤剂含量测定不同柱温考察结果表
[0382]
柱温(℃)地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)280.2060.0820.288300.2080.0840.292320.2040.0810.285rsd(％)0.971.861.22
[0383]
结果显示，柱温
±
2℃，测得总含量rsd值为1.22％，小于3.0％，说明该方法对柱温的较小变动耐用性良好。
[0384]
③
不同流速考察
[0385]
比较不同的流速，分别为0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min对半边莲中药标准汤剂含量测定的影响。
[0386]
取半边莲中药标准汤剂(gt1906135)“2.4”项下供试品溶液液，除流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min，其他色谱条件均同“2.2”项下的规定，进样分析，计算半边莲中药标准汤剂含量及rsd值，实验结果表41。
[0387]
表41、半边莲中药标准汤剂含量测定不同流速考察结果表
[0388]
流速(ml/min)地奥司明含量(mg/g)蒙花苷含量(mg/g)总含量(mg/g)0.80.2170.0860.3031.00.2080.0840.2921.20.2070.0810.288rsd(％)2.612.972.64
[0389]
结果显示，流速
±
0.2ml/min，测得总含量rsd值为2.64％，小于3.0％，说明该分析方法在流速
±
0.2ml/min范围内耐用性良好。
[0390]
(9)样品测定
[0391]
取15批半边莲中药标准汤剂，按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备15份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，采用外标法进行计算，结果见表42所示。
[0392]
表42、15批半边莲中药标准汤剂含量测定结果
[0393][0394][0395]
结果显示，15批半边莲中药标准汤剂中地奥司明、蒙花苷总含量波动范围在0.221mg/g～0.415mg/g，含量均值为0.313mg/g，sd为0.054mg/g，均值的
±
30％范围为0.219mg/g～0.407mg/g，均值
±
3倍sd范围为0.151mg/g～0.175mg/g。考虑到15批样品的代表性，取均值的70％为下限，均值 3倍sd为上限，确定半边莲中药标准汤剂地奥司明、蒙花苷总含量范围应为0.219mg/g～0.475mg/g。
[0396]
实施例3
[0397]
半边莲中药标准汤剂与通泉草、叶下珠的中药标准汤剂特征图谱鉴别研究，具体实施步骤如下：
[0398]
按半边莲中药标准汤剂制备工艺制备通泉草、叶下珠的标准汤剂，按“1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品，按“1.3”项下确定的色谱条件进样测定，半边莲中药标准汤剂分别与通泉草中药标准汤剂、叶下珠中药标准汤剂进行对比分析：
[0399]
从图17和图18可看出，通泉草、叶下珠特征图谱与半边莲特征图谱差异较大，说明三者所含的化学成分差异较大。
[0400]
此外，从图17中看出，通泉草中蒙花苷的含量较低，峰9的含量较半边莲高；从图18中看出，叶下珠中地奥司明和蒙花苷的含量均较低。
[0401]
本发明建立的方法可以有效的控制半边莲中药标准汤剂的质量，并且可以实现半边莲与混淆品通泉草和叶下珠的有效区分。
[0402]
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
[0403]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术
人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。