枳实薤白桂枝汤UPLC特征图谱的构建及应用的制作方法

枳实薤白桂枝汤uplc特征图谱的构建及应用
技术领域
1.本发明涉及一种枳实薤白桂枝汤特征图谱的构建方法，尤其涉及一种可表征处方中各药味色谱信息，全面、快速、可靠的枳实薤白桂枝汤基准样品uplc特征图谱的构建方法及应用。


背景技术：

2.枳实薤白桂枝汤来源于2018年发布的古代经典名方目录(第一批)第22首，原文出自汉
·
张仲景《金匮要略》，是治疗胸痹的经典验方。原文记载处方组成和制备方法为：枳实四枚，厚朴四两，薤白半斤，桂枝一两，瓜蒌实一枚(捣)。上五味，以水五升，先煮枳实、厚朴，取二升，去滓，内诸药，煮数沸，分温三服。本方的配伍原则为：瓜蒌、薤白为君药。薤白辛温，通阳散结，化痰散寒；瓜蒌性寒入肺，涤痰散结，开胸通痹。枳实、厚朴为臣药，枳实下气破结、消痞除满，厚朴燥湿化痰，下气除满。桂枝为佐药，通阳散寒，平冲降逆；诸药配伍，使胸阳振，痰浊降，阴寒消，气机畅，则胸痹而气逆上冲诸证可除。
3.经典名方的研究原则上要求应体现处方中各药味的质量属性，建立较全面反映基准样品或制剂的质量的检测方法，同时所建立的评价指标能反映药材、饮片、基准样品、复方制剂的相关性，能够说明研制全过程的量值传递情况，更好的控制复方制剂的内在质量。
4.枳实薤白桂枝汤中枳实、厚朴、桂枝的现代药学研究比较充分，质量标准和相关检测项目较为明确，在《2010版中国药典》各药味项下也均有相应含量指标的质量控制方法。瓜蒌、薤白属于中药研究领域中的难点品种，研究基础较为薄弱，2010版药典项下未规定含量和特征图谱等质量标准要求。由于瓜蒌、薤白药味中主要含挥发性、脂肪油等小极性物质，成分稳定性较差，检测分析和质量控制的难度较大。经典名方研究要求采用传统方式提取，一般采用水煎煮，瓜蒌、薤白中的挥发性成分、小极性有效成分在水溶液中的含量非常低，且不易检出。如何在水煎液中表征瓜蒌、薤白的活性成分，成为本方研究的重点。加之，复方中含有多个药味，化学成分复杂，将各药味中的不同极性组分在一张图谱上进行全面表征和有效分离，分析检测的难度非常大。
5.现有技术中对枳实薤白桂枝汤的质量标准研究较少，目前仅有2篇专利cn111759937a、cn114062563a分别采用hplc方法建立了枳实薤白桂枝汤的指纹图谱和特征图谱，但两篇专利的图谱表征信息不够完善，色谱峰相对较少，均未体现处方中薤白的色谱峰信息。本方中薤白是处方之君药，亦为治疗胸痹之要药，是处方发挥临床疗效的关键，因此薤白色谱信息的表征对其复方制剂的质量控制和产品疗效的发挥具有非常重要的意义。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明旨在提供一种表征全面、高效的枳实薤白桂枝汤uplc特征图谱的构建方法，解决了现有枳实薤白桂枝汤质量控制方法存在的色谱峰信息少、药味表征不全面、检测效率低、质控效果差等问题；本发明的另一目的旨在提供所述方法在处方相应药材、饮片的检测和质量控制中的应用，实现了一种质量传递和质量追溯的评价方法，即采用
一套方法对产业链多个环节样品质量的一致性进行评价，达到产品全过程的质量追溯和控制。
7.技术方案：本发明所述的枳实薤白桂枝汤uplc特征图谱的构建方法，包含以下步骤：
8.(1)对照品加入溶剂制成对照品溶液；
9.(2)取枳实薤白桂枝汤作为供试品，加入溶剂处理后制成供试品溶液；
10.(3)液相色谱检测；
11.(4)特征图谱的建立：呈现22个共有峰，通过对照品指认出10个特征峰，分别为尿苷、腺苷、鸟苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、和厚朴酚、厚朴酚。
12.进一步地，步骤(4)中所述各共有峰的相对保留时间如下：
13.以鸟苷为基准峰s1，8个共有峰的相对保留时间如下：0.68(
±
10％)、0.75(
±
10％)、0.94(
±
10％)、1.00、1.10(
±
10％)、1.82(
±
10％)、2.34(
±
10％)、3.01(
±
10％)；
14.以柚皮苷为基准峰s2，14个共有峰的相对保留时间如下：0.81(
±
10％)、0.85(
±
10％)、0.88(
±
10％)、0.94(
±
10％)、1.00、1.06(
±
10％)、1.13(
±
10％)、1.23(
±
10％)、1.33(
±
10％)、1.37(
±
10％)、1.44(
±
10％)、1.47(
±
10％)、1.52(
±
10％)、1.56(
±
10％)。
15.进一步地，步骤(1)中所述对照品及其溶液浓度如下：尿苷10-50μg/ml、腺苷5-50μg/ml、鸟苷5-50μg/ml、芸香柚皮苷30-100μg/ml、柚皮苷0.1-1.0mg/ml、橙皮苷0.1-1.0mg/ml、新橙皮苷0.1-1.0mg/ml、桂皮醛5-50μg/ml、和厚朴酚10-50μg/ml、厚朴酚10-100μg/ml。
16.进一步地，所述供试品为枳实薤白桂枝汤提取液(煎煮液)、基准样品(冻干粉)、制剂中间产品或制剂成品。
17.进一步地，步骤(2)中所述加入溶剂处理的具体步骤为：以水或甲醇-水溶液为溶剂，每30～50ml加入1g供试品，超声处理，溶解。
18.进一步地，步骤(3)中所述色谱条件具体为：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相a：乙腈、流动相b：0.05％～1％体积分数的酸性溶液，检测波长：210～360nm，流速：0.25～0.35ml/min；柱温：20℃～40℃；按如下的洗脱梯度进行洗脱：
[0019][0020]
进一步地，所述色谱柱柱长为100～150mm，色谱柱填料粒径为1.7～1.9μm。
[0021]
进一步地，所述供试品溶液检测的进样量为1～2μl。
[0022]
所述枳实薤白桂枝汤uplc特征图谱的构建方法可应用于表征瓜蒌、薤白、枳实、厚
朴和桂枝5个药味的色谱信息，并检测控制枳实薤白桂枝汤提取物及其制剂的质量。其中，瓜蒌、薤白、枳实、厚朴、桂枝(5个药味)对应药材和饮片作为供试品溶液的制备过程为：取药材或饮片粉末适量，加入10～50％体积分数的甲醇15～50ml，超声处理30分钟，放冷摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0023]
进一步地，所述22个共有峰中，峰2-4,6,8归属于薤白，峰2-8归属于瓜蒌，峰1-4,6,8-15,17-20归属于枳实，峰21-22归属于厚朴，峰16归属于桂枝；其中，峰5,7为瓜蒌专属成分，峰1,9-15,17-20为枳实专属成分，峰21-22为厚朴专属成分，峰16为桂枝专属成分。
[0024]
本发明通过建立的uplc特征图谱可用于检测瓜蒌、薤白、枳实、厚朴、桂枝药材和饮片的检测和质量控制，实现药材到饮片到枳实薤白桂枝汤复方制剂的量值传递，确保复方制剂的特征峰一致和质量稳定。
[0025]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该特征图谱方法的构建充分考虑了组方配伍原则，克服了各药味活性成分极性差异较大、分离难度大等困难，特别是将君药薤白中的成分进行表征、归属和指认，解决了现有技术中薤白信息缺失或无法控制的现象；(2)该方法构建了一种表征处方全药味信息的枳实薤白桂枝汤的特征图谱。呈现22个特征峰，特征组分信息丰富、专属性较强，可以较为全面地反映复方整体特性和产品质量；(3)可以快速检测产品质量状况，适于连续化生产的需求。相较于hplc检测方法，超高效液相色谱法，更加快捷、高效、实现快速质量检测以满足产业化生产需求，提高生产效率；(4)方法操作简便、适用广泛，适用于枳实薤白桂枝汤的提取物、基准样品、制剂中间产品及成品的质量评价；(5)将该方法应用于药材、饮片、中间体、成品的的全过程质量检测和控制，实现特征峰从药材、饮片到产品生产的全过程量值传递和监测，同时作为产品质量追溯的有力判断和依据，确保枳实薤白桂枝汤复方制剂的批间质量稳定、一致；(6)本发明将为经典名方枳实薤白桂枝汤复方制剂的研制和开发提供坚实、充分的科学依据。
附图说明
[0026]
图1为实施例1枳实薤白桂枝汤特征图谱专属性色谱图；
[0027]
图2为实施例1枳实薤白桂枝汤特征图谱延长实验；
[0028]
图3为实施例1中15批次基准样品特征叠加图谱；
[0029]
图4为实施例1对照品指认色谱图；
[0030]
图5为枳实薤白桂枝汤的对照特征图谱；
[0031]
图6为实施例3瓜蒌药材特征图谱；
[0032]
图7为实施例3薤白药材特征图谱；
[0033]
图8为实施例3枳实药材特征图谱；
[0034]
图9为实施例3厚朴药材特征图谱；
[0035]
图10为实施例3桂枝药材特征图谱；
[0036]
图11为实施例3瓜蒌特征峰归属情况；
[0037]
图12为实施例3薤白特征峰归属情况；
[0038]
图13为实施例3枳实特征峰归属情况；
[0039]
图14为实施例3厚朴特征峰归属情况；
[0040]
图15为实施例3桂枝特征峰归属情况。
具体实施方式
[0041]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0042]
实施例1
[0043]
特征图谱方法学验证
[0044]
枳实薤白桂枝汤制剂(基准样品)制备方法：
[0045]
先将枳实、厚朴，加水1000ml，浸泡30-60min，加热煎煮30-60min，滤过，去除药渣，煎液备用；再将薤白，瓜蒌，桂枝，加入先煎药液，加热煎煮10-20分钟，滤过，冷冻干燥，即得。
[0046]
1仪器和试药
[0047]
agilent technologies 1290infinity超高效液相色谱仪；1290dad fs二极管阵列检测器；1290mct柱温箱；1290vial sampler自动进样器；1290fiexible pump四元泵；open lab 2.3色谱工作站；电子分析天平；kq-250b超声清洗机；纯水系统；as165w型离心机。
[0048]
2色谱条件的确定
[0049]
以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％体积分数的甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为35℃；检测波长为280nm。
[0050][0051]
3参照物溶液的制备
[0052]
对照品参照物溶液的制备：取尿苷对照品、腺苷对照品、鸟苷对照品、芸香柚皮苷对照品适量，精密称定，加10％体积分数的甲醇水溶液制成每1ml含尿苷15μg、腺苷10μg、鸟苷10μg、芸香柚皮苷50μg的溶液，摇匀；另取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、桂皮醛对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml含柚皮苷0.5mg、橙皮苷0.5mg、新橙皮苷0.5mg、桂皮醛10μg、和厚朴酚25μg、厚朴酚30μg的溶液，摇匀；均作为对照品参照物溶液。
[0053]
4供试品溶液的制备
[0054]
(1)供试品溶液的制备方法
[0055]
最终确定如下制备方法：取本品适量，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％体积分数的甲醇水溶液15ml，密塞，称定重量，超声处理(250w，40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％体积分数的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0056]
(2)专属性考察
[0057]
提取溶剂对枳实薤白桂枝汤基准样品特征图谱的测定无干扰，结果见附图1。
[0058]
(3)整体性考察
[0059]
在相同的色谱条件上，保持有机相比例最高时的洗脱梯度，洗脱时间延长一倍，记录色谱图。
[0060]
结果表明，原梯度洗脱结束后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，结果见附图2。
[0061]
(4)精密度的考察
[0062]
取方法学批号样品，按供试品溶液制备方法制备成供试液，连续进样6次，每次1μl，记录色谱图。以鸟苷所对应的峰4为参照峰s1，计算峰1～峰8的相对保留时间，以柚皮苷所对应的峰13为参照峰s2，计算峰9～峰22的相对保留时间，结果见下表。
[0063]
表1精密度的考察
[0064][0065]
表2精密度的考察
[0066][0067]
注：f2-尿苷，f3-腺苷，f4-鸟苷，f12-芸香柚皮苷，f13-柚皮苷，f15-新橙皮苷，f16-桂皮醛，f21-和厚朴酚，f22-厚朴酚。
[0068]
结论：各特征峰的相对保留时间的rsd均小于1％，精密度良好。
[0069]
(5)稳定性考察
[0070]
取方法学批号样品，按供试品溶液制备方法制成供试液，分别于0h，2h，4h，6h，8h，12h进样，每次进样1μl，记录色谱图。以鸟苷所对应的峰4为参照峰s1，计算峰1～峰8的相对保留时间，以柚皮苷所对应的峰13为参照峰s2，计算峰9～峰22的相对保留时间，结果见下表。
[0071]
表3稳定性的考察
[0072][0073]
表4稳定性的考察
[0074][0075]
注：f2-尿苷，f3-腺苷，f4-鸟苷，f12-芸香柚皮苷，f13-柚皮苷，f15-新橙皮苷，f16-桂皮醛，f21-和厚朴酚，f22-厚朴酚。
[0076]
结论：供试品溶液在24小时内稳定性良好(rsd％＜1.0％)。
[0077]
(6)重复性考察
[0078]
取方法学批号样品，按供试品溶液制备方法制成供试液，平行6份，每次进样1μl，记录色谱图。以鸟苷所对应的峰4为参照峰s1，计算峰1～峰8的相对保留时间，以柚皮苷所对应的峰13为参照峰s2，计算峰9～峰22的相对保留时间，结果见下表。
[0079]
表5重复性的考察
[0080][0081]
表6重复性的考察
[0082][0083]
注：f2-尿苷，f3-腺苷，f4-鸟苷，f12-芸香柚皮苷，f13-柚皮苷，f15-新橙皮苷，f16-桂皮醛，f21-和厚朴酚，f22-厚朴酚。
[0084]
结论：结果表明，各特征峰的相对保留时间rsd均小于1％，供试液重复性良好。
[0085]
(7)样品测定及共有峰的确定
[0086]
按上文确定的特征图谱供试品制备方法和色谱条件对多批次枳实薤白桂枝汤基准样品特征图谱进行测定，每次进样1μl，记录uplc色谱图。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，结合峰归属情况，选择其共有峰，计算各共有峰的相对保留时间，拟合共有峰叠加图谱，生成共有模式的特征对照图谱，结果见附图3。
[0087]
表7多批次供试品结果(相对保留时间)
[0088][0089]
表8多批次供试品结果(相对保留时间)
[0090][0091]
注：f2-尿苷，f3-腺苷，f4-鸟苷，f12-芸香柚皮苷，f13-柚皮苷，f15-新橙皮苷，f16-桂皮醛，f21-和厚朴酚，f22-厚朴酚。
[0092]
结论：经过15批次供试品的检测，特征峰的相对保留时间稳定，rsd均小于1％，说明本发明构建的特征图谱可靠稳定。
[0093]
(8)对照品指认
[0094]
取尿苷对照品、腺苷对照品、鸟苷对照品、芸香柚皮苷对照品适量，精密称定，加10％体积分数的甲醇制成每1ml含尿苷15μg、腺苷10μg、鸟苷10μg、芸香柚皮苷50μg的溶液，摇匀；另取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、桂皮醛对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml含柚皮苷0.5mg、橙皮苷0.5mg、新橙皮苷0.5mg、桂皮醛10μg、和厚朴酚25μg、厚朴酚30μg的溶液，摇匀；均作为对照品参照物溶液，结果见附图4。
[0095]
实施例2
[0096]
特征图谱的建立:
[0097]
为了更好的保证特征方法的可操作性，可重现性，便于后期标准实施过程中的判定，减少不同实验室和外界条件对标准重现性的影响，综合考虑以对照品参照物溶液和相对保留时间相结合，随行参照的形式建立特征图谱，结果见附图5。
[0098]
供试品色谱中应呈现22个特征峰，其中峰2、峰3、峰4、峰12、峰13、峰14、峰15、峰16、峰21、峰22应分别与尿苷对照品、腺苷对照品、鸟苷对照品、芸香柚皮苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷、新橙皮苷对照品、桂皮醛对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品参照物峰保留时间相对应。与鸟苷参照物峰相应的峰作为s1峰，计算峰1、峰5～峰8与s1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.68(峰1)、1.10(峰5)、1.82(峰6)、2.34(峰7)、3.01(峰8)；与柚皮苷参照物峰相应的峰作为s2峰，计算峰9～峰11、
峰17～峰20与s1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.81(峰9)、0.85(峰10)、0.88(峰11)、1.33(峰17)、1.37(峰18)、1.44(峰19)、1.47(峰20)。
[0099]
实施例3
[0100]
特征图谱应用：
[0101]
(1)单味药材的特征图谱测定
[0102]
供试品溶液的制备：
[0103]
称取瓜蒌、薤白、枳实药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％体积分数的甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％体积分数的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0104]
称取厚朴、桂枝药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％体积分数的甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％体积分数的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0105]
色谱条件：同实施例1枳实薤白桂枝汤特征图谱色谱条件。
[0106]
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0107]
结果见附图6～10。
[0108]
(2)特征峰归属
[0109]
(2.1)复方阴性归属验证
[0110]
制备方法：分别取缺瓜蒌、缺薤白、缺枳实、缺厚朴、缺桂枝饮片所组成得5个复方，加水煎煮，趁热过滤，放冷，冷冻干燥，即得枳实薤白桂枝汤缺味基准样品。分别取各缺味基准样品适量，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50％体积分数的甲醇25ml，称定重量，超声(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％体积分数的甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0111]
色谱条件：同实施例1枳实薤白桂枝汤特征图谱色谱条件。
[0112]
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0113]
(2.2)单味药归属指认结果
[0114]
根据单味药阳性及对应阴性对照，各成分归属结果见下表。
[0115]
表9各色谱峰单味药归属结果
[0116][0117][0118]
通过单味药、复方阴性和对照品指认的特征图谱研究，对瓜蒌、薤白、枳实、厚朴、桂枝进行了峰归属。基准样品色谱中共呈现22个特征峰，其中有5个峰归属于薤白，有7个峰归属于瓜蒌(其中峰5、峰7为瓜蒌仅有的专属特征峰)，有17个峰归属于枳实(其中峰1、峰9-15、峰17-20为枳实仅有的专属特征峰)，有2个峰归属于厚朴(即峰21、22为厚朴仅有的专属特征峰)，有1个峰归属于桂枝(即峰16为桂枝仅有的专属特征峰)，结果见附图11～15。