一种头孢克洛中残留杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种头孢克洛中残留杂质的检测方法。


背景技术：

2.头孢克洛是一种半合成的第二代口服头孢菌素类抗生素药物，头孢克洛自1979年获fda批准，1982年在美国成功上市以来，因其具有广谱、高效和良好的临床安全性，它已成为目前治疗细菌感染的重要药物之一。头孢克洛的杀菌机制是使转肤酶失活，干扰细菌细胞壁最终阶段的合成，阻止粘肽原的交联，对葡萄球菌、链球菌属、肺炎球菌及大肠杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很强的杀灭作用。现有工艺生成头孢克洛原料药中可能会产生残留一种基因毒性杂质：7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐，其化学结构如下所示，
[0003][0004]
按照ich m7指导原则，头孢克洛原料药中杂质7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的限度不得超过30μg/g，因此需要严格进行控制。
[0005]
目前，常规液相色谱检测方法的灵敏度不能满足头孢克洛原料药中杂质7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测要求，且尚未发现能够满足该要求的检测方法报道。因此，需要提供一种能够准确可靠检测头孢克洛中杂质7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测方法，以满足检测需要。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术中不能对头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐进行有效检测的问题，本发明提供一种头孢克洛中残留杂质的检测方法。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
[0008]
一种头孢克洛中残留杂质的检测方法，所述残留杂质为7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐，采用高效液相色谱与质谱联用法进行检测，包含以下步骤：
[0009]
(1)供试品溶液和对照品溶液的配制：
[0010]
取头孢克洛原料，用甲醇配制成供试品溶液；
[0011]
取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐对照品，用甲醇配制成对照品溶液；
[0012]
(2)对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测，其中，所述高效液相色谱的条件：
[0013]
色谱柱：c18色谱柱；
[0014]
流动相a：体积浓度为0.05％-0.2％甲酸的水溶液，流动相b：甲醇；
[0015]
梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
[0016]
0min，59％-61％流动相a，39％-41％流动相b；
[0017]
2min，59％-61％流动相a，39％-41％流动相b；
[0018]
7min，4％-6％流动相a，94％-96％流动相b；
[0019]
10min，4％-6％流动相a，94％-96％流动相b；
[0020]
10.1min，59％-61％流动相a，39％-41％流动相b；
[0021]
15min，59％-61％流动相a，39％-41％流动相b；
[0022]
质谱条件为：esi离子源，正离子扫描模式，定量离子为：母离子370.1m/z，子离子为342.1m/z，碰撞电压为7.2v，去簇电压为50v；定性离子为：母离子370.1m/z，子离子为306.2m/z，碰撞电压为15v，去簇电压为50v。
[0023]
本发明提供的头孢克洛中残留杂质的检测方法，具体的残留杂质为7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐，其检测方法灵敏度高，准确可靠，线性关系良好(r2＝0.9984)，具有优异的精密度和耐用性。该方法回收率在93.05％-116.97％之间，样品重复性的相对标准偏差小于10％，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测限为5.94ng/ml，相当于样品的2.97％，定量限为11.88ng/ml，相当于样品的5.94％，符合ich m7的指导原则的检测要求，可作为其质量监控的依据。且本发明提供的检方法中溶剂不干扰杂质7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐检测，样品中无干扰杂质测定的峰，方法专属性良好，且方法简便、快速、准确、重复性好。
[0024]
优选的，流速为0.9ml/min-1.1ml/min；柱温为27℃-33℃。
[0025]
进一步优选的，流速为1.0ml/min；柱温为30℃。
[0026]
优选的，所述色谱柱的规格为4.6mm*150mm，填料直径为5μm。
[0027]
进一步优选的，所述色谱柱为capcell pak mgⅱc18。
[0028]
优选的，流动相a为体积浓度为0.1％甲酸的水溶液。
[0029]
在流动相中加入特定浓度的甲酸溶液有助于待测物质在色谱中电离，提高检测结果的准确度及精密度；进一步优选0.1％的甲酸的水溶液作为流动相，一方面配置简单方便，另一方面也符合质谱仪器以及色谱柱的耐受范围。
[0030]
优选的，进样体积为10μl。
[0031]
优选的，供试品溶液的浓度为2mg/ml。
[0032]
优选的，对照品溶液的浓度为60ng/ml。
[0033]
优选的液相色谱的检测条件有利于头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的有效检出，提高检测的灵敏度，从而达到有效准确检测头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的目的。
[0034]
优选的，所述质谱的扫描模式为多反应监测，气帘气体压力为40kpa；碰撞气压力为medium；离子化电压为5500v；射入电压为10v；碰撞室射出电压为10v；喷雾气为55psi；辅助加热气为55psi；离子化温度(tem)为550℃。
[0035]
优选的质谱分析条件在具有较高的响应强度的前提下，具有高选择性和较低的基线，使得目标化合物具有较高的信噪比，较高的灵敏度，从而能够最大限度地提高头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐测定的准确性。
[0036]
本发明采用高效液相色谱和质谱联用的检测方法，能够实现对头孢克洛中7-氨
基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的准确检测，检测限为样品的2.97％，适用于头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的的检测，解决了目前无法对头孢克洛原料中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐进行有效控制的问题。且该检测方法操作简便、精密度高，具有推广和实用价值。
附图说明
[0037]
图1为实施例1中空白溶液的色谱图；
[0038]
图2为实施例1中对照溶液的色谱图；
[0039]
图3为实施例1中供试品溶液的色谱图；
[0040]
图4为实施例2中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的标准曲线图。
具体实施方式
[0041]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，应当理解，此处所描述的具体实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
[0042]
本发明检测方法的高效液相色谱与质谱条件：
[0043]
高效液相色谱条件为：
[0044]
色谱柱：capcell pak mg
ꢀⅱꢀ
c18，4.6mm*150mm，5μm；
[0045]
流动相a：0.1％甲酸的水溶液；
[0046]
流动相b：甲醇；
[0047]
流速：1ml/min；
[0048]
进样体积：10μl；
[0049]
柱温：30℃；
[0050]
梯度洗脱，洗脱程序如下：
[0051]
mina相％b相％060402.0060407.0059510.0059510.10604015.006040
[0052]
质谱条件为：esi离子源，使用正离子扫描模式，扫描模式为多反应监测，气帘气体压力为40kpa，碰撞气压力为medium，离子化电压为5500v，射入电压为10v，碰撞室射出电压为10v，喷雾气为55psi，辅助加热气为55psi，离子化温度(tem)为550℃，检测离子对以及碰撞电压和去簇电压见下表。
[0053][0054]
实施例1
[0055]
专属性试验：
[0056]
空白溶液：甲醇。
[0057]
对照品溶液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml中约含60.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐溶液，作为对照品溶液。
[0058]
供试品溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
[0059]
取上述空白溶液、对照品溶液和供试品溶液对照品溶液各10μl，分别按照上述条件进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，如图1-图3所示。
[0060]
由图1-图3可知，本发明7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的测定方法，空白溶液及供试品溶液中均无干扰7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐测定的峰，该方法专属性良好。
[0061]
实施例2
[0062]
线性关系：
[0063]
线性储备液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml中约含60.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐，作为线性储备液。
[0064]
线性溶液：精密量取线性储备液适量，分别用甲醇稀释至每1ml中约含7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐11.88ng、23.74ng、35.64ng、59.39ng、83.15ng、118.79ng的溶液，摇匀，作为线性溶液。
[0065]
取各线性溶液，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。以7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐进样浓度(ng/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图4；并计算回归方程，结果见表1。
[0066]
表1 7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐线性试验结果
[0067][0068]
由表1可知，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐在11.88ng/ml～118.79ng/ml的浓度范围内相关系数r2＝0.9984，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。
[0069]
实施例3
[0070]
检测限和定量限试验：
[0071]
对照品溶液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml中约含60.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐溶液，作为对照品溶液。
[0072]
取对照品溶液，用甲醇逐级定量稀释，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，按信噪比不低于10:1，得到定量限，结果见表2。
[0073]
平行制备定量限溶液6份，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，观察定量限精密度，结果见表3。
[0074]
表2检测限、定量限检测结果
[0075][0076]
表3定量限重复性检测结果
[0077][0078]
由表2可知，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测限浓度为5.94ng/ml，相当头孢克洛原料的2.97％可被检出；定量限浓度为11.88ng/ml，相当于头孢克洛原料的5.94％可被定量检出，检测限和定量限均能满足头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测要求。且由表3可知，对6份定量限溶液进行检测，重复性良好，证明该方法的灵敏度高。
[0079]
实施例4
[0080]
准确度试验：
[0081]
7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的准确度试验以回收率(％)表示。
[0082]
对照品贮备液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml中约含1200.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐溶液，作为对照品贮备液。
[0083]
对照品溶液：取对照品贮备液0.5ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻
度，作为对照品溶液。
[0084]
60％7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐限度回收率溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，置于10ml容量瓶中，加入对照品贮备液0.3ml，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
[0085]
100％7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐限度回收率溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，置于10ml容量瓶中，加入对照品贮备液0.5ml，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
[0086]
140％7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐限度回收率溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，置于10ml容量瓶中，加入对照品贮备液0.7ml，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
[0087]
取对照品溶液和各回收率溶液，分别进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，回收率结果见表4。
[0088]
回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量
×
100％
[0089]
表4 7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐回收率检测结果
[0090][0091]
由表4可知，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐在60％-140％限度浓度范围内，回收率在93.05％-116.97％之间，rds小于10％，该检测方法的回收率良好；在60％-140％限度浓度范围内平均回收率为103.91％，该方法的准确度良好。
[0092]
实施例5
[0093]
重复性试验：
[0094]
供试品溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0095]
取上述制备的供试品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。检测结果见表5。
[0096]
表5 7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐重复性试验结果
[0097][0098]
由表5可知，重复测定同批配制的6份供试品溶液，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐均未检出，说明本方法重复性良好。
[0099]
实施例6
[0100]
精密度试验：
[0101]
对照品溶液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml中约含60.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐溶液，作为对照品溶液。
[0102]
取对照品溶液进行hplc-ms/ms检测，连续进样检测6次，记录色谱图。检测结果见表6。
[0103]
表6精密度试验结果
[0104][0105]
由表6可知，连续检测对照品溶液6次，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的峰面积rsd值为2.52％，小于10％，说明本方法精密度良好。
[0106]
实施例7
[0107]
中间精密度试验：
[0108]
供试品溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0109]
分别取上述6份供试品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。此次检测与重复性检测日期不同、操作者不同，检测结果见表7。
[0110]
表7中间精密度试验结果
[0111]
[0112][0113]
由表7可知，不同日期、不同操作者对6份供试品溶液进行检测，均未检出7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐，与实施例5中的重复性结果一致，说明本方法中间精密度性良好。
[0114]
实施例8
[0115]
耐用性试验：
[0116]
对照品溶液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml中约含60.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐溶液，作为对照品溶液。
[0117]
微调色谱条件：(1)其他条件不变，设置流速为1.1ml/min；
[0118]
(2)其他条件不变，设置流速为0.9ml/min；
[0119]
(3)其他条件不变，设置柱温为33℃；
[0120]
(4)其他条件不变，设置柱温为27℃；
[0121]
(5)其他条件不变，设置梯度中b相整体增加1％，a相整体降低1％；
[0122]
(6)其他条件不变，设置梯度中b相整体降低1％，a相整体增减1％。
[0123]
在以上微调后的色谱条件下，分别取对照品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，考察7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的耐用性，检测结果见表8。
[0124]
表8 7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐耐用性试验结果
[0125][0126][0127]
由表8可知，微调色谱条件对7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐检测无影响，说明该方法耐用性良好，适于实际应用和推广。
[0128]
实施例9
[0129]
稳定性试验：
[0130]
对照品溶液：取7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml中约含60.00ng的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐溶液，作为对照品溶液。
[0131]
供试品溶液：取头孢克洛原料约20.00mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0132]
将对照溶液和供试品溶液在室温条件下静置，每隔0h、2h、4h、6h、8h后，分别进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，检测结果见表9和表10。
[0133]
表9对照品溶液稳定性试验结果
[0134][0135]
表10供试品溶液稳定性试验结果
[0136][0137]
由表9可知，对照品溶液在室温条件下，放置8小时，峰面积的rsd为9.52％(≤10％)，说明对照品溶液的稳定性均良好；由表10可知，供试品溶液在室温条件下，放置0h、2h、4h、6h、8h 7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐均未检出，说明供试品溶液的稳定性均良好。
[0138]
实施例10
[0139]
样品检测：
[0140]
按照本发明提供的头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测方法，对三批头孢克洛原料样品中的7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐进行检测。检测结果见表11。
[0141]
表11样品检测结果
[0142]
批次1234含量(％)未检出未检出未检出未检出
[0143]
结果显示，3批头孢克洛原料样品中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐均未检出，符合限度规定(7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐≤30μg/g)。
[0144]
由以上实施例可知，本发明方法灵敏度高，准确可靠，线性关系良好，同时具有良好的精密度和耐用性，适用于头孢克洛中7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸对硝基苄基酯盐酸盐的检测，可作为其质量监控的依据。
[0145]
以上所述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。