猪笼草组培快速育苗方法及其应用与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，具体来说是一种猪笼草组培快速育苗方法及其应用。


背景技术：

2.猪笼草（nepenthes misabilis）又名猪仔笼、捕虫草、公仔瓶、招财进宝、袋袋平安等，为猪笼草科猪笼草属多年生草本植物，我国主要分布于广东西部与南部以及海南，国外主要分布在柬埔寨、缅甸、老挝、泰国、越南、澳大利亚北部以及大洋洲各国等多个国家。猪笼草一般生于海拔50～400m的沼地、路边、山腰和山顶等灌丛中、草地上或林下。
3.有关猪笼草的文字记载始于1658年法国殖民地马达加斯加的统治者etienne de flacourt，1789年joseph banks首次将其引种与英国皇家植物园。由于其婀娜多姿的藤蔓、美丽的叶笼和奇特的捕食方式而引起了人们的兴趣，它常用于盆栽或吊盆观赏，十分优雅别致，也具有消灭室内飞虫、净化空气的功能，是目前我国主要的观赏性食虫植物之一。猪笼草在我国最早是因其药用价值而被人们认知，《中华本草》、《广东中药》、《广西本草选编》、《全国中草药汇编》等著名医药书籍均对猪笼草的性味归经等有较为详细的记载。猪笼草以全草入药，有润肺止咳，清热利湿排湿，解热消肿的功效，主要用于肺燥咳血，感冒咳嗽，百日咳，黄疸，痢疾，尿路结石，胃及十二指肠溃疡，高血压，糖尿病，疮殇痈肿等病症的治疗，经现代医药研究表明，其内含黄酮甙、酚类、氨基酸、多糖类、蒽醌甙等有效成分。
4.由于其兼具观赏性及药用价值，猪笼草市场需求日益增长，野生资源亦由于生态环境的破坏急剧减少，人工栽培是猪笼草的必然发展。但猪笼草为雌雄异株，种子结实率低，同时，其种子发芽率极低，发芽周期较长，发芽后种苗生长缓慢，从而使得猪笼草种子繁殖未成为猪笼草繁殖的主要方式。而猪笼草另一种繁殖方式——扦插繁殖，由于其生长迅速，种苗易得而成为了猪笼草目前最主要的繁殖方式，但其仍然存在繁殖率低，繁殖周期长等缺点。
5.随着现代生物技术的发展，猪笼草组织培养技术的研究亦逐步开始开展，我国自上世纪90年代就有猪笼草属相关组织培养方面的报道，但猪笼草组培技术发展至今，仍存在初代诱导褐化严重、继代增殖系数低、增殖周期长、生根时几乎不能出“笼”等（图1）。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术存在的不足，提出一种具有诱导褐化率低，继代增殖系数高，增殖周期短、生根时能出笼等优势的猪笼草组织培养方法。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种猪笼草组培快速育苗方法，包括如下步骤：（1）外植体清洁：选择猪笼草幼嫩茎段，剪去叶片，置于饱和肥皂水溶液中涮洗8～10min，后用自来水洗净表面肥皂液，再滴加2～3滴吐温-80，震摇10～15min，最后用自来水冲淋60～80min；
（2）外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒20～30s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒20～25min，无菌水涮洗3～4次，0.1%升汞溶液消毒3～4min，无菌水涮洗3～4次，0.05%升汞溶液消毒8～9min，无菌水涮洗6～7次；（3）丛生芽诱导：将消毒外植体去表面水分，剪去两端伤口，并将其剪成1～2cm长的具芽小段，接种于1/3ms naa 0.05～0.1mg/l cppu 0.4～0.5mg/l kt 2.0～3.0mg/l 硝酸银 1.5～2.0μg/l 活性炭1.0g/l的丛生芽诱导培养基，接种完成后在5
±
2℃的低温下暗培养6天，后转移至在温度为25
±
2℃的环境下，再继续暗培养10天，后再以光照强度2000～3000lx，日照光12h的光暗交替下培养30～40天；（4）丛生芽增殖：诱导所得丛生芽切成单芽，接种于改良wpm naa 0.1～0.15mg/l tdz 1.0～1.5mg/l br 0.1～0.2mg/l ch 20～30mg/l 牛肉膏1.0～2.0g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基中，在温度为25
±
2℃的环境下，光照强度2000～3000lx，日照光12h的光暗交替下培养50～60天；（5）丛生芽生根：增殖所得丛生芽切成单芽，接种于改良wpm naa 0.5～0.6mg/l iba 0.2～0.3mg/l 牛肉膏3.0～4.0g/l ch 60～80mg/l 活性炭 0.3g/l的生根培养基中，在温度为25
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2℃的环境下，光照强度3000～4000lx，日照光12h的光暗交替下培养50～60天；进一步的、所述改良wpm为在原wpm培养基的基础上，磷酸二氢钾改为40mg/l，硝酸铵改为210mg/l，硫酸镁改为40mg/l，硫酸钾改为340mg/l，硝酸钙改为70mg/l，盐酸硫胺素改为1.0mg/l，甘氨酸改为2.5mg/l，其余成分不变。
8.本发明的有益技术效果是：1. 本发明在解决猪笼草初代诱导褐化情况时，通过在外植体消毒时，采用75%酒精、饱和漂白粉溶液以及高浓度升汞短时结合低浓度升汞长时消毒的结合，能有效降低消毒污染率以及消毒死亡率的同时，还能降低消毒剂对外植体的伤害，减少外植体在培养过程中的褐化率，同时在初代诱导培养时，采用一定浓度硝酸银及高浓度活性炭，而在接种完成后进行为期使初代诱导褐化率几乎不能发生，减少了短期内不断转瓶的繁琐程序。猪笼草在初代诱导时褐化是极其普遍的问题，是外植体是否能诱导出丛生芽的关键，而现有技术仅能通过5～7天一周期不断转瓶的方式来解决褐化不影响丛生芽诱导。
9.2.本发明在丛生芽诱导培养时采用了naa、kt以及活性极高的cppu进行诱导，诱导率可达90%，是目前猪笼草属诱导率最佳的诱导培养基配方，究其原因，一方面是各植物生长调节剂种类及浓度的适宜搭配，同时低褐化率亦可能是提高诱导率的原因之一。
10.3. 本发明在增殖培养基中采用naa、tdz及br的有效搭配，使得丛生芽的再分化能力得到了极大的提高，可在短期能生长出大量的丛生芽，同时增殖培养基中采用了改良wpm培养基为基本培养基，并根据猪笼草本身兼具自养及异样特性，添加了ch及牛肉膏两种适宜的有机营养成分，有效促使了丛生芽的快速生长，大幅度的缩短了增殖周期，提高了增殖系数。现有猪笼草组培技术在增殖培养时，增殖系数大多在2～3，而增殖周期一般在60～90天，使得猪笼草在组培生产时生产效率降低，生产成本增高。
11.4.猪笼草在组培过程中，几乎不能结“笼”，而无“笼”猪笼草在驯化时一般最少需一年的周期才可以结笼，造成了猪笼草驯化周期过长。而本发明在生根培养时，采用了改良wpm的同时，还添加了较高浓度的ch和牛肉膏，同时搭配适宜浓度的naa及iba的组合，能使
猪笼草在组培过程中就能有一定概率的结“笼”，最终缩短了猪笼草驯化周期，降低了猪笼草的商品成本。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
13.图1是现有技术方法培养的幼苗结果图，组培苗无“笼”出现；图2是实施例1丛生芽生根培养结果图，已经培养出现“笼”。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.试验例11、丛生芽的增殖培养以0.1mg/l的naa为唯一生长素，搭配不同浓度的cppu、kt、6-ba、tdz、zt、br、ga3、2-ip，发现猪笼草诱导芽对cppu、tdz以及br极其敏感，选择三个因子进行了正交试验，其具体试验设计如下：表1 实验设计表2 实验结果
分别选择z2、z3和z8进行了多次重复试验，结果显示仅z3和z8具有高度重复性，而z2重复性较差，但z8玻化现象严重，易造成转接后僵苗。
16.2、丛生芽有机物添加剂试验由于增殖系数高的z3和z8苗均较弱，且出现不同程度的玻化现象，因此在两个配方基础上，进行不同浓度的ch、ye（酵母提取物）、牛肉膏、lh（水解乳蛋白）、椰乳、椰汁、香蕉以及土豆的添加试验，发现ch、ye、牛肉膏、lh均具有一定的壮苗和减少玻化率的作用。
17.在其基础上进行了正交试验，其具体试验设计如表3所示：表3 实验设计z3添加有机物试验结果见表4所示：表4 实验结果
从上表可以看出，适宜浓度的ch有明显减少玻化的发生，亦能一定程度的壮苗，低浓度ye虽亦能一定程度的减少玻化和壮苗，但不论多少浓度均会造成一定数量的叶片变黑，导致部分苗不能继续生长，从而降低了增殖系数，适宜浓度的牛肉膏，有明显壮苗作用，而lh的添加虽有一定的壮苗作用，但极大的降低了增殖系数。而使用ch和牛肉膏搭配添加，不仅可以壮苗，还可以在很大程度提高增殖系数。
18.z8添加有机物试验结果见表5所示：表5 实验结果
处理\结果增殖系数其他处理\结果增殖系数其他y13.9苗弱且有较多玻化y63.0苗较弱，有少量玻化，有少量叶片变黑。y23.2苗稍健壮，有较多玻化，有一定苗叶片变黑。y72.7苗稍健壮，有少量玻化。y32.5苗弱，有较多玻化玻化，有较多苗叶片变黑。y81.9苗稍健壮，有少量玻化，但又较多叶片变黑。y43.7苗稍健壮，有少量玻化，y93.1苗稍健壮，有少量玻化，有较多苗叶片变黑。y54.0苗稍健壮，有少量玻化，有少量苗叶片变黑
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从上表5可以看出，不论什么种类和浓度的有机物进行搭配，都不能完全杜绝玻化的发生，同时增殖系数亦显著低于z3的植物生长调节剂组合和y5的有机物添加组合。
19.3、丛生芽的生根培养在增殖培养研究时，发现ch和牛肉膏不仅能使增殖苗更加健壮，杜绝玻化现象的发生，还可以一定程度促使“笼”的发生。
20.在进行生根培养时，采用不添加有机物和搭配一定浓度ch和牛肉膏的组合进行试验，其具体试验设计如下。
21.表6 实验设计编号\有机物ch（mg/l）牛肉膏（g/l）编号\有机物ch（mg/l）牛肉膏（g/l）s100s9500s201.0s10501.0s302.0s11502.0s404.0s12504.0s5200s131000s6201.0s141001.0s7202.0s151002.0s8204.0s161004.0
表7 试验结果编号生根率根状态60天结笼率编号生根率根状态60天结笼率s1100%极细弱1.4%s9100%较细弱4.9%s2100%细弱1.6%s10100%较粗壮6.7%s3100%较细弱2.3%s11100%粗壮7.7%s4100%较粗壮3.6%s12100%极粗壮15.3%s5100%极细弱2.8%s13100%较粗壮5.4%s6100%细弱2.3%s14100%较粗壮7.9%s7100%较细弱3.9%s15100%粗壮10.8%s8100%较粗壮5.8%s16100%极其粗壮16.7%由上表7可以看出，在生根培养时，添加s12及s16浓度及种类的有机物，能使根系更加粗壮，60天结笼率为最高。
22.实施例1一种猪笼草组培快速育苗方法，包括如下步骤：1、外植体清洁：选择猪笼草幼嫩茎段剪去叶片，置于饱和肥皂水溶液中涮洗8min，后用自来水洗净表面肥皂液，再滴加2滴吐温-80，震摇10min，最后用自来水冲淋60min；2、外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒20s、无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒20min、无菌水涮洗3次，0.1%升汞溶液消毒3min、无菌水涮洗3次，0.05%升汞溶液消毒9min、无菌水涮洗7次；3、丛生芽诱导：将消毒外植体用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，并将其剪成1cm长的具芽小段，接种于1/3ms naa 0.05mg/l cppu 0.4mg/l kt 2.0mg/l 硝酸银 1.5μg/l 活性炭1.0g/l的丛生芽诱导培养基，接种完成后在5℃的低温下暗培养6天，后转移至在温度为25℃的环境下，再继续暗培养10天，后再以光照强度2000lx，日照光12h的光暗交替下培养40天；4、丛生芽增殖：诱导所得丛生芽切成单芽，接种于改良wpm naa 0.1mg/l tdz 1.0mg/l br 0.1mg/l ch 20mg/l 牛肉膏1.0g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基中，在温度为25℃的环境下，光照强度2000lx，日照光12h的光暗交替下培养60天；5、丛生芽生根：增殖所得丛生芽切成单芽，接种于改良wpm naa 0.5mg/l iba 0.2mg/l 牛肉膏3.0g/l ch 60mg/l 活性炭 0.3g/l的生根培养基中，在温度为25℃的环境下，光照强度3000lx，日照光12h的光暗交替下培养60天（图2）；6、生根苗驯化：猪笼草生根苗洗净基部培养基，栽植于水苔中，在遮阴率75%环境下驯化，驯化前期保持空气湿度100%，后逐步降低空气湿度，整个驯化期间，保持水苔湿度为70%。
23.实施例2一种猪笼草组培快速育苗方法，包括如下步骤：1、外植体清洁：选择猪笼草幼嫩茎段剪去叶片，置于饱和肥皂水溶液中涮洗10min，后用自来水洗净表面肥皂液，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋80min；2、外植体的消毒：洗净外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒30s、无菌水涮洗
3次，饱和漂白粉溶液消毒25min、无菌水涮洗3次，0.1%升汞溶液消毒4min、无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液消毒8min、无菌水涮洗7次；3、丛生芽诱导：将消毒外植体用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，并将其剪成2cm长的具芽小段，接种于1/3ms naa 0.1mg/l cppu 0.5mg/l kt 3.0mg/l 硝酸银 2.0μg/l 活性炭1.0g/l的初代丛生芽诱导培养基，接种完成后在3℃的低温下暗培养6天，后转移至在温度为23℃的环境下，再继续暗培养10天，后再以光照强度3000lx，日照光12h的光暗交替下培养40天；4、丛生芽增殖：诱导所得丛生芽切成单芽，接种于改良wpm naa 0.15mg/l tdz 1.5mg/l br 0.2mg/l ch 30mg/l 牛肉膏2.0g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基中，在温度为23℃的环境下，光照强度3000lx，日照光12h的光暗交替下培养60天；5、丛生芽生根：将增殖所得的丛生芽切成单芽，接种于改良wpm naa 0.6mg/l iba 0.3mg/l 牛肉膏4.0g/l ch 80mg/l 活性炭 0.3g/l的生根培养基中，在温度为23℃的环境下，光照强度4000lx，日照光12h的光暗交替下培养60天；6、生根苗驯化：将猪笼草生根苗，洗净基部培养基，栽植于水苔中，在遮阴率75%环境下驯化，驯化前期保持空气湿度100%，后逐步降低空气湿度，整个驯化期间，保持水苔湿度为70%。
24.对比例1照谢怡青，谢雄辉等，《猪笼草组培快繁技术研究》（广西农业科学[j]，2007，38（2）：131~132）中的最佳技术进行实施，并按照本发明实施例1中的驯化技术进行驯化。
[0025]
对比例2照徐强兴，潘学峰等，《猪笼草的快速繁殖技术研究》（热带林业[j]，2003,31（2）：50~52）中的最佳技术进行实施，并按照本发明实施例1中的驯化技术进行驯化。
[0026]
对比例3照廖伟，王胜男等，《猪笼草组织培养》（农业科学[j]，2017,5：61~62）中的最佳技术进行实施，并按照本发明实施例1中的驯化技术进行驯化。
[0027]
对比例4照专利《一种猪笼草组织培养繁殖方法》（申请号：cn1442044a）中的实施例1进行实施，并按照本发明实施例1中的驯化技术进行驯化。
[0028]
对比例5照专利《一种猪笼草离体快繁方法》（申请号：cn105519445a）中的实施例1进行实施，并按照本发明实施例1中的驯化技术进行驯化。
[0029]
将实施例1和2，对比例1-5的方法从消毒污染率、消毒死亡率、诱导过程中不转瓶的褐化率、60天增殖系数、30天生根率、60天结笼率和驯化120天结笼率进行对比统计，结果见下表：表8 对比结果
从上表8可知实施例2和3公开的方法消毒污染率仅仅高于对比例5，虽然消毒死亡率高于对比例3，但对比例3污染率却很高，实施例1和2方法中，诱导过程中不转瓶的褐化率、60天增殖系数、60天结笼率和驯化120天结笼率均高于现有技术对比例。
[0030]
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。