一种具有防治作物青枯病的鬼针草浸提液的制备方法及应用与流程

1.本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种具有防治作物青枯病的鬼针草浸提液的制备方法及应用。


背景技术：

2.作物青枯病是一种典型的植物细菌性维管束病害，该病的病原物为青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)，是茄子、番茄、辣椒、马铃薯、花生等作物种植过程中影响其产量和品质的重要病害，该病害可使植株的根、茎、叶出现典型的萎蔫症状，严重影响植株的生长发育。
3.对于作物青枯的防治研究，在田间主要采用种植抗性品种、农业防治措施如轮作和嫁接等、化学防治和生物防治等，其中化学防治是比较普遍的防治方法，也取得一些防治效果，但由于存在环境污染、病菌抗药性等问题，故亟需更加安全、无公害的生物防治来控制该病害的发生、发展。因而近年来生物防治成为研究热点。植物本身富含丰富的活性物质以及一些有益的微生物，能够对病虫害具有天然的防御作用，故利用植物源提取物防控病害是生物防治的主要方法之一。
4.鬼针草（bidens pilosa l.），一年生草本植物，产于中国多省区。可生长于村旁、路边及荒地中，为中国民间常用草药，有清热解毒、散瘀活血的功效。现有报道已将鬼针草的乙醇提取物和甲醇提取物用于抑制瓜果蔬菜炭疽菌等植物病原真菌以及抑制人类病原菌如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等，但未涉及植物病原细菌，且其采用有机溶剂进行提取，易造成环境污染。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种具有防治作物青枯病的鬼针草浸提液的制备方法及应用，其通过制备鬼针草浸提液并将其应用于作物青枯病的防治，以磷酸盐缓冲液为浸提介质，不污染环境，且获得的鬼针草浸提液对青枯病菌的具有特异性的抑制作用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种具有防治作物青枯病的鬼针草浸提液的制备方法，将新鲜鬼针草切成2-5cm的小段，加入磷酸盐缓冲液，室温浸提2d后，用无菌纱布过滤，即得所述鬼针草浸提液。其中，鬼针草与磷酸盐缓冲液的料液比为0.2g/ml。
7.进一步的，磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/ml。
8.所述鬼针草浸提液在防治作物青枯病中的应用。
9.研究发现鬼针草磷酸盐缓冲液浸提液在浸提浓度（鬼针草与浸提介质磷酸盐缓冲液的料液比）为0.2g/ml，浸提时间为2 d时平板抑菌结果最好。
10.鬼针草浸提液对烟草青枯病的防治效果：采用浸提液灌根接种法进行盆钵防治效果测定结果显示，接种后14 d，鬼针草磷酸盐缓冲液对烟草青枯病的防治效果为50.7%。
11.本发明的优点是：
①
本发明的鬼针草浸提液对常见作物青枯病菌具有抑制作用，而且盆栽实验也具有较好的防治效果，这为防治作物青枯病提供了一个新的策略。
12.②
本发明的鬼针草浸提液可以对烟草青枯病菌具有20d以上的持续作用，与化学农药相比无污染、无残留、无毒害，对环境有较高的安全性，是一个绿色防控措施，对作物青枯病的防治具有重要的意义。
13.③
鬼针草浸提液中含有丰富的化学物质，主要包括黄酮、多炔、萜类和挥发油类等，且鬼针草植物体内含有丰富的微生物，因此，鬼针草浸提液中含有丰富的微生物和活性物质，可应用于作物青枯病的防治，与化学药剂相比，植物浸提液具有易被自然微生物所分解、不污染环境、不易产生抗药性、专一性相对较强、对有益生物群体无毒害作用等优点。
附图说明
14.图1为实例1不同浓度鬼针草浸提液对烟草青枯的平板抑菌效果；图2为实例2不同浸提时间鬼针草浸提液对烟草青枯的平板抑菌效果；图3为实例2鬼针草浸提液的平板抑菌结果图（浓度0.20g/ml，浸提时间2d），a水浸提液，b磷酸盐浸提液；图4为实例4鬼针草浸提液对烟草青枯病的防治效果；图5为实例4鬼针草浸提液对烟草青枯病的防治第14 d的实物图，a磷酸盐浸提液 烟草青枯菌，b中生菌素 烟草青枯菌，c 烟草青枯菌。
具体实施方式
15.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
16.磷酸盐缓冲液的配制方法：分别将11.856 g 的nah2po4·
2h2o与44.392 g的na2hpo4·
12h2o溶于1l蒸馏水中，即为0.2mol/ml 的磷酸盐缓冲液，用于浸提鬼针草。
17.实施例1不同浓度的鬼针草浸提液对烟草青枯菌的平板抑制效果鬼针草浸提液的获得：采集鬼针草的新鲜植株若干，分别称取20g、40g、60g、80g、200g鬼针草将其切成2-5cm小段，将切碎的鬼针草置于无菌的容器中，分别加入1l的水或磷酸盐缓冲液，室温静置浸提2d后，用无菌纱布过滤除去鬼针草浸提液中的残渣，取滤液置于4℃冰箱备用，即得不同浓度的浸提液。
18.鬼针草浸提液对作物青枯菌的抑菌效果测定：采用抑菌圈法，挑取供试烟草青枯菌于nb培养基中，恒温振荡培养（28℃，180r/min）24h后，将细菌悬浮液与适温融化好的cpg固体培养基以1:100的比例混匀后倒板；分别吸取不同浓度的鬼针草浸提液（5μl）于平板上，晾干后放入28℃培养箱中培养，每个处理重复3次。
19.如图1结果显示：鬼针草水浸提液和鬼针草磷酸盐浸提液在浓度为0.20g/ml时抑菌效果最好，其抑菌圈平均半径分别为2.67mm和4.67mm，对应的平板抑菌结果图如图3所示。
20.实施例2 不同浸提时间的鬼针草浸提液对烟草青枯菌的平板抑菌效果鬼针草浸提液的获得：采集鬼针草的新鲜植株若干，分别称取200g鬼针草将其切成2-5cm小段，将切碎的鬼针草置于无菌的容器中，分别加入1l的水或磷酸盐缓冲液，室温
静置浸提不同时间后，用无菌纱布过滤除去鬼针草浸提液中的残渣，取滤液置于4℃冰箱备用，即得不同浓度的浸提液。
21.分别浸提1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d的鬼针草浸提液，采用抑菌圈法（具体操作同实施例1中）测定其对烟草青枯菌的平板抑菌效果。
22.如图2结果显示，鬼针草水浸提液和鬼针草磷酸盐浸提液均在浸提2d时抑菌效果最好，抑菌圈半径分别为2.67mm和4.67mm，对应的平板抑菌结果图如图3所示。
23.实施例3 鬼针草浸提液对作物病原细菌的平板抑菌效果采用抑菌圈法（具体操作同实施例1中），测定鬼针草浸提液对烟草青枯菌（ralstonia solanacearium）、番茄青枯菌（r. solanacearium）、甘薯青枯菌（r. solanacearium）、辣椒青枯菌（r. solanacearium）、马铃薯青枯菌（r. solanacearium）、烟草空腔病菌(pectobacterium carotovorum)、烟草野火病菌（pseudomonas amygdali）、番茄细菌性斑点病菌（p. syringae）、菊苣假单胞菌（p. cichorii）、小白菜软腐菌(p. carotovorum)、辣椒疮痂病菌菌(xanthomonas euvesicatoria)等的抑菌效果，结果见表1。其中鬼针草浸提液选择浓度为0.20g/ml，浸提时间为2d。
24.表1 鬼针草浸提液对作物病原细菌的平板抑菌效果表1结果显示，鬼针草浸提液对不同作物的青枯菌均具有较强的抑菌效果，但对烟草空腔病菌、烟草野火病菌、番茄细菌性斑点病菌、菊苣假单胞菌、小白菜软腐菌、辣椒疮痂病菌等植物病原细菌没有抑菌作用，这证明本发明获得的鬼针草浸提液对青枯病菌的抑制作用具有特异性。其中，鬼针草磷酸盐浸提液的抑菌效果优于鬼针草水浸提液。
25.实施例4 鬼针草浸提液对烟草青枯病的防治效果测定选取长势一致、健康的烟苗，分别浇灌30ml浓度为0.20g/ml，浸提时间为2d的鬼针草磷酸盐浸提液以及稀释750倍液的中生菌素（中生菌素的有效含量为3%），每个处理6株，每个处理重复3次，24h后灌根接种30ml烟草青枯菌悬浮液（od600=0.8）。
26.如图4，5结果表明，在接种14d后，鬼针草磷酸盐浸提液对烟草青枯菌的防效为50.7%；在接种21d后，其防效仍有40.0%，高于稀释750倍液的中生菌素的防治效果（16.4%）。
防治效果如图5所示。
27.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。