一种防治作物青枯病的牛膝菊浸提液的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种防治作物青枯病的牛膝菊浸提液的制备方法及其应用。


背景技术：

2.作物青枯病是一种典型的土传病害，该病害的病原物为青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)，其寄主范围广，如茄子、番茄、辣椒、马铃薯、花生等作物。青枯菌可通过土壤和灌溉水进行传播，从寄主植物根部侵入，进入木质部维管束，通过维管束系统迅速扩散到植物地上部组织，病害典型症状表现为木质部变褐，植株萎蔫。青枯病的大面积发生，使得农产品品质和产量受到严重的影响，造成不可挽回的经济损失，是热带、亚热带和温带地区最具破坏性的植物细菌病害之一。
3.作物青枯的防治策略主要是“以防病栽培为基础，抗病品种利用为中心，药剂防控为辅”，其防治措施主要包括，选择种植抗病优质的品种或嫁接苗、抗病品种轮作、用无病新土培育健康壮苗、改良土壤、及时清除病株、施用农药等。然而，化学农药的大量和频繁使用威胁着生态的可持续性以及人类的健康，因此，“绿色农业”发展迫在眉睫。
4.近年来，生物防治已成为研究热点。由于植物本身富含的活性物质以及一些有益的微生物，能够对病虫害具有天然的防御作用，故利用植物源提取物防控病害是生物防治的方法之一。植物提取物取材天然、来源广泛、成分复杂，在防治病虫害过程中不容易产生抗药性，对环境和农作物无残留。因此，开发利用我国丰富的植物资源对有害生物的防治具有深远的意义。
5.牛膝菊（galinsogaparviflora）属于一种外来入侵杂草，给当地的物种造成威胁。现有报道已有将牛膝菊的丙酮提取物用于抑制水稻恶苗病菌、稻瘟病菌等植物病原真菌，但未有涉及植物病原细菌，且其采用有机溶剂进行提取，易造成环境污染。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种防治作物青枯病的牛膝菊浸提液的制备方法及应用。其通过制备牛膝菊浸提液并将其应用于作物青枯病的防治，不但可消耗外来入侵植物牛膝菊，而且可用于防控作物青枯病，因而具有较好的应用前景。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种防治作物青枯病的牛膝菊浸提液的制备方法，其是将新鲜牛膝菊切成2-5cm的小段，然后按液料比10 ml/g加入ph=7浓度为0.20mol/ml的磷酸盐缓冲液，室温浸提2d后，经无菌纱布过滤，即得所述牛膝菊浸提液。
8.所得牛膝菊浸提液可用于作物青枯病的防治。
9.本发明的优点是：本发明制得的牛膝菊浸提液对多种作物青枯病菌均具有明显抑制作用，且持续作用强，与化学农药相比，其具有无污染、无残留、无毒害、对环境有较高安全性等优势，为生
物防治作物青枯病提供了一个新的策略。
附图说明
10.图1为实施例1不同浓度牛膝菊浸提液对烟草青枯病菌的抑菌效果对比。
11.图2为实施例2不同浸提时间所得牛膝菊浸提液对烟草青枯病菌的抑菌效果对比。
12.图3为实施例2中浸提2d获得的牛膝菊水浸提液（a）和牛膝菊磷酸盐浸提液（b）的平板抑菌结果图。
具体实施方式
13.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
14.磷酸盐缓冲液的配制：将11.856 g 的nah2po4·
2h2o与44.392 g的na2hpo4·
12h2o溶于1l蒸馏水中，即得0.2mol/ml的磷酸盐缓冲液，其ph值为7.0。
15.实施例1 不同浓度的牛膝菊浸提液对烟草青枯菌的平板抑制效果牛膝菊浸提液的获得：采集牛膝菊新鲜植株若干，将其切成2-5cm小段，然后取200g切碎的牛膝菊置于无菌容器中，分别加入一定量的水或磷酸盐缓冲液，使其浓度为0.02g/ml、0.04g/ml、0.06g/ml、0.08g/ml、0.10g/ml和0.20g/ml，室内静置浸提2d后，用无菌纱布过滤除去浸提液中的残渣，得到牛膝菊水浸提液及牛膝菊磷酸盐浸提液，置于4℃冰箱备用。
16.牛膝菊浸提液对作物青枯菌的平板抑菌作用：采用抑菌圈法，挑取供试烟草青枯菌菌株于nb培养基中，恒温振荡（28℃，180r/min）培养24h后，将细菌悬浮液与适温融化好的cpg固体培养基以1:100的比例混匀后倒板；分别吸取不同浓度的牛膝菊水浸提液或牛膝菊磷酸盐浸提液（5μl）于平板上，晾干后放入28℃培养箱中培养，每个处理重复3次。
17.如图1结果显示，在0.08g/ml~0.20g/ml范围内，牛膝菊磷酸盐浸提液的抑菌效果明显优于牛膝菊水浸提液，且牛膝菊磷酸盐浸提液在浓度为0.10g/ml时抑菌效果最好，其抑菌圈平均半径为4.33mm。
18.实施例2 不同浸提时间的牛膝菊浸提液对烟草青枯菌的平板抑菌效果牛膝菊浸提液的获得：采集牛膝菊新鲜植株若干，将其切成2-5cm小段，然后取200g切碎的牛膝菊置于无菌容器中，分别加入1l的水或磷酸盐缓冲液，室内静置浸提不同时间后，用无菌纱布过滤除去浸提液中的残渣，得到牛膝菊水浸提液及牛膝菊磷酸盐浸提液，置于4℃冰箱备用。
19.牛膝菊浸提液对作物青枯菌的平板抑菌作用：采用抑菌圈法，挑取供试烟草青枯菌菌株于nb培养基中，恒温振荡（28℃，180r/min）培养24h后，将细菌悬浮液与适温融化好的cpg固体培养基以1:100的比例混匀后倒板；分别吸取不同浸提时间的牛膝菊水浸提液或牛膝菊磷酸盐浸提液（5μl）于平板上，晾干后放入28℃培养箱中培养，每个处理重复3次。
20.如图2结果显示，浸提2 d获得的牛膝菊水浸提液和牛膝菊磷酸盐浸提液的抑菌效果均最好，两者抑菌圈半径分别为3.33mm和3.67mm（如图3）。
21.实施例3 牛膝菊浸提液对作物病原细菌的平板抑菌效果采用抑菌圈法测定牛膝菊浸提液（浓度为0.10g/ml、浸提2d获得）对烟草青枯菌
（ralstonia solanacearium）、番茄青枯菌（r. solanacearium）、甘薯青枯菌（r. solanacearium）、马铃薯青枯菌（r. solanacearium）、茄子青枯菌（r. solanacearium）、烟草空腔病菌(pectobacterium carotovorum)、烟草野火病菌（pseudomonas amygdali）、番茄细菌性斑点病菌（p. syringae）、菊苣假单胞菌（p. cichorii）、小白菜软腐菌(p. carotovorum)、辣椒疮痂病菌菌(xanthomonas euvesicatoria)等的抑菌效果，结果见表1。
22.表1牛膝菌浸提液对作物病原细菌的平板抑菌效果由表1结果显示，牛膝菊水浸提液及牛膝菊磷酸盐浸提液对不同作物青枯菌均具有一定抑制效果，但其对烟草空腔病菌、烟草野火病菌、番茄细菌性斑点病菌、菊苣假单胞菌、小白菜软腐菌、辣椒疮痂病菌等植物病原细菌没有抑菌作用，这证明牛膝菊浸提液对青枯病菌的抑制作用具有特异性，其中，牛膝菊磷酸盐浸提液的抑菌效果优于牛膝菊水浸提液。
23.实施例4 牛膝菊浸提液对烟草青枯病的防治效果选取长势一致、健康的烟苗，分别浇灌30ml浓度为0.10g/ml的牛膝菊浸提液（每个处理6株，每个处理重复3次），24h后灌根接种30ml od
600
=0.8烟草青枯菌悬浮液，以考察牛膝菊浸提液对烟草青枯病的防治效果（以中生菌素作为对照），结果见表2。
24.表2 牛膝菊浸提液对烟草青枯病的防治效果由表2结果可见，在接种后，牛膝菊水浸提液和牛膝菊磷酸盐浸提液对烟草青枯病
的防效均优于中生菌素的防效，且牛膝菊磷酸盐浸提液的防效优于牛膝菊水浸提液的防效。
25.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。