一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法与流程

一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法
【技术领域】
1.本发明涉及乙醇检测技术领域，具体涉及一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法。


背景技术：

2.乙醇在常温常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体，低毒性，纯液体不可直接饮用；具有特殊香味，并略带刺激；微甘，并伴有刺激的辛辣滋味。乙醇的用途很广，可用乙醇制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等，医疗上也常用体积分数为70-75％的乙醇作消毒剂等，乙醇在国防化工、医疗卫生、食品工业、工农业生产中都有广泛的应用。
3.青贮是在密封无氧的状态下，将可溶性碳水化合物发酵生成各种终产物，以此达到长期保存青绿饲料营养特性的一种方法。测量ph及发酵终产物(有机酸和醇类)是评价青贮发酵的基本方法。乳酸和乙酸是发酵过程中对主要的两种酸，含量较高。乳酸和挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)通常采用高效液相色谱和气相色谱法分析。乙醇是青贮中最常见的一种醇类物质，它可由多种微生物(异型发酵乳酸菌、肠杆菌和酵母)产生，通常在全株玉米青贮和豆科青贮中含量较低(0.5-1.5％)。摄入的乙醇在瘤胃中可被转化为乙酸或被瘤胃壁所吸收，从而转化为乳脂或用于新陈代谢和生长。青贮饲料若含有高浓度的乙醇(3-4％)，通常与酵母的大量繁殖密不可分，一些酵母可消耗乳酸，造成干物质的大量流失，引起青贮变质，甚至影响牛奶的风味。
4.目前已有相关的研究，例如中国专利申请号202111113291.1一种基于气相色谱法的测定酒类中乙醇含量的方法，包括试样前处理步骤和色谱检测步骤：其中，所述试样前处理步骤中内标物为叔戊醇；所述色谱检测步骤中仪器参考条件如下：进样口和检测器温度：250℃；载气流量：1.0ml/min；吹扫流量：3.0ml/min；分流比：1：99；尾吹流量：30ml/min；氢气流量：40ml/min；空气流量：400ml/min，该发明的检测方法基于gb5009.266-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》第三法，通过优化色谱条件和以叔戊醇作为内标物，加速标准使用溶液和样品溶液的溶解均匀性，缩短了样品处理时间，提高测量的准确度。
5.总的来说，目前乙醇的测定多用气相色谱法(gc)法，但现有方法测定的物系中乙醇含量较高，或者水含量较低。而青贮的发酵液中存在大量的水和酸，且乙醇含量较低，这些势必对乙醇的分离和测定造成很大的干扰。


技术实现要素：

6.针对现有技术中青贮的发酵液中存在大量的水和酸，且乙醇含量较低，对乙醇的分离和测定造成很大的干扰的问题，本发明提供了一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法，通过选择适宜的色谱条件，对样液稍加处理，选用合适内标物，成功的达到了快速、准确测定青贮饲料发酵液微量乙醇的目的。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法，包括如下步骤：
9.1)样品前处理：青贮饲料样品剪碎后，称取20g于500ml三角瓶中，加入200ml水，超声提取20min，在1000r/min转速下离心5min，得上清液，再将上清液抽真空过0.45μm微孔滤膜，滤液置冰箱冷藏备用；取滤液2ml于离心管中，在12000r/min转速下离心15min，得上清液，再将上清液抽真空过0.45μm微孔滤膜；处理好的样品取900μl于气相进样瓶中，加入100μl正丙醇，混匀，准备上机；
10.2)气相色谱条件：
11.仪器为agilent 7890a型气相色谱仪；色谱柱型号：hp-innowax毛细管气相色谱柱，规格：30m
×
0.25mm
×
25μm；型号：19091n-133；载气：氮气；fid检测器温度：200℃；进样口温度：180℃；程序升温：初始温度为40℃，持续6min后以3℃/min的速率升至55℃，持续2min后再以7℃/min的速率升至120℃，再持续2min；载气流速：1ml/min；氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min；分流比：5:1；进样量：1.0μl；
12.3)标准溶液的配制与曲线绘制：
13.乙醇储备液：准确称取乙醇32mg于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为3200μg/ml储备液，置冰箱冷藏保存；
14.乙醇标准溶液配制：取乙醇储备液5ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，然后倍比稀释，配制成浓度分别为1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125ug/ml的标准品；
15.内标正丙醇储备液：准确称取正丙醇2.0mg于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为200μg/ml的内标储备液，置冰箱冷藏保存；
16.内标法标准溶液配制：分别准确量取不同浓度的乙醇标准溶液各1ml于10ml容量瓶中，再分别加内标储备液1ml，用蒸馏水定容，得到一系列乙醇标准溶液160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ug/ml，其中内标正丙醇的浓度为20ug/ml；将配制好的标准溶液置冰箱冷藏保存待用；
17.按照色谱条件进行气相测定，用乙醇浓度为横坐标，乙醇与正丙醇峰面积比值为纵坐标建立气相色谱标准曲线；
18.4)进行精密度试验、稳定性试验、重复性试验和回收率试验。
19.本发明中：
20.步骤3)所述的氮气，纯度≥99.999％。
21.步骤4)所述的精密度试验，是在步骤2)的的色谱条件下，用20μg/ml乙醇标准溶液连续测定6次。
22.步骤4)所述的稳定性试验，是在步骤2)的的色谱条件下，用20μg/ml乙醇标准溶液放置0、2、4、8、16、24h测定6次。
23.步骤4)所述的重复性试验，是在步骤2)的的色谱条件下，用20μg/ml乙醇标准溶液做6个平行。
24.步骤4)所述的回收率试验，准备已知不同浓度的青贮发酵液样品6份，分别加入相同体积的乙醇标准储备液，按照步骤2)的色谱条件操作。
25.和现有技术相比，本发明具有如下优点：
26.1、本发明所述的一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法，采用毛细管气相色谱柱、fid检测器，选择沸点较低的正丙醇为内标物定量，使得检测时间缩短，在4min之前乙醇和正丙醇出峰，并且分离度良好；用氢火焰离子化检测器，排除了常规气体的干扰；使用内
标法定量可抵消分析过程中的部分误差，从而提高分析的准确度和精密度，而且样品前处理简单，不需要进行太多化学处理，省时、省力。
27.2、本发明所述的一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法，通过了大量的实验与论证，得出的结论为此方法简便易行，准确度和灵敏度高，能够检验出量限为0.1μg/ml的微量乙醇含量，成功的达到了快速、准确测定青贮饲料发酵液微量乙醇的目的，非常适合青贮饲料生产厂家及用户乙醇实验室的检测。
【附图说明】
28.图1是本发明实施例的样标气相色谱图；
29.图2是本发明实施例的标准曲线的图。
【具体实施方式】
30.以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
31.实施例：
32.一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法，包括如下步骤：
33.试验材料和方法
34.材料：无水乙醇、正丙醇均为色谱纯
35.1)样品前处理：
36.青贮饲料样品剪碎后，称取20g于500ml三角瓶中，加入200ml水，超声提取20min。在1000r/min转速下离心5min，得上清液，再将上清液抽真空过0.45μm微孔滤膜，滤液置冰箱冷藏备用。取滤液2ml于离心管中，在12000r/min转速下离心15min，得上清液，再将上清液抽真空过0.45μm微孔滤膜；
37.处理好的样品取900μl于气相进样瓶中，加入100μl正丙醇，混匀，准备上机；
38.2)气相色谱条件：
39.仪器为agilent 7890a型气相色谱仪；色谱柱型号：hp-innowax毛细管气相色谱柱(规格：30m
×
0.25mm
×
25μm；型号：19091n-133)；载气：氮气(纯度为99.999％)；fid检测器温度：200℃；进样口温度：180℃；程序升温：初始温度为40℃，持续6min后以3℃/min的速率升至55℃，持续2min后再以7℃/min的速率升至120℃，再持续2min；载气流速：1ml/min；氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min；分流比：5:1；进样量：1.0μl；
40.3)标准溶液的配制与曲线绘制：
41.乙醇储备液：准确称取乙醇32mg于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为3200μg/ml储备液，置冰箱冷藏保存；
42.乙醇标准溶液配制：取乙醇储备液5ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容。然后倍比稀释，配制成浓度分别为1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125ug/ml的标准品。
43.内标正丙醇储备液：准确称取正丙醇2.0mg于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为200μg/ml的内标储备液，置冰箱冷藏保存；
44.内标法标准溶液配制：分别准确量取不同浓度的乙醇标准溶液各1ml于10ml容量瓶中，再分别加内标储备液1ml，用蒸馏水定容，得到一系列乙醇标准溶液160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ug/ml，其中内标正丙醇的浓度为20ug/ml，将配制好的标准
溶液置冰箱冷藏保存待用；
45.按照上述色谱条件进行gc测定，用乙醇浓度为横坐标，乙醇与正丙醇峰面积比值为纵坐标建立气相色谱标准曲线。
46.试验结果：
47.1、样标色谱图
48.用此气相色谱法，乙醇和正丙醇分离度良好，正丙醇可以做内标物。乙醇保留时间为2.115min，正丙醇保留时间为3.081min。
49.图1是样标气相色谱图。
50.2、标准曲线
51.用乙醇浓度为横坐标，乙醇与正丙醇峰面积比值为纵坐标建立气相色谱标准曲线。得线性方程：y＝0.0388x-0.0246，相关系数：r2＝0.9999，以3倍信噪比确定乙醇的检出限为0.1μg/ml。
52.图2是标准曲线的图。
53.3、精密度试验
54.在确定的色谱条件下，用20μg/ml乙醇标准溶液连续测定6次，进行精密度考察。结果显示(表1)，精密度试验的乙醇浓度相对标准偏差(rsd)为0.54％，表明该方法具有很好的精密度。
55.表1：
56.序号123456平均值rsd/％乙醇浓度20.0619.8819.7819.7719.8519.9219.880.54
57.4、稳定性试验
58.在确定的色谱条件下，用20μg/ml乙醇标准溶液放置0、2、4、8、16、24h测定6次，进行稳定性考察。结果显示(表2)，乙醇浓度相对标准偏差(rsd)为0.57％，说明在24h内测定样品稳定性较好。
59.表2：
60.放置时间0h2h4h8h6h24h平均值rsd/％乙醇浓度19.8819.7819.9820.0219.9920.1219.960.57
61.5、重复性试验
62.在确定的色谱条件下，用20μg/ml乙醇标准溶液做6个平行，进行重复性试验。结果显示(表3)，乙醇浓度相对标准偏差(rsd)为0.63％，说明样品重复性良好。
63.表3：
64.序号123456平均值rsd/％乙醇浓度19.7219.7819.9320.0619.9719.8519.890.63
65.6、回收率试验
66.准备已知不同浓度的青贮发酵液样品6份，分别加入相同体积的乙醇标准储备液，按照上面的gc方法做加样回收率试验，结果显示(表4)该方法的回收率在96.37％～103.81％之间，rsd为2.64％。表明该气相色谱法乙醇回收率良好，能较好的测定乙醇的含量。
67.表4：
[0068][0069]
结论：
[0070]
本技术建立了气相色谱法测定青贮饲料中乙醇含量的方法，选定特定优化的气相色谱条件，以水为溶剂，以正丙醇为内标物，乙醇标准溶液浓度在0.3μg/ml～160μg/ml范围内呈良好的线性相关，线性方程：y＝0.0388x-0.0246，相关系数为0.9999，试验方法的精密度、稳定性、重复性良好，rsd分别为0.54％、0.57％、0.63％，检出限为0.1μg/ml；样品加标平均回收率为99.31％，rsd为2.64％，该方法操作简单、干扰少、准确度高、精密度好、回收率高，可用于青贮饲料中乙醇的测定。
[0071]
以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。