再生医疗凝胶材料的制作方法

1.本发明涉及一种再生医疗凝胶材料及用于制作该凝胶材料的试剂盒，所述再生医疗凝胶材料包含具有由亲水性聚合物成分的浓厚相和稀薄相两个区域构成的多孔体结构的高分子凝胶。


背景技术：

2.近年来，具有网格结构的高分子凝胶因其具有优异的保水能力及生物相容性等特性，不仅应用于人造组织及再生支架材料、密封、防粘连、药物递送、隐形眼镜等医疗目的，还有望用于传感器及表面涂层等各种用途(例如，非专利文献1)。特别是，在这些用途中，期待开发一种具有微米级大小的多孔体结构的高分子材料。
3.然而，一直以来，为了获得微米级的多孔体结构，需要使用通过光刻等对预先制成的凝胶或聚合物结构体进行微细加工等自上而下的方法，或者需要使用不溶于溶剂的聚合物原料来制作高分子材料。另一方面，在使用亲溶剂性聚合物原料的情况下，材料自身原本可溶于溶剂，或者只能制作纳米级的较小的多孔体结构的凝胶。另外，目前尚未报告将该多孔体结构的凝胶材料应用于活体组织再生及修复的示例。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1：sakai等，macromolecules，41，5379-5384，2008


技术实现要素：

7.技术问题
8.因而，本发明的课题在于，提供一种具有微米级多孔体结构的由亲溶剂性高分子构成的凝胶材料、以及提供一种能够适当地应用这种凝胶材料的新用途。
9.解决问题的手段
10.本发明人等为了解决所述课题进行了潜心探讨，结果发现，通过将亲水性的聚合物原料在特定条件下交联得到的高分子凝胶具有现有的高分子凝胶中不存在的特殊结构，即，如不良溶剂性的高分子中的相分离那样，形成由聚合物成分密集存在的浓厚区域和聚合物成分稀疏存在的稀薄区域构成的海绵样三维网格结构(微米级的多孔体结构)；以及，在骨等活体组织再生及修复中，通过将包含该高分子凝胶的凝胶材料应用于患处，能够促进活体组织再生及修复。基于这些见解，完成了本发明。
11.即，在一种方案中，本发明为：
12.《1》一种再生医疗凝胶材料，其包含亲水性的聚合物单元相互交联而成的高分子凝胶，其特征在于，所述高分子凝胶含有作为溶剂的水，并具有具备所述聚合物单元密集存在的第一区域及所述聚合物单元稀疏存在的第二区域的两个区域的三维网格结构，由所述第一区域构成的网格尺寸具有1～500μm的大小。
13.另外，作为本发明的再生医疗凝胶材料相关的优选方案，提供：
14.《2》根据上述《1》所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述再生医疗凝胶材料具有比凝胶化前的聚合物单元的透过率更低的透过率；
15.《3》根据上述《1》或《2》所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述再生医疗凝胶材料具有相对于凝胶化前的聚合物单元的渗透压在其1/5～1/2的范围的渗透压；
16.《4》根据上述《1》～《3》中任一项所述的再生医疗凝胶材料，其中，凝胶化起经过一定时间后的渗透压(π
os
)和弹性压(π
el
)具有π
el
》π
os
的关系；
17.《5》根据上述《1》～《4》中任一项所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述第一区域的高分子浓度为10～99重量百分比，所述第二区域的高分子浓度为0～1重量百分比；
18.《6》根据上述《1》～《5》中任一项所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述再生医疗凝胶材料的高分子含量为5重量百分比以下；
19.《7》根据上述《1》～《6》中任一项所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述聚合物单元为具有聚乙二醇骨架或聚乙烯骨架的聚合物；
20.《8》根据上述《1》～《7》中任一项所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述聚合物单元由侧链或末端具有一个以上亲核官能团的第一聚合物单元和侧链或末端具有一个以上亲电子官能团的第二聚合物单元构成；
21.《9》根据上述《8》所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述亲核官能团选自由硫醇基及氨基组成的组，所述亲电子官能团选自由马来酰亚胺基、n-羟基-琥珀酰亚胺(nhs)基、磺基琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、咪唑基、丙烯酰基、硝基苯基及-co2phno2组成的组；
22.《10》根据上述《1》～《9》中任一项所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述再生医疗凝胶材料用于组织再生；
23.《11》根据上述《10》所述的再生医疗凝胶材料，其中，所述组织为骨、软骨、皮肤或神经；以及
24.《12》一种治疗方法，其使用上述《1》～《11》中任一项所述的再生医疗凝胶材料。
25.在另外方案中，本发明还涉及一种用于制作上述再生医疗凝胶材料的试剂盒，其特征在于，
26.《13》一种试剂盒，用于制作再生医疗凝胶材料，其特征在于，收纳有以下的(a)和(b)两种溶液，而不使其相互混合，
27.(a)包含浓度小于重叠浓度且大于等于临界凝胶化浓度的亲水性的第一原料聚合物的水溶液；(b)包含浓度小于重叠浓度且大于等于临界凝胶化浓度的亲水性的第二原料聚合物的水溶液；上述(a)及/或(b)溶液中进一步包含分子内不具有能够与所述原料聚合物进行交联反应的官能团的非反应性聚合物，通过将上述(a)及(b)的溶液混合而得到的高分子凝胶由所述第一原料聚合物及所述第二原料聚合物相互交联而成，其中，所述高分子凝胶具有由第一区域和第二区域这两个区域构成的结构，第一区域中，来自原料聚合物的聚合物单元密集存在；第二区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元稀疏存在；以及
28.《14》一种试剂盒，用于制作再生医疗凝胶材料，其特征在于，收纳有以下的(a’)和(b’)两种溶液，而不使其相互混合，(a’)包含第一凝胶前体的水溶液，其中，所述第一凝胶前体通过使亲水性的原料聚合物在浓度小于重叠浓度且小于临界凝胶化浓度的条件下交联而获得，储能模量g’和损耗模量g”具有g’《g”的关系；(b’)包含第二凝胶前体的水溶液，其中，所述第二凝胶前体通过使亲水性的原料聚合物在浓度小于重叠浓度且小于临界凝胶
化浓度的条件下交联而获得，储能模量g’和损耗模量g”具有g’《g”的关系；上述(a’)及/或(b’)的溶液中进一步包含交联剂，通过将上述(a’)及(b’)的溶液混合而得到的高分子凝胶由上述第一原料聚合物及上述第二原料聚合物相互交联而成，其中，所述高分子凝胶具有由第一区域和第二区域这两个区域构成的结构，第一区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元密集存在；第二区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元稀疏存在。
29.作为本发明的试剂盒相关的优选方案，提供：
30.《15》根据上述《13》或《14》所述的试剂盒，其中，所述原料聚合物为具有聚乙二醇骨架或聚乙烯骨架的聚合物；
31.《16》根据上述《13》～《15》中任一项所述的试剂盒，其中，所述原料聚合物由侧链或末端具有一个以上亲核官能团的第一聚合物和侧链或末端具有一个以上亲电子官能团的第二聚合物构成；
32.《17》根据上述《16》所述的试剂盒，其中，所述亲核官能团选自由硫醇基及氨基组成的组，所述亲电子官能团选自由马来酰亚胺基、n-羟基-琥珀酰亚胺(nhs)基、磺基琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、咪唑基、丙烯酰基、硝基苯基及-co2phno2组成的组；
33.《18》根据上述《13》所述的试剂盒，其中，所述非反应性聚合物为不具有交联反应基的聚乙二醇或纤维素；
34.《19》根据上述《14》所述的试剂盒，其中，所述第一凝胶前体和所述第二凝胶前体均由侧链或末端具有一个以上亲核官能团的第一聚合物和侧链或末端具有一个以上亲电子官能团的第二聚合物构成，所述第一凝胶前体中第一聚合物的含量大于第二聚合物的含量，所述第二凝胶前体中第二聚合物的含量大于第一聚合物的含量；
35.《20》根据上述《14》所述的试剂盒，其中，所述凝胶前体具有10～1000nm的范围的直径；
36.《21》提供一种再生医疗凝胶材料的制作方法，其中，其使用上述《13》～《20》中任一项所述的试剂盒，在活体内制作再生医疗凝胶材料；以及
37.《22》一种上述《13》～《20》中任一项所述的试剂盒在治疗组织再生中的应用。
38.发明的效果
39.在骨等活体组织再生及修复中，通过将本发明的再生医疗凝胶材料用于患处，能够促进活体组织再生及修复。具体而言，如实施例所示，通过在骨缺损部填充本发明的再生医疗凝胶材料，能够获得使面部骨缺损部处的骨良好愈合及新生骨良好生长的效果。
40.另外，通过使用本发明的试剂盒，可以在活体内原位形成再生医疗凝胶材料，因此，能够将其用作可向活体内的封闭腔或半封闭腔注射的凝胶材料。
附图说明
41.图1为示出实施例2中制作的本发明的高分子凝胶的凝胶化反应的时间表的图表。
42.图2为示出本发明的凝胶化工序中透过率的变化的图表。
43.图3为示出未经过凝胶前体的比较例凝胶的透过率的变化的图表。
44.图4为示出本发明的高分子凝胶的溶胀度的时间变化的图表。
45.图5为示出本发明的高分子凝胶的渗透压(π
os
)的变化的图表。
46.图6为示出本发明的高分子凝胶(右)及比较例凝胶(左)的荧光显微镜图像。
47.图7中，图7a为制作骨缺损2、3、4周后高分子凝胶非充填(a～c)和高分子凝胶充填(d～f)的大鼠胫骨部位的显微ct图像。图7b为制作骨缺损4周后高分子凝胶非充填(g及h)和高分子凝胶充填(i及j)的大鼠胫骨部位的h.e.染色图像(黑条：5mm；g及h的图像中的虚线方框部位的放大图分别为i及j)。
48.图8为制作骨缺损2、4、8周后sham(ntc；negative control)、比较例凝胶充填(“tetra-peg gel”)及本发明的高分子凝胶充填(“tetra-peg sponge”)的显微ct图像。
49.图9为将本发明的高分子凝胶(“oligo-tetrapeg凝胶”及比较例凝胶(tetra-peg凝胶)植入大鼠皮下时的图像。
具体实施方式
50.下面，对本发明的实施方式进行说明。本发明的范围并不限于这些说明，除以下示例之外，还可以在不损害本发明的宗旨的范围内进行适当变更后实施。
51.1.本发明的再生医疗凝胶材料
52.本发明的再生医疗凝胶材料的特征在于，其包含具有微米级的海绵样多孔体结构的高分子凝胶。
53.在本说明书中，“再生医疗”广义上是指对因先天性、或者疾病及伤害、事故、衰老等因素导致缺损、损伤、功能降低的活体组织进行再生或者修复，以恢复其功能的治疗。因此，并不仅限于移植从自己或他人采集的成体干细胞或者ips细胞等多能干细胞、或从这些细胞获得的组织等的治疗(“狭义的再生医疗”)。
54.另外，在本说明书中，作为再生医疗对象的“组织”只要为需要该再生及修复的活体组织，则不受特别限定，可列举例如：骨、软骨、皮肤、神经、脏器等。
55.下面，对作为再生医疗凝胶材料的主要成分的高分子凝胶及其制造方法进行详细说明。
56.(1)高分子凝胶
57.本发明的再生医疗凝胶材料中所含的高分子凝胶即所谓的水凝胶，其由亲水性的聚合物单元相互交联而形成，并进行了凝胶化，且含有水作为溶剂，其特征在于，
58.i)具有具备所述聚合物单元密集存在的第一区域及所述聚合物单元稀疏存在的第二区域这两个区域的三维网格结构，
59.ii)由所述第一区域构成的网格尺寸具有1～500μm的大小。
60.即，本发明中的高分子凝胶虽然由亲溶剂性的聚合物单元形成，但如不良溶剂性的高分子在溶剂中相分离后的状态那样，凝胶中具有形成有聚合物成分密集存在的浓厚相(第一区域)和聚合物成分稀疏存在的稀薄相(第二区域)这两个聚合物浓度不同的区域的结构。并且，其特征还在于，该高分子凝胶通过该相分离形成了海绵样三维网格结构-多孔体结构(下面，有时将该结构称为“海绵样多孔体结构”。)，其网格尺寸是微米级的，远远大于现有的凝胶中得到的纳米级尺寸。在此，在区域中存在的聚合物单元的浓度(密度)大于第二区域中的密度这一相对含义上，第一区域被称为“浓厚相”。优选第一区域具有第二区域的约100倍左右的浓度(密度)。
61.在本说明书中，“凝胶”通常是指丧失了流动性的高粘度高分子分散体系，表示储能模量g’和损耗模量g”具有g’≥g”的关系的状态。
62.如上所述，本发明中的高分子凝胶的特征在于，其具有微米级多孔体结构。具体而言，由第一区域构成的网格尺寸可以为1～500μm的大小，优选为10～100μm。该网格尺寸表示由作为浓厚相的第一区域形成外周的网格单位(即孔)的长边的长度。或者，在该网格单位为大致圆形的情况下，也可以表示其直径的长度。该网格单位的内部存在作为稀薄相的第二区域及/或溶剂。
63.通常情况下，相对于包含溶剂的凝胶整体，作为浓厚相的第一区域具有10～99重量百分比的高分子浓度，作为稀薄相的第二区域具有0～1重量百分比的高分子浓度。优选地，第一区域具有40～80重量百分比的高分子浓度，第二区域具有0.01～0.1重量百分比的高分子浓度。
64.另外，本发明的高分子凝胶整体中，高分子含量为5重量百分比以下，优选为4重量百分比以下，更优选为1.5～3.0重量百分比。
65.如上所述，本发明的高分子凝胶中所含的溶剂可以使用水。在该情况下，含有该水的高分子凝胶形成水凝胶。
66.但是，有些情况下，也可以进一步包含乙醇等醇类、dmso等有机溶剂。
67.下面，对构成本发明的再生医疗凝胶材料中使用的高分子凝胶的聚合物单元及该高分子凝胶所显示的特有的物性进行说明。
68.1-a.聚合物单元
69.用于形成本发明的高分子凝胶的聚合物单元为亲溶剂性聚合物、即对于凝胶中所含的溶剂为可溶性的聚合物。即，在凝胶含有水作为溶剂的水凝胶中，该聚合物单元为亲水性聚合物。该聚合物单元只要为能够通过溶液中的凝胶化反应(交联反应等)形成凝胶的物质，则能够根据最终的凝胶的用途及形状等，使用该技术领域中公知的物质。更详细而言，优选在最终的凝胶中通过聚合物单元相互交联能够形成网格结构、特别是三维网格结构的聚合物单元。
70.用作该聚合物单元的亲水性聚合物可以优选为具有聚乙二醇骨架或聚乙烯骨架的聚合物。作为具有聚乙二醇骨架的聚合物的代表示例，可列举具有多个聚乙二醇骨架支链的聚合物种，特别优选具有四个聚乙二醇骨架支链的聚合物种。由该四支链型聚乙二醇骨架构成的凝胶通常作为tetra-peg凝胶被熟知，通过分别在末端具有活性酯结构等亲电子官能团和氨基等亲核性的官能团的两种四支链高分子之间的ab型交叉偶联反应构建网格结构的网络(matsunaga等，macromolecules，vol.42，no.4，pp.1344-1351，2009)。另外，tetra-peg凝胶可以通过各高分子溶液简单的二液混合简易原位制作，还可以通过调节制备凝胶时的ph及离子强度来控制凝胶化时间。并且，由于该凝胶以peg为主要成分，因此其生物相容性也很优异。
71.需要说明的是，只要为能够相互交联而进行凝胶化的物质即可，也可以使用聚乙二醇骨架以外的聚合物，例如，也可以使用甲基丙烯酸甲酯等具有聚乙烯骨架的聚合物。
72.为了在最终的凝胶中形成海绵样多孔体结构，所述聚合物单元使侧链或末端具有一个以上亲核官能团的第一聚合物单元和侧链或末端具有一个以上亲电子官能团的第二聚合物单元这两种聚合物种反应并交联的方法较为合适，但不限定于此。在此，亲核官能团和亲电子官能团合计优选为5以上。进一步优选这些官能团存在于末端。另外，组成中，第一聚合物单元的含量可以大于第二聚合物单元的含量，或第二聚合物单元的含量可以大于第
一聚合物单元的含量。如下所述，在优选方案中，通过这样的组成，在形成两种以上不同的凝胶前体之后，能够使该凝胶前体进一步交联，从而得到高分子凝胶。
73.作为聚合物单元中存在的亲核官能团，可列举：硫醇基(-sh)、氨基或等，本领域技术人员能够适当使用公知的亲核官能团。优选亲核官能团为-sh基。亲核官能团分别可以相同，也可以不同，优选相同。通过使官能团相同，与将会形成交联键的亲电子官能团的反应性变均匀，进而容易获得具有均匀立体结构的凝胶。
74.作为聚合物单元中存在的亲电子官能团，能够使用活性酯基。作为这样的活性酯基，可列举：马来酰亚胺基、n-羟基-琥珀酰亚胺(nhs)基、磺基琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、咪唑基、丙烯酰基、硝基苯基、-co2phno2(ph表示o-、m-或p-亚苯基)等，本领域技术人员能够适当使用其它公知的活性酯基。优选亲电子官能团为马来酰亚胺基。亲电子官能团分别可以相同，也可以不同，优选相同。通过使官能团相同，与将会形成交联键的亲核官能团的反应性变均匀，进而容易获得具有均匀立体结构的凝胶。
75.作为末端具有亲核官能团的聚合物单元的优选的非限制性具体示例，可列举例如：具有四个聚乙二醇骨架支链，并在末端具有硫醇基的下述式(i)表示的化合物。
76.化学式1
[0077][0078]n11
～n
14
分别可以相同或不同。n
11
～n
14
的值越接近，越能够形成均匀的立体结构，强度越高。因此，为了获得高强度的凝胶，优选n
11
～n
14
相同。若n
11
～n
14
的值过高，则凝胶的强度减弱，若n
11
～n
14
的值过低，则因化合物的空间位阻而难以形成凝胶。因此，n
11
～n
14
可列举25～250的整数值，优选35～180，进一步优选50～115，特别优选50～60。并且，其分子量可列举5
×
103～5
×
104da，优选7.5
×
103～3
×
104da，更优选1
×
104～2
×
104da。
[0079]
上述式(i)中，r
11
～r
14
是连接官能团和核部分的连接基部位。r
11
～r
14
分别可以相同，也可以不同，但为了制造具有均匀的立体结构的高强度凝胶，优选相同。r
11
～r
14
表示c
1-c7亚烷基、c
2-c7亚烯基、-nh-r
15-、-co-r
15-、-r
16-o-r
17-、-r
16-nh-r
17-、-r
16-co
2-r
17-、-r
16-co
2-nh-r
17-、-r
16-co-r
17-、r
16-nh-co-r
17-或-r
16-co-nh-r
17-。其中，r
15
表示c
1-c7亚烷基。r
16
表示c
1-c3亚烷基。r
17
表示c
1-c5亚烷基。
[0080]
在此，“c
1-c7亚烷基”表示任选具有支链的碳原子数1以上且7以下的亚烷基，表示直链c
1-c7亚烷基或具有一个或两个以上支链的c
2-c7亚烷基(包含支链在内的碳原子数为2以上且7以下)。c
1-c7亚烷基的示例为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基。c
1-c7亚烷基的示例可列举-ch
2-、-(ch2)
2-、-(ch2)
3-、-ch(ch3)-、-(ch2)
3-、-(ch(ch3))
2-、-(ch2)
2-ch(ch3)-、-(ch2)
3-ch(ch3)-、-(ch2)
2-ch(c2h5)-、-(ch2)
6-、-(ch2)
2-c(c2h5)
2-及-(ch2)3c(ch3)2ch
2-等。
[0081]“c
2-c7亚烯基”为链中具有一个或者两个以上双键的形状或支链状的碳原子数2～7的亚烯基，可列举例如：从所述亚烷基中除去相邻的碳原子的2～5个氢原子而成的具有双键的二价基团。
[0082]
另一方面，作为末端具有亲电子官能团的聚合物单元的优选非限制性具体示例，
可列举例如：具有四个聚乙二醇骨架支链，并在末端具有马来酰亚胺基的下述式(ii)表示的化合物。
[0083]
化学式2
[0084][0085]
上述式(ii)中，n
21
～n
24
分别可以相同或不同。n
21
～n
24
的值越接近，凝胶越能够形成均匀的立体结构，强度越高，越优选，因此优选它们相同。若n
21
～n
24
的值过高，则凝胶的强度减弱，若n
21
～n
24
的值过低，则因化合物的空间位阻而不易形成凝胶。因此，n
21
～n
24
可列举5～300的整数值，优选20～250，更优选30～180，进一步优选45～115，更进一步优选45～55。本发明的第二四支链化合物的分子量可列举5
×
103～5
×
104da，优选7.5
×
103～3
×
104da，更优选1
×
104～2
×
104da。
[0086]
上述式(ii)中，r
21
～r
24
是连接官能团和核部分的连接基部位。r
21
～r
24
分别可以相同，也可以不同，为了制造具有均匀立体结构的高强度凝胶，优选它们相同。式(ii)中，r
21
～r
24
分别相同或不同，其表示c
1-c7亚烷基、c
2-c7亚烯基、-nh-r
25-、-co-r
25-、-r
26-o-r
27-、-r
26-nh-r
27-、-r
26-co
2-r
27-、-r
26-co
2-nh-r
27-、-r
26-co-r
27-、-r
26-nh-co-r
27-、或-r
26-co-nh-r
27-。其中，r
25
表示c
1-c7亚烷基。r
26
表示c
1-c3亚烷基。r
27
表示c
1-c5亚烷基。
[0087]
在本说明书中，亚烷基及亚烯基可以具有一个以上任意的取代基。作为该取代基，可列举例如：烷氧基、卤素原子(可以为氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一种)、氨基、单或者二取代氨基、取代甲硅烷基、酰基、或芳基等，但不限定于此。在烷基具有两个以上取代基的情况下，它们可以相同，也可以不同。包括烷基部分在内的其它取代基(例如烷基氧基及芳烷基等)的烷基部分也相同。
[0088]
另外，在本说明书中，在将某一官能团定义为“可以具有取代基”的情况下，取代基的种类、取代位置及取代基的个数不受特别限定，在具有两个以上取代基的情况下，它们可以相同，也可以不同。作为取代基，可列举例如：烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、氧代基等，但不限定于此。这些取代基上可以进一步存在取代基。
[0089]
1-b.高分子凝胶的物性
[0090]
如上所述，本发明的再生医疗凝胶材料中使用的高分子凝胶在凝胶中具有由浓厚相(第一区域)和稀薄相(第二区域)形成的微米级的海绵样多孔体结构，通过该结构，其在各种物性方面具有特殊的性质。
[0091]
本发明的高分子凝胶具有比凝胶化前的聚合物单元的透过率更低的透过率。这是因为，在该高分子凝胶中，凝胶中具有浓厚相(第一区域)和稀薄相(第二区域)这两个聚合物浓度不同的区域，正如不良溶剂性的高分子在溶剂中相分离后的状态那样，因此，其不是完全透明的，而是呈现出白浊。优选该高分子凝胶具有90～96％范围的透过率。在该透过率
方面，其显示出与几乎透明的普通高分子凝胶完全不同的特性。
[0092]
本发明的高分子凝胶具有相对于凝胶化前的聚合物单元的渗透压在其1/5～1/2的范围的渗透压。另外，与由相同聚合物单元形成的单一相的高分子凝胶相比，其渗透压也较低。
[0093]
另外，本发明的高分子凝胶从凝胶化起经过一定时间后渗透压(π
os
)和弹性压(π
el
)具有π
el
》π
os
的关系。π
el
大于π
os
这一关系表示其为凝胶收缩的状态。而普通高分子凝胶通常具有π
el
《π
os
的关系，存在溶胀的倾向。
[0094]
可以理解，本发明的再生医疗凝胶材料中使用的高分子凝胶具有浓厚相和稀薄相这种两相分离的结构，因此，稀薄相的渗透压(π
os
)较普通单一相的高分子凝胶降低，另一方面，因弹性压的增加，导致凝胶产生收缩的倾向，但并不受理论约束。在以上方面，可以认为本发明的高分子凝胶具有与现有的高分子凝胶非常不同的特殊性质。
[0095]
并且，如上所述，在浓厚相和稀薄相中，聚合物单元的高分子密度不同，因此，本发明的高分子凝胶也可以在以上两个区域具有不同的含水率。具体而言，本发明的高分子凝胶中，所述第一区域(浓厚相)的含水率在10～99％的范围，所述第二区域(稀薄相)的含水率在99～100％的范围。
[0096]
本发明的高分子凝胶可以根据其用途加工成薄膜状等各种形状。这样的加工中能够使用该技术领域中熟知的任意方法。例如，在薄膜的情况下，能够通过例如在凝胶完全固化前的具有流动性的状态下，将其涂布在玻璃等平面基板上等方法来获得薄膜。
[0097]
(2)高分子凝胶的制造方法
[0098]
接着，对本发明的再生医疗凝胶材料中使用的高分子凝胶的制造方法(凝胶化工序)进行说明。本发明的高分子凝胶能够通过例如以下的第一种方案及第二方案中所示的工序来制造，但所有方案中，均能够通过将亲溶剂性的原料聚合物在浓度小于重叠浓度的条件下交联来制造。通过在该条件进行凝胶化工序，能够从由亲溶剂性的聚合物制造具有目前难以实现的微米级多孔体结构的高分子凝胶。
[0099]
2-a.高分子凝胶的制造方法的第一种方案
[0100]
在第一种方案中，本发明的高分子凝胶的制造方法的特征在于，包括下面的工序：
[0101]
a)使亲溶剂性的原料聚合物在浓度小于重叠浓度且小于临界凝胶化浓度的条件下交联，以形成凝胶前体；
[0102]
b)通过交联剂将所述凝胶前体相互交联，从而获得作为最终目标物的高分子凝胶。
[0103]
工序a)是使最终将构成高分子凝胶的原料聚合物(聚合物单元)在即将凝胶化的状态下进行反应，从而形成具有尚未形成凝胶的结构的、即溶胶状态的凝胶前体(聚合物簇)的工序。然后，在工序b)中，根据需要添加适当的交联剂，使以上凝胶前体相互进一步反应，并相互三维交联，从而获得作为最终生成物的高分子凝胶。在此，凝胶前体并不限定于如下所述那样组成相同的单一种类的情况，也可以使用具有不同组成的多种凝胶前体。如此一来，第一种方案的制造方法基于将凝胶前体用作所谓的最终凝胶的中间体的概念。
[0104]
工序a)中，使用使原料聚合物的初始浓度小于重叠浓度且小于临界凝胶化浓度的条件。通过使用该原料聚合物的初始浓度，能够形成尚未达到凝胶化的溶胶状态的凝胶前体、优选具有即将凝胶化的结构的凝胶前体。
[0105]
工序a)中，原料聚合物的初始浓度小于重叠浓度c
＊
，优选小于1/3c
＊
。在此，“重叠浓度”(也称为“聚合浓度”。)是指溶剂中的高分子在空间内相互开始接触的浓度，通常，重叠浓度c
＊
用下面的式子表示。
[0106]
数学式1
[0107]
c*＝3mw/(4π
·
α
·
na·rg3
)
[0108]
式中，mw为高分子的重均分子量；α为溶剂的比重；na为阿伏伽德罗常数；rg为高分子的惯性半径。
[0109]
重叠浓度c
＊
的计算方法可以参考例如polymer physics(m.rubinstein、r.colby著)。具体而言，例如，能够根据稀薄溶液的粘度测定，使用弗洛里-福克斯方程式求得。
[0110]
另外，工序a)中，原料聚合物的初始浓度被设为小于临界凝胶化浓度。在此，“临界凝胶化浓度”表示在通过原料聚合物交联构建三维结构凝胶的体系中，实现其凝胶化所需的原料聚合物的最低浓度，也称为最低凝胶化浓度。在本发明中，作为术语临界凝胶化浓度，例如，在使用两种以上原料聚合物的体系中，除原料整体的浓度尚未达到实现凝胶化的浓度的情况之外，还包括仅一种原料聚合物的浓度较低的情况，即通过使各原料聚合物的比率为非当量而使其不会产生凝胶化的情况。
[0111]
通常，临界凝胶化浓度(最低凝胶化浓度)依赖于所使用的原料聚合物的种类，该浓度是该技术领域中公知的，或者本领域技术人员容易通过实验而获知的。通常情况下，该浓度为0.5～5重量百分比，其下限为重叠浓度的1/5左右。
[0112]
作为将原料聚合物的初始浓度调节为小于临界凝胶化浓度的条件的方法，例如，在使用如上所述具有亲核官能团或亲电子官能团的两种聚合物单元的情况下，能够使用如下条件：当量包含两种聚合物单元，但整体浓度较低，不足以达到凝胶化；或者通过将一种聚合物单元的浓度设为低浓度、即通过使两者为非当量，使其不会产生凝胶化。
[0113]
通常情况下，工序a)能够通过将包含两种原料聚合物的溶液或者通过给与刺激来进行。另外，还能够利用自由基引发剂通过单体的自由基聚合来进行。各溶液的浓度、添加速度、混合速度、混合比例不受特别限定，本领域技术人员可以适当调节。另外还可知，即使在使用三种以上原料聚合物的情况下，同样能够制备包含对应的原料聚合物的溶液，并将这些溶液适当混合。包含原料聚合物的溶液的溶剂能够使用水、乙醇等醇类、dmso等。在该溶液为水溶液的情况下，能够使用磷酸缓冲液等合适的ph缓冲液。
[0114]
作为混合方式，能够使用例如国际公开wo2007/083522号公报中公开的二液混合注射器来进行混合。混合时二液的温度不受特别限定，只要能够分别溶解前体单元，并使每种液体为具有流动性的状态的温度即可。例如，作为混合时溶液的温度，可列举1℃～100℃的范围。二液的温度可以不同，但温度相同时，二液容易混合，故优选。
[0115]
工序a)中得到的该凝胶前体虽然具有前体单元无相互键合或交联而成的结构，但仍是在尚未达到凝胶化的条件下形成的。因此，该凝胶前体的储能模量g’和损耗模量g”具有g’《g”的关系。周知，通常，在凝胶化以前的聚合物中，损耗模量g”的值大于储能模量g’，然后，这些物性值的大小随着凝胶化而反转，g’变大。并且，g’＝g”时刻即为所谓的凝胶化点。因此，凝胶前体簇为g’《g”表示，其为溶胶状态，尚未达到凝胶化。优选地，在1hz的频率下，g’《g”《100g’。
[0116]
优选地，该凝胶前体的g”在1hz的频率下处于0.005～5pa的范围，更优选处于0.01
～1pa的范围，进一步优选处于0.01～0.5pa的范围。这些弹性模量能够使用流速计等公知的测定设备通过动态粘弹性测定等公知的方法来计算。
[0117]
本发明的凝胶前体优选具有10～1000nm的直径，更优选具有50～200nm的直径。另外，优选地，在其分布中，具有100nm左右直径的凝胶前体的存在比例最多。
[0118]
用于形成凝胶前体簇的原料聚合物是亲水性聚合物，即对于作为凝胶中所含的溶剂的水为可溶性的聚合物。其详细说明如上述本发明的高分子凝胶中的聚合物单元中所述。
[0119]
接着，工序b)中，使工序a)中得到的凝胶前体相互进一步反应，以使其相互三维交联，从而得到作为最终生成物的高分子凝胶。如上所述，凝胶前体形成为凝胶化点以前的状态，因此，各凝胶前体中用于交联的取代基以未反应状态残留。因而，能够使凝胶前体中的该取代基与其它凝胶前体的残留取代基进行反应并交联，从而形成最终的凝胶。
[0120]
工序b)中最终得到的高分子凝胶的特征在于，其具有由第一区域和第二区域这两个区域构成的结构，第一区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元密集存在；第二区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元稀疏存在。由此，如在本发明的高分子凝胶的说明中所述，能够由亲溶剂性的原料聚合物得到具有微米级多孔体结构的高分子凝胶。
[0121]
优选地，该工序b)中，能够添加用于使凝胶前体相互交联的交联剂或给与刺激。作为这样的交联剂，能够使用具有与原料聚合物中的交联基相同的取代基的物质，也可以将原料聚合物自身作为交联剂额外添加。例如，在工序a)中，在使具有亲核官能团或亲电子官能团的两种原料聚合物以非当量进行反应，得到凝胶前体的情况下，通过添加具有浓度较小的官能团的交联剂，能够使凝胶前体之间进一步交联。作为这样的交联剂，能够使用双(磺基琥珀酰亚胺)戊二酸酯(bs2g)及dl-二硫苏糖醇(dtt)、或者末端具有硫醇基的合成肽等。另外，作为用于交联的刺激，例如可以对诸如引发光二聚化之类的官能团(马来酰亚胺基等)照射紫外光。
[0122]
另外，在优选方案中，还可以在分子内不具有能够与凝胶前体进行交联反应的官能团的非反应性聚合物存在下进行工序b)。该非反应性聚合物适合用于获得浓厚相和稀薄相这样类似两相分离的三次元结构。作为这样的非反应性聚合物的示例，可列举基本骨架与原料聚合物相同，但侧链或末端不具有交联反应基的聚合物，例如不具有交联反应基的聚乙二醇。或者，也可以使用纤维素及改性纤维素等材料。
[0123]
工序b)的其它反应溶液条件等与工序a)相同。优选地，在工序b)中，能够用2小时以内的反应时间、优选1小时以内的反应时间得到最终凝胶。通常，在制作以低浓度包含高分子的凝胶的情况下，需要较长反应时间(根据体系而不同，例如，在高分子含量为1重量百分比以下的情况下，需要约8小时)，而在上述制造方法中，能够通过更加短的时间制作凝胶。
[0124]
2-b.高分子凝胶的制造方法的第二方案
[0125]
在第二方案中，本发明的高分子凝胶的制造方法的特征在于，其包括下面的工序：
[0126]
c)在规定浓度的非反应性聚合物存在下，使浓度小于重叠浓度且大于等于临界凝胶化浓度的亲溶剂性的原料聚合物相互交联，以得到所述高分子凝胶。
[0127]
即，在第二方案的制造方法中，通过向溶液中添加规定浓度的非反应性聚合物，能够由原料聚合物一步获得本发明的高分子凝胶，而无需如第一方案那样经过凝胶前体。在
该情况下，通过使用浓度小于重叠浓度的原料聚合物，也能够获得具有浓厚相和稀薄相两个区域，且具有微米级多孔体结构的高分子凝胶。
[0128]
在此，非反应性聚合物是指分子内不具有能够与原料聚合物进行交联反应的官能团的聚合物，可列举：基本骨架与原料聚合物相同，但侧链或末端不具有交联反应基的聚合物，例如不具有交联反应基的聚乙二醇。或者，也可以使用纤维素及改性纤维素等材料。非反应性聚合物的浓度优选为原料聚合物浓度的1/10～10的范围，更优选为1/5～2的范围。
[0129]
另外，第二方案的原料聚合物的初始浓度小于重叠浓度，这一点与第一方案相同。另一方面，在第二方案中，原料聚合物的初始浓度大于等于临界凝胶化浓度，并一步进行凝胶化，这些方面与第一方案不同。
[0130]
此外，反应溶液条件及混合方式等与第一方案相同。
[0131]
2.本发明的试剂盒
[0132]
在另一方案中，本发明涉及一种用于制作再生医疗凝胶材料的试剂盒。该试剂盒基于上述高分子凝胶的制造方法。
[0133]
具体而言，根据上述高分子凝胶的制造方法的方案，可列举下面所示的第一方案及第二方案的试剂盒(顺序虽然分前后，但这些试剂盒的优选方案分别与上述制造方法相关的第二方案及第一方案对应)。应理解，即使不使用这些试剂盒，也能够制作再生医疗凝胶材料中使用的高分子凝胶。
[0134]
在第一方案中，本发明的试剂盒的特征在于，其收纳有以下的(a)和(b)两种溶液，而不使其相互混合：
[0135]
(a)包含浓度小于重叠浓度且大于等于临界凝胶化浓度的亲水性的第一原料聚合物的水溶液；
[0136]
(b)包含浓度小于重叠浓度且大于等于临界凝胶化浓度的亲水性的第二原料聚合物的水溶液。
[0137]
此外，在该第一方案中，作为本发明的试剂盒，上述(a)及/或(b)的溶液中进一步包含分子内不具有能够与所述原料聚合物进行交联反应的官能团的非反应性聚合物。
[0138]
并且，如上所述，使用本发明的该试剂盒得到的高分子凝胶具有以下结构的特征。即，通过将上述(a)及(b)的溶液混合而得到的高分子凝胶是所述第一原料聚合物及所述第二原料聚合物相互交联而成的高分子凝胶，所述高分子凝胶具有由第一区域和第二区域这两个区域构成的结构，第一区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元密集存在；第二区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元稀疏存在。
[0139]
另外，在本发明的试剂盒的第二方案(与制造方法的第一方案对应)中，该试剂盒的特征在于，其收纳有以下(a’)和(b’)两种溶液，而不使其相互混合：
[0140]
(a’)包含第一凝胶前体的水溶液，其中，所述第一凝胶前体通过使亲水性的原料聚合物在浓度小于重叠浓度且小于临界凝胶化浓度的条件下交联而获得，储能模量g’和损耗模量g”具有g’《g”的关系；
[0141]
(b’)包含第二凝胶前体的水溶液，其中，所述第二凝胶前体通过使亲水性的原料聚合物在浓度小于重叠浓度且小于临界凝胶化浓度的条件下交联而获得的，储能模量g’和损耗模量g”具有g’《g”的关系。
[0142]
此外，在该第二方案中，作为本发明的试剂盒，在上述(a’)及/或(b’)的溶液中进
一步包含分子内不具有能够与所述原料聚合物进行交联反应的官能团的非反应性聚合物。
[0143]
另外，与上述第一对应相同地，使用本发明的该试剂盒得到的高分子凝胶具有以下的结构的特征。即，通过将上述(a’)及(b’)的溶液得到的高分子凝胶是上述第一原料聚合物及上述第二原料聚合物相互交联而成的高分子凝胶，所述高分子凝胶具有由第一区域和第二区域这两个区域构成的结构，第一区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元密集存在；第二区域中，来自所述原料聚合物的聚合物单元稀疏存在。
[0144]
本发明的试剂盒中使用的原料聚合物的优选方案与上述聚合物单元相同。例如，本发明的试剂盒的原料聚合物优选为具有聚乙二醇骨架或聚乙烯骨架的聚合物。同理，在本发明的试剂盒中，原料聚合物优选由侧链或末端具有一个以上亲核官能团的第一聚合物和侧链或末端具有一个以上亲电子官能团的第二聚合物构成。在此，亲核官能团及亲电子官能团的种类如上所述。
[0145]
在本发明的试剂盒的上述第二方案中，优选地，所述第一凝胶前体和所述第二凝胶前体均由侧链或末端具有一个以上亲核官能团的第一聚合物和侧链或末端具有一个以上亲电子官能团的第二聚合物构成，所述第一凝胶前体中第一聚合物的含量大于第二聚合物的含量，所述第二凝胶前体中第二聚合物的含量大于第一聚合物的含量。另外，上述凝胶前体优选具有10～1000nm的范围的直径，更优选具有50～200nm的直径。
[0146]
另外，本发明的试剂盒中所含的非反应性聚合物可以为例如不具有交联反应基的聚乙二醇或纤维素。
[0147]
本发明的试剂盒的溶液(a)、(b)、(a’)及(b’)可以包含磷酸缓冲液等合适的ph缓冲液等作为其它成分。
[0148]
3.本发明的治疗方法等
[0149]
如上所述，本发明的再生医疗凝胶材料能够用于再生医疗的用途，优选用于组织再生。因此，本发明也涉及一种使用该再生医疗凝胶材料的治疗方法(或者组织再生方法)。
[0150]
作为本发明的治疗方法(或者组织再生方法)的对象的“组织”，只要其为需要该再生及修复的活体组织，则不受特别限定，可列举例如：骨、软骨、皮肤、神经、脏器等。因此，本发明的治疗方法优选再生骨、软骨、皮肤或神经，更优选以骨为再生对象。
[0151]
在本发明的治疗方法(或者组织再生方法)中，具体而言，优选向需要再生或修复的患处给药、注入或涂布(下面称为“给药等”。)再生医疗凝胶材料，从而将该患处用该再生医疗凝胶材料覆盖。或者，也可以通过该再生医疗凝胶材料填充患处的空间(待再生及修复的部分)。例如，治疗骨及神经的损伤或断裂时，实施治疗以将该断裂或损伤部分等重新接合，并向重新接合后的患处施用再生医疗凝胶材料。另外，有时还包括通过该给药等在患处的周边区域创造存在再生医疗凝胶材料的环境的情况。
[0152]
在本发明的治疗方法(或者组织再生方法)中，施用再生医疗凝胶材料等时，能够在所需患处或其周边原位(活体内)制作再生医疗凝胶材料。在该情况下，优选使用上述本发明的试剂盒，基于上述高分子凝胶的制造方法，在患处或其周边将两种聚合物溶液(例如，(a)和(b)的溶液或(a’)和(b’)的溶液)混合。
[0153]
因此，本发明提供一种使用上述试剂盒在活体内制作再生医疗凝胶材料的方法。另外，从其它观点出发，本发明提供上述试剂盒在治疗组织再生中的应用。
[0154]
此外，在患处或其周边原位(活体内)制作再生医疗凝胶材料的情况下，凝胶化时
间能够优选1小时以内，更优选10分以内，进一步优选1分以内。如上所述，该凝胶化时间可以通过适当设置试剂盒中所含的聚合物溶液中的聚合物浓度及ph、离子强度来进行调节。
[0155]
实施例
[0156]
下面，通过实施例对本发明进行更详细说明，但本发明并不限定于此。在下面的实验中，使用日本电子公司的jnm-ecs400(400mhz)解析1h nmr光谱。使用氘代氯仿作为溶剂，使用四甲基硅烷作为内标。使用布鲁克道尔顿公司的质谱仪ultraflex iii的线性正离子模式确定分子量。需要说明的是，在下面的实施例中，使用了聚合物浓度的g/l的单位，相当于1g/l＝约0.1重量百分比。
[0157]
实施例1
[0158]
凝胶前体的合成[shpeg mapeg]
[0159]
使用末端具有-sh基的shpeg(四硫醇-聚乙二醇)及末端具有马来酰亚胺基的mapeg(四马来酰亚胺基-聚乙二醇)，如下合成凝胶化反应中作为前体的凝胶前体。原料聚合物shpeg及mapeg分别使用日油株式会社的市售品(分子量均为10000)。
[0160]
分别制备分别溶解有shpeg及mapeg的50mm柠檬酸-磷酸缓冲液水溶液(物质量比设为shpeg/mapeg＝1/1，整体的聚合物浓度设为20g/l)。用另外的容器将得到的两种溶液混合，通过自转/公转混合机脱泡及搅拌。然后，将混合液迅速转移至falcon管，为了防止干燥加盖，然后在室温下静置12小时。此时，制得包含两种凝胶前体的多个样本，shpeg：mapeg的摩尔比为0.78：0.22及0.22：0.78，其中，样本过剩包含两种凝胶前体中的任一种。
[0161]
使用流速计观测该反应工序中的储能模量g’和损耗模量g”的时间变化(25℃、1hz)。在反应终点，得到的凝胶前体具有g’《g”的关系，确认其为尚未形成凝胶的溶胶状态的聚合物簇。
[0162]
实施例2
[0163]
高分子凝胶的合成
[0164]
使用实施例1中合成的凝胶前体，如下合成高分子凝胶(oligo-tetrapeg凝胶)。
[0165]
将实施例1中得到的r＝0.78的凝胶前体溶液a及r＝0.22的凝胶前体溶液b用水稀释，以使其分别为10g/l(或20g/l)。计算溶液中的未反应的sh基量，并添加交联剂(bis-(sulfosuccinimidyl)glutarate(bs2g))，以使交联剂与sh基等量，通过自转/公转混合机进行脱泡及搅拌。然后，将混合液迅速转移至falcon管，为了防止干燥加盖，然后在室温下静置5小时。通过流速计进行观测(25℃、1hz)，在反应终点，具有g’》g”的关系，确认通过凝胶前体交联形成了高分子凝胶(图1)。
[0166]
实施例3
[0167]
高分子凝胶的透过率
[0168]
将实施例2的凝胶化工序中的透过率的变化示于图2。将凝胶前体的二液混合后，注入器皿内，由25℃、波长400nm时的吸光度的时间变化计算透过率。另外，图中，也一并示出了g’和g”的变化，g’＝g”的时刻为凝胶化点。
[0169]
另外，将作为比较例的、不经过凝胶前体而将60g/l的shpeg溶液及mapeg溶液的二液分别混合直接获得的单一相的高分子凝胶的透过率变化及g’和g”变化示于图3。
[0170]
比较图2和图3可知，在未经过凝胶前体的普通凝胶(图3)中，凝胶化前后，几乎未见透过率变化(t＝98％附近)，而在实施例2的高分子凝胶(图2)中，透过率t随着凝胶化从
约99％大幅度减少至约94％，从而产生白浊。这是因为，在本发明的高分子凝胶中，随着凝胶化，产生聚合物单元密集存在的浓厚相和聚合物单元稀疏存在的稀薄相这两个区域，从而产生相分离。
[0171]
实施例4
[0172]
高分子凝胶的溶胀试验
[0173]
对本发明的高分子凝胶(a、b)和比较例的凝胶(c)这三种凝胶进行溶胀试验。凝胶a及b按照实施例2合成。
[0174]
(a)oligo-tetra-peg凝胶(10g/l)：
[0175]
按照实施例2，以20g/l、r＝0.78；20g/l、r＝0.22制作两种凝胶前体。将各种凝胶前体溶液稀释至10g/l，将二液混合并凝胶化。
[0176]
(b)oligo-tetra-peg凝胶(20g/l)：
[0177]
按照实施例2，以20g/l、r＝0.78；20g/l、r＝0.22制作两种凝胶前体。将各种凝胶前体溶液直接混合并凝胶化。
[0178]
(c)tetra-peg凝胶(比较例)：
[0179]
将60g/l的shpeg溶液和mapeg溶液这二液混合并凝胶化。
[0180]
制作圆柱形的样本(高度7mm、直径15mm)，充分进行凝胶化反应后(1天)，浸入纯水中，在25℃下测定溶胀度的时间变化。将得到的结果示于图4。
[0181]
在未经过凝胶前体的普通凝胶c中，随时间经过，可见凝胶溶胀。而本发明的高分子凝胶示出具有较长缓冲的收缩这一特有性质。
[0182]
实施例5
[0183]
高分子凝胶的渗透压试验
[0184]
针对按照实施例2制作的本发明的高分子凝胶，测定渗透压(π
os
)和弹性压(π
el
)。作为比较例，对凝胶化前的原料聚合物及不经过凝胶前体的普通凝胶进行相同的测定。
[0185]
·
本发明的高分子凝胶：
[0186]
使用按照实施例2，在凝胶前体溶液的浓度为10g/l、12.5g/l、15g/l、17.5g/l、20g/l的多个条件所制作的凝胶。
[0187]
·
原料聚合物：
[0188]
使用10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l的各种mapeg溶液。
[0189]
·
比较例凝胶：
[0190]
使用将10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l的shpeg溶液和mapeg溶液的二液分别混合并凝胶化而成的凝胶。
[0191]
在透析膜中制作样本，对pvp溶液(29k、5g/l～120g/l)进行透析，根据初始状态求得未溶胀的pvp的浓度。此时，凝胶的溶胀压(π
os-π
el
)和pvp的渗透压(πpvp)均衡。另外，通过流速计测定弹性压(π
el
＝g’)，并使用下面的式子求得π
os
。
[0192]
数学式2
[0193]
π
os
＝π
pvp
π
el
[0194]
将各凝胶化浓度(c)下得到的渗透压(π
os
)的绘图示于图5。由该结果可知，在重合浓度(c
＊
)以下时，本发明的高分子凝胶相对于相同浓度的原料聚合物及比较例凝胶均具有
低渗透压。
[0195]
实施例6
[0196]
高分子凝胶的荧光显微镜图像
[0197]
使用双光子激光显微镜(zeiss)，观测本发明的凝胶(a)及比较例凝胶(b)的结构。
[0198]
(a)oligo-tetra-peg凝胶(10g/l)：
[0199]
按照实施例2，以20g/l、r＝0.78；20g/l、r＝0.22制作两种凝胶前体。将各种凝胶前体溶液稀释至10g/l，将二液混合并凝胶化。
[0200]
(b)tetra-peg凝胶(比较例)：
[0201]
将60g/l的shpeg溶液和mapeg溶液这二液混合并凝胶化。
[0202]
使用制备上述(a)及(b)的凝胶样品后在水中静置7天的凝胶。
[0203]
一次染色：浸入anti-peg溶液(0.04g/l)中，静置1小时，并清洗三次，每次15分。
[0204]
二次染色：浸入antibody-alexafloar488(0.04g/l)中，静置1小时，并清洗三次，每次15分。
[0205]
将得到的荧光显微镜图像示于图6。可知，比较例的tetra-peg凝胶(左图)为纳米级网格结构，而本发明的高分子凝胶(右图)具有微米级网格结构(多孔体结构)，远远大于从分子结构预测的结构。需要说明的是，该微米级网格结构的外周由聚合物密集存在的浓厚相形成，其内部为稀薄相或溶剂。
[0206]
实施例7
[0207]
高分子凝胶的细胞粘附性
[0208]
评价实施例2中制作的本发明的高分子凝胶对于细胞的粘附性。由其结果确认，与未经过凝胶前体的普通tetra-peg凝胶(比较例)相比，本发明的高分子凝胶能够高效地粘附atdc5(体细胞型万能细胞)。
[0209]
实施例8
[0210]
应用于骨再生
[0211]
(1)利用大鼠胫骨的骨缺损模型进行验证
[0212]
使用大鼠胫骨的骨缺损模型，验证本发明的具有海绵样多孔体结构的高分子凝胶对于骨再生的效果。在成体大鼠胫骨上形成9mm的骨缺损后，通过实施例2的方式，在骨缺损部位填充高分子凝胶(oligo-tetrapeg凝胶)。具体而言，将分别包含shpeg及mapeg的聚合物溶液注入骨缺损部位并混合，使其原位凝胶化。
[0213]
然后，缝合缺损部周围组织，经时观察骨缺损部的骨再生效果(图7)。由微型ct解析结果可知，骨缺损4周后，高分子凝胶非充填组(对照)的骨再生不完全，未见骨缺损部断端骨愈合(图7a的a～c)。另一方面，高分子凝胶充填组中，骨缺损制作2周时，可见骨缺损部断端骨愈合，4周后，大部分骨缺损部位被新生骨取代(图7a的d～f)。由制作骨缺损4周后的骨缺损部位的组织学解析结果可知，对照组中，骨缺损部位可见纤维细胞浸润，缺损的骨断端未愈合，骨再生不充分(图7b的g部分及h部分)。另一方面，高分子凝胶充填组中，缺损部位几乎被新生骨取代，可见骨断端愈合(图7b的i部分及j部分)。
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(2)利用小鼠颅骨的骨缺损模型进行验证
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接着，在成体小鼠颅骨上制作直径4mm的骨缺损后，如上述(1)那样，验证高分子凝胶(oligo-tetrapeg凝胶)的效果。在本解析中，制作骨缺损并将缺损部周围组织缝合1天
后，通过将分别包含shpeg及mapeg的聚合物溶液的二液混合，来将高分子凝胶充填至缺损部位。作为比较对象，除sham组(阴性对照；ntc)之外，还使用了比较例凝胶(实施例4的“c)tetra-peg凝胶”)。结果如图8所示，由微型ct解析的结果可知，sham组、比较例凝胶组中，骨缺损后12周时，几乎未见骨再生，而在本发明的oligo-tetrapeg凝胶组(图8中的“tetra-peg sponge”组)中，可见显著的骨再生效果。
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实施例9
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皮下应用
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针对本发明的凝胶(a)和比较例的凝胶(b)这两种凝胶，进行大鼠皮下植入试验。
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(a)oligo-tetrapeg凝胶:
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按照实施例2，以20g/l、r＝0.78；20g/l、r＝0.22制作两种凝胶前体。将各种凝胶前体溶液稀释至10g/l，将二液混合并凝胶化。
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(b)tetrapeg凝胶(比较例):
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将20g/l的shpeg溶液的mapeg溶液这二液混合并凝胶化。
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麻醉下剔除大鼠背部的毛，左右放入共计2处的切开线，在皮下制成口袋。右侧填充本发明的凝胶(a)，左侧填充比较例凝胶(b)。具体而言，向该部位注入分别包含shpeg及mapeg的聚合物溶液并混合，以原位使其凝胶化。
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然后，缝合创面的皮肤。处理2周后，处死大鼠，取出埋入物，通过肉眼进行评价(图9)。可知在本发明的凝胶(a)中，凝胶中形成软组织。另一方面，在比较例凝胶(b)中，未见新生组织形成。
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以上结果验证了，通过将本发明的包含具有海绵样多孔体结构的高分子凝胶的再生医疗凝胶材料应用于患处，能够促进活体组织再生及修复。