新型血管疾病治疗剂

1.本发明涉及一种含有西罗莫司作为有效成分的血管疾病的治疗剂。


背景技术：

2.血管疾病有时会引起各种严重的症状。特别是末梢血管中的血管疾病会呈现雷诺现象或坏死等，显著降低患者的qol(quality of life，生活质量)，不只是在末梢，在各组织中引起严重的症状的情况下有时会导致死亡。因此，对掌管全身的血管疾病的治疗是非常重要的。
3.以往，以雷诺现象为首的末梢血管疾病或血液循环障碍的大多数的起因被认为是细胞外基质的异常积累所导致的毛细血管脱落、低氧所导致的功能下降等。虽然对导致此原因有各种各样的假说，但直接原因尚为不明。被认为是环境因素、外部刺激或体内的免疫异常等某些理由成为导火线，在血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞引起异常，而且在过量产生的细胞外基质中胶原蛋白质的积累也被认为是血管壁增厚的一个原因(例如，非专利文献1)。
4.至今为止，血管疾病的治疗是进行以服用具有血管扩张作用的药剂为首的对症疗法，而没有进行从根本上去除疾患原因的处理(根治疗法)。至少，没有看到对血管中的细胞外基质积累直接作用的药剂。
5.以雷诺现象为首的末梢血管疾病有时会伴随硬皮病的发生，而在硬皮病治疗指南(日本皮肤科学会全身性硬皮病诊疗指南)中，作为伴随硬皮病的肺高血压症的基础疗法，记载有利用含有地高辛的毛地黄制剂的疗法。
6.现有技术文献
7.非专利文献
8.非专利文献1：armando gabrielli,et al.,n engl j med.2009；360(19)：1989-2003


技术实现要素：

9.发明要解决的问题
10.血管疾病的治疗中，虽说优选进行从根本上去除疾患原因的处理，但至今为止，还未公开可进行这种处理的药剂。另外，也未公开与伴随硬皮病发生的末梢血管疾病有关的药剂。本发明鉴于这样的状况，目的在于提供一种药剂，该药剂有效地治疗以细胞外基质异常积累、特别是以iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌为一个原因的末梢的血管疾病。
11.用于解决问题的手段
12.本发明人们经过研究的结果，首次发现在来自呈现血管疾病的患者ips细胞的血管内皮细胞中，主要高表达iv型胶原基因。iv型胶原蛋白质主要丰富存在于与血管内皮细胞邻接的基底膜，且由血管内皮细胞合成以及分泌。并且，发现通过使西罗莫司作用于血管内皮细胞，可有效抑制血管内皮细胞中的iv型胶原蛋白质的合成以及分泌，从而完成本发
明。
13.即，本发明是以下的[1]～[5]。
[0014]
[1]一种血管疾病的治疗剂，所述血管疾病是伴随iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌的血管疾病，其中，所述治疗剂含有西罗莫司作为有效成分。
[0015]
[2]一种疾患的治疗剂，所述疾患是因血管内皮细胞过量合成以及分泌iv型胶原蛋白质而引起的疾患，其中，所述治疗剂含有西罗莫司作为有效成分。
[0016]
[3]一种用于治疗血管疾病的医药组合物，所述血管疾病是伴随iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌的血管疾病，其中，所述医药组合物含有西罗莫司作为有效成分，且进一步含有药学上允许的载体。
[0017]
[4]一种用于治疗疾患的医药组合物，所述疾患是因血管内皮细胞过量合成以及分泌iv型胶原蛋白质而引起的疾患，其中，所述医药组合物含有西罗莫司作为有效成分，且进一步含有药学上允许的载体。
[0018]
[5]一种抑制剂，所述抑制剂是用于抑制血管内皮细胞过量合成以及分泌iv型胶原蛋白质的抑制剂，其中，所述抑制剂含有西罗莫司作为有效成分。
[0019]
发明效果
[0020]
根据本发明，能够抑制血管内皮细胞中的iv型胶原蛋白质的合成以及分泌，并能够有效地治疗伴随含有胶原的细胞外基质的过量积累而产生的末梢血管疾病等血管疾病。
附图说明
[0021]
图1是示出来自健康成人以及硬皮病患者的血管内皮细胞(病例1，2个细胞系)中iv型胶原基因的表达状况的确认结果的图。分别以col4a1表示iv型胶原α1基因、以col4a2表示iv型胶原α2基因、以col4a5表示iv型胶原α5基因、以col4a6表示iv型胶原α6基因。
[0022]
图2是示出培养基中由西罗莫司的有无导致的iv型胶原蛋白质量的不同的图。
[0023]
图3是示出培养基中由地高辛的有无导致的iv型胶原蛋白质量的不同的图。
具体实施方式
[0024]
本发明涉及如下：
[0025]
[1]一种伴随iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌的血管疾病的治疗剂，其中，所述治疗剂含有西罗莫司作为有效成分；
[0026]
[2]一种因iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌而引起的疾患的治疗剂，其中，所述治疗剂含有西罗莫司作为有效成分；
[0027]
[3]一种用于治疗伴随iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌的血管疾病的医药组合物，其中，所述医药组合物含有西罗莫司作为有效成分；
[0028]
[4]一种用于治疗因血管内皮细胞过量合成以及分泌iv型胶原蛋白质而引起的疾患的医药组合物，其中，所述医药组合物含有西罗莫司作为有效成分；以及
[0029]
[5]一种用于抑制血管内皮细胞过量合成以及分泌iv型胶原蛋白质的抑制剂，其中，所述抑制剂含有西罗莫司作为有效成分。
[0030]
西罗莫司(别名：雷帕霉素)是从复活节岛的土壤分离出来的放线菌streptomyces hygroscopicus(吸水链霉菌)的代谢产物，于1970年代作为大环内酯类抗生素被发现。之
后，发现西罗莫司具有免疫抑制作用，在世界55个国家作为抑制肾移植后的排斥反应的医药品被批准。
[0031]
本发明的伴随iv型胶原蛋白质的过量合成以及分泌的血管疾病的治疗剂，作为其治疗对象的血管疾病，典型地是末梢血管疾病，但不限于此。例如，像以硬皮病为原因发病的血管疾病这样，由于过量产生含有胶原的细胞外基质而引起的血管疾病等也可成为本发明的治疗剂的治疗对象。具体来说，可以举出硬皮病的典型症状之一的雷诺综合征、与之伴随的肺高血压症、间质性肺疾患、消化系统纤维化、肾脏纤维化、心脏纤维化、以及其他血管病变等。
[0032]
本发明的含有西罗莫司作为有效成分的因血管内皮细胞过量合成以及分泌iv型胶原蛋白质而引起的疾患的治疗剂中，疾患选自下述(1)～(3)。
[0033]
(1)因硬皮病而发病的末梢血管疾病
[0034]
(2)雷诺综合征
[0035]
(3)伴随雷诺综合征的以下疾患：肺高血压症、间质性肺疾患、消化系统纤维化、肾脏纤维化、心脏纤维化或其他血管病变。
[0036]
本发明的医药组合物，除了作为有效成分的西罗莫司以外，还含有药学上允许的载体，能够以口服剂或从外部直接涂敷于患处而使用的外用剂的形态来使用。特别是对于以全身性的疾患为原因发病的血管疾病的治疗对象(患者)，优选以口服剂的形态使用。该种医药组合物能够用以往公知的方法制造。
[0037]
本发明的口服剂，例如可以是片剂、口腔内崩解片剂、胶囊剂或颗粒剂。口服剂中，在不妨碍作为有效成分的西罗莫司的效果的范围内，含有常用的赋形剂、添加剂以及/或介质等药学上允许的载体。作为该种药学上允许的载体，例如，可以使用选自以下的载体，即，结合剂、崩解剂、润滑剂、增塑剂、表面活性剂、稳定剂、抗氧化剂、涂层剂、甜味料、着色剂以及芳香剂等。
[0038]
作为可使用的载体，具体来说，可以分别例举如下，即，作为结合剂，可例举出无水乳糖、乳糖水合物、结晶纤维素、甘露醇、聚乙二醇400(macrogol 400)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、甘油单油酸酯、硫酸钙等，作为结合剂，可例举出葡聚糖、低取代度羟丙基纤维素、玉米淀粉、部分α化淀粉、羧甲基纤维素钠以及羟丙基甲基纤维素等，作为崩解剂，可例举出羧甲淀粉钠等，作为润滑剂，可例举出硬脂酸镁、滑石、硬脂富马酸钠、硬脂酸、轻质无水硅酸、含水二氧化硅等，作为增塑剂，可例举出柠檬酸三乙酯、丙二醇等，作为表面活性剂，可例举出单硬脂酸甘油酯、硫酸月桂酯钠、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60等，作为稳定剂，可例举出黄原胶、聚乙烯吡咯烷酮、尿素等，作为抗氧化剂，可例举出对羟基苯甲酸丁酯、生育酚、维生素c等，作为涂层剂，可例举出尤特奇(eudragit)、巴西棕榈蜡、羟丙基甲基纤维素或其衍生物等，作为甜味料，可例举出木糖醇等，作为着色剂，可例举出氧化钛等，以及作为芳香剂，可例举出薄荷脑等。
[0039]
本发明的外用剂可以为软膏剂、乳霜剂、液体剂或凝胶剂等常用形态。该种外用剂能够为将有效成分的西罗莫司溶解或分散于适当的溶剂后，配合常用的赋形剂或添加剂等药学上允许的载体，如凝胶化剂、増粘剂、ph调节剂、稳定剂等而成。
[0040]
用法
·
用量
[0041]
本发明的治疗剂的一形态的口服剂可以与水一起服用等，以与通常的口服剂相同
的方法使用。用量是根据疾患对象的种类或者疾患的严重程度及治疗对象(患者)的状态，来酌情决定。通常对成人是每天口服服用1～4mg的西罗莫司。
[0042]
本发明的治疗剂的一形态的外用剂可以直接涂敷于患处，以与用于皮肤疾患等的通常的外用剂相同的方法使用。用量是根据疾患对象的种类或者疾患的严重程度及治疗对象(患者)的状态，来酌情决定。通常对成人可以将相当于每天0.1～2mg的量的西罗莫司直接涂敷于患处周围的皮肤来使用。
[0043]
实施例
[0044]
以下举出具体的实施方式来对本发明进行说明，但应该理解，本发明不限于该实施方式，本领域技术人员可以在不脱离附上的权利要求书所规定的本发明的范围或主旨的情况下，对本发明进行各种变更及改变。
[0045]
(实施例)
[0046]
(1)对来自患者ips细胞的血管内皮细胞的培养
[0047]
细胞使用已在日本熊本大学建立完成的来自健康成人以及硬皮病患者的ips细胞(zhongzhi wang,et al.,jds 2016nov；84(2):186-196.)。硬皮病已知其症状是引起末梢血管疾病之一的雷诺综合征，因此作为血管疾病模型细胞进行采用。
[0048]
对于来自健康成人以及硬皮病患者的ips细胞，通过在表1记载的条件下进行培养，由此进行了向血管内皮细胞的诱导分化。
[0049]
[表1]
[0050]
表1：血管内皮细胞诱导分化培养基的组成
[0051][0052]
所得细胞是使用流式细胞术，只将对作为血管内皮细胞标记的ve-cadherin(cd144)、pecam-1(cd31)阳性的细胞分离取出。从分离取出的细胞的形态与上述标记基因表达来确认分离取出的细胞是血管内皮细胞。
[0053]
将分离取出的来自健康成人以及硬皮病患者ips细胞的血管内皮细胞用表2下段所示的含有10％fbs的humediaeb-2 growth factor(生长因子)培养基(以下，简称有血清培养基)进行培养，并扩大至3次继代。使用相同培养基将培养的细胞以约1
×
10 5
个为单位接种至6孔板(well plate)(已涂层i型胶原)，在37℃、5％co2的培养箱培养1天。
[0054]
[表2]
[0055]
表2：血管内皮细胞培养用培养基的组成
[0056][0057]
确认细胞固定于板底部后，除去上清液的培养基，用pbs洗净板内的培养基。将全
体分为2组，对于rna回收用的细胞，使用有血清培养基，制备含有0.25％作为溶剂对照物质的dmso条件的培养基，或制备含有1μmol/l作为第一被测物质的西罗莫司、0.25％dmso条件的培养基。另外，对于回收细胞上清液中蛋白质用的细胞，使用表2上段的不含有fbs的humediaeb-2 growth factor培养基(以下，简称无血清培养基)，并与上述条件相同地进行培养基的制备。将制备的各培养基添加至移植了细胞的板中，在37℃、5％co2浓度的培养箱培养3天。
[0058]
(2)确认血管内皮细胞中的iv型胶原基因的表达
[0059]
使用在上述(1)所得的培养细胞中以有血清培养基培养的细胞，通过以下步骤，确认了来自健康成人以及硬皮病患者ips细胞的血管内皮细胞中iv型胶原基因的表达量。
[0060]
培养3天后，从板中去除上清液(培养基)，并使用pbs将板内洗浄。加入rna提取试剂(产品名：sepasol(r)-rnaisuperg，nacalai tesque制)，并回收细胞后，将细胞悬浊液移至容器。向其中加入三氯甲烷并搅拌，以4℃、12000rpm进行15分钟离心分离。之后，只将分离的三氯甲烷层分离取出至另一容器，并使用乙醇沉淀法纯化了rna。使用逆转录酶(产品名：superscript
tm iii reverse transcriptase，invitrogen tm
制)从纯化的rna合成cdna，并使用荧光试剂(产品名：thunderbird(r)sybr(r)qpcr mix，东洋纺制)，用qpcr法确认了iv型胶原基因的表达量。
[0061]
结果如图1所示。确认到在来自硬皮病患者的血管内皮细胞中，相较于来自健康成人的血管内皮细胞，其iv型胶原基因(特别是iv型胶原α5基因以及α6基因)的表达较多。如前所述，已知硬皮病患者中，作为其典型的症状之一，会引发末梢血管疾病之一的雷诺综合征。因此，该结果强力地启示了iv型胶原基因的高表达与血管壁增厚有关。
[0062]
(3)确认西罗莫司对血管内皮细胞中的iv型胶原蛋白质的合成以及分泌的影响
[0063]
使用上述(1)中以无血清培养基培养的细胞上清液，用下述方法对释放到培养基中的iv型胶原蛋白量进行定量。
[0064]
首先，进行对释放到培养基中的蛋白质的浓缩。考虑到血清中含有的蛋白质的影响，该操作需要在无血清下进行培养。只回收以3天、无血清培养基下培养的细胞的细胞上清液，之后向其中加入所回收的培养基的4倍量的冷却丙酮，并在-20℃下静置一晩。次日，以4℃、1000g进行10分钟离心分离后，除去上清液，向沉淀物加入75％乙醇并搅拌，再次进行相同条件的离心分离。除去乙醇后，使沉淀物干燥，用ripa缓冲液溶解，并使用蛋白质定量试剂(bradford protein assay，bio-rad制)将各样品调节为1mg/ml的蛋白质浓度。调节后，用95℃的加热块使蛋白质变性，并进行了western blotting(蛋白质印迹法)。将各样品注入凝胶(supersep
tm
ace 5-12％，富士胶片和光纯药制)，电泳后转印至膜(immobilon-p膜，merck制)上。第一抗体使用goatanti-typeivcollagen抗体(southernbiotech)，第二抗体使用hrp标记抗体(bio-rad制)。抗体反应后，使用hrp化学发光试剂(immobilon(r)蛋白质印迹法检测试剂，merck制)用鲁米诺化学发光成像仪(imagequantlas4000mini，ge healthcare japan制)对iv型胶原蛋白质进行了检测。
[0065]
结果如图2所示。如该图所示，含有第一被测物质(西罗莫司)的培养基中，相较于溶剂对照培养基，其iv型胶原蛋白质的量明显较少。此结果示出通过含有西罗莫司，抑制了血管内皮细胞内中的iv型胶原蛋白质的合成以及分泌。如上所述，硬皮病会因某些原因引起血管壁增厚，因此结合上述(2)所示的我们的实验结果，启示出在血管内皮细胞的iv型胶
原基因的高表达为该疾病的一个原因，而且示出由于西罗莫司具有减少iv型胶原蛋白质量的效果，因此本药剂作为雷诺综合征等因过量产生含有胶原的细胞外基质而造成的末梢血管疾病的治疗剂，有效地发挥作用。
[0066]
(比较例)
[0067]
代替在上述(1)中含有第一被测物质的培养基使用含有第二被测物质(地高辛)10nmol/l的培养基进行与实施例相同的操作，从而确认地高辛的存在对iv型胶原的表达的影响。
[0068]
结果如图3所示。如该图所示，含有地高辛的培养基中，培养基中的iv型胶原蛋白质量几乎没有减少，启示出地高辛对末梢血管疾病的治疗效果低。含有地高辛的毛地黄制剂作为伴随硬皮病的肺高血压症的基础疗法被记载于硬皮病治疗指南(日本皮肤科学会全身性硬皮病诊疗指南)中。另外，含有地高辛的强心苷的类似物质对纤维化疾患的效果被多个出版物等所报告。我们得到的结果示出，与这样的以往的见解相反，至少对于末梢血管疾病，并不能期待地高辛的效果，另一方面，在指南中既没有记载治疗效果也没有任何启示的西罗莫司，对于以过量产生含有iv型胶原的细胞外基质为起因的末梢血管疾病的治疗具有效果。