一种特定药脂比的药物组合物在抗肿瘤中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种特定药脂比的药物组合物在抗肿瘤中的应用。


背景技术：

2.脂质体给药系统技术作为药物载体的应用最早于1961年由alec bangham提出，目前技术已逐渐成熟。应用广泛的peg修饰的脂质体(隐形脂质体)具有长循环和epr(被动靶向)的作用，使药物在肿瘤组织中富集，发挥更大的作用。多柔比星脂质体是第一个在全球范围内上市的脂质体产品，我国也有多个多柔比星脂质体药品包括多美素，力葆素等，此外，还有紫杉醇脂质体、柔红霉素脂质体、长春新碱脂质体、伊立替康脂质体、米托蒽醌脂质体、柔红霉素和阿糖胞苷共载脂质体等多种抗肿瘤药物及其组合的脂质体已上市或接近上市。
3.在脂质体给药时，在这些载药脂质体的处方中，一个重要的参数是药物与脂质分子的摩尔比例，可以用质量比或摩尔比表示，简称药脂比。药脂比越大，每个脂质体中装载的药物越多，载药效率越高。药脂比由于药物分子量和物理化学性质的不同而不同，对于多柔比星脂质体，现有技术的摩尔药脂比在0.17，对于伊立替康脂质体，现有技术的摩尔药脂比在0.6之间，其他如长春新碱脂质体，其药脂比为0.2。对于含有两个甚至更多药物的脂质体，由于药物协同作用的有效浓度可以降低，如vyxeos，药脂比为0.12。一般认为，药脂比越高，药物输送的效率越高，药效越好。但是我们通过研究发现，载体脂质体的抗肿瘤活性，当药脂比超过一定数值后，反而会降低。因此本领域迫切需要通过优化载药脂质体的药脂比范围，使得脂质体运载的药物组合物具有更好的抗肿瘤活性，且毒性更低，达到最优的抗肿瘤效果。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种新的药脂比范围，使得在该范围内的脂质体运载的药物组合物具有有效的抗肿瘤活性。具体地，本发明提供了一种低于业内常见的载药脂质体药脂比范围，即摩尔比在0.01-0.15之间时，药脂比在该范围内的脂质体运载的药物组合物相比于现有技术具有更好的抑制肿瘤细胞的活性。
5.在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，包含a1)抗肿瘤药物；a2)作为载体的脂质体；其中抗肿瘤药物与脂质载体的摩尔比(药脂比)在0.01-0.15之间。
6.在另一优选例中，所述药脂比的范围0.02-0.1之间，优选地为0.022-0.085。
7.在另一优选例中，所述药物组合物中药物的包封率》90％。
8.在另一优选例中，所述药物组合物的粒径在60-180nm之间，优选地在80-120nm之间，更佳地为85nm。
9.在另一优选例中，所述抗肿瘤药物选自下组：蒽环类药物、铂类药物、氟尿嘧啶类药物、喜树碱类药物、紫杉类药物或其组合。
10.在另一优选例中，所述抗肿瘤药物为蒽环类药物，优选地为多柔比星
11.在另一优选例中，所述抗肿瘤药物为喜树碱类药物，优选地为伊立替康
12.在另一优选例中，所述抗肿瘤药物为铂类药物，优选地为顺铂
13.在另一优选例中，所述脂质载体选自下组的成分组成：磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，胆固醇，聚乙二醇甘油脂肪酸酯，聚乙二醇甘油磷酰乙醇胺。
14.在另一优选例中，所述脂质载体的结构为由脂质分子双分子膜包围的球体。
15.在另一优选例中，所述脂质载体上具有偶联的靶向基团。
16.在另一优选例中，所述靶向基团包括但不限于多肽、蛋白、抗体片段。
17.在另一优选例中，所述靶向基团选自下组：fab’片段、f(ab’)2片段、fab片段、单链fv片段(scfv)、单域抗体(sdab)、微抗体(minibody)、或其组合。
18.在本发明的第二方面，提供了一种第一方面所述的药物组合物的用途，用于制备b1)抑制肿瘤细胞增殖的抑制剂；b2)抗肿瘤的药物。
19.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为非口服的。
20.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。
21.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
22.在另一优选例中，所述注射剂选自：液体制剂、混悬液制剂、冻干粉针剂。
23.在另一优选例中，所述注射剂给药方式选自：静脉注射、皮下注射、原位注射。
24.在本发明的第三方面，提供了一种体外的抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：给所述细胞施用医学有效量的第一方面所述的药物组合物。
25.在另一优选例中，所述细胞是人的肿瘤细胞。
26.在另一优选例中，所述细胞是化疗耐药的人的肿瘤细胞
27.在另一优选例中，所述细胞选自：sk-br-3、bt-474、nci-n87、mda-mb-231、mda-mb-453、mcf-7、a2780、mgc-803、huvec、mcf-7/adr。
28.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
29.图1为多柔比星脂质体冷冻电镜图，(a)药脂比为0.17(高药脂比)的多柔比星脂质体；(b)药脂比为0.043(低药脂比)多柔比星脂质体。
30.图2高药脂比、低药脂比以及抗体靶向的低药脂比多柔比星脂质体针对不同细胞的药效研究(a)sk-br-3,(b)nci-n87,(c)bt474,(d)mda-mb-453,(e)mcf-7,(f)a2780，(g)mgc-803,(h)huvec,(i)mda-mb-231。
31.图3高药脂比、低药脂比以及抗体靶向的低药脂比多柔比星脂质体对阿霉素耐药乳腺癌细胞mcf-7/adr的抑制作用。
32.图4高、中、低药脂比的多柔比星脂质体注射后血药浓度曲线
33.图5高、中、低药脂比的多柔比星脂质体注射后血液中药物与脂质浓度比例的变
化。
34.图6高药脂比和低药脂比以及抗体靶向的低药脂比多柔比星脂质体在裸鼠bt474乳腺癌肿瘤模型中抑制肿瘤生长的作用。
35.图7高药脂比和低药脂比以及抗体靶向的低药脂比多柔比星脂质体给药后对裸鼠bt474乳腺癌肿瘤模型小鼠体重变化的影响。
36.图8抗体靶向低药脂比(0.043)多柔比星脂质体对her2/neu高表达的nci-n87胃癌肿瘤模型的药效作用
37.图9不同药脂比的抗体靶向伊立替康脂质体对nci-n87肿瘤细胞的药效作用。
具体实施方式
38.本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现抗肿瘤药物和脂质载体的组合物的药脂比在0.01-0.15之间时，虽然单位脂质浓度下的载药效率降低，但单位药物浓度的抗肿瘤效果更好，具有更高的体内外抗肿瘤效果，在此基础上，完成了本发明。
39.具体地，本发明提供了实施例制备并研究了多柔比星脂质体，伊立替康脂质体和顺铂脂质体。本发明的实施例表明，当多柔比星脂质体的药脂比在0.02-0.08的范围内时(现有技术的药脂比为0.17)，载药脂质体的药效大大提高，体内药代动力学数据显示低药脂比脂质体的循环半衰期延长，稳定性提高。体内抗肿瘤效果也较好。对于伊立替康脂质体，药脂比为0.075和0.015时的脂质体，均优于药脂比为0.3时的脂质体。特别是当脂质体表面连接了靶向肿瘤细胞相关抗原(taa)的多肽/蛋白/抗体分子后，具有主动靶向作用的低药脂比脂质体针对taa高、中、低表达的肿瘤细胞均有优异的效果，对化疗耐药的肿瘤细胞的抑制效果也很好。
40.术语
41.如本文所用，“本发明的药物组合物”指的是包含抗肿瘤药物以及脂质体的药物组合物，且该组合物的药脂比在0.01-0.15的范围内，优选的为0.02-0.1。
42.药物组合物以及实用方法
43.本发明提供了一种药物组合物，包含：a1)抗肿瘤药物；a2)作为载体的脂质体；其中抗肿瘤药物与脂质体载体的摩尔比(药脂比)在0.01-0.15之间。
44.本发明所述的药物组合物中的抗肿瘤药物选自下组：蒽环类药物、铂类药物、氟尿嘧啶类药物、喜树碱类药物、紫杉类药物或其组合。
45.本发明所述的药物组合物中的脂质分子为业内人士常用的磷脂和相关两亲性分子，选自磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，胆固醇，聚乙二醇甘油脂肪酸酯，聚乙二醇甘油磷酰乙醇胺。
46.在另一优选例中，所述脂质体的组成为脂质分子自组装形成的双分子膜包围的球体。
47.在另一优选例中，所述脂质体上具有偶联的靶向基团。
48.在另一优选例中，所述靶向基团包括但不限于多肽、蛋白、抗体片段。
49.在另一优选例中，所述靶向基团选自下组：fab’片段、f(ab’)2片段、fab片段、单链fv片段(scfv)、单域抗体(sdab)、微抗体(minibody)、或其组合。
50.如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性
(即抗肿瘤活性)的且可被人和/或动物所接受的量。
51.如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
52.本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。
53.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
54.在另一优选例中，所述注射剂选自：注射液、混悬液、冻干粉针剂。
55.在另一优选例中，所述注射剂给药方式选自：静脉注射、皮下注射、原位注射。
56.用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
57.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
58.典型地，当以口服方式给予本发明的药物组合物时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。
59.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
60.脂质体&药脂比
61.脂质体给药系统技术作为药物载体的应用最早于1961年由alec bangham提出。脂质体是一种球形小囊泡，其特征是脂质双分子层，由磷脂或与固醇类(如胆固醇)等两亲性分子构成，内部为水相。药物被装载在脂质体内或脂质膜中，改变药物的药代动力学和药效学。
62.在这些载药脂质体的处方中，一个重要的参数是药物与脂质分子的摩尔比(药脂比)，现有技术中的多柔比星脂质体包括doxil，多美素，力葆素的药脂比为0.17，的药脂比为0.27；另外伊立替康脂质体onivyde
tm
的药脂比为0.6。此外(cancer chemother pharmacol(2013)71:555
–
564)中公开的长春新碱脂质体的药脂比为0.2；(international journal of pharmaceutics 391(2010)248
–
259)中公开了vyxeos脂质体中的总药脂比为0.12，顺铂脂质体的药脂比为0.2。
63.(biochimica et biophysica acta 1758(2006)55
–
64)评价了不同药脂比的长春新碱脂质体制剂，发现长春新碱在体内从卵鞘磷脂/胆固醇脂质体释放半衰期t1/2随不同的药脂比而变化：药脂比(d/l)为0.025(wt/wt)时，半衰期为6.1h；药脂比(d/l)为0.1(wt/
wt)时，半衰期为15.6h；药脂比(d/l)为0.6(wt/wt)时，半衰期为117h。可见药脂比增加，半衰期增加。但在肿瘤小鼠中的药效结果却是，药脂比(d/l)为0.6(wt/wt)时的抗肿瘤效果低于药脂比(d/l)为0.1(wt/wt)的处方，与药脂比(d/l)为0.1(wt/wt)的处方类似，高于药脂比(d/l)为0.025(wt/wt)的处方。美国专利us5616341(high drug:lipid formulations of liposomal antineoplastic agents)公开了高药脂比多柔比星脂质体和长春新碱脂质体的制备和应用。
64.本发明的主要优点包括：
65.(a)本发明公开的低药脂比脂质体，针对肿瘤细胞的抗肿瘤活性高于现有技术中的高药脂比脂质体。
66.(b)在相同给药剂量下，低药脂比脂质体在体内的驻留时间延长，药物释放更慢。
67.(c)低药脂比脂质体的体内抗肿瘤效果有所提高。
68.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
69.实施例1制备实施例脂质体包裹的阿霉素(多柔比星)
70.称取900mg hspc，300mg chol以及60mg dspe-mpeg2000，加入2ml无水乙醇，水浴加热至60℃，加入磁力搅拌子，搅拌至完全溶解为透明状液体；同时称取3.304g硫酸铵于玻璃瓶中，加入100ml超纯水，搅拌溶解，调节ph至5.0，得到浓度为250mm硫酸铵溶液，现配现用；将溶解的脂质混合液，采用注射器注入至19ml硫酸铵水溶液中，搅拌挤出6次，然后采用10kd的透析膜在hepes缓冲液(10mm，ph为6.8)中透析，得到外水相为hepes溶液的空白脂质体。
71.另取10mg/ml阿霉素溶液，按照设定的药脂比加入上述空白脂质体混悬液，调节总体积均为10ml，60℃搅拌孵育30min，载药完成后使用100kd的透析膜去除游离的药物，分别检测阿霉素和hspc，胆固醇和dspe-mpeg2000的含量，确认得到的阿霉素脂质体的药物分子和总脂质分子的摩尔比。
72.采用nano-s90纳米粒度分析仪进行检测，不同药脂比多柔比星脂质体的粒径均为85nm左右；多分散性系数(polydispersity index，pdi)均小于0.1。其中药脂比为0.17的多柔比星脂质体制剂和药脂比为0.043的多柔比星脂质体的冷冻电镜形貌如图1a和图1b，脂质体多为圆形形态，大小分布均一。其中，0.043药脂比多柔比星脂质体中的多柔比星结晶比0.17药脂比多柔比星脂质体中的多柔比星结晶要纤细。
73.实施例2测试不同药脂比多柔比星脂质体的药效
74.在本实施例中，实施例1中制备的不同药脂比的多柔比星脂质体，针对肿瘤细胞的杀伤效果。
75.首先针对表1所列的肿瘤细胞株包括sk-br-3、nci-n87、bt474、mda-mb-453、mcf-7、mgc-803、a2780、mda-mb-231，和一个正常细胞系huvec，进行了药效研究。
76.表1细胞株
77.细胞株描述
sk-br-3人乳腺癌细胞系bt-474人乳腺癌细胞系nci-n87人胃癌细胞系mda-mb-231人三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-453人乳腺癌细胞系mcf-7人乳腺癌细胞系a2780人卵巢癌细胞系mgc-803人胃癌细胞系huvec正常人脐静脉内皮细胞mcf-7/adr人乳腺癌阿霉素耐药细胞株
78.采用promega公司的luminescent cell viability assay发光法细胞活力检测试剂盒，检测不同药脂比多柔比星脂质体对肿瘤细胞的杀伤作用，应用graph prism 8.0分析软件，拟合细胞杀伤毒性曲线，计算各个ic50值，结果见表2。
79.实验结果显示，药脂比为0.022，0.043，和0.085的多柔比星脂质体，相较于高药脂比(0.17)多柔比星脂质体具有更高的细胞杀伤活性。
80.表2不同药脂比的多柔比星脂质体的ic50
81.[0082][0083]
na：表示未检测。
[0084]
另外本发明从为了更详尽的验证不同药脂比的多柔比星脂质体对不同的细胞株的杀伤效果，本发明人设置了更多组不同的药脂比的实验组，并测试了其对不同细胞株的ic50值。
[0085]
测试结果如表3所示。
[0086]
表3不同药脂比的多柔比星脂质体的ic50
[0087][0088]
实施例3 her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体的制备和细胞药效学性能
[0089]
3.1 her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体的制备
[0090]
制备了her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体，脂质组成为氢化大豆磷脂(hspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇(dspe-mpeg2000)、her/neu抗体片段偶联脂质分子，其中各组分摩尔比范围为(30～80):(5～40):(0.1～10):(0.01～0.1)。其中所述her2/neu抗体片段偶联脂质分子为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000]-her2/neu抗体片段(her2-dspe-peg2000)。her2/neu抗体片段通过游离的巯基与含有马来酰亚胺基团的脂质分子dspe-peg2000-mal反应形成硫醚键进行连接，然后将her2-dspe-peg2000与实施例1中制备的0.043药脂比多柔比星脂质体共孵育，即可获得her2/neu抗体靶向的特定药脂比的载药脂质体。
[0091]
3.2 her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体在肿瘤细胞中的性能
[0092]
在本实施例中，实施例3.1中制备的her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体，针对不同her2/neu表达水平的肿瘤细胞的杀伤效果。
[0093]
肿瘤细胞株：肿瘤细胞系包括sk-br-3、nci-n87、bt474、mda-mb-453、mcf-7、mgc-803、a2780、mda-mb-231，以及一个正常细胞系huvec，各个细胞her2/neu表达水平具体见表4所示。
[0094]
表4不同细胞表面her2/neu表达水平
[0095][0096]
同样采用promega公司的luminescent cell viability assay发光法细胞活力检测试剂盒，检测her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体对肿瘤细胞的杀伤作用，设置trastuzumab单抗作为对照，同时比较非靶向的0.043和0.17药脂比多柔比知脂质体。应用graph prism 8.0分析软件，拟合细胞杀伤毒性曲线，计算各个ic50值，结果见表5。
[0097]
结果表明，her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体可进一步提高对肿瘤细胞的杀伤活性，且具有靶向her2/neu阳性肿瘤的作用。her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体在her2/neu高表达的肿瘤细胞的杀伤活性是0.043药脂比多柔比星脂质体的3-10倍，与0.17药脂比相比均大于10倍。
[0098]
表5 her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体在不同细胞中的ic50(ug/ml)
[0099]
[0100][0101]
3.3 her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体在阿霉素耐药肿瘤细胞株中的性能
[0102]
具体实施操作见3.2，为了考察her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体在阿霉素耐药肿瘤细胞株肿瘤细胞中的性能，采用mcf-7/adr阿霉素乳腺癌耐药株进行测试。细胞毒性结果显示her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体、0.043和0.17药脂比多柔比星脂质体、以及trastuzumab单抗在mcf-7/adr中的ic50值分别为13.70μg/ml、46.41μg/ml、101.30μg/ml(如图3)，表明her2/neu抗体靶向的多柔比星脂质体对阿霉素耐药细胞株仍具有很强的细胞毒性作用。因而，在临床上具有潜在的治疗阿霉素耐药肿瘤患者的药效。
[0103]
实施例4不同药脂比的多柔比星脂质体的药代动力学性能
[0104]
在荷瘤小鼠模型中研究了不同药脂比的多柔比星阿霉素脂质体的体内药代动力学特征，其中脂质体中加入了微量的氘代胆固醇分子标记，用于检测外源性脂质浓度的变化。
[0105]
bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建：购买4～5周龄、体重18g左右、spf级的雌性balb/c-nude裸鼠，于动物饲养间适应性饲养一周左右；bt474细胞生长至指数增长期，采用胰酶消化细胞，离心收集细胞，pbs缓冲液清洗2～3次，pbs缓冲液重悬细胞并计数，调节细胞密度为1*10^8个细胞/ml；提前从-20℃冰箱中拿出基质胶matrigel冰上融化，细胞悬液与基质胶matrigel按照1:1等体积混合；按照5*106～1*107个细胞量，1ml注射器吸取对应体积的细胞悬液，皮下接种于裸鼠右侧腋下部位，接种后按压针孔部位30s，防止细胞液漏出。接种后皮下可见一明显皮丘。定期观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长。
[0106]
给药：第一组按照小鼠体重尾静脉给予0.17药脂比(高药脂比)多柔比星脂质体，药物剂量为5mg/kg；第二组按照小鼠体重尾静脉给予0.085药脂比(中药脂比)多柔比星脂质体，药物剂量为5mg/kg；第三组按照小鼠体重尾静脉给予0.043药脂比(低药脂比)多柔比星脂质体，药物剂量为5mg/kg；
[0107]
采血：四组不同药脂比多柔比星脂质体组分别于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72小时采血，收集在edta抗凝管中，冰上放置，4摄氏度，3000rpm转速离心30min，小心吸取上层血浆至新的贴有标签的离心管中，并进行后续检测或者-80摄氏度冰箱保存。
[0108]
处理血浆样品：准确量取40μl血浆样品于离心管中；按照血浆与有机试剂1:4的比
例加入160μl乙腈-甲醇(1:1，v/v)，涡旋震荡1～2min，充分使血浆中的蛋白沉淀，1000
×
g转速4摄氏度离心10min；小心吸取上清至新的离心管中，注意此步骤一定要避免吸入蛋白层，在1000
×
g转速4摄氏度离心10min；0.22μm有机滤头过滤；取50ul于上样瓶中，上机检测。
[0109]
检测：高效液相色谱色谱条件(参照中国药典)：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的athena c18柱(4.6
×
150mm，5μm)；以十二烷基硫酸钠溶液(取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml，加水500ml使溶解)-乙腈-甲醇(500：500：60)为流动相；检测波长为254nm；检测流速为1.0ml/min；上样体积为10μl。
[0110]
分析：不同药脂比脂质体在大鼠中的血药浓度结果如图4所示，血液样品中药物浓度与氘代胆固醇浓度的比值变化如图5所示。血液中药物浓度与氘代胆固醇浓度的比值变化可以用来提示药物从脂质体中释放的过程，可以看到不同药脂比的脂质体，体内的释放过程不同。低药脂比脂质体的释放较慢。
[0111]
实施例5不同药脂比多柔比星脂质体的体内药效实验
[0112]
5.1.异种移植瘤(xenograft)模型构建
[0113]
bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建：购买4～5周龄、体重18g左右、spf级的雌性balb/c-nude裸鼠，于动物饲养间适应性饲养一周左右；bt474细胞生长至指数增长期，采用胰酶消化细胞，离心收集细胞，pbs缓冲液清洗2～3次，pbs缓冲液重悬细胞并计数，调节细胞密度为1*10^8个细胞/ml；提前从-20℃冰箱中拿出基质胶matrigel冰上融化，细胞悬液与基质胶matrigel按照1:1等体积混合；按照5*106～1*107个细胞量，1ml注射器吸取对应体积的细胞悬液，皮下接种于裸鼠右侧腋下部位，接种后按压针孔部位30s，防止细胞液漏出。接种后皮下可见一明显皮丘。定期观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长。
[0114]
5.2给药及药效评价：
[0115]
待肿瘤大小长至100～200mm3时，将小鼠随机进行分成三组，每组至少6只，三组分别为：对照组、0.17药脂比多柔比星脂质体组、0.043药脂比多柔比星脂质体组、以及her2/neu抗体靶向0.043药脂比多柔比星脂质体组。
[0116]
分组后对照组尾静脉给予空白脂质体，0.17药脂比多柔比星脂质体组根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的0.17药脂比多柔比星脂质体药物剂量；0.043药脂比多柔比星脂质体组同样根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的0.043药脂比多柔比星脂质体药物剂量；her2/neu抗体靶向0.043药脂比多柔比星脂质体组同样根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的her2/neu抗体靶向0.043药脂比多柔比星脂质体药物剂量。每周给药一次，共给药5次；隔天记录小鼠小鼠体重以及肿瘤生长曲线；给药结束后将小鼠安乐死处理。
[0117]
主要是检测受试药物对乳腺癌bt474小鼠移植瘤的生长抑制作用。
[0118]
肿瘤体积和荷瘤鼠体重测量：使用游标卡尺隔天测量，肿瘤体积计算公式为v＝0.5a
×
b2，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径。
[0119]
肿瘤生长抑制率tgi(％)＝[1-(d
i-d0)/(c
i-c0)]
×
100，其中d
i-d0》0。d0为给药组(drug)首次给药时的平均肿瘤体积，di为给药组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积；c0为对照组(control)首次给药时的平均肿瘤体积，ci为对照组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积。
[0120]
bt474乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤体内药效结果如图6和图7所示。如图6所示，0.17药脂比多柔比星脂质体、0.043药脂比多柔比星脂质体、以及her2/neu抗体靶向0.043药脂比多柔比星脂质体在给药后第18天抑制肿瘤生长率(tgi％)分别为50.55％、60.12％、69.66％，结果显示0.043药脂比多柔比星脂质体具有更强的抑制肿瘤生长能力，her2/neu抗体靶向0.043药脂比多柔比星脂质体更进一步提高抑制肿瘤生长能力。如图7所示，balb/c-nude裸鼠在给药后小鼠体重下降，但是没表现出显著毒性(体重降低《10％)，且在给药结束小鼠体重恢复正常。
[0121]
实施例6：her2/neu抗体靶向低药脂比多柔比星脂质体动物体内药效实验
[0122]
6.1.nci-n87乳腺癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤(xenograft)模型构建
[0123]
选用细胞表面her2高表达的nci-n87胃癌细胞株构建balb/c-nude裸鼠异种移植瘤模型。
[0124]
购买4～5周龄、体重18g左右、spf级的雌性balb/c-nude裸鼠，于动物饲养间适应性饲养一周左右；nci-n87细胞生长至指数增长期，采用胰酶消化细胞，离心收集细胞，pbs缓冲液清洗2～3次，pbs缓冲液重悬细胞并计数，调节细胞密度为2*10^8个细胞/ml；提前从-20℃冰箱中拿出基质胶matrigel冰上融化，细胞悬液与基质胶matrigel按照1:1等体积混合；按照1*10^7个细胞量，1ml注射器吸取对应体积的细胞悬液，皮下接种于裸鼠右侧腋下部位，接种后按压针孔部位30s，防止细胞液漏出。接种后皮下可见一明显皮丘。定期观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长。
[0125]
6.2.给药及药效评价
[0126]
待肿瘤大小长至100～200mm3时，将小鼠随机进行分成三组，每组至少6只，三组分别为：对照组、0.17药脂比多柔比星脂质体组和her2/neu抗体靶向0.043多柔比星脂质体组
[0127]
分组后对照组尾静脉给予空白脂质体，0.17药脂比多柔比星脂质体组根据裸鼠体重尾静脉给予2mg/kg的0.17药脂比多柔比星脂质体药物剂量，her2/neu抗体靶向0.043多柔比星脂质体组同样根据裸鼠体重尾静脉给予0.5、2、5、10mg/kg的her2/neu抗体靶向0.043多柔比星脂质体药物剂量，同时设置trastuzumab单抗为对照，给予5mg/kg，每周给药一次，共给药5次，；隔天记录小鼠小鼠体重以及肿瘤生长曲线；给药结束后将小鼠安乐死处理。
[0128]
主要是检测受试药物对胃癌nci-n87小鼠移植瘤的生长抑制作用或完全治愈能力。
[0129]
(1)肿瘤体积测量：使用游标卡尺隔天测量，肿瘤体积计算公式为v＝0.5a
×
b2，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径。
[0130]
(2)肿瘤生长抑制率tgi(％)＝[1-(d
i-d0)/(c
i-c0)]
×
100，其中d
i-d0》0。d0为给药组(drug)首次给药时的平均肿瘤体积，di为给药组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积；c0为对照组(control)首次给药时的平均肿瘤体积，ci为对照组开始给药后某一次测量时的平均肿瘤体积。
[0131]
(3)所有荷瘤鼠体重隔天测量。同时计算给药后小鼠体重增长变化比率：rcbw(％)＝(bwi–
bw0)/bw0×
100，bwi为开始给药后某一次测量时的平均体重，bw0为首次给药时的平均体重。
[0132]
nci-n87胃癌balb/c-nude裸鼠异种移植瘤体内药效结果如图8和图9所示，肿瘤生
长曲线(图8)表明抗体靶向低药脂比(0.043)的多柔比星脂质体在体内对her2/neu高表达的nci-n87胃癌肿瘤模型生长具有更佳的抑制肿瘤生长效果，且具有剂量依赖关系。
[0133]
实施例7不同药脂比的伊立替康脂质体的制备
[0134]
精密称量hspc、chol、dspe-mpeg2000，加入玻璃平底瓶中，加入适量的无水乙醇，水浴加热充分溶解脂质。加入30ml，500mm 1,3
‑‑
丙二磺酸三乙胺作为水合介质，65℃搅拌水合45min。依次通过l00nm和80nm的聚碳酸酯滤膜挤出，形成均匀的小单室脂质体。
[0135]
以10mm，ph7.0的hepes缓冲液为透析介质，形成脂质体内外水相的丙二磺酸三乙胺梯度。配置浓度为10mg/ml的伊立替康溶液，按照药脂比为0.01、0.02、0.04、0.075、0.15、0.3进行载药，60℃水浴加热孵育45min。后以10mm，ph7.0的hepes缓冲液为透析介质，除去外水相中的游离药物，得到0.01、0.02、0.04、0.075、0.15、0.3不同特定药脂比伊立替康脂质体。
[0136]
其中0.075，0.15和0.3药脂比的伊立替康脂质体的的物理学参数如表6所示，粒径相近，pdi分布均小于0.1，包封率均大于95％以上。
[0137]
表6不同药脂比的伊立替康脂质体的物理学参数
[0138]
药脂比平均粒径(nm)pdi包封率(％)0.075820.0798.50.15820.0799.50.3830.06998.9
[0139]
采用实施例2的方法测试不同药脂比的伊立替康脂质体对于不同细胞模型的细胞毒性，得到的结果如表7所示。结果显示，0.15药脂比的伊立替康脂质体的细胞杀伤毒性最佳。
[0140]
表7不同药脂比的伊立替康脂质体对于nci-n87细胞模型的ic50
[0141][0142]
实施例8：不同药脂比抗体靶向伊立替康脂质体的细胞毒性实验
[0143]
本实施例采用nci-n87肿瘤细胞系，购自中国科学院细胞库。制备了不同药脂比的抗体靶向的伊立替康脂质体，评价了其对nci-n87的细胞杀伤作用。检测方法与实施例2一致，即采用发光法检测细胞活性。结果如图9所示，0.15药脂比的抗体靶向伊立替康脂质体对nci-n87细胞的杀伤毒性较优。
[0144]
实施例10不同药脂比的顺铂脂质体的制备以及测试
[0145]
精密称量hspc、chol、dspe-mpeg2000，加入玻璃平底瓶中，加入适量的无水乙醇，水浴加热充分溶解脂质。以30ml/min的速率注入到50摄氏度并以480ml/min流速注入1mg/ml，2mg/ml，5mg/ml的顺铂水溶液，混合溶液过l00nm和80nm的聚碳酸酯滤膜挤出，透析去除未包封药物，获得粒径为80nm，药脂比为0.01，0.05，0.08的顺铂脂质体。
[0146]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。