大分子非特异性清除测定的制作方法

大分子非特异性清除测定
1.本文报道了一种使用新的基于人原代细胞的体外测定来估计人体内治疗性蛋白质的清除的新方法。这种大分子非特异性清除测定(luca)提供了基于体外的方法来评估和预测针对治疗性蛋白质的主要pk特性。


背景技术：

2.g类人免疫球蛋白(igg)包含传递对靶抗原的特异性的两个抗原结合(fab)区以及负责与fc受体相互作用的恒定区(fc区)(参见例如edelman,g.m.,scand.j.immunol.34(1991)1-22；reff,m.e.and heard,c.,crit.rev.oncol.hematol.40(2001)25-35)。igg1、igg2和igg4亚类的人igg的平均血清半衰期为21天，其比任何其他已知血清蛋白的血清半衰期都长(参见例如waldmann,t.a.and strober,w.,prog.allergy 13(1969)1-110)。这种长半衰期主要由fc区和新生儿fc受体(fcrn)之间的相互作用介导(参见例如ghetie,v.and ward,e.s.,annu.rev.immunol.18(2000)739-766；chaudhury,c.,et al.,j.exp.med.197(2003)315-322。)。这就是为什么将igg或含fc的融合蛋白用作一类广泛的治疗剂的原因之一。
3.新生儿fc受体fcrn是膜相关的受体，该受体参与igg和白蛋白稳态、母体igg跨胎盘转运和抗原igg免疫复合物吞噬作用(参见例如brambell,f.w.,et al.,nature 203(1964)1352-1354；ropeenian,d.c.,et al.,j.immunol.170(2003)3528-3533)。人fcrn是由糖基化的i类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-fcrn)和β2微球蛋白(β2m)亚基组成的异二聚体(参见例如kuo,t.t.,et al.,j.clin.immunol.30(2010)777-789)。fcrn与fc区的ch2-ch3区中的位点结合(参见例如ropeenian,d.c.and akilesh,s.,nat.rev.immunol.7(2007)715-725；martin,w.l.,et al.,mol.cell 7(2001)867-877；goebl,n.a.,et al.,mol.biol.cell 19(2008)5490-5505；kim,j.k.,et al.,eur.j.immunol.24(1994)542-548。)，并且两个fcrn分子可以同时与fc区结合(参见例如sanchez,l.m.,et al.,biochemistry 38(1999)9471-9476；huber,a.h.,et al.,j.mol.biol.230(1993)1077-1083。)。fcrn和fc区之间的亲和力是ph依赖性的，在内体ph为5-6时显示纳摩尔级的亲和力，而在生理ph为7.4时显示相当弱的结合(参见例如goebl,n.a.,et al.,mol.biol.cell 19(2008)5490-5505；ober,r.j.,et al.,proc.natl.acad.sci.usa 101(2004)11076-11081；ober,r.j.,et al.,j.immunol.172(2004)2021-2029)。可以通过三个基本步骤来解释将长半衰期传递给igg的潜在机制。首先，igg经受多种细胞类型的非特异性胞饮作用(参见例如akilesh,s.,et al.,j.immunol.179(2007)4580-4588；montoyo,h.p.,et al.,proc.natl.acad.sci.usa 106(2009)2788-2793。)。其次，igg在ph为5-6时在酸性内体中遇到并结合fcrn，从而保护igg免于溶酶体降解(参见例如ropeenian,d.c.and akilesh,s.,nat.rev.immunol.7(2007)715-725；rodewald,r.,j.cell biol.71(1976)666-669)。最后，在生理ph为7.4时，在细胞外空间中释放igg(参见例如ghetie,v.and ward,e.s.,annu.rev.immunol.18(2000)739-766)。这种严格的ph依赖性结合和释放机制对于igg再循环至关重要，并且在不同ph值下的结合特性的任何偏差都可能强烈影响igg的循环半衰期
(参见例如vaccaro,c.,et al.,nat.biotechnol.23(2005)1283-1288)。
4.eigenmann,m.j.等人概述了抗体的细胞摄取被认为主要发生在内皮细胞和造血细胞中。一旦抗体被吸收到内体中，就可以通过与新生儿fc受体(fcrn)结合来保护它们免于降解。新生儿fc受体以ph依赖性方式结合抗体，内体中ph为6时的亲和力高于血浆中生理ph为》7.4时的亲和力。因此，在内体中与fcrn结合的抗体在中性ph下释放到血浆中，从而允许抗体再循环而不是溶酶体降解(mabs 9(2017)1007-1015)。
5.grevys,a.等人报道了一种基于人内皮细胞的再循环测定，用于筛选靶向fcrn的分子(nat.commun.9(2018)621)。nath,n.等人报道了使用ph传感器荧光染料的基于均质板的抗体内化测定(j.immunol.meth.431(2016)11-21)。
6.在wo 2013/134686中提供了荧光传感器试剂及其使用和制造方法。特别地，提供了在改变周围环境的ph时(例如，在从一种ph环境移动到另一种ph环境时)表现出可检测的荧光(例如，荧光强度)变化的传感器试剂。
7.基于患者中的治疗性抗体的非特异性清除的主要生物学因素，即经由胞饮作用和fcrn介导的再循环的非特异性摄取，需要用于预测体内清除(即半衰期)的体外方法。


技术实现要素：

8.本文报道了一种用于通过胞饮作用和溶酶体降解确定治疗性蛋白质，尤其是抗体的非特异性清除的水平的方法。
9.本发明至少部分基于以下发现：在体外将抗体摄入原代人内皮细胞可用作评估体内，特别是小鼠、食蟹猴和人体内的所述抗体的非特异性清除的替代物。
10.本发明至少部分基于以下发现：仅原代人内皮细胞可以用于根据体外实验确定体内清除率，因为非原代内皮细胞不显示相同的相关性，因此，不适用于此目的。使用所述非原代内皮细胞，无法实现不同抗体之间的分化。
11.本发明至少部分基于以下发现：通过胞饮作用摄取抗体且将其运送至原代内皮细胞的溶酶体区室的贡献最大并显示出与原代内皮细胞的荧光的良好相关性.
12.因此，本发明包括用于确定或估计抗体的非特异性(即非靶标介导的)清除(率)的方法，该方法包括以下步骤：
13.a)将缀合至ph敏感性荧光染料的抗体与原代人内皮细胞一起孵育(在规定的时间内)，以及
14.b)确定步骤a)中获得的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度(在规定的孵育时间之后)，
15.其中通过在步骤b)中确定的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度相对于背景水平(即未与抗体一起孵育的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光)的增加，确定存在抗体的非特异性清除(即指示抗体的非特异性清除)。
16.在某些实施例中，该方法进一步包括以下步骤：
[0017]-在与抗体一起孵育/未与抗体一起孵育之前，确定原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度，
[0018]
以及
[0019]
通过在步骤b)中确定的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度相对于针对不存
在抗体的原代人内皮细胞确定的(细胞内的)荧光强度的增加，确定存在抗体的非特异性清除(即指示抗体的非特异性清除)。
[0020]
此外，本发明包括用于从众多抗体中选择一种或多种具有低相对非特异性(非靶标介导的)清除(率)的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
[0021]
a)将多种抗体中的每种抗体与原代人内皮细胞分别孵育相同的定义的时间，并且在其后，确定原代人内皮细胞的(细胞内)荧光强度(变化)(即确定荧光强度的变化)，其中每种抗体缀合至相同的ph敏感性荧光染料；
[0022]
b)从众多抗体中选择一种或多种抗体，该一种或多种抗体在孵育后使得原代人内皮细胞的最低(细胞内的)荧光强度(变化)，
[0023]
从而选择具有低相对非特异性(非靶标介导的)清除(率)的一种或多种抗体。
[0024]
此外，本发明包括用于基于众多抗体的非特异性(非靶标介导的)清除(率)对众多抗体进行排序的方法，其包括以下步骤：
[0025]
a)将众多抗体中的每种抗体与原代人内皮细胞分别孵育相同的定义的时间，并且在其后，确定原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度(变化)，其中每种抗体缀合至相同的ph敏感性荧光染料；
[0026]
b)基于从低到高或从高到低的(细胞内的)荧光强度(变化)对抗体进行排序，
[0027]
从而基于抗体的非特异性(非靶标介导的)清除(率)对抗体进行排序。
[0028]
此外，本发明包括用于估计或确定抗体在人或食蟹猴或小鼠中的(相对)体内清除率的方法，其包括以下步骤：
[0029]
a)将缀合至ph敏感性荧光染料的抗体与原代人内皮细胞一起孵育规定的时间，并且在其后，确定原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度(变化)；
[0030]
b)将至少第一参考抗体与原代人内皮细胞一起孵育与a)中的相同的定义的时间，对于所述至少第一参考抗体，人或食蟹猴或鼠清除率是已知的，并且所述至少第一参考抗体缀合至(在与a)中相同的一个优选的实施例中)ph敏感性荧光染料，并且在其后，确定原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度(变化)，
[0031]
其中抗体在人或食蟹猴或小鼠中的(相对)体内清除率被估计或确定为第一参考抗体在人或食蟹猴或小鼠中的清除率乘以a)中确定的荧光强度(变化)与b)中确定的(细胞内的)荧光强度(变化)的比率。
[0032]
在某些实施例中，步骤b)是
[0033]
b)i)将众多参考抗体(即，至少两个)中的每个成员与原代人内皮细胞(分别)孵育与a)中相同的定义的时间，对于所述参考抗体，人或食蟹猴或鼠清除率是已知的，并且所述参考抗体缀合至(在与a)中相同的一个优选的实施例中)ph敏感性荧光染料，
[0034]
ii)在其后，针对参考抗体中的每一种确定原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度(变化)，和
[0035]
iii)针对在ii)中获得的值，计算公式y＝a*x b的最佳拟合直线，其中y是以ml/day/kg为单位的清除率，且x对应于荧光强度(变化)。
[0036]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，(细胞内的)荧光强度(变化)是几何平均(细胞内的)荧光强度(变化)。
[0037]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，所讨论的相应抗体的(细胞内的)荧光强
度(变化)是在另外的步骤c)中获得的相对归一化(细胞内的)荧光强度(变化)率，该另外的步骤包括：
[0038]
1)针对所讨论的抗体和至少两种参考抗体，确定在两个或更多个规定的孵育时间后的(几何平均)(细胞内的)荧光强度，其中在优选的实施例中，所述确定至少针对在2小时和4小时的孵育时间后的两个时间点；
[0039]
2)从1)中针对所讨论的抗体和参考抗体中的每一种确定的(几何平均)(细胞内的)荧光强度中的每个荧光强度分别减去原代人内皮细胞(孵育相同时间但不存在抗体的情况下)的(几何平均)(细胞内的)荧光强度，从而获得校正的(几何平均)(细胞内的)荧光强度；
[0040]
3)将在2)中获得的所讨论的抗体和参考抗体的校正的(几何平均)(细胞内的)荧光强度除以相应抗体中存在的荧光染料分子的数量，以获得(例如至少两种参考抗体或所讨论的抗体的)归一化的(几何平均)(细胞内的)荧光强度；
[0041]
4)基于由如3)中所计算的针对(即每个个体的)抗体的至少两个不同孵育时间的归一化的(几何平均)(细胞内的)荧光强度组成且包括原点的值的组，针对所讨论的抗体和参考抗体中的每一种确定最佳拟合直线(即线性回归曲线y＝s*x b，其中y＝归一化(几何平均值)(细胞内的)荧光强度，s＝斜率，x＝时间和b＝y轴交叉点)的斜率；
[0042]
5)将所讨论的抗体的最佳拟合直线的斜率归一化如下：
[0043][0044]
在所有方面和实施例的一个实施例中，在测定(细胞内的)荧光之前洗涤孵育的原代人内皮细胞(以去除非特异性/外细胞表面结合的和未结合的抗体)。
[0045]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，染料在为约7的生理ph与在ph 4至5范围内的酸性ph之间具有约10倍、优选约25倍和最优选约50倍的荧光强度变化。在某些实施例中，染料具有式i/是式i的phab。
[0046][0047]
与抗体或接头的缀合(如果存在)位于式i的残基r处。
[0048]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，染料在fc区中的氨基酸残基297(根据kabat编号)处缀合至抗体。
[0049]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，染料通过点击化学缀合至抗体。
[0050]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，染料直接或经由接头缀合至抗体。在某
些实施例中，接头是式ii的磺基dbco-peg4-胺。
[0051][0052]
与抗体的缀合是在式ii的游离氨基处。
[0053]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，染料缀合至接头并且接头缀合至抗体并且该缀合物具有式iii的结构。
[0054][0055]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，染料通过化学交联缀合至抗体。
[0056]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，荧光是借助facs通过确定荧光最大值的移位来确定的。
[0057]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，荧光是通过facs确定的几何平均荧光强度。
[0058]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，原代人内皮细胞是原代人肝内皮细胞。
[0059]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，确定在至少0.5小时的孵育之后进行，即规定的时间是至少0.5小时。
[0060]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，确定在持续最长达24小时的孵育之后进行，即规定的时间最长达24小时。在某些实施例中，确定在持续最长达16小时的孵育之后进行。在一个优选的实施例中，确定在最长达4小时的孵育之后进行，即规定的时间最长达4小时。在某些实施例中，确定在持续2小时或/和4小时的孵育之后进行，即规定的时间是2小时或/和4小时。在某些实施例中，确定在持续4至24小时的孵育之后进行，即规定的时间在4小时至24小时之间并包括4小时至24小时。在某些实施例中，确定在持续4小时或/和8小时的孵育之后进行，即规定的时间是4小时或/和8小时。
[0061]
在某些实施例中，确定直接在孵育之后进行。
[0062]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，抗体具有人源的fc区。在某些实施例中，fc区属于人igg1或igg2或igg4亚类。在某些实施例中，fc区包含一种或多种影响与人fcrn结合的突变。
[0063]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，抗体是具有另外的多肽的抗体的融合。在某些实施例中，另外的多肽是scfv、fab、scfab或非抗体多肽。在某些实施例中，融合位于抗体的重链之一的c端。
[0064]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，抗体是双特异性抗体。
[0065]
在所有方面和各实施例的一个实施例中，第一参考抗体是具有突变m252y/s254t/t256e的莫维珠单抗，和/或以tcb形式的双特异性抗体。
附图说明
[0066]
图1在与人微血管内皮细胞一起孵育期间，已用相同的ph敏感性荧光染料标记的不同抗体的荧光强度的时程；1＝抗人磷酸化tau 422抗体；2＝抗cd44抗体；3＝奥拉木单抗；4＝抗cd20抗体(1)；5＝阿维单抗；6＝抗人α-突触核蛋白抗体；7＝抗cd20抗体(2)。
[0067]
图2在与人原代肝内皮细胞一起孵育期间，已用相同的ph敏感性荧光染料标记的不同抗体的荧光强度的时程；1＝抗人磷酸化tau 422抗体；2＝抗cd44抗体；3＝奥拉木单抗；4＝抗cd20抗体(1)；5＝阿维单抗；6＝抗人α-突触核蛋白抗体；7＝抗cd20抗体(2)。
[0068]
图3在根据本发明的方法中使用的荧光标记抗体的方案；phab染料经由磺基dbco-peg4-amine接头缀合至抗体。
[0069]
图4根据本发明的方法的方案。
[0070]
图5使用facs获取的内化抗体的校正平均荧光强度(mfi，更具体地说是几何平均值)是通过减去阴性对照，然后用染料抗体比率(dar)归一化(除法)获得的。将来自每种抗体的校正和归一化的几何平均值绘制为线性回归曲线，并提取斜率(针对120和240分钟的几何平均mfi/分钟)。选择了两种标准抗体来归一化斜率：莫维珠单抗-yte设置为0，tcb设置为1。最终斜率是针对体内人清除值绘制的。如果获得不同的清除值，则使用描述分子非特异性清除的剂量线性清除。
[0071]
图6使用facs获取的内化抗体的校正平均荧光强度(mfi，更具体地说是几何平均值)是通过减去阴性对照，然后用染料抗体比率(dar)归一化(除法)获得的。将来自每种抗体的校正和归一化的几何平均值绘制为线性回归曲线，并提取斜率(针对120和240分钟的几何平均mfi/分钟)。选择了两种标准抗体来归一化斜率：莫维珠单抗-yte设置为0，tcb设置为1。针对体内食蟹猴清除值绘制最终斜率。如果获得不同的清除值，则使用描述分子非特异性清除的剂量线性清除。
[0072]
图7使用facs获取的内化抗体的校正平均荧光强度(mfi，更具体地说是几何平均值)是通过减去阴性对照，然后用染料抗体比率(dar)归一化(除法)获得的。将来自每种抗体的校正和归一化的几何平均值绘制为线性回归曲线，并提取斜率(针对120和240分钟的几何平均mfi/分钟)。选择了两种标准抗体来归一化斜率：莫维珠单抗-yte设置为0，tcb设置为1。针对体内hfcrn tg32 / 小鼠清除值绘制最终斜率。
[0073]
图8igg的fc变体显示出与wt fc igg相同的体外-体内相关性。
[0074]
图9与单特异性二价抗体一起孵育的原代人内皮细胞的平均荧光强度的时程。
[0075]
图10原代人肝源性内皮细胞的流式细胞术分析。内皮细胞与抗体一起孵育，事先用phab胺反应性染料(532nm)标记：低清除抗体莫维珠单抗-yte(实线)，两种中等清除双特异性抗体(分别为点划线和虚线)，以及高清除双特异性抗体(点划线)。4小时后，记录荧光强度并对细胞进行单线态、形态和活力门控；
[0076]
y轴缩放是相对于事件的数量，
[0077]
x轴缩放显示pe通道中的强度。
具体实施方式
[0078]
本发明至少部分基于以下发现：使用原代人内皮细胞的基于细胞的测定可用于体外估计治疗性抗体的体内溶酶体降解率。
[0079]
通过使用人原代细胞，本技术的发明人已发现根据本发明的方法的读出与人体内的非特异性清除的显著相关性。针对超过20种处于临床试验阶段或已上市的治疗性抗体，已经证明了这一点。本技术的发明人进一步发现，根据本发明的方法同样适用于反映野生型人抗体的y形的常规双特异性抗体、单克隆抗体，以及适用于具有与野生型不同的形式和多于两个价及抗体fc区融合体的非常规双特异性抗体型人抗体。这为根据本发明的方法的读出与小鼠、食蟹猴以及人类清除率的相关性的一般适用性提供了证据。
[0080]
根据本发明的方法可用于估计不同抗体分子(形式、价和特异性不同)的药代动力学(pk)特性。
[0081]
因此，根据本发明的方法可用于
[0082]-支持选择关于pk(药代动力学)特性(分别为清除率和半衰期)的合适的临床先导分子；
[0083]-从文库中取消选择具有不适合治疗应用的pk特性的抗体，即分别具有高清除率或体内半衰期短的抗体；
[0084]-根据pk特性(分别为清除率和半衰期)对一组抗体的成员进行排序；
[0085]-仅基于具有已知pk特性的参考抗体(或许多参考抗体)的体内清除率确定所讨论的抗体的相对体内清除率，即无需进行体内测试；
[0086]-指导pk特性的抗体工程化(通过改变fc区的fcrn亲和力或通过工程化fab的荷电斑块(后者在wo 2018/197533中描述)；
[0087]-确定对pk工程化的需求并评估pk工程化的结果。
[0088]
因此，根据本发明的测定可以减少甚至替代动物pk研究。
[0089]
i.定义
[0090]
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)中描述的kabat编号系统编号的，并且在本文中被称为“根据kabat编号”。具体地，将kabat编号系统(参见kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域cl，并且将kabat的eu索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(ch1、铰链、ch2和ch3，这在本文中通过在此情况下称为“根据kabat的eu索引编号”而进一步分类)。
[0091]
杵臼结构二聚模块及其在抗体工程化中的用途在carter p.、ridgway j.b.b.、presta l.g.:immunotechnology，1996年2月第2卷第1期，第73-73(1)页中有所描述。
[0092]
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：kabat,e.a.等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)中。
[0093]
可用于实施本发明的方法和技术在例如以下文献中有所描述：ausubel,f.m.(编
辑)，current protocols in molecular biology，第i卷至第iii卷(1997)；glover,n.d.和hames,b.d.编辑，dna cloning:a practical approach，第i卷和第ii卷(1985),oxford university press；freshney,r.i.(编辑)，animal cell culture
–
a practical approach,irl press limited(1986)；watson,j.d.等人，recombinant dna，第二版，chsl press(1992)；winnacker,e.l.,from genes to clones；n.y.,vch publishers(1987)；celis,j.编辑，cell biology，第二版，academic press(1998)；freshney,r.i.,culture of animal cells:a manual of basic technique，第二版，alan r.liss,inc.,n.y.(1987)。
[0094]
使用重组dna技术能够生成核酸衍生物。此类衍生物可以例如在单个或几个核苷酸位置处通过取代、改变、交换、缺失或插入来加以修饰。修饰或衍生化可以例如借助定点诱变来进行。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如，sambrook,j.等人，molecular cloning:a laboratory manual(1999)cold spring harbor laboratory press,new york,usa；hames,b.d.和higgins,s.g.,nucleic acid hybridization
–
a practical approach(1985)irl press,oxford,england)。
[0095]
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞和本领域技术人员已知的其等同物，诸如此类。同样，术语“一个/一种”、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
[0096]
术语“约”表示其后所跟随的数值的 /-20％范围。在某些实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的 /-10％范围。在某些实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的 /-5％范围。
[0097]
如本文所用，术语“确定”还包括术语测量和分析。
[0098]
术语“包含”也包括术语“由...组成”。
[0099]
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)，只要它们是全长抗体并表现出所需的抗原和/或fcrn结合活性即可。
[0100]“多特异性抗体”表示具有关于同一抗原上至少两个不同表位或两个不同抗原的结合特异性。多特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，f(ab')2双特异性抗体)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scfv或fab片段)。具有两个、三个或更多个(例如，四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体也已有报告(参见，例如，us 2002/0004587 a1)。
[0101]
术语“结合(至抗原)”表示抗体在体外测定中的结合。在某些实施例中，结合在结合测定中确定，其中抗体与表面结合，并且抗原与抗体的结合通过表面等离子体共振(spr)来测量。术语“结合”也包括术语“特异性结合”。
[0102]
术语“缓冲物质”表示在溶液中时可以调节例如由于酸性或碱性物质的添加或释放所引起的溶液ph值的变化的物质。
[0103]
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称
为α、δ、ε、γ和μ。
[0104]
术语“fc-融合多肽”表示结合结构域(例如，抗原结合结构域，诸如单链抗体，或多肽，诸如受体的配体)与表现出所需靶向和/或蛋白质a和/或fcrn结合活性的抗体fc区的融合体。
[0105]
术语“人源的fc区”表示人源免疫球蛋白重链的c端区，其含有铰链区、ch2结构域和ch3结构域的至少一部分。在某些实施例中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。在某些实施例中，fc区具有seq id no:05的氨基酸序列。然而，fc区的c末端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。fc区由两条重链fc区多肽组成，它们可以经由铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接，形成链间二硫键。
[0106]
术语“fcrn”表示人新生儿fc受体。fcrn的功能是从溶酶体降解途径中挽救igg，从而引起清除率降低和半衰期增加。fcrn是由以下两种多肽组成的异二聚体蛋白质：50kda i类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-fcrn)和15kdaβ2-微球蛋白(β2m)。fcrn以高亲和力与igg的fc区的ch2-ch3部分结合。igg与fcrn之间的相互作用是严格ph依赖性的，并且以1:2的化学计量发生，其中一个igg经由其两条重链与两个fcrn分子结合(huber,a.h.等人，j.mol.biol.230(1993)1077-1083)。fcrn结合在酸性ph(ph《6.5)下发生在核内体中，并且igg在中性细胞表面(ph为约7.4)处释放。该相互作用的ph敏感性通过在核内体的酸性环境内与受体结合，促进fcrn介导的对胞饮入细胞的igg的保护，使其免于细胞内降解。fcrn然后促进igg再循环到细胞表面，随后在fcrn-igg复合物暴露于细胞外的中性ph环境时释放到血流中。
[0107]
术语“fc区的fcrn结合部分”表示抗体重链多肽的以下部分：大致从eu位置243延伸到eu位置261、大致从eu位置275延伸到eu位置293、大致从eu位置302延伸到eu位置319、大致从eu位置336延伸到eu位置348、大致从eu位置367延伸到eu位置393和eu位置408，以及大致从eu位置424延伸到eu位置440。在某些实施例中，根据kabat的eu编号，下列氨基酸残基中的一者或多者为改变的f243、p244、p245 p、k246、p247、k248、d249、t250、l251、m252、i253、s254、r255、t256、p257、e258、v259、t260、c261、f275、n276、w277、y278、v279、d280、v282、e283、v284、h285、n286、a287、k288、t289、k290、p291、r292、e293、v302、v303、s304、v305、l306、t307、v308、l309、h310、q311、d312、w313、l314、n315、g316、k317、e318、y319、i336、s337、k338、a339、k340、g341、q342、p343、r344、e345、p346、q347、v348、c367、v369、f372、y373、p374、s375、d376、i377、a378、v379、e380、w381、e382、s383、n384、g385、q386、p387、e388、n389、y391、t393、s408、s424、c425、s426、v427、m428、h429、e430、a431、l432、h433、n434、h435、y436、t437、q438、k439和s440(eu编号)。
[0108]
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。全长抗体包含两条全长抗体轻链和两条全长抗体重链，该两条全长抗体轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，该两条全长抗体重链包含重链可变结构域、第一恒定结构域、铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域。全长抗体可包含其他结构域，诸如例如，缀合至全长抗体的一条或多条链的额外scfv或scfab。这些缀合物也由术语全长抗体涵盖。
[0109]
术语“衍生自”表示氨基酸序列通过在至少一个位置处引入改变而衍生自亲本氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列与对应的亲本氨基酸序列在至少一个对应位置(根据抗体fc区的kabat eu索引进行编号)处不同。在某些实施例中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基
酸序列在对应位置相差1至15个氨基酸残基。在某些实施例中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在对应位置相差1至10个氨基酸残基。在某些实施例中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在对应位置相差1至6个氨基酸残基。同样，衍生的氨基酸序列与其亲本氨基酸序列具有高氨基酸序列同一性。在某些实施例中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有80％或更多的氨基酸序列同一性。在某些实施例中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有90％或更多的氨基酸序列同一性。在某些实施例中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有95％或更多的氨基酸序列同一性。
[0110]
术语“人fc区多肽”表示与“天然”或“野生型”人fc区多肽相同的氨基酸序列。术语“变体(人)fc区多肽”表示衍生自“天然”或“野生型”人fc多肽的氨基酸序列的区别在于至少一个“氨基酸改变”。“人fc区”由两个人fc区多肽组成。“变体(人)fc区”由两个fc区多肽组成，其中两者都可以是变体(人)fc区多肽，或者一个是人fc区多肽而另一个是变体(人)fc区多肽。
[0111]“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有hvr(例如cdr)对应于非人抗体的hvr，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的fr。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
[0112]“分离的”抗体是已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，sds-page、等电聚焦(ief)、毛细管电泳)或色谱(例如，尺寸排阻色谱或离子交换或反相hplc)确定的。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见flatman,s.等人，j.chrom.b 848(2007)79-87。
[0113]“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
[0114]
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
[0115]“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从n端至c端，每条重链均具有可变区(vh)，亦称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)。类似地，自n末端至c末端，各轻链具有可变区(vl)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(cl)结构域。抗体的轻链
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
[0116]
术语“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
[0117]“药用载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0118]
如本文所用，术语“重组抗体”表示所有通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体(嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体)。这包括从宿主细胞诸如ns0、hek、bhk或cho细胞或从人类免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体，或使用转染至宿主细胞内的重组表达质粒表达的抗体。此类重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。如本文所报告的重组抗体可能经受体内体细胞超突变。因此，重组抗体的vh区和vl区的氨基酸序列是下述序列，尽管衍生自人类种系vh序列和vl序列并与之相关，但在天然条件下可以不存在于体内人类抗体种系品目中。
[0119]
如本文所用，术语“tcb”表示t细胞双特异性抗体。此类抗体可以具有例如在wo 2013/026831中所描述的形式。这些分子可以同时结合t细胞上的cd3(第一特异性)和靶(例如肿瘤)细胞上的抗原(第二特异性)，从而诱导杀伤靶细胞。tcb是由四种多肽或多肽链组成的三价双特异性抗体：一条轻链，其为全长轻链；另一条轻链，其为结构域交换全长轻链；一条重链，其为全长重链；以及另一条重链，其为包含额外的结构域交换重链或轻链fab片段的延伸的重链。
[0120]
在一个优选的实施例中，tcb包括：
[0121]
a)第一fab片段和第二fab片段，每者结合第一抗原，
[0122]
b)特异性结合第二抗原的一个结构域交换fab片段，在该结构域交换fab片段中ch1结构域和cl结构域彼此交换，
[0123]
c)包含第一重链fc区多肽和第二重链fc-区多肽的一个fc区，
[0124]
其中第一fab片段的ch1结构域的c末端连接至重链fc区多肽之一的n末端，且结构域交换fab片段的cl结构域的c末端连接到其他重链fc区多肽的n末端，并且
[0125]
其中第二fab片段的ch1结构域的c末端连接至第一fab片段的vh结构域的n末端，或连接至结构域交换fab片段的vh结构域的n末端，并且
[0126]
其中第一抗原或第二抗原是人cd3。
[0127]
在另一个同样优选的实施例中，tcb包括：
[0128]
a)第一fab片段和第二fab片段，每者结合第一抗原，
[0129]
b)特异性结合第二抗原的一个结构域交换fab片段，在该结构域交换fab片段中vh结构域和vl结构域彼此交换，
[0130]
c)包含第一重链fc区多肽和第二重链fc-区多肽的一个fc区，
[0131]
其中第一fab片段的ch1结构域的c末端连接至重链fc区多肽之一的n末端，且结构域交换fab片段的ch1结构域的c末端连接到其他重链fc区多肽的n末端，并且
[0132]
其中第二fab片段的ch1结构域的c末端连接至第一fab片段的vh结构域的n末端，或连接至结构域交换fab片段的vl结构域的n末端，并且
[0133]
其中第一抗原或第二抗原是人cd3。
[0134]
如在本技术中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如本文所报告的双特异性抗体是“二价”的一个优选实施例。
[0135]
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与其抗原的结合的结构域。抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个框架区(fr)和三个高变区(hvr)(参见例如，kindt,t.j.等人，kuby immunology，第6版，w.h.freeman and co.,n.y.(2007)，第91页)。单个vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的vh或vl结构域来进行分离，以筛选互补vl或vh结构域的文库。参见例如：portolano,s.等人，j.immunol.150(1993)880-887；clackson,t.等人，nature 352(1991)624-628)。
[0136]
术语“变体”、“经修饰的抗体”和“经修饰的融合多肽”表示具有不同于亲本分子的氨基酸序列的氨基酸序列的分子。通常，此类分子具有一种或多种改变、插入或缺失。在某些实施例中，经修饰的抗体或经修饰的融合多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含非天然存在的fc区的至少一部分。此类分子与亲本抗体或亲本融合多肽具有小于100％的序列同一性。在某些实施例中，变体抗体或变体融合多肽的氨基酸序列与亲本抗体或亲本融合多肽的氨基酸序列具有从约75％至小于100％的氨基酸序列同一性，尤其是从约80％至小于100％，尤其是从约85％至小于100％，尤其是从约90％至小于100％，尤其是从约95％至小于100％。在某些实施例中，亲本抗体或亲本融合多肽和变体抗体或变体融合多肽相差一个(单个)、两个或三个氨基酸残基。
[0137]“原代人内皮细胞”是使用酶促或机械方法直接从其来源、器官、组织或血液中分离出来的人细胞。原代细胞不是永生的。一旦分离，将它们放置在人工环境中，诸如例如，放置在塑料或玻璃容器中，在含有必需营养素和生长因子以支持增殖的专门培养基中。原代细胞可以是两种类型：贴壁细胞或悬浮生长的细胞。贴壁细胞需要附着才能生长，并且被称为锚定依赖性细胞。贴壁细胞通常衍生自器官组织。悬浮细胞不需要附着即可生长，并且被称为非锚定依赖性细胞。大多数悬浮细胞是从血液中分离出来的。
[0138]
术语“ph敏感性荧光染料”表示在为约ph 7.4的生理ph和在为约ph4.5的溶酶体ph下具有不同荧光强度或发射波长的染料。
[0139]
ii.体内抗体
[0140]
由于igg分子是二价的，因此单个igg分子可以中和最多达两个抗原分子。对于中和抗体，有两种类型的靶抗原：存在于血浆中的可溶性抗原和表达于细胞表面的膜结合抗原。
[0141]
在抗原是膜结合抗原的情况下，所施用的治疗性抗体与细胞表面上的膜结合抗原结合。随后，抗体通过内化与抗体结合的膜结合抗原一起被吸收到细胞内的内体中。在其后，仍然与抗原结合的抗体移动到溶酶体，在溶酶体中其与抗原一起被降解。由膜结合抗原内化介导的从血浆中消除抗体被称为抗原依赖性消除。这已针对不同的抗体分子进行了报道(参见例如drug discov.today,11(2006)81-88)。由于单个igg抗体分子在与抗原二价结合时与两个抗原分子结合，并且然后被溶酶体内化并直接降解，单个普通igg抗体无法中和两个或更多个抗原分子。
[0142]
igg分子在血浆中长时间保留(缓慢消除)的原因是fcrn，称为igg分子补救受体
(参见例如nat.rev.immunol.7(2007)715-725)。已通过胞饮作用被吸收到内体的igg分子在内体内酸性条件下与内体中表达的fcrn结合。与fcrn结合的igg分子移动到细胞表面，在细胞表面，它们在血浆的中性条件下从fcrn解离。无法与fcrn结合的igg分子进入溶酶体中，在溶酶体中，它们被降解。
[0143]
如果当igg抗体通过内化被吸收到细胞内的内体中时，该igg抗体在内体内酸性条件下从抗原上解离，解离的抗体可以与也存在于内体中的fcrn结合。因此，从抗原解离并被fcrn结合的igg分子被转移到细胞表面并在ph中性条件下从fcrn释放到血浆中。从而将抗体再循环到血浆中。回到血浆中的igg分子能够再次与新抗原结合。该过程的重复允许单个igg分子重复地与抗原结合，从而能够用单个igg分子中和多个抗原。
[0144]
在可溶性抗原的情况下，施用的治疗性抗体在血浆中与抗原结合，并以抗原-抗体复合物的形式保留在血浆中。与不与抗原结合的igg分子的情况一样，在血浆与抗原结合的igg分子通过胞饮作用被吸收到内体中。在内体中，它们可以在内体内酸性条件下与在内体中表达的fcrn结合。与fcrn结合的igg分子移动到细胞表面，然后在血浆中的中性条件下从fcrn解离。如果igg分子可以在内体内酸性条件下与抗原解离，解离的抗原将不能与fcrn结合，从而可以被溶酶体降解。由于已回到血浆中的igg分子已经与内体中的抗原解离，它们能够再次与血浆中的新抗原结合。该过程的重复允许单个igg分子重复地结合可溶性抗原。这使得单个igg分子能够中和多种抗原。
[0145]
因此，无论抗原是膜结合抗原还是可溶性抗原，如果在内体内酸性条件下igg抗体与抗原的解离是可能的，则单个igg分子可以重复中和抗原。
[0146]
更具体地说，单个igg分子在细胞表面ph为7.4时与抗体强结合，而在内体内ph为5.5至6.0时与抗原弱结合，可能能够中和多种抗原，从而改善药代动力学(已报道内体内ph通常为ph 5.5至6.0(参见例如nat.rev.mol.cell.biol.5(2004)121-132))。
[0147]
一般来说，蛋白质-蛋白质相互作用由疏水相互作用、静电相互作用和氢键结合组成，并且结合强度通常表示为结合常数(亲和力)或表观结合常数(亲合力)。ph依赖性结合的结合强度在中性条件(ph 7.4)和酸性条件(ph 5.5至6.0)之间变化，存在于天然发生的蛋白质-蛋白质相互作用中。例如，上述igg分子与被称为igg分子的补救受体的fcrn之间的结合在酸性条件(ph 5.5至6.0)下强，但在中性条件(ph 7.4)下显著弱。据报道，上述igg-fcrn相互作用的ph依赖性结合与igg中存在的组氨酸残基相关联(参见例如mol.cell.7(2001)867-877)。
[0148]
iii.根据本发明的方法
[0149]
本文报道了使用新的基于人原代细胞的体外测定用于估计人体内治疗性抗体清除的新方法。这种大分子非特异性清除测定(luca)提供了基于体外的方法来评估和预测治疗性抗体的pk特性。
[0150]
本发明至少部分基于以下发现：体外摄取和再循环到原代人内皮细胞中的抗体的总和可以用作估计所述抗体在体内的非特异性清除的替代物。
[0151]
本发明至少部分基于以下发现：仅原代人内皮细胞可以用于根据体外实验预测体内清除率，因为非原代内皮细胞不显示相同的相关性，因此，不适用于此目的。使用所述非原发性内皮细胞，无法实现不同抗体之间的分化(比较图1和图2)。图4描绘了根据本发明的方法的方案。
[0152]
因此，本发明包括用于确定或估计抗体的非特异性(非靶标介导的)清除(率)的方法，其包括以下步骤：
[0153]
a)将缀合至ph敏感性荧光染料的抗体与原代人内皮细胞一起孵育，以及
[0154]
b)确定步骤a)的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度(在规定的孵育时间之后)，
[0155]
其中步骤b)中确定的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光强度相对于背景水平(即未与抗体孵育的原代人内皮细胞的(细胞内的)荧光)的增加指示抗体的非特异性清除。
[0156]
本发明至少部分基于以下发现：体外摄取和再循环到原代人内皮细胞中的抗体的总和可以用作估计所述抗体在体内的非特异性清除的替代物。
[0157]
本发明至少部分基于以下发现：仅原代人内皮细胞可以用于预测来自体外实验的体内清除率，因为非原代内皮细胞不显示相同的相关性，因此，不适用于此目的。使用所述非原代内皮细胞，无法实现不同抗体之间的分化(参见图1和2)。
[0158]
本发明至少部分基于以下发现：通过胞饮作用摄取抗体并将其运送至溶酶体区室而不被原代内皮细胞的fcrn再循环，对原代内皮细胞荧光的贡献最大。
[0159]
在图1和图2中，比较了不同抗体在与内皮细胞(人微血管内皮细胞，hmec1；图1)一起孵育期间和与原代内皮细胞(人原代肝内皮细胞；图2)一起孵育期间的荧光强度的时程，该不同抗体已用相同的ph敏感性荧光染料标记。从图1可以看出，对于七种抗体中的五种，当使用简单的内皮细胞时，不可能进行分化。与此相反，当使用原代内皮细胞时，所有七种抗体都可以进行分化(参见图2)。
[0160]
已通过肝素和fcrn色谱分析的标记的抗体。在下表中显示了非标记和标记的抗体的示例性保留时间。可以看出，标记不会改变抗体的肝素和fcrn结合特性。对于在根据本发明的测定内可靠的抗体，预期与几何平均值的差异低于15％。
[0161]
表1：非标记的和标记的抗体在人肝素和人fcrn色谱柱上的保留时间。
[0162][0163]
在根据本发明的方法中使用的荧光标记可以是任何ph依赖性荧光染料，其荧光强度在约为7的生理ph与在ph 4至5范围内的酸性ph之间具有约10倍，优选地约25倍和最优选约50倍的移位。
[0164]
示例性的合适染料是由promega销售的phab染料。这些染料是ph传感器染料，在ph》7时具有非常低的荧光，并且随着溶液的ph变为酸性，荧光会急剧增加。phab染料在532nm处具有激发最大值(ex)，并且在560nm处具有发射最大值(em)。phab染料有两种适用于抗体缀合的反应形式：phab胺反应性染料和phab硫醇反应性染料。phab胺反应性染料具有琥珀酰亚胺酯基团，该琥珀酰亚胺酯基团可与抗体上赖氨酸氨基酸上的伯胺反应。phab硫醇反应性染料具有与硫醇反应的马来酰亚胺基团。在通过使用还原剂(诸如dtt或tcep)将抗体的铰链区中的半胱氨酸二硫键还原为硫醇后，预计该马来酰亚胺基团将缀合至抗体。phab染料在缀合至抗体后保留其对ph降低的荧光反应。
[0165]
不合适的染料是invitrogen的click-it
tm phrodo
tm ifl red sdibo炔烃。当ph值仅变化2到3倍时，该染料的荧光强度只有很小的变化。
[0166]
一种合适的接头是由clickchemistrytools销售的磺基dbco-peg4-amine。sulfo dbco-peg4-amine是水溶性试剂，用于通过稳定的酰胺键将含羧基分子或活化酯(例如nhs酯)与dbco部分衍生化。亲水性磺化间隔臂提高了dbco衍生分子的水溶性，使其在许多情况下完全溶于水性介质。peg间隔臂提供长且灵活的连接。缀合是通过抗体的叠氮化物活化并使用点击化学反应与dbco部分反应来实现的。
[0167]
在下文中，使用phab染料和使用磺基dbco-peg4-胺接头的缀合来举例说明本发明。同样可以使用表现出上述特征或接头或不干扰抗体的结合特性的缀合化学以及染料的
ph依赖性荧光特性的任何其他染料。这仅作为本发明的示例而呈现，不应被解释为限制。真实范畴在所附权利要求书中阐述。
[0168]
该示例性标记抗体的结构如图3所示。
[0169]
使用facs获取内化抗体的平均荧光强度(mfi，更具体地说是几何平均荧光强度)，激发波长为488nm，检测波长为585/540nm。完全相同的条件、增益和门用于所有时间点(即2和4小时)。使用flojo_v10软件进行数据提取。从所有几何平均值中减去阴性对照的值，然后归一化为染料抗体比率(dar)。使用graphpad prism将来自每种抗体的归一化几何平均值绘制为线性回归曲线以提取斜率(针对120和240分钟的几何平均mfi/分钟，并包含原点，即0/0)。两种抗体用于归一化斜率：具有突变m252y/s254t/t256e的莫维珠单抗设置为0，tcb设置为1。选择这些抗体是因为它们跨越了足够的速率范围。使用tibco spotfire软件针对相应体内的人、食蟹猴和hfcrn tg32 / 小鼠清除值绘制最终斜率。具有包括表1的抗体的不同抗体的人、食蟹猴和人fcrn转基因小鼠的相应图显示在图5至7中。
[0170]
图8显示根据本发明的方法也可用于确定igg的fc区变体的体内清除。这进一步指示在根据本发明的方法中适当地捕获了fcrn再循环。
[0171]
图9显示了荧光对孵育时间的依赖性。可以看出，线性范围至少最长达24小时。
[0172]
在某些实施例中，根据本发明的方法是用于估计或确定抗体在人或食蟹猴或小鼠中的体内清除率的方法，该方法包括以下步骤：
[0173]
a)将缀合至相同的ph敏感性荧光染料的抗体和至少第一和第二参考抗体与原代人内皮细胞分别孵育至少2和4小时，以及针对每次孵育时间，确定原代人内皮细胞的几何平均细胞内的荧光强度，任选地在确定细胞内的荧光强度之前洗涤细胞以去除粘附的荧光标记抗体，
[0174]
b)在与a)相同的时间点，确定不与任何标记抗体一起孵育的原代人内皮细胞的几何平均细胞内的荧光强度，任选地在确定细胞内的荧光强度之前洗涤细胞以去除粘附的荧光化合物，
[0175]
c)通过以下确定相对归一化的细胞内荧光强度率：
[0176]
i)针对所讨论的抗体和参考抗体，从a)中确定的几何平均细胞内的荧光强度中的每一个减去在相同时间点确定的原代人内皮细胞的几何平均细胞内的荧光强度，以获得校正的几何平均细胞内的荧光强度，
[0177]
ii)将所讨论的抗体和参考抗体的2)中获得的校正的几何平均细胞内的荧光强度分别除以相应抗体中存在的荧光染料分子的数量，以获得归一化的几何平均细胞内的荧光强度，
[0178]
iii)基于由aa)如ii)中所确定的针对a)的每个孵育时间的归一化的几何平均细胞内的荧光强度以及bb)原点组成的值的组，针对所讨论的抗体和参考抗体中的每一种确定最佳拟合直线(即线性回归曲线y＝s*x b，其中y＝归一化的几何平均(细胞内的)荧光强度，s＝斜率，x＝时间且b＝y轴交叉点)的斜率；
[0179]
iv)将所讨论的抗体的最佳拟合直线的斜率归一化如下：
[0180]
[0181]
其中抗体在人或食蟹猴或小鼠中的体内清除率是第一参考抗体在人或食蟹猴或小鼠中的清除率乘以相对归一化的细胞内的荧光强度率。
[0182]
已经发现通过使用相对归一化率(细胞内的)荧光强度(率)，测定内和日内偏差可以最小化。
[0183]
通过使用根据本发明的在相对归一化的细胞内的荧光强度率和体内确定的清除率之间的比对，已经建立了体外-体内相关性。该相关性不依赖于在其生成期间使用的特异性抗体。同样，可以使用具有已知体内清除率的其他抗体。
[0184]
针对具有未知体内清除率的抗体，通过将确定的相对归一化的细胞内的荧光强度率用作根据本发明的体内-体外相关性中的x值，具有未确定的体内清除率的抗体的体内清除率可以估计为y值。
[0185]
***
[0186]
提供以下实例、序列和附图来辅助理解本发明，本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
[0187]
实例
[0188]
i材料和方法
[0189]
抗体
[0190]
实验中使用的参考抗体是具有seq id no:01的重链氨基酸序列和seq id no:02的轻链氨基酸序列的抗ptau抗体以及具有seq id no:03的重链氨基酸序列和seq id no:04的轻链氨基酸序列的抗her 3抗体。
[0191]
合成基因在geneart(life technologies gmbh,carlsbad,ca,usa)生产。
[0192]
本文使用的单克隆抗体在hek293细胞中瞬时表达(参见下文)，并使用标准程序(参见下文)通过蛋白质a色谱法进行纯化。
[0193]
生化表征包括尺寸排阻色谱(waters biosuite
tm 250 7.8x300mm，洗脱液：200mm kh2po4,250mm kcl,ph 7.0)并使用bioanalyzer 2100(agilent technologies，santa clara，ca，usa)分析分子量分布。
[0194]
表达质粒
[0195]
为了表达上述抗体，应用了基于具有或不具有cmv-内含子a启动子的cdna组织或基于具有cmv启动子的基因组组织的用于瞬时表达(例如在hek293-f中)细胞的表达质粒的变体。
[0196]
除抗体表达盒外，质粒还包含：
[0197]
‑ꢀ
复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，
[0198]
‑ꢀ
β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性，以及
[0199]
‑ꢀ
来自mus musculus的二氢叶酸还原酶基因作为真核细胞中的选择标记。
[0200]
抗体基因的转录单位由以下元件组成：
[0201]
‑ꢀ5’
端的独特限制性位点，
[0202]
‑ꢀ
来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，
[0203]
‑ꢀ
在cdna组织的情况下，之后是内含子a序列，
[0204]
‑ꢀ
人抗体基因的5'非翻译区，
[0205]
‑ꢀ
免疫球蛋白重链信号序列，
[0206]
‑ꢀ
人抗体链，该人抗体链作为cdna或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组织的基因组组织，
[0207]
‑ꢀ
具有聚腺苷酸化信号序列的3'非翻译区，以及
[0208]
‑ꢀ
3'端的独特限制性位点。
[0209]
通过pcr和/或基因合成产生包含抗体链的融合基因，并将所述融合基因通过已知的重组方法和技术，通过例如使用相应质粒中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行装配。通过dna测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染，通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒(nucleobond ax,macherey-nagel)。
[0210]
细胞培养技术
[0211]
使用如在current protocols in cell biology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.和yamada,k.m.(编辑)，john wiley&sons,inc中所述的标准细胞培养技术。
[0212]
hek293-f系统中的瞬时转染
[0213]
根据制造商的说明，使用hek293-f系统(invitrogen)通过瞬时转染相应质粒(例如编码重链以及相应的轻链)来生成抗体。简而言之，在摇瓶或搅拌发酵管中在无血清freestyle
tm 293表达培养基(invitrogen)中悬浮生长的hek293-f细胞(invitrogen)用相应表达质粒和293fectin
tm
或fectin(invitrogen)的混合物转染。对于2l摇瓶(corning)，将hek293-f细胞以1*106个细胞/ml的密度接种于600ml中并在120rpm、8％co2下孵育。细胞以约1.5*106个细胞/ml的细胞密度用约42ml的以下混合物转染后的第二天分别以等摩尔比编码重链和对应的轻链：a)具有600μg总质粒dna(1μg/ml)的20ml opti-mem(invitrogen)和b)20ml opti-mem 1.2ml 293fectin或fectin(2μl/ml)。根据葡萄糖消耗量，在发酵过程中添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，并且直接从上清液纯化抗体，或者将上清液冷冻并储存。因此已生产的一些抗体：
[0214]
[0215][0216]
纯化
[0217]
通过使用mabselectsure-sepharose
tm
(ge healthcare,sweden)的亲和色谱、使用丁基琼脂糖(ge healthcare,sweden)的疏水相互作用色谱和superdex200尺寸排阻(ge healthcare,sweden)色谱从细胞培养上清液中纯化抗体。
[0218]
简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用pbs缓冲液(10mm na2hpo4、1mm kh2po4、137mm nacl和2.7mm kcl，ph 7.4)平衡的mabselectsure树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用ph 3.0的25mm柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分合并，并用2m tris，ph 9.0中和。通过添加1.6m硫酸铵溶液直至最终浓度为0.8m硫酸铵并使用乙酸将ph调节至ph 5.0来制备抗体池以用于疏水相互作用色谱。在用35mm乙酸钠、0.8m硫酸铵(ph 5.0)平衡丁基琼脂糖树脂后，将抗体应用于该树脂，用平衡缓冲液洗涤并用线性梯度洗脱至35mm乙酸钠ph 5.0。合并含有抗体的级分，并使用用20mm组氨酸、140mm nacl(ph 6.0)平衡的superdex 200 26/60gl(ge healthcare,sweden)柱通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。合并含有抗体的级分，使用vivaspin超滤装置(法国sartorius stedim biotechs.a.)浓缩至所需浓度并存储在-80℃。
[0219]
在每个纯化步骤后，使用微流体labchip技术(caliper life science，usa)通过ce-sds分析纯度和抗体完整性。使用ht protein express试剂盒根据制造商的说明制备5μl蛋白溶液用于ce-sds分析，并使用ht protein express芯片在labchip gxii系统上进行分析。使用labchip gx软件分析数据。
[0220]
小鼠
[0221]
b6.cg-fcgrt
tm1dcr tg(fcgrt)276dcr小鼠缺乏小鼠fcrnα-链基因，但针对人fcrnα-链基因的半合转基因(mufcrn-/-hufcrn tg /-，第276行)用于药代动力学研究。小鼠饲养是在特定的无病原体条件下进行的。小鼠获自jackson laboratory(bar harbor,me,usa)(雌性，4-10周龄，给药时体重17-22g)。所有动物实验均已获得德国上巴伐利亚州政府批准(许可证号55.2-1-54-2532.2-28-10)，并根据欧盟实验动物护理和使用规范在aaalac认可的动物设施中进行。将动物圈养在标准笼子中，并且在整个研究期间可以自由获取食物和水。
[0222]
药代动力学研究
[0223]
经由侧尾静脉以5mg/kg的剂量水平i.v.注射单次剂量的抗体。将小鼠分为3组，每组6只小鼠，共覆盖9个血清采集时间点(给药后0.08、2、8、24、48、168、336、504和672小时)。每只小鼠接受两次眶后抽血，在异氟醚
tm
(cp-pharma gmbh,burgdorf,germany)轻度麻醉下进行；在安乐死时采集了第三份血样。将血液收集到血清管(microvette 500z-gel,sarstedt,n
ü
mbrecht,germany)中。孵育2小时后，将样品以9.300g离心3分钟以获得血清。
离心后，血清样品在-20℃冷冻保存直至分析。
[0224]
人抗体血清浓度的测定
[0225]
通过特定的酶联免疫测定法测定鼠血清中抗体的浓度。对每种抗体特异的生物素化捕获试剂和异羟基洋地黄毒苷标记的抗人fc小鼠单克隆抗体(roche diagnostics,penzberg,germany)分别用于捕获和检测。链霉亲和素包被的微量滴定板(roche diagnostics,penzberg,germany)用在测定缓冲液(roche diagnostics,penzberg,germany)中稀释的生物素化捕获试剂包被1小时。洗涤后，加入不同稀释度的血清样品，然后再孵育1小时。在重复洗涤后，通过随后与检测抗体一起孵育来检测结合的抗体，然后是缀合至辣根过氧化物酶(hrp；roche diagnostics,penzberg,germany)的抗异羟基洋地黄毒苷抗体。abts(2,2'azino-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]；roche diagnostics，germany)用作hrp底物以形成有色反应产物。使用tecan日出板读数器(switzerland)在405nm处读出所得反应产物的吸光度，参考波长为490nm。
[0226]
一式两份分析所有血清样品、阳性和阴性对照样品并对照参考标准进行校准。
[0227]
pk分析
[0228]
使用winnonlin
tm 1.1.1(pharsight,ca,usa)通过非房室分析计算药代动力学参数。
[0229]
简而言之，由于抗体的非线性减少，曲线下面积(auc
0-inf
)值通过对数梯形法计算，并使用表观终末速率常数λz外推至无穷大，从最后时间点观察到的浓度外推。
[0230]
血浆清除率计算为剂量率(d)除以auc
0-inf
。表观终末半衰期(t1/2)衍生自等式t1/2＝ln2/λz。
[0231]
实例1
[0232]
食蟹猴sdpk研究
[0233]
在食蟹猴中以0.3mg/kg至150mg/kg范围的剂量水平单次静脉内施用后测定测试化合物的药代动力学。在数周内从猴子采集连续血样，并从采集的血样中制备血清/血浆。通过elisa测定测试化合物的血清/血浆水平。在线性药代动力学的情况下，药代动力学参数通过标准非房室方法确定。清除率根据以下公式计算：
[0234]
清除率＝剂量/浓度-时间曲线下面积
[0235]
在非线性药代动力学的情况下，清除率的线性分数经由以下替代方法确定：要么在以高剂量水平iv施用后估计清除值，在该等高剂量水平下，额外的非线性清除途径实际上已饱和。或者，建立包含线性和非线性、可饱和清除项的pk模型。在这些情况下，模型确定的线性清除率分数用于相关性。
[0236]
实例2
[0237]
fcrn亲和柱的制备
[0238]
fcrn在hek293细胞中的表达
[0239]
通过用包含fcrn和β-2-微球蛋白的编码序列的两个质粒转染hek293细胞来瞬时表达fcrn。转染的细胞在摇瓶中在36.5℃、120rpm(摇床振幅5cm)、80％湿度和7％co2条件下培养。每2-3天将细胞稀释至3至4*105个细胞/ml的密度。
[0240]
对于瞬时表达，在36.5℃、ph 7.0
±
0.2、po
2 35％(用n2和空气充气，总气体流量200ml min-1
)，启动14l不锈钢生物反应器，培养体积为8.1，搅拌器速度为100-400rpm。当细
胞密度达到20*105个细胞/ml时，将10mg质粒dna(两种质粒的等摩尔量)稀释在400ml opti-mem(invitrogen)中。将20ml 293fectin(invitrogen)添加到该混合物中，然后将其在室温下孵育15分钟，随后转移到发酵罐中。从第二天开始，以连续模式为细胞提供营养：以每天500ml的速率添加进料溶液，并根据需要添加葡萄糖以保持水平高于2g/l。转染7天后，使用带有1l桶的摆动头离心机在4000rpm下收集上清液90分钟。由sartobran p过滤器(0.45μm 0.2μm,sartorius)清除上清液(13l)并从中纯化fcrnβ-2-微球蛋白复合物。
[0241]
新生儿fc受体的生物素化
[0242]
将3mg fcrnβ-2-微球蛋白复合物溶解/稀释在含有150mm氯化钠的5.3ml 20mm磷酸二氢钠缓冲液中，并添加到250μl pbs和1片完全蛋白酶抑制剂(完全ultra片剂，roche diagnostics gmbh)中。根据制造商说明(bulk bira,avidity llc)，使用来自avidity的生物素化试剂盒对fcrn进行生物素化。将生物素化反应物在室温完成过夜。
[0243]
将生物素化fcrn在4℃对20mm mes缓冲液(包含140mm nacl、ph 5.5)(缓冲液a)透析过夜，以去除过量的生物素。
[0244]
与链霉亲和素琼脂糖偶联
[0245]
为了与链霉亲和素琼脂糖偶联，将1ml链霉亲和素琼脂糖(ge healthcare,united kingdom)添加到生物素化和透析的fcrnβ-2-微球蛋白复合物中，并在4℃下孵育过夜。将衍生化的fcrnβ-2-微球蛋白复合物琼脂糖填充到4.6mm x 50mm色谱柱(repligen)。将柱储存在80％缓冲液a和20％缓冲液b(20mm tris(羟甲基)氨基甲烷ph 8.8，140mm nacl)中。
[0246]
实例3
[0247]
使用fcrn亲和柱和ph梯度的色谱
[0248]
条件：
[0249]
柱尺寸：50mm x 4.6mm
[0250]
上样：30μg样品
[0251]
缓冲液a：20mm mes，含140mm nacl，调节至ph 5.5
[0252]
缓冲液b：20mm tris/hcl，含140mm nacl，调节至ph 8.8
[0253]
将30μg样品施加到用缓冲液a平衡的fcrn亲和柱上。在20％缓冲液b中以0.5ml/min的流速的10分钟的洗涤步骤后，以20％至70％缓冲液b的线性梯度进行洗脱超过70分钟。使用波长为280nm的紫外光吸收进行检测。每次运行后使用20％缓冲液b将柱再生10分钟。
[0254]
为了计算相对保留时间，根据bertoletti-ciarlet,a.等人(mol.immunol.46(2009)1878-1882)，与0.02％过氧化氢氧化18小时的标准样品(抗her3抗体(seq id no:03and 04))在序列开始时和每10次样品注射后运行。
[0255]
简而言之，将10mm磷酸钠ph 7.0中的抗体(9mg/ml)与h2o2混合至最终浓度为0.02％，并在室温下孵育18小时。为了淬灭反应，将样品彻底透析到预冷的10mm乙酸钠缓冲液ph 5.0中。
[0256]
实例4
[0257]
使用肝素亲和柱和ph梯度的色谱
[0258]
条件：
[0259]
柱尺寸：50mm x 5.0mm
[0260]
上样：20-50μg样品
[0261]
缓冲液a：50mm tris，ph 7.4
[0262]
缓冲液b：50mm tris，ph 7.4，1000mm nacl
[0263]
将20至50μg低盐缓冲液(≤25mm离子强度)中的蛋白质样品应用于5.0x50mm的tskgel heparin-5pw玻璃柱(tosoh bioscience,tokyo/japan)，该柱在室温下用缓冲液a预平衡。用0-100％缓冲液b的线性梯度在32分钟内以0.8mg/ml的流速进行洗脱。使用波长为280nm的紫外光吸收进行检测。
[0264]
实例5
[0265]
检查抗体内化
[0266]
该方法基于先前报道的方法，该方法使用ph激活探针的均匀荧光成像检测内化抗体，该方法可在细胞内酸性条件下实现抗体的最大荧光信号，而不会在细胞外环境中检测到任何荧光信号(li,z.,et al.,int.immunopharm.62(2018)299-308)。
[0267]
简而言之，将相应抗体缀合至phab胺反应性染料，然后用细胞培养基稀释。同时，将细胞接种到6孔板中(每孔1
×
105个细胞)，每孔加入100μl含有phab胺反应性染料缀合抗体的培养基(最终浓度为10μg/ml)。在37℃孵育后，通过流式细胞术在不同时间点(0h、1.5h、2h、4h、5.5h和/或24h)测量抗体的内化。
[0268]
实例6
[0269]
抗体标记
[0270]
根据制造商的说明，使用siteclick
tm antibody azido modification kit(thermo fisher scientific)标记抗体。简而言之，fc区的n-连接半乳糖残基被β-半乳糖苷酶去除并经由β-1,4-半乳糖基转移酶(galt)被含有叠氮化物的半乳糖(galnaz)取代。这种叠氮化物修饰能够实现sdibo修饰染料的无铜缀合。ph敏感性胺反应性染料(523nm)购自promega，并与磺基dbco peg4胺偶联。用摩尔染料过量2标记抗体。使用mwco为50kda(emd millipore,#ufc200324)的ultra-2离心过滤器去除多余的染料，并在20mm组氨酸缓冲液(ph 5.5)中重新缓冲抗体。用nanodrop光谱仪在280nm(a
280nm
)和532nm(a
532nm
)测定标记抗体[1]的浓度以及染料与抗体的比率(dar)[2]。
[0271]
cab＝[a
280nm-[a
280nm
*cf
dye
]]/ε
mab
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[1]
[0272]
dar＝[a
532nm
*mw
mab
]/[c
mab
*ε
dye
]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[2]
[0273]
ε
dye
＝47225
[0274]
cf
dye
＝0.36
[0275]
实例7
[0276]
细胞维护和准备
[0277]
冷冻保存的人肝源性内皮细胞(hlec-p2)购自lonza(lonza,#hlecp2)。将细胞维持在补充有egm
tm-2 mv微血管内皮细胞生长培养基singlequots
tm
(lonza,#cc-4176)的ebm
tm-2内皮细胞生长基础培养基-2(lonza,#cc-3156)中。抗体处理前5天，将细胞接种到胶原蛋白i涂层的100mm培养皿(biocoat
tm
,#354450)上，并在处理前两天将细胞传代培养到胶原蛋白i涂层的96孔板(biocoat
tm
,#354407)中，细胞密度为4x104个细胞/孔，以允许粘附48小时。24小时后更换培养基，细胞保持在37℃和5％co2。
[0278]
在实验当天，用200μl预热的培养基洗涤细胞两次，随后在培养基中与400nm标记抗体或20mm组氨酸缓冲液(ph 5.5)作为阴性对照一起孵育。2和4小时后，去除抗体溶液并用200μl冰冷的dpbs(不含mg和ca)洗涤细胞一次，并通过在37℃下应用100μl胰蛋白酶(含edta)2.5分钟进行分离。通过加入100μl facs缓冲液(20％fcs，1mm edta在dpbs中)使胰蛋白酶失活。
[0279]
实例8
[0280]
流式细胞术和药代动力学分析
[0281]
使用分析仪10(miltenyi biotec)获取内化抗体的平均荧光强度(mfi，更具体地说是几何平均值(geo-mean))，该分析仪配备有在488nm处激发的激光和在585nm/540nm处用于收集发射光的滤光片。两个时间点(2小时和4小时)使用完全相同的条件、增益和门。使用flojo_v10软件进行数据提取。从所有几何平均值中减去阴性对照的值，然后对dar进行归一化。使用graphpad prism将来自每种抗体的归一化的几何平均值绘制为线性回归曲线以提取斜率(针对120和240分钟的几何平均mfi/分钟)。选择了两种标准抗体来归一化斜率：莫维珠单抗-yte设置为0，tcb设置为1。使用tibco spotfire软件针对公布的体内人、食蟹猴和hfcrn tg32 / 小鼠清除值绘制最终斜率。
[0282]
实例9
[0283]
质量控制
[0284]
生物物理结合特性是影响清除机制的关键决定因素。因此，重要的是评估抗体的结合亲和力是否在标记过程中发生变化。肝素色谱和新生儿fc受体结合先前已被证明可以预测体外抗体清除率(kraft,t.e.,et.al.,mabs 12(2020)e1683432)。在此，该方法用于说明点击标签引入的潜在异常结合特性。实例3和4中提供了方法的细节。
[0285]
为了确认不存在未结合的染料并验证在光谱仪上测量的浓度，对标记的抗体进行了尺寸排阻色谱。使用biosuite diol(oh)柱(waters,186002165)分离样品，其中磷酸二氢钾缓冲液(ph 6.2)作为流动相，流速为0.5ml/min。使用280nm和532nm的检测器对标记的抗体进行量化和分析。提取280nm和532nm处的曲线下面积(auc)以计算浓度。计算了所有抗体的auc的几何平均值，并确定了每种抗体与该几何平均值的偏差。对于在根据本发明的测定内可靠的抗体，与几何平均值的差异预期低于15％。