用选择性糖皮质激素受体调节剂(SGRM)和抗体检查点抑制剂治疗肾上腺皮质癌的制作方法

用选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)和抗体检查点抑制剂治疗肾上腺皮质癌


背景技术：

1.肾上腺是糖皮质激素(gc)皮质醇的天然来源。皮质醇由肾上腺产生和分泌，响应垂体分泌的促肾上腺皮质激素(acth)。皮质醇水平昼夜变化，可以在血液(例如血清、血浆或全血)中测量，也可以在晨间测量(皮质醇水平在此时通常最高)。皮质醇水平也可在尿液(例如，24小时尿液皮质醇测量，其可提供较少受采样时间影响的皮质醇测定)、唾液(例如，深夜唾液皮质醇，皮质醇水平在此时通常最低)和其他体液(例如，泪液和汗液)中测量。皮质醇也可在地塞米松抑制试验后测量，其中皮质醇提供下丘脑-垂体-肾上腺轴对外部给予的糖皮质激素(如地塞米松)反应的测量。
2.糖皮质激素(gc)活性升高，例如“皮质醇过量”或“过量皮质醇”，虽然难以精确量化，但与多种癌症类型的病理生理学有关。约半数肾上腺皮质癌(acc)患者表现出明显的系统性gc过量(gc )的临床和生化证据，这为评估gc活性的相关性提供了一个独特的测试案例。gc的广谱免疫抑制作用可能限制肿瘤免疫反应和免疫检查点抑制剂(ici)效力。
3.抗体检查点抑制剂在肾上腺皮质癌(acc)中的效力有限。约半数acc患者存在系统性皮质醇过量(gc )。过量皮质醇会导致库欣综合征和其他疾病。此外，皮质醇具有免疫抑制作用。免疫抑制与对检查点抑制剂的不良反应有关。皮质醇在acc中的特异性免疫抑制作用尚不清楚。因此，sgrm在gc acc中的免疫作用尚不清楚。
4.本领域需要为acc提供更有效的治疗，包括需要增强抗体检查点抑制剂治疗对acc患者的效果。


技术实现要素：

5.分析肾上腺皮质癌(acc)多组学，以确定糖皮质激素(gc)活性的分子后果，并评估糖皮质激素受体(gr)拮抗剂瑞拉可兰(relacorilant)与免疫检查点抑制剂(ici)组合治疗糖皮质激素过量的肾上腺皮质癌(gc acc)的理论基础。申请人分析了有关于acc肿瘤基因转录和gc过量(例如过量皮质醇)的公开可用数据。
6.治疗方法包括对患有肾上腺皮质癌(acc)且皮质醇过量的患者给予选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)和抗体检查点抑制剂。当患者的皮质醇水平超过正常范围，例如高于正常皮质醇的上限时，患者皮质醇过量。在实施方式中，当患者的皮质醇水平等于或大于正常皮质醇浓度的一倍半(1.5)，或等于或大于正常皮质醇浓度约两倍(2)时，可认定为皮质醇过量。在实施方式中，当患者的昼夜皮质醇节律中观察到非典型升高时，认定为皮质醇过量。
7.皮质醇过量的影响可能包括例如，增加皮质醇在肿瘤中和对肿瘤免疫反应的影响(例如肿瘤、淋巴结和他处的免疫抑制)。在实施方式中，联合给予sgrm与抗体检查点抑制剂可有效地减少或逆转皮质醇过量acc患者中皮质醇过量的影响，并可有效地降低患者中的acc肿瘤负荷。在实施方式中，联合给予sgrm与抗体检查点抑制剂可有效减少或逆转皮质醇过量acc患者中皮质醇过量的影响，并且可有效地恢复患者中的t细胞和自然杀伤(nk)细胞
信号转导通路。在实施方式中，联合给予sgrm与抗体检查点抑制剂可有效减少或逆转皮质醇过量acc患者中皮质醇过量的影响，并且可有效地增加患者中t细胞和自然杀伤(nk)细胞向acc肿瘤的浸润。在实施方式中，联合给予sgrm与抗体检查点抑制剂可有效地减少或逆转皮质醇过量acc患者中皮质醇过量的影响，并可有效地降低患者中中性粒细胞向acc肿瘤的浸润。
8.在一些情况下，grm(例如，sgrm)是包含稠合氮杂萘烷结构的非甾体化合物，其中稠合氮杂萘烷结构如美国专利7,928,237和美国专利8,461,172中所述和公开，这两项专利的全部内容在此通过引用其全部内容纳入本文。
9.在一些情况下，grm(例如sgrm)是包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的非甾体化合物，其中杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构如美国专利8,859,774中所述和公开，该专利的全部内容通过引用其全部内容纳入本文。
10.在一些情况下，grm(例如sgrm)是包含八氢稠合氮杂萘烷结构的非甾体化合物，其中八氢稠合氮杂萘烷结构如美国专利10,047,082中所述和公开，该专利的全部内容通过引用纳入本文。
11.在一些情况下，经口服给予grm(如sgrm，如非甾体sgrm)。
12.本方法提供了治疗肾上腺皮质癌(acc)的改进方法。本文公开的方法据信为患有acc的患者提供治疗益处，其中这种治疗益处包括，例如，在患者中降低acc肿瘤负荷；恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路；增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤中；减少中性粒细胞浸入acc肿瘤中；以及其他治疗益处。附图简要说明
13.图1：显示了gc acc病例中转录通路的差异(“gc ”表示展现出gc过量的acc患者)。下调指gc acc病例中降低的通路，而上调是指gc acc中升高的通路。
14.图2：显示了acc肿瘤中特异性免疫细胞类型的丰度。gc 病例的淋巴细胞丰度较低(左)，而间充质干细胞和中性粒细胞丰度较高(右)。
15.图3a：根据激素状态的acc肿瘤分类。在进行的4项比较中，gc过量的存在与否(gc /-)与acc中最大数量的显著不同基因相关(其中“gc
‑”
表示没有展现出gc过量的acc患者)。
16.图3b：gc过量的转录效应。发现858个基因的表达受到gc过量的显著影响。gc 病例中表达较高的基因(与gc-相比p≤0.05和＞2倍的表达变化)显示在右侧。gc 病例中表达较低的基因显示在左侧。
17.图4：gc对启动子甲基化的影响。在gc 肿瘤中更多基因被显著低甲基化(p≤0.05，δβ《-0.2)而非高甲基化(p≤0.05，δβ＞0.2)。β值表示基因中的甲基化百分数。
18.图5：2个kegg通路的归一化基因表达的无监督式聚类。显示的通路包括t细胞受体信号转导和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。最上2行表示每个肿瘤的gc和常规激素状态(黑色：gc /h ，白色：gc-/h-)，蓝色/红色阴影(以灰度显示)显示每个肿瘤的归一化基因表达，其中深蓝色对应于较低表达。当按基因表达聚类时，gc 病例出现在图右侧，其中许多基因表现出较低的表达。(“h ”表示激素存在，“h
‑”
表示激素不存在。)
19.图6：图5所示的2个kegg通路的归一化基因表达的监督聚类。在gc 病例(右侧聚类)中，基因的较低表达主导了这些通路(深蓝色)。
20.图7：gc acc中肿瘤突变负荷增加。与gc-相比，gc 病例中观察到更多错义和无义突变。
21.图8：不同肿瘤类型和acc亚群的gr活性评分。与其他肿瘤相比，acc表现出高gr驱动的基因活性，且与激素状态无关(见插图)。
22.图9：利用随机森林(random forest)区分gc /-acc病例的基因特征推导。nlrp1和znf683(突出显示)被确定为特征的重要组成部分。仅显示高于阈值0.0028的特征基因(其中“a.u.”表示每个基因的重要人工单位)。
23.图10a：acc基因特征在tcga肿瘤中的应用。请注意，acc肿瘤的数据显示在最左边的两个框中(由标签“acc”上方的柱表示)。来自无gc过量(gc-)的acc患者和来自gc过量(gc )患者的数据点分别由相应方框上方的标记箭头指示。据预测，葡萄膜(uvm)和皮肤黑色素瘤(skcm)的肿瘤发生率最高，与gc acc相似。
24.图10b：与gc acc相似的肿瘤病例的预测频率。据预测，葡萄膜(uvm)和皮肤黑色素瘤(skcm)的肿瘤发生率最高，与gc acc相似。
25.图11a：il-2、皮质醇和/或瑞拉可兰刺激对体外分离的人nk细胞的影响。瑞拉可兰的添加显著改善了自然杀伤(nk)细胞对il-2的反应。
26.图11b：il-2、皮质醇和/或瑞拉可兰刺激对体外分离的人nk细胞的影响。添加瑞拉可兰显著改善nk细胞响应il-2的增殖。
27.图12a：il-2、皮质醇和/或瑞拉可兰刺激对分离的人nk细胞细胞因子分泌和基因表达的影响。与单独用皮质醇处理的nk细胞相比，添加瑞拉可兰改善了干扰素γ(ifnγ)的分泌。
28.图12b：il-2、皮质醇和/或瑞拉可兰刺激对分离的人nk细胞细胞因子分泌和基因表达的影响。与单独用皮质醇处理的nk细胞相比，添加瑞拉可兰改善了肿瘤坏死因子(tnfα)的分泌。
29.图12c：il-2、皮质醇和/或瑞拉可兰刺激对分离的人nk细胞细胞因子分泌和基因表达的影响。与单独用皮质醇处理的nk细胞相比，添加瑞拉可兰改善了颗粒酶a分泌。
30.图12d：il-2、皮质醇和/或瑞拉可兰刺激对分离的人nk细胞基因表达的影响。瑞拉可兰连同其他nk活性的关键调节因子(包括lag3和il2ra(编码白细胞介素2(il2)受体))一起也改善ifng(编码ifnγ)的转录。
31.图13a：糖皮质激素在体外抑制人nk细胞对肿瘤细胞的杀伤。在图例中列出的治疗条件下以不同的效应物：肿瘤细胞比进行k562细胞杀伤。这被瑞拉可兰抵消。
32.图13b：糖皮质激素在体外抑制人nk细胞对肿瘤细胞的杀伤。在效应物：肿瘤细胞比为5:1的情况下，皮质醇存在时肿瘤细胞杀伤的显著降低被瑞拉可兰抵消。
具体实施方式
a.引言
33.申请人分析了肾上腺皮质癌(acc)肿瘤基因转录；筛选数据以在有无糖皮质激素(gc)过量(如过量皮质醇)的acc患者中鉴定此类基因转录。申请人发现皮质醇过量改变肾上腺皮质癌(acc)中858个基因的表达。具体而言，在皮质醇过量(gc )患者的acc肿瘤中，与自然杀伤(nk)介导的细胞毒性、th17细胞分化、t细胞受体信号转导、th1/2分化以及抗原加
工和递呈相关的基因下调(见图1)。图1和本文其他地方也显示了其它差异。
34.申请人还发现，在具有或不具有皮质醇过量的acc肿瘤中，特异性免疫细胞的存在是不同的。在gc 病例中，原初和记忆cd4 细胞、cd8 细胞、cd8 中央记忆细胞和自然杀伤t细胞(nkt)较低(见图2)。相反，具有gc 的acc患者中肿瘤相关中性粒细胞(tan)较高。
35.患者对抗体检查点抑制剂的临床反应取决于免疫系统。具体而言，t细胞功能和抗原递呈对于抗体检查点抑制剂的临床疗效至关重要。此外，肿瘤内免疫细胞浸润与抗体检查点抑制剂的临床疗效相关。具有低t细胞数或高中性粒细胞浸润的肿瘤倾向于对抗体检查点抑制剂的反应较差。
36.申请人在此公开了在给予抗体检查点抑制剂的同时给予sgrm可以改善皮质醇过量acc患者对给予抗体检查点抑制剂的反应，从而改善该患者的治疗，其中sgrm的给予有效减少或逆转皮质醇过量acc患者中皮质醇过量的影响。在实施方式中，给予sgrm与抗体检查点抑制剂组合可有效减少或逆转皮质醇过量acc患者中皮质醇过量的影响，并可有效降低患者的acc肿瘤负荷。
37.申请人在此进一步公开了在给予抗体检查点抑制剂的同时给予sgrm，其中sgrm的给予有效恢复患者(包括该患者的acc肿瘤)中t细胞和nk细胞信号转导通路。t细胞和nk细胞信号转导通路的这种恢复可以改善该患者对抗体检查点抑制剂给药的反应，从而改善对皮质醇过量acc患者的治疗。在实施方式中，给予有效恢复患者(包括该患者的acc肿瘤)中t细胞和nk细胞信号转导通路的sgrm可以有效降低患者的acc瘤负荷。
38.申请人在此进一步公开了在给予抗体检查点抑制剂的同时给予sgrm，其中sgrm的给予有效增加患者中t细胞和nk细胞浸润到acc肿瘤中。t细胞和nk细胞浸润的这种增加可以改善该患者对抗体检查点抑制剂给药的反应，从而改善对皮质醇过量acc患者的治疗。在实施方式中，给予有效增加患者中t细胞和nk细胞浸润到acc肿瘤中的sgrm可以有效降低患者的acc肿瘤负荷。
39.申请人在此进一步公开了在给予抗体检查点抑制剂的同时给予sgrm，其中sgrm的给予有效减少患者中中性粒细胞浸润到acc肿瘤中。这种中性粒细胞浸润减少可改善该患者对抗体检查点抑制剂给予的反应，从而改善皮质醇过量acc患者的治疗。在实施方式中，给予有效减少患者中中性粒细胞浸入acc肿瘤中的sgrm可以有效降低患者的acc肿瘤负荷。b.定义
40.当用于预定值时，术语“约”表示包含预定值
±
10％的范围。
41.例如，在癌症基因组图谱(tgca)中可以找到关于癌症的信息。可通过国家癌症研究所网站(www.cancer.gov)的“about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga”页面访问tgca。以下缩写用于指代不同类型的癌症：
42.如本文所用，术语“肿瘤”和术语“癌症”能互换使用，其均指由过度细胞分裂所导致的组织异常生长。侵入周围组织和/或可以转移的肿瘤被称为“恶性”。不转移的肿瘤被称为“良性”。
43.如本文所用，术语“肾上腺皮质癌”和首字母缩略词“acc”可互换地用于指肾上腺肾上腺癌。
44.如本文所用，术语“自然杀伤细胞”和缩写“nk细胞”、“nkt细胞”等，包括其复数形式，如本领域所知，用于指免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。
45.如本文所用，术语“t细胞”如本领域所知，是指在免疫反应中起重要作用的胸腺衍
生淋巴细胞。
46.如本文所用，术语“中性粒细胞”如本领域所知，是指哺乳动物中最丰富的白细胞类型，也是最丰富的粒细胞类型。中性粒细胞有时也称为“中性白细胞(neutrocyte)”。
47.如本文所用，术语“浸润”是指源自不同组织的细胞(如t细胞、nk细胞或中性粒细胞)对组织(如acc肿瘤)的侵袭和占领。
48.如本文所用，术语“患者”是指正在或将要接受或已经接受疾病或病症医疗护理的人。
49.如本文所用，术语“给予”、“给药”、“给予的”或“施用”指向对象或患者提供化合物或组合物(例如，本文所述那些)。例如，化合物或组合物可以经口服给予患者。
50.如本文所用，术语“给予”、“给药”、“给予的”或“施用”指向对象或患者提供化合物或组合物(例如，本文所述那些)。给药可以通过口服给予(即对象口服接受化合物或组合物，其作为丸剂、胶囊、液体或适合口服施用其他形式。口服给予可以是含服的(其中化合物或组合物保持在口中，如在舌下，并且在那里被吸收)。给药可以通过注射，即通过针头、微针、压力注射器或其他刺穿皮肤或使化合物或组合物强行穿过对象皮肤的方式递送化合物或组合物。注射可以是静脉内(即进入静脉)；动脉内(即进入动脉)；腹膜内(即进入腹膜)；肌肉内(即进入肌肉)；或通过其他注射途径。给药途径还可以包括直肠、阴道、经皮、经肺(如通过吸入)、皮下(如通过从含有该化合物或组合物的植入物吸收到皮肤中)，或通过其他途径。
51.如本文所用，术语“促肾上腺皮质激素(acth)”是指由垂体前叶腺产生和分泌的肽类激素，它刺激肾上腺皮质分泌糖皮质激素，帮助细胞合成葡萄糖、分解蛋白质、调动游离脂肪酸和抑制过敏反应中的炎症。这类糖皮质激素中的一种是皮质醇，它调节碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。在健康哺乳动物中，acth分泌受到严格调节。acth分泌受下丘脑释放的促肾上腺皮质素释放激素(crh)的正调节。acth分泌受皮质醇和其他糖皮质激素的负调节。
52.在acth、皮质醇或其他分析物的上下文中，术语“测量水平”是指测定、检测或定量获自对象的样品中皮质醇、acth或其他类固醇的量、水平或浓度。样品可以是例如血液样品、唾液样品、尿液样品或获自患者的其他样本。可以从样品的部分测量水平。例如，水平(例如acth或皮质醇)可以在血液样品的血浆部分中测量；可以在血液样品的血清部分中测量；或者在实施方式中，可以在全血中测量；可以在唾液中测量；可在尿液中测量；或在其他体液中测量。
53.术语“皮质醇”是指由肾上腺束状带产生的天然存在的糖皮质激素(也称为氢化可的松)。皮质醇具有以下结构：
54.术语“总皮质醇”是指与皮质醇结合球蛋白(cbg或皮质素传递蛋白)结合的皮质醇和游离皮质醇(不与cbg结合的皮质醇)。术语“游离皮质醇”指的是不与皮质醇结合球蛋白(cbg或皮质素传递蛋白)结合的皮质醇。如本文所用，术语“皮质醇”是指总皮质醇、游离皮质醇和/或与cbg结合的皮质醇。
55.皮质醇水平可以在血液(例如血清或血浆)、尿液、唾液和其他体液中测量。尿游离皮质醇(ufc，24小时内排泄的尿液中皮质醇的测量)是一种常见的皮质醇水平测量方法，由于需要一整天的样本掩盖了每日皮质醇变化。血浆皮质醇(采集血样时皮质醇水平的测量)通常用于地塞米松抑制测试(测试患者对糖皮质激素水平迅速升高的反应)。此外，还可以根据本领域已知的方法测量血清样品中的皮质醇水平。可测量唾液皮质醇。皮质醇水平的数值在测量方法之间是不同的；也就是说，血液皮质醇水平(例如血清或血浆水平)在采集血样时对皮质醇采样，并且在数值上不同于唾液皮质醇水平(在采集唾液样品时采集的皮质醇样品)和尿游离皮质醇水平(代表24小时内的皮质醇水平)。
56.可以在样品(例如血清、血浆、唾液、尿液或任何其他生物液)中使用各种方法测量皮质醇水平，包括但不限于免疫测定，例如竞争性免疫测定、放射免疫测定(ma)、免疫荧光酶测定和elisa；竞争性蛋白结合测定；液相色谱法(例如hplc)；以及质谱，例如高效液相色谱/三重四极质谱(lc-ms/ms)。在优选实施方式中，使用lc-ms/ms测量皮质醇水平，例如由quest diagnostics(secacus，n.j.07094)进行。
57.术语“正常水平”是指通过测量获自多个正常对象的样品确定的分析物的平均水平。为了进行比较，必须比较相同类型的测量值(如血浆或血清、唾液或尿液)。
58.术语“正常皮质醇水平”是指通过测量获自多个正常对象的样品(例如血清样品)确定的皮质醇平均水平。例如，据putignano等(european journal of endocrinology 145:165-171(2001))所报告，健康女性的正常血浆皮质醇在上午8点(上午)约为420纳摩尔/升(nmol/l)；下午5时(晚上)约为250毫摩尔/升；午夜12点约为90nmol/l(深夜)。这些妇女的唾液皮质醇测量值在上午8时(上午)约为14nmol/l；下午5时(晚上)约为7nmol/l；午夜12点约为5nmol/l(深夜)。在这些健康女性中测得的尿游离皮质醇水平约为130nmol/24小时(nmol/24h)。地塞米松抑制测试(dst)抑制皮质醇水平，如dst后约24nmol/l的血浆皮质醇水平和dst后约4nmol/l的唾液皮质醇水平所示。
59.申请人已经发现，测量acc肿瘤患者的皮质醇水平可以通过确定患者是否存在皮质醇过量来鉴定那些将受益于sgrm和抗体检查点抑制剂组合治疗的患者。
60.如本文所用，术语“皮质醇过量”是指皮质醇水平，无论如何测量，其大于健康对象中测量的皮质醇水平的约1.5倍或约2倍(其中健康对象皮质醇水平通过与患者皮质醇测量相同的方法测量)。例如，使用putignano等的晨间血浆皮质素水平，如果患者的晨间血浆皮质醇水平为约630nmol/l或更高，或约840nmol/l或更大，则确定皮质醇过量。使用putignano等的晨间唾液皮质素水平，如果患者的晨间唾液皮质醇水平为约21nmol/l或更高，或约28nmol/l或更大，则确定皮质醇过量。使用putignano等的24小时尿游离皮质醇水平，如果患者24小时尿皮质醇浓度为约195nmol/24小时或更高，或约260nmol/24h或更高时，则确定皮质醇过量。
61.在实施方式中，组合标准可用于鉴定皮质醇过量患者。例如，可以使用两个或多个或全部或以下标准来确定患者是否患有皮质醇过量：
尿游离皮质醇(ufc)高于正常上限(uln)深夜唾液皮质醇(lnsc)大于uln达2晚皮质醇水平大于1.8μg/dl的地塞米松抑制测试(dst)促肾上腺皮质激素(acth)低于10皮克/毫升(pg/ml)
62.本文所用“标准对照”是指包含适用于本发明应用的预定量分析物(如acth或皮质醇)的样品，以用作比较基础，提供测试样品中存在的分析物的相对量的指示。用作标准对照的样品提供了代表确定样品类型(如血浆、血清、唾液或尿液)的分析物(如acth或皮质醇)的平均量，所述分析物在一天中确定时间(例如，上午8点)采集自未经历或后续发生低钾血症或任何相关病症或并发症风险未增加且给予了相同grm治疗的普通个体。如本文所使用的，“血样”可以是适用于根据常规应用通过现有技术已知方法测量分析物水平的全血样品、血清样品、血浆样品或血细胞样品。类似地，特定分析物的“血液水平”可能是全血、血清、血浆或血细胞中分析物的水平。例如，钾、acth或皮质醇的血液水平可能是取自受试者的血清或血浆样本中的每种分析物水平。
63.在描述接受grm治疗之前未患有且发生低钾血症或任何相关病症或疾病风险未增加的个体(尤其是人对象)的上下文中，术语“平均值”指的是代表随机选择的个体对象组中存在的分析物平均量或水平的某些特征，例如未接受grm处理的个体样品中存在的分析物(例如acth或皮质醇)水平或量，，所述个体对象未被诊断为低钾血症或任何相关疾病或病症或对其不敏感，因此可以作为grm治疗前特定分析物的“平均正常值”或“标准对照值”。该选定组应包括足够数量的个体(例如，至少200或500或更多个)，使得在这些个体中评估的感兴趣分析物(例如，acth或皮质醇)的平均值(即，水平或量)以合理的准确度反映接受grm治疗后无已知疾病或相关病症风险的常规非低血钾群体相应的分析物水平或量。在某些情况下，选定的群体通常具有相同的性别、相似的年龄(例如，彼此相差5岁或10岁内)，具有相似的种族和医学背景。根据分析物的不同，可能需要通过在一天中大约相同的时间(例如，上午6点、上午8点、下午12点、下午4点或下午6点)采集自这些个体的样品确定平均值或标准对照值。任何特定分析物的平均值或标准对照值也可以根据用于定量测量分析物的特定实验或实验形式(包括特定试剂)而变化，因此可以通过实验或实验制造商的信息提供。
64.术语“糖皮质类固醇”(“gc”)或“糖皮质激素”是指与糖皮质激素受体结合的甾类激素。糖皮质类固醇的通常特征在于其具有21个碳原子、在环a中的α,β-不饱和酮、连接至环d的α-酮醇基团。它们在c-11、c-17和c-19的氧化程度和羟基化程度上存在差异；参见rawn,“膜脂质的生物合成和运输以及胆固醇衍生物的形成(biosynthesis and transport of membrane lipids and formation of cholesterol derivatives),”biochemistry,daisy等(编),1989,第567页)。皮质醇是糖皮质类固醇。
65.盐皮质激素受体(mr)也称为i型糖皮质激素受体(gr i)，由人体内的醛固酮激活。
66.如本文所用，术语“糖皮质激素受体”(gr)指ii型gr，其是特异性结合皮质醇和/或皮质醇类似物例如地塞米松的胞内受体家族(参见例如，turner和muller,j.mol.endocrinol.2005 35(2):283-292)。所述糖皮质激素受体也称为皮质醇受体。该术语包括gr同种型、重组gr和突变gr。
67.术语“糖皮质激素受体调节剂”(grm)指调节与gr和激动剂结合相关联的任何生物响应的任何化合物。例如，作为激动剂的grm(例如地塞米松)增加hepg2细胞(人肝肝细胞癌
细胞系；英国ecacc)中酪氨酸氨基转移酶(tat)的活性。作为拮抗剂的grm(例如米非司酮)降低hepg2细胞中酪氨酸氨基转移酶(tat)的活性。可如文献中所述检测tat活性：a.ali等,j.med.chem.,2004,47,2441-2452。
68.如本文所用，术语“选择性糖皮质激素受体调节剂”(sgrm)指调节与gr和激动剂结合相关联的任何生物响应的任何组合物或化合物。通过“选择性”，药物优先结合gr而非其它核受体，例如黄体酮受体(pr)、盐皮质激素受体(mr)或雄激素受体(ar)。优选选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲合力是其与mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或者mr、ar和pr结合的亲合力的10倍(kd值的1/10)。在一个更优选的实施方式中，选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲合力是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr结合的亲合力的100倍(kd值的1/100)。在另一实施方式中，选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲合力是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr结合的亲合力的1000倍(kd值的1/1000)。瑞拉可兰是sgrm。
[0069]“糖皮质激素受体拮抗剂”(gra)指抑制与gr和激动剂结合相关联的任何生物响应的任何化合物。因此，可以通过测量化合物抑制地塞米松作用的能力来鉴定gr拮抗剂。可如文献中所述检测tat活性：a.ali等,j.med.chem.,2004,47,2441-2452。拮抗剂是ic
50
(半最大抑制浓度)少于10微摩尔的化合物。参见美国专利8,859,774的实施例1，其全部内容通过引用并入本文。
[0070]
如本文所用，术语“选择性糖皮质激素受体拮抗剂”(sgra)是指抑制与gr和激动剂结合相关联的任何生物响应的任何组合物或化合物(其中相对于化合物不存在情况下的响应确定抑制)。通过“选择性”，药物优先结合gr而非其它核受体，例如黄体酮受体(pr)、盐皮质激素受体(mr)或雄激素受体(ar)。优选选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲合力是其与mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或者mr、ar和pr结合的亲合力的10倍(kd值的1/10)。在一个更优选的实施方式中，选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲合力是其与mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或mr、ar和pr结合的亲合力的100倍(kd值的1/100)。在另一实施方式中，选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲合力是其与mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或mr、ar和pr结合的亲合力的1000倍(kd值的1/1000)。瑞拉可兰(corti125134)是一种sgra。
[0071]
如本文所用，短语“除非另有说明用糖皮质激素受体调节剂治疗”是指未患有医学界公认的可以糖皮质激素受体拮抗剂有效治疗的任何病症的患者，肝脂肪变性除外。本领域已知并被医学界接受的可以糖皮质激素受体拮抗剂有效治疗的病症包括：与干扰素-α治疗相关联的精神病、精神病性重度抑郁症、痴呆、应激障碍、自身免疫疾病、神经损伤和库欣综合征。
[0072]
术语“免疫反应/应答”是指上述细胞或肝脏产生的诸如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致从人体中选择性损伤、破坏或消除入侵性病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或正常人细胞或组织(在自身免疫或病理性炎症的情况中)。
[0073]
如本文所用，术语“检查点抑制剂敏感型癌”是指对检查点抑制剂有反应的癌症。向具有这种肿瘤的患者给予一种或多种检查点抑制剂将在患者中降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤中，并减少中性
粒细胞浸入acc肿瘤中，或与癌症改善相关的其他所需有益临床结果。
[0074]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗量”指有效治疗、消除或减缓被治疗疾病的至少一种症状的药剂量。一些情形中，“治疗有效量”或“有效量”可指能够显示可检测的治疗或抑制作用的功能性剂或药物组合物量。所述作用可通过本领域已知的任何试验方法检测。有效量可以是有效引起抗肿瘤反应的量。有效量可以是在受体对象中有效引起治疗性有益反应(例如抗肿瘤、体液和/或细胞免疫反应)(例如导致靶细胞生长抑制或死亡)的量。出于本公开目的，sgrm的有效量或抗体检查点抑制剂(和任选地，化学治疗剂)的有效量是这样的量，其将在患者中降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤中，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤中，或与癌症改善相关的其他所需有益临床结果。
[0075]
如本文所用，术语“增强有效量”是指这样的药剂量，其有效增强另一治疗剂在治疗、消除或减轻被治疗疾病的至少一种症状中的活性。例如，与抗体检查点抑制剂联合给予的sgrm的有效量是改善对该抗体检查点抑制物治疗反应的sgrm量。用于增强另一种试剂活性的试剂在治疗、消除或减轻疾病本身的症状方面可能有效或无效。在一些情况下，增强剂是无效的，并且与单独使用治疗剂的治疗相比，增强的作用可以通过因两种药物组合治疗所致症状缓解程度的增加来显示。在一些情况下，增强剂本身在治疗症状方面是有效的，并且增强效果可以通过增强剂和治疗剂之间的协同作用来显示。出于本公开的目的，sgrm用作增强剂，以增强检查点抑制剂在治疗癌症中的活性，而不论sgrm如果单独给予是否会有效治疗癌症。在一些实施方式中，可以实现10％至1000％的增强效果。在一些实施方式中，给予sgrm的量是使得肿瘤对检查点抑制剂敏感的量，即在患者中显示降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤中，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤中，或在不存在sgrm时用抗体检查点抑制剂治疗肿瘤不会出现的其他相关临床益处。
[0076]
如本文所用，术语“组合疗法”指给予对象至少两种药剂以治疗疾病。这两种试剂可同时给予，或可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予。这两种试剂可按相同或不同给药方案给予。在一些情形中，一种试剂按预定方案给予，而另一种试剂间歇给予。在一些情形中，两种药剂均间歇给予。在一些实施方式中，一种药剂(例如，sgrm)每天给予，而另一种药剂(例如，抗体检查点抑制剂)每两、三或四天或每周或每两周给予。
[0077]
如本文所用，术语“共同给予/施用”是指同时或在短时间内给予两种组合物，例如在约0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内。
[0078]
如本文所用，术语“检查点蛋白”是指存在于某些类型的细胞(如t细胞和某些肿瘤细胞)表面上的蛋白质，其可以诱导检查点信号转导通路并抑制免疫反应。常见的检查点蛋白包括ctla4、pd-1、pd-l1、lag3、b7-h3、b7-h4、tim3、cd160、cd244、vista、tigit和btla。(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264；baksh,2015,semin oncol.2015年6月；42(3):363-77)。其中，ctla4、pd-1和pd-l1的研究最为充分，并且靶向这些蛋白质的疗法在临床上比靶向其他检查点蛋白的疗法更先进。
[0079]
如本文所用，术语“pd-1”是指程序性细胞死亡蛋白1(也称为cd279)，其为免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白。pd-1由b细胞、t细胞和nk细胞表达。pd1的主要作用是在响应感染的炎症期间限制外周组织中的t细胞活性，以及限制自身免疫性。pd1表达在活化的t
biotechnology 16：778。这种单链抗体也意为包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。可以将特定scfv的任何vh和vl序列与人免疫球蛋白恒定区cdna或基因组序列连接，以产生编码完整igg分子或其他同种型的表达载体。使用蛋白质化学或重组dna技术，vh和vi还可以用于产生fab、fv或其他免疫球蛋白片段。还包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域表达于单个多肽链，但是使用的接头太短，使同一链上的两个结构域之间无法配对，从而迫使结构域与其他链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见如holliger,p.等，(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448；poljak,r.j.等，(1994)structure 2:1121-1123)。
[0086]
抗体可以是多克隆或单克隆的；异种异体、同种异体或同源的；或其修饰形式，如人源化、嵌合等。本发明的抗体特异性地或基本上特异性地结合一种或多种检查点蛋白。术语“单克隆抗体”是指仅含有一种能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的抗体分子群，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体分子群。单克隆抗体组合物通常对与其发生免疫反应的特定抗原表现出单一结合亲和力。
[0087]
本文中所用术语“组合物”旨在涵盖包含特定成分的产品，例如所述化合物，其互变异构形式，其衍生物，其类似物，其立体异构体，其多晶型物，其氘化种类，其药学上可接受的盐，酯，醚，代谢物，异构体混合物，其药学上可接受的溶剂合物和特定量的药学上可接受的组合物，以及由特定量的特定成分的组合直接或间接产生的任何产品。对于药物组合物而言，该术语旨在涵盖包含活性成分和构成运载体的惰性成分的产品，以及直接或间接导致任意两个或更多个成分组合、复合或聚集，或一个或更多个成分分解，或一个或更多个成分其他类型的反应或相互作用的任何产品。因此，本发明的药物组合物意在涵盖通过将本发明的化合物与其药学上可接受的运载体混合而制得的任何组合物。
[0088]
在一些实施方式中，术语“基本由
……
组成”指制剂中唯一活性成分是所示活性成分的组合物，但也可包括其他化合物，这些其它化合物用于稳定、保存制剂等，但不直接涉及所示活性成分的治疗作用。在一些实施方式中，术语“基本由
……
组成”可指包含活性成分和促进活性成分释放的组分的组合物。例如，该组合物可包含使活性成分随时间推移缓释至对象的一种或多种组分。在一些实施方式中，术语“由
……
组成”指包含活性成分和药学上可接受的运载体或赋形剂的组合物。
[0089]
如本文所用，术语“化合物”用于指具有独特、可鉴定的化学结构的分子部分。分子部分(“化合物”)可以游离物质形式存在，其中它不与其它分子相关联。化合物也可作为较大聚集体的部分存在，其中它与一个或多个其它分子相关联，但仍保留其化学特点。其中具有确定化学结构的分子部分(“化合物”)与溶剂的分子相关联的溶剂合物是此类相关形式的示例。水合物是其中相关联的溶剂为水的溶剂合物。述及“化合物”指(所述及结构的)分子部分本身，不论其是以游离形式还是缔合形式存在。
[0090]
当取代基基团由其常规化学式从左至右定义时，它们同样包括了从右至左定义该结构所得的化学上相同的取代基，例如-ch2o-与-och
2-等同。
[0091]
当取代基基团由其常规化学式从左至右定义时，它们同样包括了从右至左定义该结构所得的化学上相同的取代基，例如-ch2o-与-och
2-等同。
[0092]“烷基”是指具有指定数量碳原子的直链或支链饱和脂族基团。烷基可包括任何数
目的碳，例如c
1-2
、c
1-3
、c
1-4
、c
1-5
、c
1-6
、c
1-7
、c
1-8
、c
1-9
、c
1-10
、c
2-3
、c
2-4
、c
2-5
、c
2-6
、c
3-4
、c
3-5
、c
3-6
、c
4-5
、c
4-6
和c
5-6
。例如，c
1-6
烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。
[0093]“烷氧基”指具有氧原子的烷基基团，所述氧原子将烷基连接至连接点：烷基-o-。就烷基而言，烷氧基可具有任何适当数目的碳原子，如c
1-6
。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
[0094]“卤素”指氟、氯、溴和碘。
[0095]“卤代烷基”是指其中一些或全部氢原子被卤素原子替代的如上文所定义的烷基。就烷基而言，卤代烷基可具有任何合适数量的碳原子，如c
1-6
，并且包括三氟甲基、氟甲基等。
[0096]
术语“全氟”可用于表示全部氢被氟取代的化合物或基团。例如，全氟甲烷包括1,1,1-三氟甲基。
[0097]“卤代烷氧基”指一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。就烷基而言，卤代烷氧基可具有任何适当数目的碳原子，如c
1-6
。所述烷氧基可被1、2、3或更多个卤素取代。当所有氢都被一种卤素取代、例如被氟取代时，该化合物是全取代的，例如全氟化。卤代烷氧基包括但不限于：三氟甲氧基、2,2,2,-三氟乙氧基和全氟乙氧基。
[0098]“环烷基”指饱和的或部分不饱和的、单环的、稠合二环或桥接的多环组合件，其包含从3至12个环原子或指定数量的原子。环烷基可包括任意数量的碳，如c
3-6
、c
4-6
、c
5-6
、c
3-8
、c
4-8
、c
5-8
、c
6-8
、c
3-9
、c
3-10
、c
3-11
和c
3-12
。饱和的单环环烷基环包括例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的二环和多环环烷基环包括：例如，降冰片烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢化萘和金刚烷。环烷基还可以是部分不饱和的，在其环中具有一个或多个双键或三键。代表性的部分不饱和的环烷基包括但不限于：环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。当环烷基是饱和的单环c
3-8
环烷基时，示例性的基团包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。当环烷基是饱和单环c
3-6
环烷基时，示例性的基团包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
[0099]“杂环烷基”是指具有3至12个环原子和1至4个的n、o和s杂原子的饱和环系统。也可以使用其它的杂原子，包括但不限于b、al，si和p。所述杂原子还可被氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)
2-。杂环烷基可以包括任何数目的环原子，如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环原子。任何适当数量的杂原子都可包括在杂环烷基中，如1、2、3或4，或者1至2、1至3、1至4、2至3、2至4或3至4。所述杂环烷基可包括：如氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、氮杂环辛烷(azocane)、奎宁环、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1,2-，1,3-和1,4-异构体)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、噁烷(四氢吡喃)、氧杂环庚烷、硫杂丙环、硫杂环丁烷、四氢硫杂茂(thiolane)(四氢噻吩)、硫杂环己烷(thiane)(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫戊环、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。所述杂环烷基还可与芳族或非芳族环系统稠合以形成包括但不限于二氢吲哚的基团。
[0100]
当杂环烷基包括3-8个环原子和1-3个杂原子时，代表性的成员包括但不限于：吡
咯烷、哌啶、四氢呋喃、噁烷、四氢噻吩、硫杂环己烷、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、二噁烷和二噻烷。杂环烷基也可形成具有5-6个环原子和1-2个杂原子的环，代表性的成员包括但不限于：吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷和吗啉。
[0101]“芳基”指具有任意合适数量的环原子和任意合适数量的环的芳族环系统。芳基可包括任何合适数目的环原子，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6至10、6至12或6至14个环原子。芳基可以是单环，稠合以形成二环或三环基团，或由键连接以形成联芳基。代表性的芳基基团包括苯基、萘基和联苯基。其它芳基基团包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6-12个环原子，如苯基、萘基或联苯基。其它芳基具有6-10个环原子，如苯基或萘基。一些其它芳基具有6个环原子，如苯基。芳基可以是取代的或未取代的。
[0102]“杂芳基”指具有5个环原子到16个环原子单环、稠合二环或多环组合件，其中1到5个环原子是例如n，o或s的杂原子。其他的杂原子也可以是有用的，包括但不限于b，al，si和p。所述杂原子也可被氧化，例如但不限于n-氧化物，-s(o)-和-s(o)
2-。杂芳基可以包括任何数目的环原子，如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环原子。杂芳基基团中可包含任何合适数目的(如1、2、3、4或5个，或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5个)杂原子。杂芳基基团可具有5至8个环原子和1至4个杂原子、或5至8个环原子和1至3个杂原子、或5至6个环原子和1至4个杂原子、或5至6个环原子和1至3个杂原子。杂芳基可包括如下基团：例如，吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、和异噁唑。杂芳基也可稠合至芳族环系统(如苯环)以形成包括但不限于：苯并吡咯(如吲哚和异吲哚)、苯并吡啶(如喹啉和异喹啉)、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪(如酞嗪和噌啉)、苯并噻吩和苯并呋喃。其它杂芳基包括由化学键连接的杂芳基环(如联吡啶)。杂芳基可以是取代的或未取代的。
[0103]
杂芳基可通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-、2-和3-吡咯，吡啶包括2-、3-和4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-和5-咪唑、吡唑包括1-、3-、4-和5-吡唑，三唑包括1-、4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-、5-和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-、4-和5-噻唑，异噻唑包括3-、4-和5-异噻唑，噁唑包括2-、4-和5-噁唑，异噁唑包括3-、4-和5-异噁唑，吲哚包括1-、2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-、3-和4-喹啉，异喹啉包括1-、3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，并且苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。
[0104]
一些杂芳基基团包括具有5至10个环原子和1至3个包括n、o或s的环原子的基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩和苯并呋喃。其它一些杂芳基基团包括具有5至8个环原子和1至3个杂原子的基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。其它一些杂芳基基团包括具有9至12个环原子和1至3个杂原子的那些基团，例如吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、
酞嗪、噌啉、苯并噻吩、苯并呋喃和联吡啶。此外，其它杂芳基包括具有5至6个环原子和包括n、o或s的1至2个环杂原子的那些基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。
[0105]
一些杂芳基基团包含5至10个环原子和仅氮杂原子，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪和噌啉。其它杂芳基包含5-10个环原子和仅氧杂原子，例如呋喃和苯并呋喃。其它一些杂芳基包含5-10个环原子和仅硫杂原子，例如噻吩和苯并噻吩。此外，其他杂芳基基团包含5-10个环原子和至少2个杂原子，例如咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪和噌啉。
[0106]“杂原子”指o、s或n。
[0107]“盐”指本发明方法中使用的化合物的酸或碱盐。药学上可接受的盐的说明性示例有：无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐，有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐，和季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。合适的药学上可接受的盐的其他信息可在remington's pharmaceutical sciences(《雷明顿药物科学》)，第17版，马克出版公司(mack publishing company)，宾西马尼亚州伊斯顿，1985中找到，其通过引用纳入本文。
[0108]“异构体”指具有相同化学式但在结构上有区别的化合物。
[0109]“互变异构体”指两种或更多种结构异构体之一，它们以平衡态共存且易于从一种形式转换成另一种形式。
[0110]
本发明的化合物的描述遵循本领域技术人员已知的化学成键原理。因此，当某一基团可被一种或多种取代基取代时，这类取代基的选择应符合化学成键原理并生成非内在不稳定和/或本领域普通技术人员已知其在环境条件(如水性、中性或生理条件)下可能是不稳定的化合物。
[0111]
非甾类sgrm化合物包括具有稠合氮杂萘烷骨架、杂芳基酮稠合氮杂萘烷骨架和八氢稠合氮杂萘烷骨架的sgrm。具有稠合氮杂萘烷骨架的示例性糖皮质激素受体调节剂包括美国专利7,928,237和8,461,172中所描述的那些。具有杂芳基酮稠合氮杂萘烷骨架的示例性糖皮质激素受体调节剂包括美国专利8,859,774中所描述的那些。具有八氢稠合氮杂萘烷骨架的示例性糖皮质激素受体调节剂包括美国专利10,047,082中所描述的那些。
[0112]“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的运载体”指有助于活性剂施用于对象且被对象吸收的物质，并且可被包括在本发明的组合物中而不会对患者造成明显的不良毒理作用。本文所用的这些术语旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、抗氧化剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括：水、nacl、生理盐水、乳酸林格溶液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、包封剂、增塑剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。本领域普通技术人员应理解，其它药用赋形剂可用于本发明中。这类介质和试剂的药学活性物质用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入组合物。本领域普通技术人员应理解，其它药用赋形剂可用于本发明中。
[0113]
本文公开了通过sgrm治疗和抗体检查点抑制剂治疗联合治疗皮质醇过量患者acc肿瘤的方法。在实施方式中，癌症是检查点抑制剂敏感型癌症。在实施方式中，检查点抑制剂敏感型癌症也是gr

癌症。诊断癌症
[0114]
本方法针对治疗患有肾上腺皮质癌(acc)的患者。癌症的特征是异常细胞的不受控制生长和/或扩散。通常会进行活组织检查，并在显微镜下检查活组织检查中的细胞或组织，以确认可疑情况。在某些情形中，需要对细胞的蛋白质、dna和rna进行额外的测试以验证诊断。鉴定检查点抑制剂敏感型癌症
[0115]
在本发明的一些实施方式中，方法用于治疗具有至少一种检查点抑制剂敏感型癌症的患者。检查点抑制剂敏感型癌症是响应检查点抑制剂的癌症，例如给予一种或多种检查点抑制剂能降低acc肿瘤负荷，或实现与癌症改善相关的有益或所需临床结果。例如，给予检查点抑制剂可导致以下一种或多种情况：减少癌细胞数量；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓和/或停止)癌细胞浸润到周围器官；抑制(即在一定程度上减缓和/或停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状；缩小肿瘤大小；减少由疾病引起的症状；改善疾病患者生活质量；减少治疗该疾病所需其他药物的剂量；延缓疾病进展；和/或延长患者生存期。。
[0116]
检查点抑制剂敏感型肿瘤通常具有高表达的配体，例如pd-l1或b7，其分别与检查点蛋白pd-1或ctla-4结合。这些相互作用抑制了针对肿瘤细胞的免疫反应。除了acc，检查点抑制剂敏感型肿瘤的非限制性示例还包括：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、肾癌、胃癌(stomach cancer)、食管癌、口腔鳞状细胞癌、头颈癌、黑素瘤、肉瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、膀胱癌、胰腺癌、胆囊癌、胃癌(gastric cancer)、前列腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌和间皮瘤。检查点抑制剂
[0117]
本文公开的方法使用与至少一种检查点抑制剂组合的至少一种sgrm来治疗癌症。在一些实施方式中，检查点抑制剂是针对至少一种检查点蛋白的抗体(“cia”)。在一些实施方式中，检查点抑制剂是小分子非蛋白化合物(“cic”)，其阻断由一种或多种检查点蛋白诱导的免疫抑制通路。检查点抑制剂抗体(“cia”，也称为“抗体检查点抑制剂”)
[0118]
在一个实施方式中，用于治疗癌症的方法包括与抗体检查点抑制剂抗体组合给予sgrm。这种抗体可以阻断检查点蛋白的免疫抑制活性。许多此类抗体已被证明能有效治疗癌症，如针对pd-1、ctla4和pd-l1的抗体。
[0119]
抗pd-1抗体已用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤和肾细胞癌。示例性抗pd-1抗体包括派姆单抗(pembrolizumab)(先前称作兰博利珠单抗(lambrolizumab)，mk-3475,merck)，纳武单抗(nivolumab)(bms-936558,bristol-myers squibb)，amp-224(merck)，和匹利珠单抗(pidilizumab)(ct-011,curetech ltd.)。
[0120]
抗pd-l1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和血液系统恶性肿瘤。示例性的抗pd-l1抗体包括mdx-1105
(medarex)，medi4736(medimmune)，阿特珠单抗(atezolizumab)(mpdl3280a；genentech)，度伐鲁单抗(durvalumab)(astrazeneca)和bms-935559(bristol-myers squibb)。
[0083]
抗ctla4抗体已用于治疗黑色素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌的临床试验。抗ctl4a的显著特征是抗肿瘤作用的动力学，其生理反应所需的初始治疗后的滞后期最长达6个月。在一些情况中，观察到减少之前，肿瘤尺寸实际上在治疗起始后增加(pardoll，2012，nature reviews cancer 12:252-264)。示例性的抗ctla4 cia包括伊匹单抗(ipilimumab)(bristol-myers squibb)和特姆单抗(pfizer)。
[0121]
针对其他检查点蛋白的cia，例如lag-3(淋巴细胞活化基因-3)、b7-h3(b7同源物3蛋白)、b7-h4(b7同源物4蛋白)、tim-3(t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3)、cd160、cd244、vista(t细胞活化的v-结构域ig抑制物)、tigit(t细胞免疫球蛋白和itim结构域)，和btla(b和t细胞淋巴细胞衰减剂)也可与本文公开的sgrm组合使用以治疗癌症。例如，抑制lag-3的抗体包括imp321/艾夫替吉莫德α(eftilagimod alpha)(immutep)、瑞拉特利单抗(relatlimab)(bms-986016、bristol myers squibb(bms))、lag525(novartis)和mk-4280(merck)。抑制b7-h3的抗体包括依诺妥珠单抗(enoblituzumab)/mga271(macrogenics)、mgd009e(macrogenics)、
131
i-8h9/奥姆布尔单抗(omburtamab)(y-mab)和
124
i-8h 9/奥姆布尔单抗(y-mab)。抑制tim-3的抗体包括ly3321367(也称为ly332；eli lilly and company)、tsr-022(tesaro)、mbg453(novartis)、sym023(symphogen)、incagn2390(incyte)、bms-986258(bms)、ro7121661(roche)和shr-1702(jiangsu hengrui)；例如y3321367在早期临床试验中显示出良好的前景，包括与pd-l1检查点抑制剂联合使用时。抑制vista的抗体包括jnj-61610588(johnson&johnson)和ca-170d(curis)。抑制tigit的抗体包括mk-7684(merck)、替瑞利尤单抗(tiragolumab)/mtig7192a/rg-6058(genentech)、依替吉单抗(etigilimab)/omp-313 m32(oncomed)、bms-986207(bms)、ab-154(arcus biosciences)和asp-8374(potenza)。
[0122]
本公开中使用的cia可以是不同cia的组合，特别是若靶标检查点蛋白(如pd-1和ctla4)通过不同的信号转导通路抑制免疫反应。因此，针对任一检查点蛋白的cia组合或针对两种检查点蛋白的单个cia可以提供免疫反应增强。生成cia
[0123]
可以使用本领域熟知的方法开发cia。例如，参见kohler和milstein，nature 256：495(1975)，以及coligan等编，《免疫学实验指南(current protocols in immunology)》，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(john wiley&sons 1991)。单克隆抗体可以通过以下方法获得：给小鼠注射包含抗原的组合物(如检查点蛋白或其表位)，去除脾脏以获得b-淋巴细胞，将b-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对抗原的抗体的克隆，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
[0124]
可以通过各种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化产生的单克隆抗体。这种分离技术包括使用蛋白-a琼脂糖凝胶(sepharose)的亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析。例如，参见coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另见baines等，“免疫球蛋白g(igg)的纯化”，记载于《分子生物学方法(methods in molecular biology)》，第10卷，第79-104页(the humana press,inc.1992)。在最初产生针对检查点蛋白的抗体后，可以对
抗体进行测序，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。例如，参见leung等，hybridoma 13:469(1994)；us20140099254 a1。
[0125]
可以使用转基因小鼠生产人抗体，所述转基因小鼠经遗传工程改造以应对使用检查点蛋白的抗原性挑战，产生特异性人抗体。参见green等，nature genet，7:13(1994)、lonberg等，nature 368:856(1994)。针对检查点蛋白的人抗体也可以通过遗传或染色体转染方法、噬菌体展示技术或通过体外活化的b细胞构建。参见例如mccafferty等，1990，nature 348：552-553；美国专利5,567,610和5,229,275。修饰cia
[0126]
cia也可以通过引入相对于现有cia保守的修饰来产生。例如，经修饰的cia可以包含重链和轻链可变区，和/或与上述产生的抗体的对应物同源的fc区。可用于本文公开方法的经修饰的cia必须保留能够阻断检查点信号转导通路的所需功能特性。
[0127]
cia也可以通过改变蛋白质修饰位点来产生。例如，可以改变抗体糖基化位点以产生缺乏糖基化的抗体，并且如此修饰的cia通常具有抗体对抗原亲和力增强。抗体也可以通过在一个或多个peg基团与抗体连接的条件下与聚乙二醇(peg)反应来进行聚乙二醇化。聚乙二醇化可以增加抗体的生物半衰期。具有此类修饰的抗体也可与本文公开的选择性gr调节剂联用，只要其保留阻断检查点通路的所需功能特性即可。iii.评估候选检查点抑制剂的功能特性
[0128]
许多公知的测定法可用于评估如上文所公开的候选物(即，通过用包含检查点蛋白、检查点蛋白表位或来自组合文库的测试化合物的抗原免疫动物而产生的抗体)是否为抗体检查点抑制剂。非限制性示例分析包括结合分析——如酶联免疫吸附分析(elisa)、放射免疫分析(ria)——荧光活化细胞分选(facs)分析、基于细胞的试验和体内试验。结合试验
[0129]
在一个实施方式中，试验是直接结合试验。检查点蛋白可以与放射性同位素或酶标记物偶联，使得可以通过检测复合物中标记的检查点蛋白来确定检查点蛋白和候选物的结合。例如，可以直接或间接地用
125
i、
35
s、
14
c或3h标记检查点蛋白，并通过直接计数放射性发射或闪烁计数检测放射性同位素。可以例如通过测量直接结合来确定候选物结合其同源检查点蛋白的能力。或者，检查点蛋白分子可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶进行酶标记，并且通过将合适的底物转化为产物来确定候选物与靶标检查点蛋白的结合。
[0130]
酶联免疫吸附试验(elisa)通常用于评估cia候选物与其靶标检查点蛋白的结合特异性。在通常的试验中，通过在37℃下用5μg/ml检查点蛋白涂覆过夜来用检查点蛋白包被微量滴定板。将包含候选cia的血清样品在pbs、5％血清、0.5％吐温-20中稀释，并在室温下在孔中孵育1小时，然后在相同稀释物中加入抗人igg fc和igg f(ab’)-辣根过氧化物酶。在室温下1小时后，通过添加abts底物(sigma，苏里州圣路易斯密)评估酶活性，并在415-490nm下30分钟后读取。
[0131]
候选物的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准试验来评估，例如通过biacore分析(biacoreab，瑞典乌普萨拉)。在一个示例性试验中，使用biacore提供的标准胺偶联化学和试剂盒，通过伯胺将纯化的重组人检查点蛋白共价连接到cm5芯片(羧甲基葡聚糖涂覆的芯片)。通过在浓度为267nm、流速为50μl/分钟的hbs ep缓冲液(由
biacore ab提供)中流动候选者来测量结合。跟踪检查点蛋白-候选物缔合动力学3分钟，跟踪解离动力学7分钟。使用bia评估软件(biacore ab)将缔合和解离曲线拟合到1:1langmuir结合模型。为了使估算结合常数中亲合力的影响最小化，仅使用对应于缔合和解离阶段的初始数据段进行拟合。可以测量相互作用的kd、k
on
和k
off
值。优选的检查点抑制剂可以1
×
10-7
或更低的kd与其靶标检查点蛋白结合。
[0132]
对于通过与配体结合来阻断免疫应答的检查点蛋白，可以使用其他结合试验来测试候选物阻断配体与检查点蛋白结合的能力。在一个示例性试验中，流式细胞术用于测试配体(例如pd-l1)与转染的cho细胞上表达的检查点蛋白(例如，pd-1)结合的阻断。将各种浓度的候选物添加到表达检查点蛋白的细胞悬液中，并在4℃下孵育30分钟。洗去未结合的抑制剂，将fitc标记的配体蛋白加入试管中，并在4℃下孵育30分钟。使用facscan流式细胞仪(becton dickinson，加利福尼亚州圣何塞)进行facs分析。细胞染色的平均荧光强度(mfi)指示与检查点蛋白结合的配体的量。添加了候选物的样品中mfi降低表明候选物在阻断配体与靶标检查点蛋白的结合方面是有效的。
[0133]
均相时间分辨荧光(htrf)结合试验，如pct公开wo2015034820中所述，也可用于测定候选物阻断检查点蛋白-配体相互作用的能力。在一个实施方式中，据pd-1/pd-l1均相时间分辨荧光(htrf)结合试验所测量，该方法中使用的cic可以10pm或更小，例如从0.01到10pm，优选1pm或更小，例如0.1到1pm的ic
50
值抑制pd-1/pd-l1相互作用。基于细胞的试验
[0134]
在另一个实施方式中，评估候选物是否是抗体检查点抑制剂的试验是基于细胞的试验。混合淋巴细胞反应(mlr)试验，如美国专利8,008,449所述，常规用于测量t细胞增殖、il-2和/或ifn-υ的产生。在一个示例性试验中，使用人cd4

t细胞富集柱(r&dsystems)从pbmc纯化人t细胞。将候选物以不同浓度添加到多个t细胞培养物中。将细胞在37℃下培养5天，从每个培养物中提取100μl培养基用于细胞因子测定。使用opteia elisa试剂盒(bd biosciences)测量ifn-γ和其他细胞因子的水平。用3h-胸苷标记细胞，再培养18小时，并分析细胞增殖。结果表明，与对照相比，含有候选物的培养物显示出t细胞增殖增加、il-2和/或ifn-γ的产生增加，表明候选物在阻断检查点蛋白对t细胞免疫应答的抑制方面是有效的。体内试验
[0135]
在另一个实施方式中，用于评估候选物是否是抗体检查点抑制剂的试验是体内试验。在一个示例性试验中，将6-8周龄的雌性aj小鼠(harlan laboratories)按体重随机分为6组。第0天，将溶解在200μl dmem培养基中的2
×
106sa1/n纤维肉瘤细胞皮下植入小鼠右侧。用pbs载剂或候选物以预定剂量治疗小鼠。在第1天、第4天、第8天和第11天，通过腹腔注射约200μl含有候选物或载剂的pbs对动物给药。每周两次监测小鼠肿瘤生长，持续约6周。使用电子卡尺对肿瘤进行三维测量(高度
×
宽度
×
长度)，并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)或小鼠体重减轻超过15％时，对小鼠实施安乐死。结果表明，与对照组相比，候选物治疗组的肿瘤生长较慢，或达到肿瘤终点体积(1500mm3)的平均时间较长，表明候选物具有抑制肿瘤生长的活性。糖皮质激素受体调节剂(grm)
[0136]
通常，糖皮质激素过量患者中肾上腺皮质癌(acc)的治疗可通过给予有效量的选
择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)以及抗体检查点抑制剂来提供，该调节剂具有稠合氮杂萘烷结构，杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构或八氢稠合氮杂萘烷结构。在实施方式中，抗体检查点抑制剂对表达一种或多种抗原pd-1、ctla-4、pd-l1或pd-l2的细胞和肿瘤有效。在实施方式中，还可以给予癌症化疗剂。癌症化疗剂可以是例如选自：紫杉烷、烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、抗代谢剂、有丝分裂抑制剂及其组合。
[0137]
选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)化合物包括这样的化合物，其包含杂芳基-酮稠合氮杂萘烷结构(也可称为杂芳基-酮稠合氮杂萘烷骨架)。包含杂芳基-酮稠合氮杂萘烷结构的示例性sgrm化合物包括美国专利8,859,774、美国专利9,273,047、美国专利9,707,223、美国专利9,956,216中描述和公开的那些。本文中提及的所有专利、专利公开和专利申请通过引用其全部内容纳入本文。
[0138]
在一些情况下，grm骨架是稠合氮杂萘烷。在一些情况下，具有稠合氮杂萘烷骨架的grm是sgrm，并且可以是gra或sgra。某些情形中，所述稠合氮杂萘烷是具有如下结构式的化合物，或其盐及异构体：其中l1和l2独立地选自键和未取代的亚烷基；r1选自：未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、-or
1a
、nr
1cr1d
、-c(o)nr
1cr1d
和-c(o)or
1a
，其中r
1a
独立地选自：氢、未取代的烷基和未取代的杂烷基；r
1c
和r
1d
独立地选自：未取代的烷基和未取代的杂烷基，并且任选地，与它们所连接的氮连接形成未取代的环，其中所述环任选地包括其他环氮，r2具有如下结构式：其中，r
2g
选自：氢、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烃基、未取代的杂环烷基、-cn和-cf3；j是苯基；t是0到5的整数；x是-s(o2)-；r5是苯基，任选地被1-5个r
5a
基团取代，其中r
5a
选自：氢、卤素、-or
5a1
、s(o2)nr
5a2r5a3
、-cn和未取代的烷基，r
5a1
选自：氢和未取代的烷基，r
5a2
和r
5a3
各自独立地选自：氢和未取代的烷基。此类化合物的示例在美国专利7,928,237和美国专利8,461,172中公开，这两项专利均通过引用其全部内容纳入本文。
[0139]
在实施方式中，稠合氮杂萘烷sgrm是cort 108297，即，(r)-(4a-乙氧基甲基-1-(4-氟苯基)-6-(4-三氟甲基-苯磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h,1,2,6-三氮杂-环戊[b]萘，其具有以下结构：
[0140]
某些情形中，grm骨架是杂芳基酮稠合氮杂萘烷或八氢稠合氮杂萘烷。在一些情况下，具有杂芳基酮稠合氮杂萘烷或八氢稠合氮杂萘烷骨架的grm是sgrm，并且可以是gra或sgra。
[0141]
包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的示例性grm包括美国专利8,859,774中描述的那些，可以如该专利中公开的那样制备，该专利通过引用其全部内容纳入本文。这类示例性grm可以是sgrm。某些情形中，包含杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的grm或其盐及异构体具有如下结构：其中，r1是具有5-6个环原子和1-4个杂原子的杂芳基环，任选地被1-4个各自独立地选自r
1a
的基团取代，所述杂原子各自独立地选自下组：n、o和s；各r
1a
独立地选自下组：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、-cn、n-氧化物、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基；环j选自下组：环烷基环、杂环烷基环、芳基环和杂芳基环，其中所述杂环烷基和杂芳基环具有5-6个环原子和1-4个杂原子，所述杂原子各自独立地选自下组：n、o和s；各r2独立地选自下组：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、-cn、-oh、-nr
2ar2b
、-c(o)r
2a
、-c(o)or
2a
、-c(o)nr
2ar2b
、-sr
2a
、-s(o)r
2a
、-s(o)2r
2a
、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基，其中所述杂环烷基任选地被1-4个r
2c
基团取代；或者，与同一碳相连的两个r2基团组合形成氧代基团(＝o)；或者，两个r2基团组合形成具有5-6个环原子和1-3个杂原子的杂环烷基环，所述杂原子各自独立地选自下组：n、o和s的，其中所述杂环烷基环任选地被1-3个r
2d
基团取代；r
2a
和r
2b
各自独立地选自下组：氢和c
1-6
烷基；各r
2c
独立地选自下组：氢、卤素、羟基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、-cn和-nr
2ar2b
；各r
2d
独立地选自下组：氢和c
1-6
烷基，或者与相同环原子相连的两个r
2d
基团组合形成(＝o)；r3选自下组：苯基和吡啶基，各自任选地被1-4个r
3a
基团取代；各r
3a
独立地选自下组：氢、卤素和c
1-6
卤代烷基；和下标n是0-3的整数。
[0142]
在一些情形中，杂芳基酮稠合氮杂萘烷grm是瑞拉可兰(cort125134)，即，(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，其具有如下结构：
[0143]
在实施方式中，杂芳基-酮稠合氮杂萘烷sgrm是化合物(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1-h-吡唑并p,4-g]异喹啉-4a-基)(吡啶-2-基)甲酮，(称为“cort113176”)，其具有以下结构：
[0144]
包含八氢稠合氮杂萘烷结构的示范性grm包括美国专利10,047,082中公开的那些，其全部内容通过引用并入本文。在实施方式中，八氢稠合氮杂萘烷grm或其盐及异构体具有如下结构式：其中，r1是具有5-6个环原子和1-4个杂原子的杂芳基环，任选地被1-4个各自独立地选自r
1a
的基团取代，所述杂原子各自独立地选自下组：n、o和s；各r
1a
独立地选自下组：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、n-氧化物和c
3-8
环烃基；环j选自下组：芳基环和杂芳基环，其具有5-6个环原子和1-4个杂原子，所述杂原子各自独立地选自下组：n、o和s；各r2独立地选自下组：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、cn、oh、nr
2ar2b
、c(o)r
2a
、c(o)or
2a
、c(o)nr
2ar2b
、sr
2a
、s(o)r
2a
、s(o)2r
2a
、c
3-8
环烃基和具有1-3个各自独立的选自n、o和s的杂原子的c
3-8
杂环烷基；或者，相邻环原子上的两个r2基团组合形成具有5-6个环原子和1-3个杂原子的杂环烃基环，所述杂原子各自独立地选自下组：n、o和s，其中所述杂环烷基环任选地被1-3个r
2c
基团取
代；r
2a
、r
2b
和r
2c
各自独立地选自下组：氢和c
1-6
烷基；各r
3a
独立地是卤素；和下标n是0-3的整数。
[0145]
在一些情形中，八氢稠合氮杂萘烷grm是cort125281，即，((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-甲基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，其具有如下结构：鉴定选择性糖皮质激素受体调节剂(sgrm)
[0146]
为了确定测试化合物是否为sgrm，首先对该化合物进行试验以检测其结合至gr和抑制gr-介导的活性的能力，确定该化合物是否为糖皮质激素受体调节剂。若该化合物被确认为糖皮质激素受体调节剂，随后对其进行特异性测试，以确定相较于非gr蛋白，例如雌激素受体、黄体酮受体、雄激素受体或盐皮质激素受体，该化合物能否特异性地结合gr。在一个实施方式中，相较于非gr蛋白，sgrm以实质上更高的亲和力结合gr，例如至少高10倍的亲和力。相对于结合非gr蛋白质，sgrm结合gr的选择性是其100倍、1000倍或更大。结合
[0147]
测试化合物结合糖皮质激素受体的能力可采用多种试验检测，例如，通过筛选该测试化合物与糖皮质激素受体配体(例如地塞米松)竞争结合糖皮质激素受体的能力。本领域技术人员应知晓，有许多方法来进行这样的竞争性结合试验。在一些实施方式中，糖皮质激素受体与标记的糖皮质激素受体配体预孵育，随后与测试化合物接触。这类竞争性结合试验在本文中也可被称作结合置换试验(binding displacement assay)。与糖皮质激素受体结合的标记的配体数量减少表明测试化合物结合糖皮质激素受体。在一些情形中，标记的配体是荧光标记的化合物(例如，荧光标记的类固醇或类固醇类似物)。或者，可使用标记的测试化合物直接测量测试化合物与糖皮质激素受体的结合。这类试验被称为直接结合试验。
[0148]
可采用多种不同形式的直接结合试验和竞争性结合试验。这些形式可与免疫试验和受体结合试验中使用的那些类似。对于结合试验(包括竞争性结合试验和直接结合试验)的不同形式的描述，参见《基础和临床免疫学》(basic and clinical immunology)第7版(d.stites和a.terr编)1991；《酶免疫试验》(enzyme immunoassay)，e.t.maggio编，crc出版社，佛罗里达州博卡拉顿(1980)；以及“酶促免疫实验的实践和理论(practice and theory of enzyme immunoassays)”，p.tijssen，laboratory《生物化学与分子生物学实验室技术》(techniques in biochemistry and molecular biology)，埃尔斯威尔科学出版社(elsevier science publishers b.v.)，阿姆斯特丹(1985)，其各自通过引用方式纳入本文。
[0149]
在固相竞争性结合试验中，例如，样品化合物可与标记的分析物竞争结合与固体
表面结合的结合剂上的特异性结合位点。在此类形式中，标记的分析物可以是糖皮质激素受体配体，结合剂可以是与固相结合的糖皮质激素受体。或者，标记的分析物可以是标记的糖皮质激素受体，结合剂可以是固相糖皮质激素受体配体。与捕获剂结合的标记的分析物浓度与结合试验中测试化合物的竞争能力呈反比。
[0150]
或者，可在液相中进行竞争性结合试验，且可用各种本领域已知技术将结合的标记蛋白质与未结合的标记蛋白质分离。例如，已经开发了多种操作用于区分结合的配体和过量结合的配体或区分结合的测试化合物和过量未结合的测试化合物。这些操作包括通过蔗糖梯度沉降、凝胶电泳或凝胶等电聚焦鉴定结合的复合物；利用硫酸鱼精蛋白沉淀受体-配体复合物或在羟基磷灰石上吸附；和通过在葡聚糖涂覆的活性炭(dcc)上吸附或通过结合固化抗体来除去未结合的化合物或配体。分离后，测定结合的配体或测试化合物的量。
[0151]
或者，可进行均质结合试验，其中不需要分离步骤。例如，糖皮质激素受体上的标记物可以通过糖皮质激素受体与其配体或测试化合物的结合来改变。标记的糖皮质激素受体中的这一改变导致标记物发射的信号减少或增加，从而使得在结合试验结束时对标记物的度量能够检测或定量结合状态下的糖皮质激素受体。可使用多种标记物。组分可用多种方法中的任一种来标记。有用的放射性标记物包括引入3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p的那些标记物。有用的非放射性标记物包括引入荧光团，化学发光剂，磷光剂，电化学发光剂等的那些标记物。荧光剂在用于检测蛋白质结构偏移(如荧光各向异性和/或荧光极化)的分析技术中特别有用。标记物的选择取决于所需灵敏度、与化合物偶联的容易程度、稳定性要求和可用的仪器。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利4,391,904，其通过引用全文纳入本文以用于全部目的。标记物可以按照本领域已知方法与试验所需组分直接或间接偶联。一些情形中，测试化合物在对gr具有已知亲和力的荧光标记的配体(例如类固醇或类固醇类似物)存在下的情况下与gr接触，并通过测量标记的配体的荧光极化来估计结合的与游离的标记的配体的量。hepg2酪氨酸氨基转移酶(tat)试验
[0152]
测试对gr显示所需结合亲和力的化合物在抑制gr介导的活性方面的活性。通常对该化合物进行酪氨酸氨基转移酶试验(tat试验)，其评估测试化合物抑制地塞米松诱导的酪氨酸氨基转移酶活性的能力。参见实施例1。适用于本文公开方法的gr调节剂的ic
50
(半最大抑制浓度)少于10微摩尔。也可以使用其他试验，包括但不限于以下述试验，以确认化合物的gr调节活性。基于细胞的试验
[0153]
涉及全细胞或含糖皮质激素受体的细胞组分的基于细胞的试验也可用于检测测试化合物的结合或糖皮质激素受体活性的调节。可用于本发明方法的示例性细胞类型包括，例如，任何哺乳动物细胞，包括白细胞，例如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞，例如t细胞和b细胞、白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、肿瘤细胞(包括小鼠乳腺肿瘤病毒细胞)、内皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞，肌肉细胞，乳腺肿瘤细胞，卵巢癌，宫颈癌，成胶质细胞瘤，肝细胞，肾细胞和神经元细胞，以及真菌细胞，包括酵母。细胞可以是原代细胞或肿瘤细胞或其它类型的永生细胞系。当然，糖皮质激素受体可在不表达内源性型糖皮质激素受体的细胞中表达。
[0154]
在一些情况下，糖皮质受体的片段以及蛋白质融合体可用于筛选。当需要与糖皮
质激素受体配体竞争结合的分子时，所用的gr片段是能够结合配体(如地塞米松)的片段。或者，gr的任何片段都可用作靶标，以鉴定结合糖皮质激素受体的分子。糖皮质激素受体片段可包括糖皮质激素受体的任何片段，例如至少20、30、40、50个氨基酸，上至含糖皮质激素受体中除一个氨基酸外的所有氨基酸的蛋白质。
[0155]
在一些实施方式中，糖皮质激素受体活化所触发的信号转导减少被用于鉴定糖皮质激素受体调节剂。糖皮质激素受体的信号转导活性可用许多方式确定。例如，可监测下游分子事件来确定信号转导活性。下游事件包括因糖皮质激素受体刺激而出现的活动或表现。对于功能评价未经改变的细胞中转录活化和拮抗作用有用的示例性下游事件包括多种糖皮质激素反应元件(gre)-依赖性基因(pepck、酪氨酸氨基转移酶、芳香酶)的上调。此外，可以使用对gr活化易感的特定细胞类型，如成骨细胞中的骨钙素表达，其由糖皮质激素下调；显示出糖皮质激素介导的pepck和葡萄糖-6-磷酸(g-6-pase)上调的原代肝细胞。在使用众所周知gre调节型序列(例如，在报告基因构建体上游转染的小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(mmtv))转染的细胞系中也证实了gre介导的基因表达。有用的报告基因构建体的示例包括萤光素酶(luc)，碱性磷酸酶(alp)和氯霉素乙酰转移酶(cat)。转录抑制的功能评价可以在例如单核细胞或人皮肤成纤维细胞等细胞系中进行。有用的功能试验包括测量转染的细胞系中由nfkb或ap-1转录因子调控的基因表达；il-1β刺激的il-6表达；胶原酶、环加氧酶-2和多种趋化因子(mcp-1、rantes)的下调；或lps刺激的细胞因子释放(例如tnfα)的那些试验。
[0156]
在全细胞试验中测试的化合物还可以在细胞毒性试验中测试。细胞毒性试验用于确定感知效应在何种程度上由于非糖皮质激素受体结合细胞效应所致。在示例性的实施方式中，细胞毒性试验包括使组成性活性细胞与测试化合物接触。任何细胞活力降低都表明细胞毒性作用。3)其它试验
[0157]
可用于鉴定本发明方法中使用的组合物的其他许多示例性试验是基于体内糖皮质激素活性的试验。例如，可采用评估假定gr调节剂抑制受糖皮质激素刺激的细胞中dna吸收3h-胸苷能力的试验。或者，假定gr调节剂可与3h-地塞米松竞争结合肝细胞瘤组织培养物gr(参见例如，choi等，steroids 57:313-318,1992)。作为另一示例，可利用假定gr调节剂阻断3h-地塞米松-gr复合物的能力(alexandrova等，j.steroid biochem.mol.biol.41:723-725,1992)。为了进一步鉴定假定gr调节剂，还可使用能够通过受体结合动力学来区分糖皮质激素激动剂和调节剂的动力学试验(如jones，biochem j.204:721-729，1982中所述)。
[0158]
在另一说明性示例中，daune，molec.pharm.13:948-955，1977和美国专利4,386,085中描述的试验可用于鉴定抗糖皮质激素活性。简言之，将切除肾上腺的大鼠的胸腺细胞孵育在包含地塞米松和不同浓度的测试化合物(假定gr调节剂)的营养培养基中。将3h-尿苷添加至细胞培养基，进一步孵育，随后测量放射性标记物掺入多核苷酸的程度。糖皮质激素激动剂使掺入的3h-尿苷的量减小。因此，gr调节剂将对抗该作用。iii.选择性
[0159]
然后，对如上选择的gr调节剂进行选择性试验，以确定它们是否是sgrm。通常，选择性试验包括体外测试结合糖皮质激素受体的化合物与非糖皮质激素受体蛋白质的结合
程度。选择性试验可在体外或在基于细胞的系统中进行，如上文所述。可针对任何合适的非糖皮质激素受体蛋白，包括抗体、受体、酶等来测试结合。在示例性的实施方式中，非糖皮质激素受体结合蛋白是细胞表面受体或核受体。在另一个示例性的实施方式中，非糖皮质激素受体蛋白是类固醇受体，如雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体或盐皮质激素受体。
[0160]
相对于mr拮抗剂，gr拮抗剂的选择性可采用本领域技术人员已知的多种试验来测量。例如，可通过测量拮抗剂结合gr(相较于mr)的能力来鉴定特定拮抗剂(参见例如，美国专利5,606,021；5,696,127；5,215,916；5,071,773)。这类分析可采用直接结合试验或通过评估已知配体存在情况下与纯化的gr或mr的竞争性结合来进行。在一个示例性试验中，将高水平稳定表达糖皮质激素受体或盐皮质激素受体的细胞(参见例如，美国专利5,606,021)用作纯化的受体来源。然后直接检测配体对受体的亲和力。然后选择相对于mr表现出对gr的亲和力为至少10倍、100倍更高，通常为1000倍的那些gr调节剂用于本发明方法。
[0161]
选择性试验还可包括测试抑制gr介导的活性而非mr介导的活性的能力。鉴定此类gr特异性调节剂的一种方法是采用转染试验评估拮抗剂防止报告构建体活化的能力(参见例如，bocquel等，j.steroid biochem molec.biol.45:205-215,1993；美国专利5,606,021、5,929,058)。在一个示例性的转染试验中，将编码受体的表达质粒和包含与受体特异性调节元件相连的报告基因的报告质粒共转染到合适的受体阴性宿主细胞中。然后，将转染的宿主细胞在存在或不存在能够激活报告质粒的激素反应性启动子/增强子元件激素(例如皮质醇或其类似物)的情况下培养。随后，监测经转染和培养的宿主细胞的报告基因序列产物的诱导(即，存在)。最后，通过测定拮抗剂存在或不存在情况下报告基因的活性来测量激素受体蛋白(由表达质粒上的受体dna序列编码，并在经转染和培养的宿主细胞中产生)的表达和/或类固醇结合能力。可与gr和mr受体的已知拮抗剂相比来确定化合物的拮抗剂活性(参见例如，美国专利5,696,127)。然后，功效报告为各化合物相对于参比拮抗剂化合物观察到的最大反应百分比。然后，选择相对于mr、pr或ar表现出对gr活性为至少100倍，通常1000倍或更高的gr调节剂用于本文公开的方法。药物组合物和给药i制剂
[0162]
在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包括药学上可接受的赋形剂和sgrm以及药学上可接受的赋形剂和cic或cia。
[0163]
本文公开的任何sgrm、cic或cia可与药学上可接受的运载体一起配制。这样的组合物可以包括本发明的一种或多种(例如，两种或更多种不同的)抗体、或免疫偶联物或双特异性分子或其组合。例如，本发明的药物组合物可包含结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性抗体)的组合。
[0164]
在实施方式中，本发明提供了用于治疗患有acc并具有过量皮质醇的患者的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的赋形剂和grm。在一些实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和sgrm。在优选实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和非甾体类sgrm。
[0165]
grm和sgrm(如本文所用，grm和sgrm包括非甾体类grm和非甾体类sgrm)可以各种口服、胃肠外和局部剂型制备并给药。优选口服制备物。口服制备物包括适于患者吸收的片剂、丸剂、粉末剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、凝胶剂、糖浆、浆料、混悬剂等。grm和sgrm也可
通过注射给予，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内给予。同样，grm和sgrm可通过吸入(例如鼻内吸入)给予。此外，grm和sgrm可以透皮给药。因此，本发明还提供包含药学上可接受的运载体或赋形剂和grm或sgrm的药物组合物。
[0166]
对于从grm和sgrm制备药物组合物而言，药学上可接受的运载体可以是固体或液体。固体形式制备物包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体运载体可以是一种或多种物质，其也可起到稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的作用。关于制剂和给药技术的细节在科学和专利文献中有广泛地描述，参见例如最新版本的《雷明顿药物科学》(remington's pharmaceutical sciences)，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(mack publishing co)(“雷明顿”)。
[0167]
在粉末剂中，运载体是细碎的固体，其与细碎的活性组分grm或sgrm混合。在片剂中，活性组分与具有所需粘合性质的运载体以合适比例混合并压制为所需形状和大小。
[0168]
所述粉末和片剂优选地包含5％或10％-70％的活性化合物。合适的运载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制备物”旨在包括活性化合物伴有作为运载体的包封材料的制剂，所述运载体提供胶囊，其中，伴有或不伴有其它运载体的活性组分被运载体包围，由此与其相联。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合于口服给药的固体剂型。
[0169]
合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；来自玉米、小麦、稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和胶原。若需要，可添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸，或其盐，例如海藻酸钠。
[0170]
糖衣剂芯体具有合适的包衣剂，如浓缩糖溶液，其中还可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣剂包衣中可加有染料或颜料，用于产品标示或表征活性化合物的量(即剂量)。本发明的药物制备物还可采用如下形式口服：例如明胶制成的推入式(push-fit)胶囊，以及明胶和包衣剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的gr调节剂。软胶囊中，gr调节剂化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，例如含有或不含稳定剂的脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。
[0171]
液体形式制备物包括溶液、悬浮液和乳液，例如水或水/丙二醇溶液。对于胃肠外注射，可将液体制备物在水性聚乙二醇溶液中配制成溶液。
[0172]
适于口服使用的水溶液可通过将活性组分溶解于水中并按需添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适用于口服使用的水性悬浮液可通过将细碎的活性组分分散在含有粘性物质的水中来制备，所述粘性物质例如，天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶、和分散剂或润湿剂，例如天然磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物
10000mg，更通常为1.0mg-6000mg，最典通常为50mg-500mg。根据具体应用和活性组分的功效，合适的剂量还包括约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000mg。若需要，所述组合物还可包含其它相容的治疗剂。
[0181]
所述药物制备物优选是单位剂型。以这种形式将制备物细分成含有适量本发明化合物和组合物的单位剂量。单位剂型可以是包装的制备物，所述包装包含分散量的制备物，如小瓶或安瓿瓶中分装的片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭，或者可以是适当数量的这些剂型的包装形式。
[0182]
可以口腔给予grm，包括sgrm，。例如，grm可以如本文所述的丸剂、胶囊剂或液体制剂施用。或者，可以通过胃肠外给药提供grm。例如，grm可以静脉内施用(如通过注射或输注)。本文描述给予本文所述化合物及其药物组合物或其制剂的其他方法。
[0183]
在一些实施方式中，给予一剂grm。在其他实施方式中，给予超过一剂grm，如2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂或更多剂。在某些情况下，剂量是等量的。在其他情况下，剂量是不等量的。剂量可以在给药期间增加或逐渐减少。剂量将根据例如grm特性和患者特征而变化。
[0184]
任何合适的grm剂量都可用于本文公开的方法中。给予grm的剂量可以是至少约例如100毫克(mg)/天、约150mg/天、约200mg/天、约250mg/天、约300mg/天、约350mg/天、约400mg/天、约450mg/天、约500mg/天、约550mg/天、约600mg/天、约650mg/天、约700mg/天、约750mg/天、约800mg/天,约850mg/天、约900mg/天、约950mg/天、约1000mg/天或更多。
[0185]
在一些情况下，grm(例如sgrm，例如非甾体sgrm)的有效量为130mg/kg/天的日剂量，其中grm与至少一种化疗剂一起给予。在一些实施方式中，grm的日剂量为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、25或30mg/kg/天。在一些情形中，grm至少给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80周。
[0186]
在实施方式中，口服给予grm.在一些实施方式中，grm以至少一剂给药。换而言之，grm可以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂给药。在实施方式中，grm以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂口服给药。
[0187]
可以在例如2-48小时内给予对象一剂或多剂中的至少一剂grm。在一些实施方式中，grm以单剂给药。在其他实施方式中，在2-48小时内，例如2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内，7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、11小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、20小时内，22小时内、24小时内、26小时内、28小时内、30小时内、32小时内、34小时内、36小时内、38小时内、40小时内、42小时内、44小时内、46小时内或48小时内给予超过一剂grm，例如2剂、3剂、4剂、5剂或更多剂。在一些实施方式中，grm在2-48小时、2-36小时、2-24小时、2-12小时、2-8小时、8-12小时、8-24小时、8-36小时、8-48小时、9-36小时、9-24小时、9-20小时、9-12小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、18-48小时、18-36小时、18-24小时、24-36小时、24-48小时、36-48小时或42-48小时内给予。
[0188]
可根据患者所需并耐受的剂量和频率进行单次或多次制剂给药。制剂应提供足量的活性剂以有效治疗疾病状态。因此，在一个实施方式中，用于口服给予grm的药物制剂的日剂量是每天每千克体重约0.01mg-约150mg(mg/kg/day)。在一些实施方式中，日剂量为约1.0-100mg/kg/天、5-50mg/kg/天、10-30mg/kg/天和10-20mg/kg/天。可以使用更低的剂量，特别是当药物给予解剖学上隐蔽的部位，如脑脊髓液(csf)空腔，不同于口服给药进入血
液，其进入体腔或器官内腔。明显较高的剂量可用于局部给药。用于制备可胃肠外给予的制剂的实际方法对本领域技术人员是已知的或显而易见的，并在出版物中有更详细的描述，如雷明顿，引用同上。还参见nieman，“受体介导的抗类固醇作用(receptor mediated antisteroid action)”agarwal等编，de gruyter，纽约(1987)。
[0189]
用grm或sgrm治疗具有皮质醇过量的患者中acc的持续时间可根据对象所患疾病严重程度和对象对grm或sgrm的反应而变化。在一些实施方式中，可以给予grm和sgrm约1周-104周(2年)，更通常为约6周-80周，最通常为约9周-60周。合适的给药时间段还包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-104周。合适的给药时间段还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、100、和104周。通常grm或sgrm的给药应当持续直到观察到临床上显著减少或改善。根据本发明使用grm或sgrm治疗可以持续两年之久或更长。
[0190]
在一些实施方式中，grm或sgrm的给药不是持续的，可以停止一段或多段时间，然后恢复给药一段或多段时间。合适的停止给药时间段包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-100周。合适的停止给药时间段还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、和100周。
[0191]
剂量方案还考虑了本领域熟知的药代动力学参数，即吸收率、生物利用度、代谢、清除率等(参见，例如，hidalgo-aragones(1996)j.steroid biochem.mol.biol.58:611-617；groning(1996)pharmazie 51:337-341；fotherby(1996)contraception 54:59-69；johnson(1995)j.pharm.sci.84:1144-1146；rohatagi(1995)pharmazie 50:610-613；brophy(1983)eur.j.clin.pharmacol.24:103-108；最新的雷明顿，引用同上)。现有技术允许临床医生确定各患者、gr调节剂和待治疗疾病或病症的剂量方案。
[0192]
此外，sgrm可与已知可用于调节糖皮质激素受体的其它活性剂联用，或与单独可能无效但可有助于活性剂功效的辅助剂联用。本文公开的新方法包括联合抗体检查点抑制剂给予sgrm。
[0193]
在一些实施方式中，共同给药包括在给予一种活性剂(grm或sgrm)的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内给予第二活性剂。共同给药包括同时、大致同时(例如彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任意顺序依次施用两种活性剂。在一些实施方式中，共同给药可通过共配制完成，即制备包含两种活性剂的单一药物组合物。在其它实施方式中，活性剂可单独配制。在另一个实施方式中，活性剂和/或辅助剂可彼此连接或偶联。
[0194]
在包含sgrm的药物组合物已经在可接受的运载体中配制后，可将其置于合适的容器中，并贴上用于治疗所示病症的标签。对于grm或sgrm的给药，此类标签应包括例如关于给药量、频率和方法的说明。
[0195]
本发明所述的药物组合物可以盐形式提供，并能用包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等的许多酸形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其它情况下，制备物可以是在ph4.5-5.5的1mm-50mm组氨酸、
108；最新的雷明顿，同上)。现有技术允许临床医生基于治疗的疾病或病症来确定各患者、sgrm和检查点抑制剂的剂量方案。
[0201]
单位剂量制备物中的活性组分的量可不同，或在如下范围内调节：0.1mg-6000mg，更通常为1.0mg-3000mg，最通常为10mg-300mg。根据具体应用和活性组分的功效，合适的剂量还包括约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000mg。若需要，组合物还可包含其它相容的治疗剂。可根据患者所需并耐受的剂量和频率进行单次或多次组合物给药。
[0202]
含有抗体检查点抑制剂的组合物应提供足够量的活性组分(即抗体检查点抑制物)以有效治疗癌症，例如，当单独给予或与grm(例如sgrm)组合给药时，其量能够降低acc肿瘤负荷或实现与癌症改善相关的其他有益或所需临床结果。因此，剂量方案可能变化很大，但可以使用标准方法常规地确定。在一些情况下，药物组合物包含cic，并且可以适当给予约1-2000mg、优选约10-约1000mg、最优选约250-500mg活性成分的日剂量。日剂量可以每天1-4剂给药。其他给药计划包括每周一剂和每两天一剂循环。
[0203]
在一些情况下，药物组合物含有cia，并且(活性组分的)剂量范围为约0.0001-100mg/kg宿主体重，更通常为0.01-20mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg重量、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重或在0.1-20mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每天一次、每周一次、一周两次、每两周一次、每三周一次，每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三到六个月一次。在一些情况下，治疗包括根据前述给药方案中的一种给予cia第一时段，以及根据前述给药剂方案中的另一种给予cia第二时段。在一些情况下，治疗中止一段时间，然后恢复相同或不同给药方案。例如，患者可能接受cia给药方案两周，休息一周，再继续两周，依此类推。本发明cia的优选剂量方案包括通过静脉给予0.1mg/kg体重、0.3mg/kg体重，2mg/kg体重、3mg/kg体重或10mg/kg，其中抗体使用以下给药方案之一给予：(i)每四周六剂，然后每三月给予；(ii)每三周给予；(iii)3mg/kg体重一次，然后每三周1mg/kg体重。
[0204]
在一些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或更多种cia，在这种情况下，给予的每种抗体的剂量在所指示的范围内。通常在多种情况下给予cia。单次剂量之间的间隔可以是例如每周，每月，每三个月或每年。间隔也可以是不规则的，如测量患者体内针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中为约25-300μg/ml。
[0205]
在组合疗法中使用的含grm(例如sgrm)的组合物应提供足够量的活性剂，以有效增强检查点抑制剂治疗癌症的活性，例如，所述活性剂的量当与治疗量的抗体检查点抑制剂组合时，相较于没有grm(例如sgrm)情况下相同治疗量的检查点抑制剂，可以在患者中降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤中，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤中，或以其他方式更大程度地缓解相关癌症症状，或实现更有益或更需要的临床结果。在一些情况下，所述组合物以使acc肿瘤对检查点抑制剂敏感的量提供grm(例如，sgrm)，即显示肿瘤负荷降低或当单独用检查点抑制剂治疗肿瘤时不会出现的其他相关临床益处。因此，根据给药途径和待治疗癌症的类型，给药方案可能变化很大，但可以使用标准方法常规地确定。在一些实施方式中，每月一次、每月两次、每月
三次、每隔一周、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天、每天、每天两次、每天三次或更频繁地给予grm(例如sgrm)。
[0206]
在一些情况下，含有grm(例如sgrm)的药物组合物的每日口服剂量可用于本文公开的方法，范围为每天约1-约2000mg(mg/天)。在一些实施方式中，日剂量为约10-1000mg/天、50-500mg/天、100-300mg/天。可以使用更低的剂量，特别是当药物给予解剖学上隐蔽的部位，如脑脊髓液(csf)空腔，不同于口服给药进入血液，其进入体腔或器官内腔。明显较高的剂量可用于局部给药。用于制备可胃肠外给予的组合物的实际方法对本领域技术人员是已知的或显而易见的，并在出版物中有更详细的描述，如雷明顿，引用同上。还参见nieman，“受体介导的抗类固醇作用(receptor mediated antisteroid action)”agarwal等编，de gruyter，纽约(1987)。在一些实施方式中，sgrm是cort125281。在一些实施例中，sgrm是cort 125134。
[0207]
在本发明包含grm(例如sgrm)或抗体检查点抑制剂的药物组合物已在可接受的载剂中配制后，可将其置于适当的容器中，并贴上用于治疗所示病症的标签。对于grm(例如，sgrm)或检查点抑制剂的给予，此类标签将包括例如关于给予的量、频率和方法的说明。组合疗法
[0208]
本文公开的方法涉及向患有acc肿瘤负荷的对象给予grm(例如sgrm)和抗体检查点抑制剂两者的组合疗法，在某些情况下，acc肿瘤负荷是由于抗体检查点抑制物敏感型癌症的存在。在一些实施方式中，组合疗法涉及在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予抗体检查点抑制剂和sgrm。据信包括给予患有acc肿瘤负荷的对象grm(例如sgrm)和抗体检查点抑制剂两者的组合疗法在患者中有效降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加acc肿瘤中t细胞和nk细胞浸润，减少患者acc肿瘤中中性粒细胞浸润，并为患者提供其他治疗益处。
[0209]
在一些情况下，grm(例如sgrm)和检查点抑制剂按照相同或不同的给药方案给药。在一些情况下，grm(例如，sgrm)按照计划的方案给予，而检查点抑制剂间歇给予。在一些情况下，检查点抑制剂按照计划的方案给予，而grm(例如，sgrm)间歇给予。在一些情况下，间歇给予grm(例如sgrm)和检查点抑制剂。在一些实施方式中，每天给予grm(例如sgrm)，每周或每两周给予检查点抑制剂，例如抗体检查点抑制剂。
[0210]
在一些情况下，每月一次或两次，每月三次，每隔一周，每周一次，每周两次，每周三次，每周四次，每周五次，每周六次，每隔一天，每天，每天两次，每天三次或以更高频繁依次或同时给予grm(例如，sgrm)和检查点抑制剂，持续约一天到约一周、从约两周到约四周、从约一个月到约两个月、从约二个月到大约四个月、约四个月到六个月、大约六个月到八个月、到约八个月到一年、约1年到约2年的时间段内，或约2年至约4年或更长的时间段。
[0211]
在一些实施方式中，组合疗法包括共同给予grm(例如sgrm)和抗体检查点抑制剂。在一些实施方式中，抗体检查点抑制剂和grm(例如sgrm)的联合给药涉及同时或大致同时(例如，彼此相隔约1、5、10、15、20或30分钟内)给予两种药剂。
[0212]
可以采用grm或sgrm和抗体检查点抑制剂的各种组合来治疗患有acc并具有过量皮质醇的患者。这些治疗可在患者中有效降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤，并为患者提供其他治疗益处。“组合疗法”或“与
……
组合/联合”并不意味着治疗剂必须同时给予
和/或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。grm或sgrm和抗体检查点抑制剂可以按照相同或不同的剂量方案给药。在一些实施方式中，可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予grm或sgrm和抗体检查点抑制剂。在一些实施方式中，grm或sgrm和抗体检查点抑制剂同时或大致同时给药(例如，彼此之间约1、5、10、15、20或30分钟内)。给予grm或sgrm和抗体检查点抑制剂的组合疗法的非限制性实例如下，例如，grm或sgrm为“a”，而作为部分化疗方案给予的抗体检查点抑制物为“b”：
[0213]
a/b/ab/a/bb/b/aa/a/ba/b/bb/a/aa/b/b/b b/a/b/b
[0214]
b/b/b/a b/b/a/b a/a/b/b a/b/a/b a/b/b/a b/b/a/a
[0215]
b/a/b/a b/a/a/b a/a/a/b b/a/a/a a/b/a/a a/a/b/a
[0216]
给予患者治疗化合物或药剂需要遵循给予此类化合物的一般方案，必要时考虑疗法的毒性。外科干预也可以与所述疗法相结合。
[0133]
本方法可以与其他治疗方式相结合，例如手术、放疗、靶向疗法、免疫疗法、使用生长因子抑制剂或抗血管生成因子。持续时间
[0217]
使用grm(例如sgrm)和抗体检查点抑制剂以在患者中降低肿瘤负荷、恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路、增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤，并为患者提供其他治疗益处的治疗的持续时间可以根据对象的病情严重程度和对象对组合疗法的反应变化。在一些实施方式中，可以给予grm(例如sgrm)和/或检查点抑制剂约1周-104周(2年)，更通常为约6周-80周，最通常为约9周-60周。合适的给药时间段还包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-104周。合适的给药时间段还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、100、和104周。一般而言，sgrm和/或抗体检查点抑制剂的给药应持续直到观察到所需临床益处，并且可在观察到该益处之后继续，例如以维持或进一步增强该益处。根据本发明使用grm(例如sgrm)和抗体检查点抑制剂的治疗可持续长达两年或甚至更长。在一些实施方式中，grm(例如sgrm)给药的持续时间与检查点抑制剂给药的持续时间相同。在一些实施方式中，sgrm给药的持续时间比检查点抑制剂给药的持续时间短或长。
[0218]
在一些实施方式中，grm(例如sgrm)或抗体检查点抑制剂的给药不是持续的，可以停止一段或多段时间，然后恢复给药段或多段时间。合适的停止给药时间段包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-100周。合适的停止给药时间段还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、和100周。评估皮质醇过量患者中acc治疗的改善，包括降低肿瘤负荷
[0219]
据信本文公开的组合疗法有效治疗具有过量皮质醇且患有acc肿瘤的患者；在实施方式中，这些治疗可在患者中有效降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤，并为患者提
供其他治疗益处。用于测量这些反应的方法对于癌症治疗领域的熟练技术人员是公知的。用于测量肿瘤负荷的方法描述于实体肿瘤响应评价标准(“recist”)指南，可获自http://ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/docs/recist_guideline.pdf。
[0220]
在一个方式中，肿瘤负荷通过分析肿瘤特异性遗传标志物的表达来测量。这种方法特别适用于转移性肿瘤或不易测量的肿瘤，例如骨髓癌。肿瘤特异性遗传标志物是癌细胞特有的或相较于非癌细胞在癌细胞中丰度高得多的蛋白质或其它分子。例如，见wo2006/104474。肿瘤特异性遗传标记物的非限制性示例包括：肝癌的α-甲胎蛋白(afp)、多发性骨髓瘤的β-2-微球蛋白(b2m)；用于绒毛膜癌和生殖细胞肿瘤的β-人绒毛膜促性腺激素(β-hcg)；胰腺癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌的ca19-9；卵巢癌的ca-125和he4；结直肠癌的癌胚抗原(cea)；用于神经内分泌肿瘤的嗜铬粒蛋白a(cga)；膀胱癌的纤维蛋白/纤维蛋白原；前列腺癌的前列腺特异性抗原(psa)；和甲状腺癌的甲状腺球蛋白。见http://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet。
[0221]
测量肿瘤特异性遗传标志物表达水平的方法为人熟知。在一些实施方式中，从血液样品或肿瘤组织中分离遗传标志物的mrna，并进行实时逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)以定量遗传标志物表达。在一些实施方式中，进行western印迹或免疫组化分析来评价肿瘤特异性遗传标志物的蛋白质表达。通常检测随本发明组合疗法的时间推移采样的多个样品中的肿瘤特异性遗传标志物的水平，而水平的下降与肿瘤负荷的减小相关联。
[0222]
在另一方式中，本文公开的组合治疗所致肿瘤负荷降低由肿瘤尺寸减小或身体中癌量减少显示。对于肿瘤尺寸的测量通常由基于成像的技术实现。例如，计算机断层(ct)扫描可以通过识别现有病灶的生长或新病灶或肿瘤转移的发展，提供关于肿瘤缩小或生长以及疾病进展的准确和可靠的解剖学信息。患者中的t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路恢复，t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤增加，和中性粒细胞浸入acc肿瘤减少也可以通过基于影像的技术或其它合适手段测量。
[0223]
在另一个方法中，患者中的肿瘤负荷降低，t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路恢复，t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤增加，和中性粒细胞浸入acc肿瘤减少也可以通过功能和代谢成像技术测量。这些技术可以通过观察灌注、氧合和代谢的变化来提供对治疗响应的早期评估。例如，
18
f-fdg pet利用带放射性标记的葡萄糖类似物分子来评估组织代谢。肿瘤通常具有升高的葡萄糖摄取，对应于肿瘤组织代谢减少的值的变化表明肿瘤负荷减少。类似的成像技术公开于kang等，korean j.radiol.(2012)13(4)371-390。
[0224]
接受本文公开的组合疗法的患者可以表现出不同程度的肿瘤负荷减少，并且可以在患者中表现出不同程度的t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路恢复，t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤增加和中性粒细胞浸入acc肿瘤减少。在一些情况中，患者可显示完全响应(cr)，也称作“无疾病迹象(ned)”。cr表示通过测试、体检和扫描指示，所有可检测的肿瘤均已消失。在一些情况中，接受本文公开的组合疗法的患者可能经历部分响应(pr)，其大致对应于总肿瘤体积减少至少50％，但仍存在一些残留疾病的迹象。在一些情形中，深度部分反应中的残留疾病可能实际上是死亡的肿瘤或疤痕，从而被分类为具有pr的少数患者可能实际上具有cr。同样地，在治疗过程中显示缩小的许多患者在持续治疗后显示进一步缩小，并且可达到cr。在一些情况中，接受组合疗法的患者可能经历较小响应(mr)，这大致意味着小量的缩小，也即，多于25％但少于50％的总肿瘤体积(那将达到pr)。在一些情况中，接受组
合疗法的患者可能显示稳定疾病(sd)，这意味着肿瘤大致保持相同尺寸，但可包括小量生长(通常少于20或25％)或小量缩小(少于pr的任何情况，除非打破微小响应。若如此，则sd定义为一般低于25％)。
[0225]
除了降低acc肿瘤负荷、恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路、增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤以及减少中性粒细胞浸入acc肿瘤外，来自组合疗法的所需有益或所需临床结果还可包括例如：减少癌细胞向外周器官的浸润(即，减缓至一定程度和/或停止)；抑制肿瘤转移(即，减缓至一定程度和/或停止)；增加响应率(rr)；增加响应持续时间；与癌症相关联的一种或多种症状减轻至一定程度；减少治疗疾病所需的其它药物剂量；延迟疾病进展；和/或延长患者存活；和/或改善生活质量。用于评价这些作用的方法是为人熟知的和/或公开于，例如，http://cancerguide.org/endpoints.html和recist指南，引用同上。实施例
[0226]
以下提供的实施例仅是用于说明，而非限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相似的结果。实施例1：hepg2酪氨酸氨基转移酶(tat)试验
[0227]
以下方案描述了用于测量hepg2细胞(人肝细胞癌细胞系；ecacc，英国)中地塞米松对tat诱导的试验。在37℃、5％/95％(v/v)co2/空气下使用补充了10％(v/v)胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺和1％(v/v)neaa的meme培养基培养hepg2细胞。然后对hepg2细胞进行计数并调整，使其在不含酚红的rpmi 1640、10％(v/v)活性炭剥离的fbs、2mm l-谷氨酰胺中产生0.125x 106个细胞/ml的密度，并以200μl中25,000个细胞/孔接种在96孔无菌组织培养微量滴定板中，并在37℃、5％co2下孵育24小时。
[0228]
然后，除去生长培养基并使用测试培养基{rpmi 1640，无酚红、2mm l-谷氨酰胺 10μm毛喉素}代替。然后，针对100nm地塞米松攻击对测试化合物进行筛选。随后，将化合物从10mm储液中连续半对数稀释至100％(v/v)二甲亚砜中。然后，生成8-点半对数稀释曲线，随后在试验培养基中1:100稀释以产生10
×
最终化合物试验浓度，这导致最终化合物试验浓度范围为0.1％(v/v)二甲亚砜中10-0.003μm。
[0229]
在37℃、5/95(v/v)co2/空气下在微量滴定板中将测试化合物与细胞预孵育30分钟，之后加入100nm地塞米松并随后再孵育20小时以使得tat诱导最优化。
[0230]
然后，hepg2细胞采用包含蛋白酶抑制剂混合物的30μl的细胞裂解缓冲液在4℃裂解15分钟。然后，可添加155μl的底物混合物，其包含溶于0.1m磷酸钾缓冲液(ph 7.4)中的5.4mm酪氨酸钠盐、10.8mmα酮戊二酸和0.06mm吡哆醛5’磷酸。37℃孵育2小时之后，可通过添加15μl的10m氢氧化钾水溶液终止该反应，然后使板在37℃另孵育30分钟。tat活性产物可通过λ340nm处的吸光度测量。
[0231]
可通过使用抑制百分比(针对100nm地塞米松tat刺激进行标准化)对比化合物浓度作图并将数据拟合至4参数逻辑方程来计算ic
50
值。可使用cheng和prusoff方程将ic
50
值转化为ki(平衡解离常数)，前提是拮抗剂相对于地塞米松是竞争性抑制剂。实施例2：皮质醇过量的acc肿瘤患者中的基因表达
[0232]
方法：来自不同肾上腺切除术(n＝71)的gc状态、mrna表达、dna突变和dna甲基化数据通过癌症基因组图谱(tcga)(可通过“cancer.gov”上url：about-nci/organization/
ccg/research/srtuctural-genomics/tcga访问)。为了去卷积免疫细胞类型丰度，对mrna数据应用xcell。随机森林被用于获得基因特征(aran,dvir,zicheng hu和atul j.butte."xcell:数字描绘组织细胞异质性概况(xcell:digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape)."genome biology 18.1(2017):220)。基因分析也可通过cbioportal(可通过cbioportal.org访问)进行。
[0233]
结果：在gc-和gc acc病例中，858个基因的表达差异显著。kegg通路分析显示gc 病例中参与类固醇合成和分泌的7条通路的基因表达较高。19条通路表达较低，其中大部分与自然杀伤细胞、t细胞和免疫活性有关。低甲基化主要在类固醇合成途径中观察到。在gc 病例中，肿瘤浸润的cd4

记忆(p＝0.003)、cd8

记忆(p《0.001)和nkt细胞(p＝0.014)耗竭，而肿瘤相关中性粒细胞富集(p《0.01)。在gc 病例中观察到较高的肿瘤突变负荷(tmb)(p＝0.029)。
[0234]
与没有系统性皮质醇过量的acc肿瘤相比，gc acc肿瘤在免疫过程中表现出特异性差异。具体而言，涉及自然杀伤(nk)介导的细胞毒性、th17细胞分化、t细胞受体信号转导、th1/2分化以及抗原加工和呈递的基因在gc acc肿瘤中下调(图1)。
[0235]
此外，具有或不具有皮质醇过量的acc肿瘤中特异性免疫细胞的存在是不同的。在gc 病例中，原初和记忆cd4 细胞、cd8 细胞、cd8 中央记忆细胞和自然杀伤t细胞(nkt)较低(见图2)。相反，肿瘤相关中性粒细胞(tan)在gc acc中较高。
[0236]
gc acc中免疫细胞和免疫相关转录物的丰度较低。gc 肿瘤中较高的tmb可能与新抗原(neoantigens)耐受性增加有关。这些发现表明，gr拮抗作用可通过逆转内源性gc的免疫抑制效应来促进acc或其他gc活性升高的恶性肿瘤中的肿瘤免疫应答。结论：
[0237]
抗体检查点抑制剂的临床反应取决于免疫系统。具体而言，t细胞功能和抗原递呈对于抗体检查点抑制剂的临床疗效至关重要。此外，免疫细胞的浸润与抗体检查点抑制剂的临床疗效相关。具有低t细胞或高中性粒细胞浸润的肿瘤对抗体检查点抑制剂的反应较差。因此，使用grm(如sgrm)逆转gc 的影响可改善对抗体检查点抑制剂的反应。因此，在患有acc且皮质醇过量的患者中，grm(如sgrm)与抗体检查点抑制剂的联合给药据信有效降低acc肿瘤负荷，恢复t细胞和自然杀伤(nk)细胞信号转导通路，增加t细胞和nk细胞浸入acc肿瘤，减少中性粒细胞浸入acc肿瘤。实施例3：皮质醇过量的acc肿瘤患者中的基因表达
[0238]
方法：来自不同肾上腺切除术(n＝71)的gc状态(基于临床体征和症状或生化证据)、mrna表达、dna突变和dna甲基化数据通过tcga(www.cancer.gov/tcga)访问。两例肉瘤样病例被排除在分析之外。分析了394036个甲基化探针，并使用β混合分位数归一化(bmiq)对数据进行归一化。为了去卷积免疫细胞类型丰度，对mrna数据应用xcell(aran等，genome biol.18(1)：220(2017))。使用公开的gr活性特征对肿瘤病例进行评分(west等，24(14)：3433-3446(2018))。随机森林用于获得预测gc 肿瘤的基因特征。通过在包含80％数据的随机子集上自举随机森林并将基因的平均自举重要性与阈值进行比较来鉴定特征基因。通过将相同的程序应用于预测随机标记而不是真实gc /-标记的随机森林来计算阈值，以模拟信号缺失。选择基因重要性的第99.9个分位数作为阈值。
[0239]
结果：肾上腺皮质癌根据肿瘤的糖皮质激素状态进行分类。(图3a)使用tcga中的
3446(2018))证实，与癌症基因组图谱(tcga)中的其他肿瘤类型相比，acc中gr活性高(图8)。具有不同激素和gc状态的acc病例之间没有差异(图8插图)。
[0248]
图9：基因特征可以预测gc 样肿瘤病例。图9显示了使用随机森林分析来区分gc /-acc病例的基因特征的推导结果。nlrp1和znf683(突出显示)被确定为特征的重要组成部分。仅显示高于阈值0.0028的特征基因。随机森林方法用于推导模型，该模型可区分roc auc＝0.87
±
0.09的gc /-acc病例(图9)。炎性体的传感组分(nlrp1)和il-15活化nk的介导物(znf683)被确定为该特征的重要部分(图9插图)。
[0249]
如图10a和图10b所示，然后将基因特征用于tcga中的其他肿瘤类型以鉴定具有gc 样转录谱的肿瘤。图10a显示了acc基因特征在tcga肿瘤中的应用。根据acc中已知的gc /-病例分布，得出了0.75的截留值，以区分gc /-肿瘤(图10a中的水平线)。根据该评分，葡萄膜(uvm)和皮肤黑色素瘤(skcm)可具有与gc acc相似的最高频率的病例(图10b)。图10b显示了与gc acc相似的肿瘤病例的预测频率。据预测，葡萄膜(uvm)和皮肤黑色素瘤(skcm)的肿瘤发生率最高，与gc acc相似。
[0250]
糖皮质激素过量(gc )对acc中基因的影响显著多于其他激素。在gc acc中，类固醇合成基因的表达升高，而免疫相关基因受到抑制。正常肾上腺细胞表达类固醇合成基因，但不表达免疫相关基因。类固醇合成基因在gc 病例中低甲基化，而在免疫基因中的甲基化在gc 和gc-病例之间没有差异。此外，与gc-相比，在gc 病例中发现较少的浸润性免疫细胞(t细胞和nkt细胞)，表明免疫效应是由于免疫细胞浸润的变化而不是转录变化。gc acc病例的肿瘤突变负荷较高，这可能是由于观察到的免疫抑制或免疫细胞排斥所致，所述免疫抑制或免疫细胞排斥可能与gc 病例中对非自身抗原的耐受性较高有关。公布的gr活性评分显示gc 和gc-病例之间无差异，这可能是由于肾上腺中gc的局部高浓度，无论系统性gc水平如何。相反，淋巴结暴露于升高的gc活性可能会对acc肿瘤的免疫浸润产生负面影响。一项新的基因特征预测葡萄膜和皮肤黑色素瘤中gc 样肿瘤的最高频率。在gc acc中观察到的免疫细胞和免疫相关转录物丰度减少为gc限制免疫系统检查点抑制剂(ici)疗法反应的机制的提供了见解。gr拮抗作用可增加免疫相关转录物或免疫细胞浸润，从而促进gc acc和其他gc活性升高的恶性肿瘤中的肿瘤免疫应答。实施例4.皮质醇和瑞拉可兰对体外自然杀伤细胞功能的影响
[0251]
鉴于gc 和gc-acc之间自然杀伤(nk)细胞的显著差异，体外评估皮质醇对人nk细胞的影响。皮质醇抑制(而瑞拉可兰恢复)nk细胞活化、增殖和直接肿瘤细胞杀伤。gc acc中nk细胞和其他免疫细胞丰度的减少为gc限制ici疗法反应的机制提供了见解。gr拮抗作用可增加肿瘤中nk细胞和其他免疫细胞的丰度和功能，从而促进gc acc和其他gc活性升高的恶性肿瘤中的肿瘤免疫应答。该假设将在瑞拉可兰 ici的1期试验中进行测试。皮质醇及瑞拉可兰对体外nk细胞功能的影响
[0252]
考虑到gc 病例中nk相关基因的显著抑制，评估了gr调节人nk细胞的直接影响。nk细胞分离自健康供体并用il-2刺激。活化(cd25 cd69 细胞的丰度)通过刺激增加，被皮质醇抑制，并通过瑞拉可兰恢复(曼-惠特尼检验(mann-whitney)p＝0.0039)(图11a)。nk细胞的增殖也通过刺激增加，被皮质醇抑制，并通过瑞拉可兰恢复(曼-惠特尼检验p＝0.0099)(图11b)。细胞因子分泌(转录物和分泌蛋白)也通过刺激增加，被皮质醇抑制，并通过瑞拉可兰恢复(图12a-12d)。被刺激显著诱导、被皮质醇抑制并通过瑞拉可兰恢复的基因包括关
键nk活化基因，包括il2受体和激活子lag3(图12d)。这些数据为观察到的gc对acc肿瘤中nk细胞群的影响提供了实验证实。
[0253]
活化、增殖和细胞因子分泌都表明了由皮质醇和瑞拉可兰介导的nk细胞功能变化。为了确定这种功能变化是否也影响靶细胞杀伤，将nk细胞与k562肿瘤细胞一起孵育。在不同的nk:肿瘤细胞比下，皮质醇抑制肿瘤细胞杀伤，而瑞拉可兰使其恢复(图13a)。当以5:1的比例向nk细胞中添加瑞拉可兰时，nk细胞肿瘤杀伤有显著改善(曼-惠特尼检验p＝0.004)(图13b)。因此，糖皮质激素在体外抑制人nk细胞对肿瘤细胞的杀伤。
[0254]
皮质醇是强大的免疫细胞功能转录调节物和介导物。评估全身皮质醇活性的影响具有挑战性，因为皮质醇的昼夜变化和超昼夜变化限制了任何单一皮质醇评估的可解释性。acc多组学数据提供了一个独特的场景，其中丰富的多组学数据与皮质醇过量的临床评估相结合。研究这种放大的皮质醇生理学，目的是更好地理解acc，并深入了解其他肿瘤类型中皮质醇活性可能的亚临床表现。
[0255]
在有或无gc过量的acc病例中观察到858个基因的显著差异。较少的基因在其他比较中有显著差异，如任何类固醇激素 相对于-的病例。毫不奇怪，参与类固醇合成的基因在gc过量的病例中较高。观察到类固醇合成基因的启动子低甲基化。相反，gc 病例中免疫基因表达的减少可能是免疫细胞浸入gc 肿瘤不良的结果。gr活性的评估(通过已发表的基因特征；参见west等，clin cancer res，2018.24(14)：第3433-3446页)表明，在有或无gc过量的acc病例中，肿瘤内gr活性相似。这可能是由高皮质醇水平引起的，肾上腺独立于全身皮质醇水平。因此，免疫浸润的差异可能是由于gc的系统性效应，包括对系统性初级和次级淋巴器官的影响。gc对淋巴器官的影响也可能与gc acc病例中观察到的tmb增加有关，因为高gc可能增加对新抗原的耐受性。
[0256]
使用gc 对比gc-案例，发现了能够区分两者的基因特征。该基因特征可能有助于未来诊断肿瘤活检或切除术中的gc过量。当对非acc肿瘤的该特征进行评分时，葡萄膜和皮肤黑色素瘤表现出与gc acc转录特征相似的最频繁(尽管仍然罕见)病例。这支持了先前关于皮肤中局部皮质醇生成的报道(见vekulic等，和tissue injury.j biological chemistry,2011.286(12)第10265
–
10275页)。这些肿瘤将为评估acc外gr拮抗作用的免疫效应提供一个合理选择。
[0257]
在gc acc多组学数据中，nk细胞的抑制是显著的。在gc 病例中，nk活化基因显著降低，nk活化基因znf683是其中区分gc 和gc-病例最重要的基因之一。对人nk细胞、皮质醇和gr调节剂瑞拉可兰的功能研究证实，gr是nk功能的关键调节子。皮质醇抑制nk细胞增殖、细胞表面活化标志物上调、肿瘤细胞杀伤、ifnγ分泌和ifnγ转录。它还抑制其他效应细胞因子的分泌和il-2受体(il2ra)的表达。这些观察证实了在gc acc中观察到的nk活化基因的减少。皮质醇抑制而瑞拉可兰促进lag3(cd223，lag3)和4-1bb(cd137 tnfrsf9)的表达，两者都是旨在改善抗肿瘤免疫反应的实验性激动剂的靶点。趋化因子配体3-样1(ccl3l1)是一种吸引淋巴细胞的趋化因子，在受刺激的nk细胞中，其表达也受到皮质醇的抑制，这可以解释t细胞浸润gc acc的减少。在gc acc中观察的免疫相关转录物丰度减少为gc限制ici疗法反应的机制提供了见解。
[0258]
肾上腺癌是一种严重疾病，患者在肿瘤和激素管理方面都面临挑战。皮质醇过量的acc患者会出现库欣综合征，这种症状描述了肾上腺、垂体或异位来源的系统性皮质醇过
量。库欣综合征本身可通过这些患者的血管事件、心血管事件或感染导致死亡(参见yaneva m.等，european j endocrinology 2013,169621-627)。gr调节剂korylm
tm
(米非司酮)被批准用于治疗皮质醇过量症状。这些数据更进一步表明，使用瑞拉可兰进行选择性gr调节可以缓解系统性皮质醇引起的免疫抑制。因此，选择性gr拮抗作用既可促进其他免疫调节剂(如免疫检查点抑制剂或更多实验性nk靶向剂)的抗肿瘤功效，又可降低皮质醇过量的危险后遗症。这一假设正在当前的i期研究中，或在gc过量的acc患者中使用瑞拉可兰 派姆单抗中直接测试。
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gc过量对nk细胞的影响特别显著，皮质醇对体外nk细胞影响的直接评估证实了有效和广泛的抑制活性。此外，瑞拉可兰可逆转皮质醇的影响并恢复nk细胞活化、增殖和靶细胞杀伤。因此，据信与单独使用ici的治疗相比，通过联合给予gr调节剂(如瑞拉可兰)和免疫检查点抑制剂(ici)治疗患有过量皮质醇的肾上腺皮质癌患者(gc acc)提供了有效和改善的治疗。
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