一种体外血脑屏障模型的构建方法

1.本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种体外血脑屏障模型的构建方法。


背景技术：

2.神经系统是人体结构最复杂、功能最重要的生命系统之一。围绕神经系统进行的科研探索，如化学品神经毒性风险评估和靶向神经系统的药物研发等，却时刻面临着伦理问题、相关组织取材困难以及种属间反应的差异性等诸多挑战。血脑屏障(blood-brainbarrier，bbb)是介于血液循环系统和脑部中枢神经系统之间的一种动态界面，通过严格调节血液和脑部的物质交换，维持脑部内环境的稳态平衡和实现正常的神经系统功能。大量脑部疾病都与血脑屏障的防御功能受到破坏相关。科研人员迫切希望构建能模拟体内血脑屏障(blood-brain barrier,bbb)的体外细胞模型以开展相关科学探索，对于进一步研究血脑屏障的功能原理以及屏障功能失效导致的脑损伤药物治疗具有重要意义。脑微血管内皮细胞，周细胞和星形胶质细胞是构成bbb的主要细胞成分。其中，脑微血管内皮细胞表达的紧密连接和黏附连接蛋白使细胞具备低细胞旁和细胞间通透性，形成致密封闭的屏障；周细胞和星形胶质细胞维持屏障的完整性。
3.目前，现有的体外bbb模型，包括脑微血管内皮细胞单层培养模型、脑微血管内皮细胞与周细胞或/和星形胶质细胞共培养的多细胞模型以及3d类器官模型等，不同体外bbb模型各具优缺点，具体如表1所示。
4.表1不同体外bbb模型的优缺点
[0005][0006]
现有的体外bbb模型所使用的参数不尽相同，构筑屏障特性的内皮细胞也有多种来源，包括人源性的，鼠源性的，猪和牛来源的，以及原代细胞培养。然而，使用动物源性的细胞存在不可忽视的高细胞旁渗透性和种属间反应差异性的缺点。高细胞旁渗透性使得模型与实际血脑屏障生理特性相差甚远；而种属间反应差异性使得实验结果外推至人的反应，变得不确切。由于种属间反应的差异性，超过90％在动物实验中具有希望的神经候选药物在人类临床试验中失败。另一方面，分离原代内皮细胞费时费力，且实验结果往往受制于细胞分离纯度影响，可重复性小。因此，为了更贴近人类真实的血脑屏障环境，需要综合考
虑在构建体外血脑屏障模型中所选用的细胞系。除此之外，最近发展起来的利用多能诱导干细胞或胚胎干细胞制备血脑屏障内皮细胞也能构建起很好的血脑屏障环境，但是，细胞培养及诱导分化等相关技术要求较高，试剂耗材价格昂贵，不利于大范围推广使用，同时，该方法的重现性也有待验证。
[0007]
因此，开发一种快速、可靠、易于大范围推广的体外血脑屏障模型具有重要意义。


技术实现要素：

[0008]
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种体外血脑屏障模型的构建方法，对构建体外血脑屏障模型的细胞系进行了综合筛选，采用人源性永生化的脑组织细胞系——脑微血管内皮细胞hcmec/d3细胞、周细胞hbvp细胞和星形胶质细胞svg p12细胞，利用transwell细胞培养装置进行体外三维血脑屏障模型的构建，并优选出上述三种细胞的最佳排列模式，更贴近人类真实的血脑屏障环境；此外，模型的构建方法较简单，无需复杂设备，模型成熟所需时间短，且可稳定维持较长的成熟时间，便于大范围推广应用。
[0009]
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
[0010]
本发明提供一种体外血脑屏障模型的构建方法，包括如下步骤：
[0011]
1)细胞系选择：选择hcmec/d3细胞作为脑微血管内皮细胞，选择hbvp细胞作为周细胞，选择svg p12细胞作为星形胶质细胞；
[0012]
2)包被：采用包被液对transwell细胞培养装置的transwell膜层进行包被；所述transwell细胞培养装置包括transwell小室；
[0013]
3)细胞接种：选取对数生长期的相应细胞，先后进行细胞接种：
①
将svg p12细胞接种在第一孔板里培养；
②
将transwell小室倒扣在第二孔板里，将hbvp细胞接种在transwell小室的膜下层培养，贴壁生长后，再将transwell小室正置在第三孔板里培养；
③
将hcmec/d3细胞接种在所述transwell小室的膜上层培养，将接种有hcmec/d3和hbvp细胞的transwell小室与接种有svg p12细胞的第一孔板组合起来，hbvp细胞通过所述transwell膜层与hcmec/d3细胞间接接触，构建得到体外血脑屏障模型。
[0014]
采用上述技术方案，无需复杂设备，本发明按照上层、中层和下层的顺序分别接种hcmec/d3、hbvp和svgp12三种人源性细胞，上层腔室模拟血管内环境，而下层腔室则模拟脑组织内环境，进行了完整性和功能性的验证，模型具有更好的紧密屏障特性和转运外排功能，更贴近人类真实的血脑屏障环境；构建的体外血脑屏障模型在细胞培养箱中培养48h(即构建后的第二天)开始成熟，此时的teer值、紧密性等开始快速增加，到第三天达到最大值，体外血脑屏障模型发育完全，模型成熟所需时间短，且可稳定维持较长的成熟时间(可持续至第六天)。
[0015]
优选地，所述包被液为鼠尾胶原蛋白i型溶液，其浓度为10-20μg/ml，采用预冷的乙酸溶液配制得到。
[0016]
更优选地，所述鼠尾胶原蛋白i型溶液的浓度为12-18μg/ml，所述乙酸溶液的浓度为0.004-0.008m。
[0017]
更优选地，所述hcmec/d3细胞的接种密度为1.8
×
10
5-2.2
×
105细胞/cm2。
[0018]
更优选地，所述svg p12细胞的接种密度为1.2
×
10
4-1.8
×
104细胞/cm2。
[0019]
更优选地，所述hbvp细胞的接种密度为0.8
×
10
6-1.2
×
106细胞/cm2。
[0020]
更优选地，本发明提供的体外血脑屏障模型的构建方法，还包括步骤4)：对所构建模型的屏障特性和转运功能进行检测。
[0021]
更优选地，所述第一孔板为12孔板，所述第二孔板为6孔板，所述第三孔板为12孔板。
[0022]
更优选地，所述transwell细胞培养装置购自美国康宁公司，采用0.4μm孔径的聚碳酸脂滤膜。
[0023]
此外，本发明还挺上述体外血脑屏障模型的构建方法构建得到的体外血脑屏障模型。
[0024]
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0025]
(1)本发明对构建体外血脑屏障模型的细胞系进行了综合筛选，采用人源性永生化的脑组织细胞系——脑微血管内皮细胞hcmec/d3细胞、周细胞hbvp细胞和星形胶质细胞svg p12细胞进行模型的构建，避免了动物源性的细胞存在的高细胞旁渗透性和种属间反应差异性的缺点，也避免了使用原代细胞的带来的不稳定性。
[0026]
(2)本发明利用transwell细胞培养装置进行体外三维血脑屏障模型的构建，并优选出上述三种细胞的最佳排列模式，按照上层、中层和下层的顺序分别接种hcmec/d3、hbvp和svg p12三种人源性细胞，上层腔室模拟血管内环境，而下层腔室则模拟脑组织内环境，进行了完整性和功能性的验证，模型具有更好的紧密屏障特性和转运外排功能，更贴近人类真实的血脑屏障环境。
[0027]
(3)本发明对模型核心部分的脑微血管内皮细胞hcmec/d3细胞的接种密度进行了优化，确定了最佳细胞接种密度，使模型的跨膜电阻值(teer值)较高且相对稳定。
[0028]
(4)本发明提供的模型构建方法较简单，无需复杂设备，模型成熟所需时间短(构建后的第二天开始成熟，第三天模型发育完全)，且可稳定维持较长的成熟时间(可持续至第六天)，便于大范围推广应用。
附图说明
[0029]
图1本发明实施例三的模型构建示意图。
[0030]
图2不同接种密度的hcmec/d3细胞单层培养的bbb模型跨膜电阻值检测结果。
[0031]
图3三种细胞的不同排列模式的跨膜电阻值检测结果；其中，a指hcmec/d3-hbvp-svg p12，b指hcmec/d3-svg p12-hbvp，c指hcmec/d3-(hbvp-svg p12)-up，d指hcmec/d3-(hbvp-svg p12)-down，1指hcmec/d3-hbvp-svg p12，2指(hbvp-hcmec/d3)-svg p12，3指(hcmec/d3-hbvp)-svgp12。
[0032]
图4不同细胞的排列模式的跨膜电阻值检测结果。
[0033]
图5本发明构建的bbb模型与hcmec/d3单层培养模型的最大teer值比较结果。
[0034]
图6本发明构建的bbb模型zo-1与claudin-5的mrna、蛋白表达检测结果；其中，a和b分别指zo-1与claudin-5的mrna表达检测结果；c指zo-1与claudin-5的蛋白表达检测结果。
[0035]
图7本发明构建的bbb模型荧光素钠和荧光黄二锂盐渗透系数与回收率检测结果；其中，a指荧光素钠7天渗透系数的检测结果；b指荧光素钠7天回收率的检测结果；c指荧光黄二锂盐7天渗透系数的检测结果；d指荧光黄二锂盐7天回收率的检测结果。
[0036]
图8罗丹明123的标准曲线。
[0037]
图9本发明构建的bbb模型转运外排功能验证结果；其中，a指罗丹明123分别在bbb模型上室和下室的转运量；b指p-gp抑制剂环孢菌素a预处理后，bbb模型的转运外排能力。
具体实施方式
[0038]
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0039]
本发明中，所涉及的细胞、试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。例如：hcmec/d3细胞购自上海钰博生物科技有限公司，hbvp和svgp12细胞购自广州华拓生物科技有限公司。本发明中，百分含量按本领域的惯用习惯理解。例如：5％胎牛血清指5％体积百分含量的胎牛血清。
[0040]
本发明中，
*
表示p＜0.05，
**
表示p＜0.01，
***
表示p＜0.001，
****
表示p＜0.0001。
[0041]
细胞培养：脑微血管内皮细胞hcmec/d3细胞培养于含5％胎牛血清、1％内皮细胞生长因子和1％双抗的ecm培养基(sciencell,usa)中；周细胞hbvp和星形胶质细胞svgp12培养于含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基(gibco,usa)中。三种细胞都培养在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中。
[0042]
实施例一细胞系的选择
[0043]
对组成血脑屏障的三种细胞成分，重点考虑采用人源性永生化细胞系，尤其是构成血脑屏障最主要的脑微血管内皮细胞。在进行文献检索调研的基础上，通过比较了解每种细胞的生理特性，选择出最符合要求的细胞系。对于脑微血管内皮细胞，现有文献记载有8种人类永生化的脑微血管内皮细胞系，包括bb19、hcec、hbec-5i、hbmec-3、ty08、hbmec/ciβ、nkim-6和hcmec/d3细胞系，每种细胞系永生化方式及优缺点整理如表2所示。
[0044]
表2永生化的人脑微血管内皮细胞
[0045][0046]
hcmec/d3细胞系是通过htert和sv40大t抗原通过慢病毒载体系统的共表达使原代人脑微血管内皮细胞永生化而形成，hcmec/d3细胞表达典型的内皮标记物(如cd31、ve-cadherin和von willebrand因子)，具有稳定的正常核型，培养中保持接触抑制单层，基质中形成毛细血管。此外，该细胞系表达趋化因子受体，并响应炎症细胞因子而上调细胞粘附分子。最后，通过实验发现，hcmec/d3细胞表现出血脑屏障的特征，如紧密连接蛋白的形成
和限制性外排药物的能力。综合上述因素，本发明选择hcmec/d3细胞作为模型的内皮细胞。周细胞是附着在血管内皮细胞基膜上的一类壁细胞，功能之一为调节内皮细胞通透性。鉴于目前尚无永生化的周细胞，因此，本发明选择采用商品化的原代人脑血管周细胞作为模型的第二层细胞。星形胶质细胞是脑内最丰富的胶质细胞，其终足覆盖血管表面高达99％，在维持脑微血管内皮细胞的特异性功能及神经元的正常功能、促进蛋白聚糖合成和维持血脑屏障的完整性起到重要作用。永生化星形胶质细胞系svg p12来源于转染sv40病毒的原代胎儿脑神经胶质细胞，在多次传代(80代左右)仍然保留原代星形胶质细胞的特性，因此可以减少使用原代细胞的带来的不稳定性。综上，本发明选择脑微血管内皮细胞hcmec/d3、周细胞hbvp和星形胶质细胞svg p12构建体外bbb模型。
[0047]
实施例二体外血脑屏障模型的构建
[0048]
一种体外血脑屏障模型的构建方法，包括如下步骤：
[0049]
1)细胞系选择：选择hcmec/d3细胞作为脑微血管内皮细胞，选择hbvp细胞作为周细胞，选择svg p12细胞作为星形胶质细胞；
[0050]
2)包被：采用包被液对transwell细胞培养装置的transwell膜层进行包被，往transwell细胞培养装置上层加入200μl包被液，下层加入800μl包被液，将transwell细胞培养装置置于4℃冰箱，过夜，备用；所述包被液为鼠尾胶原蛋白i型溶液，其浓度为15μg/ml，采用预冷的0.006m乙酸溶液配制得到；所述transwell细胞培养装置包括transwell小室；
[0051]
3)细胞接种：选取对数生长期的相应细胞，先后进行svg p12、hbvp和hcmec/d3细胞的接种：
①
将svg p12细胞接种在第一孔板(12孔板)里培养，以1.5
×
104细胞/cm2的接种密度将重悬好的svg p12细胞以1ml/孔的培养基量均匀加入，放入细胞培养箱培养；
②
将包被后的transwell小室倒扣在第二孔板(6孔板)里，将hbvp细胞接种在transwell小室的膜下层培养，以1.0
×
106细胞/cm2的接种密度将重悬好的hbvp细胞以100μl/孔的培养基量均匀加入，盖上板盖，放入细胞培养箱培养4h后，hbvp细胞已经贴壁生长，取出第二孔板，用pbs溶液洗涤transwell小室，再将transwell小室正置在第三孔板(12孔板)里培养，加入600μl培养基，放入细胞培养箱培养；
③
将transwell小室正置在第三孔板里培养12h后(过夜)，将hcmec/d3细胞以2
×
105细胞/cm2的密度接种在所述transwell小室的膜上层培养，500μl培养基加入transwell上室，将接种有hcmec/d3和hbvp细胞的transwell小室与接种有svg p12细胞的第一孔板组合起来，下室加入1.5ml培养基，使其液面与上室液面持平，hbvp细胞通过所述transwell膜层与hcmec/d3细胞间接接触，构建得到体外血脑屏障模型。
[0052]
实施例三体外血脑屏障模型的构建
[0053]
一种体外血脑屏障模型的构建方法，模型构建示意图如图1所示，包括实施例二的步骤1)至步骤3)，还包括步骤4)：对所构建模型的屏障特性和转运功能进行检测。
[0054]
实施例四hcmec/d3细胞的接种密度考察
[0055]
发明人通过实验发现，hcmec/d3细胞在维持bbb屏障特性中起着至关重要作用，而其细胞接种密度影响着bbb模型的成熟时间和紧密性。本发明通过设置不同接种密度的hcmec/d3细胞单层培养的bbb模型，然后检测模型的跨膜电阻值(teer值)，结果如图2所示，以5
×
105细胞/cm2密度接种的hcmec/d3细胞，在第2天具有最大的teer值46.92
±
1.97ω.cm2，但随后teer值快速下降；而以2
×
105细胞/cm2的密度接种的hcmec/d3细胞，在第2天的
teer值为41.96
±
1.98ω.cm2，是所有接种细胞中的第二大teer，并且其teer值下降较为缓慢，在第3天，其teer值大于以5
×
105细胞/cm2的密度接种的hcmec/d3细胞的teer值，表明以2
×
105细胞/cm2的密度接种的hcmec/d3细胞可维持自身teer相对稳定。其余两种细胞接种密度的teer值均较小。综上比较，本发明最后确定构建体外bbb模型的hcmec/d3细胞接种密度为2
×
105细胞/cm2。
[0056]
实施例五bbb模型细胞的不同排列模式考察
[0057]
发明人通过实验发现，构建体外bbb模型细胞的不同排列模式(细胞间的接触)会对模型的屏障特性产生影响，通过设置周细胞hbvp和星形胶质细胞svg p12以及周细胞hbvp和脑微血管内皮细胞hcmec/d3细胞这三种细胞的不同排列模式，然后检测模型的teer值，选择最佳排列模式，结果如图3所示。将hcmec/d3细胞接种在transwell小室膜上层，hbvp细胞接种在transwell小室膜下层，通过膜与hcmec/d3细胞间接接触，而svgp12细胞接种在12孔板里，以这样的细胞排列模式构建体外bbb模型为最佳模型，其teer值最大，为61.600
±
3.677ω.cm2，表明该模型的紧密屏障特性最佳。此外，该特性在建模后的第二天开始成熟，有效缩短了模型成熟时间，且可持续至第六天，可较长时间有效维持相应功能。
[0058]
本发明还对不同细胞的排列模式进行了考察，teer值检测结果如图4所示。从图4可知。不同细胞的其他排列模式的模型成熟时间需要4-7天左右，需要花费比较多的时间等待模型的成熟，且一些模型的teer值明显更低。因此，本发明提供的体外bbb模型可有效节省时间成本，提高研究效率。
[0059]
实施例六构建的体外bbb模型的完整性鉴定
[0060]
对实施例二构建的体外bbb模型进行完整性鉴定，包括模型的teer值、紧密连接蛋白表达情况以及荧光素钠和荧光黄二锂盐渗透系数。
[0061]
a.teer值监测：采用mers00002 millicell-ers细胞电阻仪检测模型的跨膜电阻。将细胞电阻仪的检测电极用75％乙醇浸泡灭菌30min，然后用hbss冲洗电极，晾干；接着，用37℃预热的hbss轻柔地清洗transwell小室，加入新鲜的培养基，将细胞电阻仪的检测电极置于transwell小室内外侧检测模型电阻值并按公式(1)计算teer值。
[0062]
teer(ω
·
cm2)＝(模型测定电阻-空白小室电阻)
×
小室面积
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0063]
结果如图5所示，模型teer最大值在第三天开始出现，模型组最大teer值明显高于hcmec/d3单层培养组，表明本发明血脑屏障模型具备完整的致密屏障，初步判断模型建模成功。
[0064]
b.紧密连接蛋白zo-1与claudin-5表达检测：血脑屏障的致密性主要受脑微血管内皮细胞表达的紧密连接蛋白的影响。本发明采用实时荧光定量pcr与western-blot方法检测模型中脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白zo-1与claudin-5的表达情况，结果如图6所示。紧密连接蛋白zo-1与claudin-5的表达量随时间的延长而增加，在第三天达到最大表达量，随后维持到第六天开始出现下降。该结果表明模型在第三天时发育完全成熟，与teer结果一致。
[0065]
c.荧光素钠和荧光黄二锂盐渗透系数：首先，制作荧光素钠和荧光黄标准曲线，标准曲线的浓度分别为：0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2，4，8μg/ml，采用多功能酶标仪检测，每个样品测定3次，取平均值绘制两者的标准曲线。其中，荧光素钠激发光波长为485nm，发射波长为535nm；荧光黄激发光波长为428nm，发射波长为536nm。接着，在模型的
transwell下室(接受池)中加入1.5ml温hanks液，在上室(供给池)中加入0.5ml含有荧光素钠或荧光黄10μg/ml的hanks液，30min和1h后分别从接受池中取100μl溶液至黑色96孔板中，采用多功能酶标仪在上述波长处测定两者的荧光强度，再通过各自标准曲线，计算荧光素钠和荧光黄分别透过bbb模型及无细胞对照组的量。再根据公式(2)计算清除体积。
[0066]
清除体积(μl)＝(ca×va
)/c
l
ꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0067]
其中，ca为接受池浓度；va为接受池体积；c
l
为供给池初浓度。通过以清除体积对时间作图，其斜率表示清除率(μl/min)，记作相应的通透性(p)
×
表面积(s)。荧光素钠体外透过模型中内皮细胞通透性
×
表面积(pse)可由以下公式计算得到：1/pse＝1/ps
t-1/psf，其中ps
t
表示模型的通透性
×
表面积，psf表示无细胞培养池对照组的通透性
×
表面积，s为细胞培养池的膜面积，本发明所使用的transwell小室的s为1.12cm2。
[0068]
结果如图7所示，本发明体外bbb模型荧光素钠和荧光黄的平均pe在模型构建后的第一天到第六天均小于6
×
10-4
cm/min(有研究显示，当pe＞6
×
10-4
cm/min时，表明模型是渗漏或开放的)，在第七天开始平均pe＞6
×
10-4
cm/min，且模型的最小pe出现在建模后的第三天，分别为：3.317
±
0.514
×
10-4
cm/min和2.510
±
0.376
×
10-4
cm/min。此外，荧光素钠和荧光黄的7天内回收率均在80％以上，可排除模型对两者的吸收代谢情况。荧光素钠和荧光黄的渗透系数结果表明，本发明体外bbb模型的紧密屏障特性在第一天开始出现，在第三天达到成熟，并可持续至第六天，结果与teer结果一致；此外，该紧密屏障特性可阻止极性小分子物质透过。
[0069]
实施例七构建的体外bbb模型的功能性鉴定
[0070]
血脑屏障具有强大的限制性外排功能，以确保脑内环境稳态。其中，脑微血管内皮细胞表达的p糖蛋白(p-gp)起着重要作用。根据前述结果，在模型构建的第三天，本发明选用p-gp的底物罗丹明123验证模型的外排功能，采用p-gp功能抑制剂环孢菌素a作为对照。
[0071]
首先，弃去模型培养基，使用温hbss溶液轻轻清洗模型。然后，在模型上室加入0.5ml含1μm的罗丹明123的hbss溶液，下室加入1.5mlhbss溶液(ap-bl)；同时，在另一模型中，上室加入0.5mlhbss溶液，下室加入1.5ml含1μm的罗丹明123的hbss溶液(bl-ap)。将模型放回孵箱中孵育1h后，分别从接收池中吸取100μlhbss溶液于荧光专用96孔板中，采用荧光酶标仪检测溶液的荧光强度，设置条件为：激发波长485nm，发射波长535nm。每个模型重复测定3次。与此同时，分别设置0，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8μm的罗丹明123溶液进行标准曲线测定。结果如图8所示。本发明所得罗丹明123标准曲线为：y＝6500.2x-982.61，r2＝9985。
[0072]
接着，根据公式(3)计算罗丹明123在模型中的表观渗透系数p
app
。
[0073][0074]
其中，v为接收池的体积；ca为供给池的原液浓度；cr为接收池的检测液浓度；t为罗丹明123孵育时间；s为模型transwell小室底面积。
[0075]
当计算出罗丹明123在模型不同侧的表观渗透系数p
app
后，按照公式(4)计算模型的外排率er。以er》2为标准，进行判断。
[0076][0077]
结果如图9所示，罗丹明123在模型bl侧的表观渗透系数明显高于在模型ap侧，er为2.231
±
0.323，大于2，表明罗丹明123由模型基底外侧向顶端侧大量排出。同时，在抑制剂环孢菌素a预处理后，罗丹明123由模型bl侧向ap侧转运的量减少，表明p-gp的外排活性被抑制。研究结果表明，本发明体外bbb模型具备完善的转运外排功能。
[0078]
综上，本发明在首次选用了以下三种人源性的细胞系(hcmec/d3、hbvp和svg p12细胞)并利用transwell细胞培养装置进行体外血脑屏障建模，然后通过测量模型的跨膜电阻、紧密连接蛋白、小分子物质的渗透系数以及限制性转运外排功能进行模型屏障特性和功能性验证，结果表明本发明体外bbb模型具备完整的模型屏障特性和功能性，在一定程度上可以很好重现体内血脑屏障。
[0079]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。