毛绒状磁-铂纳米粒子制备及负载于细胞中的方法与应用

1.本发明涉及材料与生物医药交叉领域，具体是毛绒状磁-铂纳米粒子制备及负载于细胞中的方法与应用。


背景技术：

2.肿瘤乏氧微环境是促进肿瘤侵袭转移、抵抗肿瘤化疗、放疗或抵抗光动力治疗的重要因素。缓解肿瘤乏氧，对于抑制肿瘤生长和转移，增强化/放疗以及光动力治疗的敏感性有重要意义。利用纳米材料与肿瘤微环境发生反应，可有效获得氧气。如纳米铂或二氧化锰与肿瘤内源性的过氧化氢反应产生氧气、过氧化钙与肿瘤内的水反应产生氧气等。
3.如何将可产生氧气的纳米粒子输送到肿瘤组织，是改善肿瘤乏氧的关键。在纳米粒子表面修饰聚乙二醇并连接针对肿瘤的特异性识别分子如抗体，或者将纳米粒子包埋于脂质体或胶束或聚合物中，再进行聚乙二醇和抗体或多肽修饰，是纳米粒子靶向递送至肿瘤的常用方法。然而，这些纳米粒子进入机体后，很快被免疫系统识别，进而清除，导致抵达靶向部位(如肿瘤或炎症组织)的纳米粒子很少。以细胞为载体的递药技术，是减少体内输送的纳米粒子过早被免疫系统清除的较理想方法[yu h,yang z,li f,xu l,sun y.cell-mediated targeting drugs delivery systems.drug deliv.2020,27(1):1425-1437.]。但是，以细胞为载体的递药系统，仅具有载体细胞对肿瘤等靶组织的生物靶向性，递药效率是有限的。
[0004]
研究表明，磁性粒子尤其是是磁性氧化铁粒子，不仅生物相容性好，而且还具有多种成像诊断和治疗的功能。在外加磁场引导下，磁性纳米粒子可通过磁靶向聚集到靶组织。当将磁性粒子装载到细胞中，所获得的细胞将具有磁靶向和生物靶向的双重靶向功能。如将具有产氧能力的纳米粒子与磁性纳米粒子，再负载到细胞中，便能将产氧能力的纳米粒子高效递送至肿瘤等靶组织。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供一种磁-铂纳米粒子的制备方法、将该纳米粒子负载药物然后负载于细胞中的方法及生物应用。
[0006]
为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
[0007]
本发明的第一个方面，提供了一种磁-铂纳米粒子，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0008]
优选的，所述磁-铂纳米粒子可负载光敏剂药物、化疗药物、放疗药物。
[0009]
本发明的第二个方面，提供了一种磁-铂纳米粒子在负载药物、在制备抗肿瘤/抗炎制剂、在激光诱导下联合治疗中的应用。
[0010]
优选的，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0011]
优选的，所述磁-铂纳米粒子可负载光敏剂药物、化疗药物、放疗药物。
[0012]
优选的，所述肿瘤包括但不限于喉癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、肾癌、乳腺癌或肺癌。
[0013]
本发明的第三个方面，提供了一种抗癌用组合物，包括：
[0014]
a)磁-铂纳米粒子；
[0015]
b)光敏剂药物、化疗药物、放疗药物中的一种或几种的组合。
[0016]
优选的，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0017]
本发明的第四个方面，提供了5、一种细胞载药系统，包括：
[0018]
a)本发明所述的磁-铂纳米粒子；
[0019]
b)药物，光敏剂药物、化疗药物、放疗药物中的一种或几种的组合；
[0020]
c)宿主细胞；
[0021]
所述细胞载药系统是将磁-铂纳米粒子负载药物，并植入宿主细胞中而获得。
[0022]
优选的，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0023]
优选的，所述宿主细胞包括免疫细胞、红细胞、血小板、干细胞和肿瘤细胞中的一种。所述的免疫细胞是指单核-巨噬细胞、中性粒细胞、t淋巴细胞；所述的干细胞是指间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞。
[0024]
本发明的第五个方面，提供了抗癌用组合物、细胞载药系统在制备抗肿瘤/抗炎制剂中的应用。
[0025]
优选的，所述细胞载药系统是通过将负载药物的磁-铂纳米粒子植入宿主细胞中而获得。
[0026]
优选的，所述药物包括光敏剂药物、化疗药物、放疗药物中的一种或几种的组合。
[0027]
优选的，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0028]
优选的，所述宿主细胞包括免疫细胞、红细胞、血小板、干细胞和肿瘤细胞中的一种。所述的免疫细胞是指单核-巨噬细胞、中性粒细胞、t淋巴细胞；所述的干细胞是指间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞。
[0029]
优选的，抗癌用组合物，包括：
[0030]
a)磁-铂纳米粒子；
[0031]
b)光敏剂药物、化疗药物、放疗药物中的一种或几种的组合。
[0032]
本发明的第六个方面，提供了一种磁-铂纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0033]
s1、合成fe3o4磁性纳米球：将fecl3·
6h2o、柠檬酸钠和乙酸钠加入到乙二醇中，在有聚四氟乙烯内衬的反应釜中反应得到fe3o4磁性纳米球；
[0034]
s2、制备毛绒状多孔fe3o4磁性纳米球：用弱酸蚀刻fe3o4磁性纳米球，得到毛绒状多孔fe3o4磁性纳米球；
[0035]
s3、将k2ptcl6与步骤s2制备的毛绒状多孔fe3o4磁性纳米球在室温下进行混合，通过磁分离获得沉淀，沉淀分散于溶剂中，然后向其中加入nabh4水溶液，室温下反应，再通过磁分离获得沉淀，用去离子水对沉淀进行洗涤多次，即得磁-铂纳米粒子。
[0036]
本发明的第七个方面，提供了一种载药的磁-铂纳米粒子的方法，包括以下步骤：
将本发明提供的磁-铂纳米粒子与药物溶液混合，磁分离或离心方式除去游离药物，即得载药的磁-铂纳米粒子。
[0037]
优选的，所述药物包括光敏剂药物、化疗药物、放疗药物中的一种或几种的组合。
[0038]
优选的，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0039]
本发明的第八个方面，提供了一种细胞载药系统的方法，包括以下步骤：
[0040]
r1、培养宿主细胞，将宿主细胞重悬于不含血清的细胞培养基中；
[0041]
r2、用不含血清的细胞培养基分散载药的磁-铂纳米粒子；
[0042]
r3、将载药的磁-铂纳米粒子混悬液与细胞混悬液混合后，在细胞培养箱中培养1-3h，移去培养基，收集细胞，用磷酸盐缓冲液或不含血清的培养基洗涤细胞，即得载药的磁-铂纳米粒子的细胞载药系统。
[0043]
优选的，所述药物包括光敏剂药物、化疗药物、放疗药物中的一种或几种的组合。
[0044]
优选的，所述磁-铂纳米粒子含有fe、o和pt元素，形态为多孔结构，表面呈现毛绒状。
[0045]
优选的，所述宿主细胞包括免疫细胞、红细胞、血小板、干细胞和肿瘤细胞中的一种。所述的免疫细胞是指单核-巨噬细胞、中性粒细胞、t淋巴细胞；所述的干细胞是指间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞。
[0046]
与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明提供了一种多孔而且表面呈现毛绒状的可在肿瘤微环境中产生氧气的磁-铂纳米粒子，磁-铂纳米粒子还可负载药物；当负载光敏剂时，因磁-铂纳米粒子在有过氧化氢存在的条件下产氧，因而能在激光照射下会产生大量活性氧，不仅改善肿瘤乏氧，还显著提高光敏剂的光动力效应。更进一步，将负载药物的磁-铂纳米粒子植入细胞中，可以通过细胞对病灶(肿瘤、炎症组织)的生物靶向和磁-铂纳米粒子的磁靶向作用，将载药的磁-铂纳米粒子高效递送至病灶，发挥更强的治疗效果。
附图说明
[0047]
为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。
[0048]
显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
[0049]
图1为本发明实施例1的fe3o4、毛绒状fe3o4与负载纳米pt的毛绒状fe3o4的xrd图谱；
[0050]
图2为本发明实施例1的毛绒状fe3o4磁性纳米球的tem照片；
[0051]
图3为本发明实施例1的负载纳米pt的毛绒状fe3o4的形貌和元素定位；
[0052]
图4为本发明实施例2的负载纳米pt的毛绒状fe3o4改善喉癌细胞tu212乏氧状态的实验结果图；
[0053]
图5为本发明实施例4的不同浓度的负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4在671nm激光照射下对tu212细胞的杀伤效果图；
[0054]
图6a为本发明实施例5的巨噬细胞raw264.7的普通光学显微镜照片；
[0055]
图6b为本发明实施例5的负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4装载到巨噬细胞后的普通光学显微镜照片；
[0056]
图6c为本发明实施例5的负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4装载到巨噬细胞后的激光共聚焦荧光显微镜照片。
具体实施方式
[0057]
为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0058]
显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0059]
需要理解的是：
[0060]
对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0061]
还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。
[0062]
下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0063]
实施例1合成磁-铂纳米粒子
[0064]
制备过程分如下4个步骤。
[0065]
步骤1：合成fe3o4磁性纳米球
[0066]
将fecl3·
6h2o(0.65g)、柠檬酸钠(0.26g)和乙酸钠(1.22g)加入到乙二醇(20ml)中，待溶解后，移入有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于高温电炉中于180℃反应10h，然后自然冷却，用无水乙醇和去离子水反复洗涤沉淀，即得fe3o4磁性纳米球。
[0067]
步骤2：制备毛绒状多孔fe3o4磁性纳米球
[0068]
向上述fe3o4纳米粒子沉淀(112mg)中加入草酸溶液(20ml，50mm)，室温下混合15min，磁分离，用去离子水对沉淀洗涤3次，即得毛绒状多孔结构磁性fe3o4纳米球。
[0069]
经x-射线衍射(xrd)分析，合成的fe3o4和毛绒状fe3o4均为反相尖晶石fe3o4(附图1)。透射电子显微镜(tem)观察显示，毛绒状fe3o4为球形、多孔和表面毛绒状结构的纳米粒子(附图2)。
[0070]
步骤3：在毛绒状fe3o4中原位合成纳米铂(pt)
[0071]
在去离子水(20ml)中，将k2ptcl6(45mg)与上述毛绒状fe3o4沉淀(45mg)在室温下进行混合2h，通过磁分离获得沉淀，沉淀分散于去离子水(15ml)中，然后向其中加入nabh4水溶液(3ml，0.54m)，室温下反应30min，再通过磁分离获得沉淀，用去离子水对沉淀进行洗涤3次，即得负载了纳米pt的毛绒状fe3o4。
[0072]
xrd分析结果显示，在39.8
°
的衍射角处出现与标准卡片jcpds 04-0802一致的比较弱的pt衍射峰，表明纳米pt成功负载于毛绒状fe3o4中(附图1)。负载了纳米pt的fe3o4为多孔结构，表面呈现毛绒状(附图3)。负载了纳米pt的毛绒状fe3o4含有fe、o和pt元素，这些元素在纳米复合粒子中的分布如附图3所示。
[0073]
此外，在去离子水(20ml)中k2ptcl6(45mg)与毛绒状fe3o4沉淀(45mg)在室温下混合4h，6h或24h后，进行如上述相同的合成反应实验，结果得到形貌和组成与上述相似的负载了纳米pt的毛绒状fe3o4。
[0074]
实施例2负载纳米pt的毛绒状fe3o4在含过氧化氢溶液中的产氧情况
[0075]
用4.5ml ph 7.4的pbs溶液分散到实施例1制备的负载纳米pt的毛绒状fe3o4，然后加入0.5ml浓度为1m的h2o2，在加入后的30min内，用溶解氧测定仪检测混悬液中氧气浓度。
[0076]
结果显示，在加入h2o2后大约3min内，负载纳米pt的毛绒状fe3o4在溶液中产生大量氧气，随后氧气浓度保存相对稳定。可见，负载纳米pt的毛绒状fe3o4与过氧化氢反应使迅速。
[0077]
细胞中含有过氧化氢，由于负载纳米pt的毛绒状fe3o4在含过氧化氢溶液中的产氧，因此该纳米复合粒子在细胞内/体内也可以产生氧气，从而改善肿瘤乏氧。例如，使用厌氧产气袋使6孔板中培养的喉癌细胞tu212呈乏氧状态，然后分别加入乏氧指示剂ru(ddp)3cl2和无血清培养基分散的负载纳米pt的毛绒状fe3o4(0.2mg/ml)，培养3h后，于荧光显微镜下分析乏氧改善效果；对照组仅加入无血清的培养基。结果如附图4所示，红色荧光细胞越多，乏氧的细胞也就越多，在荧光显微镜下可直接观察到，负载纳米pt的毛绒状fe3o4能显著改善细胞的乏氧状态。
[0078]
实施例3在负载纳米pt的毛绒状fe3o4中装载光敏剂药物
[0079]
将二氢卟吩e6(ce6)溶于二甲基亚砜溶液中，得到10mg/ml的ce6溶液，再用无水乙醇稀释至4mg/ml，取该ce6溶液4ml，与无水乙醇分散的负载纳米pt的毛绒状fe3o4溶液(3.33ml，2.4mg/ml)进行混合，并于室温下振荡24h，通过磁分离获得沉淀，用去离子水对沉淀洗涤3次，即得同时负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4。
[0080]
检测结果表明，负载纳米pt的毛绒状fe3o4对ce6的负载量为46.46
±
0.03％，即100mg的载药纳米粒子中含46.46
±
0.03％的ce6。
[0081]
实施例4同时负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4在激光照射下对肿瘤细胞的杀伤
[0082]
将喉癌细胞tu212培养于96孔板中(约6
×
104个细胞/孔)，培养过夜后，移去培养基，将不含血清的培养基分散的同时负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4加入到细胞中(100μl/孔)，纳米粒子浓度(以负载纳米pt的毛绒状fe3o4计)分别为0.01、0.02、0.05、0.1和0.2mg/ml(每隔浓度5个孔)，于二氧化碳培养箱培养1h后，用671nm激光(100mw/cm2)照射细胞2min，然后继续置于培养箱培养2h，然后用cell-titer试剂检测细胞成活率，以不加纳米载药粒子、加了纳米载药粒子但不进行激光照射的细胞作为对照。
[0083]
结果表明，载药纳米粒子在671nm激光照射下能强烈杀伤tu212细胞，如附图5所示。分析原因为：载药纳米粒子在激光照射下强烈杀伤肿瘤细胞，可能主要是因为pt与细胞中的过氧化氢反应产生了氧气，氧气为ce6的光动力效应提供原料，使得ce6在671nm激光照射下产生更多的单线态氧(活性氧的一种)，单线态氧具有强氧化性，能氧化损伤细胞。为证明之，将不含pt的载药纳米粒子(即仅负载ce6的毛绒状fe3o4，fe3o4spmns：0.02mg/ml)加入到tu212细胞中，并向细胞找那个加入少许过氧化氢(1μm)。
[0084]
此外，进行上述相同激光照射实验，结果显示，在相同磁性材料浓度和相同激光照射的条件下，时负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4杀伤tu212细胞的效率是负载ce6的毛绒状fe3o4的1.31倍。同样验证了pt的关键作用。
[0085]
实施例5将同时负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4装载到活的巨噬细胞中
[0086]
将巨噬细胞raw264.7培养于6孔板中(～1.8
×
106个细胞/孔)，移去培养基，加入无血清的培养基分散的同时负载纳米pt和ce6的毛绒状fe3o4(0.1mg/ml，2ml/孔)，在细胞培养箱中培养3h后，移去培养基，再用培养基重悬细胞，通过磁分离收集细胞，即得装载了含pt和ce6的毛绒状fe3o4的巨噬细胞。
[0087]
在普通光学显微镜和激光共聚焦荧光显微镜下，均可见每个巨噬细胞中都含有载药纳米粒子，如附图6所示。
[0088]
实施例6装载了含pt和ce6的毛绒状fe3o4的巨噬细胞在激光照射下对肿瘤细胞的杀伤效果
[0089]
将装载了含pt和ce6的毛绒状fe3o4的巨噬细胞(负载纳米pt的毛绒状fe3o4：0.1mg/ml)加入到tu212细胞中并培养1h，然后以671nm激光照射2min后，继续培养2h，结果细胞成活率仅为6.11
±
4.25％，而无激光照射组的细胞成活率为84.01
±
1.72％，可见，装载了含pt和ce6的毛绒状fe3o4的巨噬细胞在671nm激光照射下可强烈杀伤tu212细胞。
[0090]
在上述说明书的描述过程中：
[0091]
术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
[0092]
最后应说明的是：
[0093]
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
[0094]
尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。