基于网络药理学分析心力衰竭治疗药物作用靶点的方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及基于网络药理学分析心力衰竭治疗药物作用靶点的方法。


背景技术：

2.白术，属于菊科、苍术属多年生草本植物，以根茎入药，味苦甘，性温，可健脾益气，燥湿利水，目前被证实具有血管扩张作用。
3.丹参，唇形科、鼠尾草属多年生直立草本植物，种根入药，含丹参酮，有祛瘀、生新、活血、调经等效用，对治疗冠心病有良好效果。
4.桂枝，樟科植物肉桂的干燥嫩枝，去除叶后直接晒干或切片晒干即可入药。可发汗解肌，温通经脉，助阳化气，常配伍枳实、薤白等治疗胸阳不振，心脉瘀阻之胸痹心痛。
5.红参，是用人参经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干等工序加工而成，可用于体虚欲脱，肢冷脉微，气不摄血，崩漏下血，心力衰竭，心源性休克的治疗。
6.黄芪，属蝶形花科、黄芪属，能扩张冠状动脉，改善心肌供血。
7.蒲黄，为香蒲科植物水烛香蒲、东方香蒲或同属植物的干燥花粉，有止血、化瘀、通淋等功效。
8.葶苈子，为葶苈属植物葶苈，具有泻肺降气，祛痰平喘，利水消肿，泄热逐邪之功效，可用于慢性肺源性心脏病、心力衰竭之喘肿的治疗。
9.猪苓，多孔菌科树花属药用真菌，针对心脏功能不全引起的水肿具有较好的治疗效果。
10.然而，对于上述心力衰竭治疗药物中具体药效成分的作用途径、作用靶点目前尚无研究。
11.因此，亟待提供一种心力衰竭治疗药物作用靶点的分析方法，进而为药物作用机制的阐明以及临床合理用药、新药研发提供保障。


技术实现要素：

12.本发明公开了基于网络药理学分析心力衰竭治疗药物作用靶点的方法，通过药物及治疗对象之间的分子关联规律进行心力衰竭治疗药物作用靶点的解析。
13.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
14.基于网络药理学分析心力衰竭治疗药物作用靶点的方法，包括如下步骤：
15.(1)分别对心力衰竭治疗药物的成分进行检索筛选，获得潜在活性成分；根据潜在活性成分筛选药物靶点；上述心力衰竭治疗药物包括白术、丹参、桂枝、红参、黄芪、蒲黄、葶苈子和猪苓；
16.(2)检索疾病作用靶点；
17.(3)药物靶点与疾病作用靶点取交集，获得药物-疾病共同靶点；
18.(4)根据潜在活性成分与药物-疾病共同靶点构建药物-成分-靶点-疾病网络，通
过与药物-疾病共同靶点的关联个数进行潜在活性成分排序，分析核心成分；
19.(5)根据药物-疾病共同靶点构建蛋白相互作用的ppi网络，根据ppi网络进行拓扑分析或聚类分析，筛选核心靶点；
20.(6)根据药物-疾病共同靶点进行关键靶基因go富集分析与kegg富集分析；
21.(7)动物实验验证。
22.优选地，步骤(1)中，
23.在tcmsp数据库中设定ob≥30％、dl≥0.136，白术、丹参、桂枝、红参、黄芪、蒲黄、葶苈子、猪苓的成分进行筛选，使用pumchem数据库获得各成分的sdf结构，导入swiss target prediction数据库筛选药物靶点。
24.优选地，步骤(2)中，
25.使用omim、genecards数据库以“heart failure”为关键词进行检索，获得疾病作用靶点。
26.优选地，步骤(3)中，
27.根据药物靶点与疾病作用靶点绘制韦恩图，取交集，获得药物-疾病共同靶点。
28.优选地，步骤(4)中，
29.根据潜在活性成分与药物-疾病共同靶点，使用cytoscape软件，构建药物-成分-靶点-疾病网络；
30.使用networkanalyzer对构建的药物-成分-靶点-疾病网络进行拓扑分析，通过与药物-疾病共同靶点的关联个数进行潜在活性成分排序，分析核心成分。
31.优选地，步骤(5)中，
32.利用string数据库检索药物-疾病共同靶点，设置蛋白种类为“homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用的ppi网络。
33.优选地，步骤(5)中，
34.利用string数据库检索药物-疾病共同靶点，设置蛋白种类为“homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，获取靶点相互作用的网络关系数据；
35.将靶点相互作用的网络关系数据导入cytoscape软件，构建蛋白相互作用的ppi网络。
36.优选地，步骤(5)中，
37.将ppi网络导入cytoscape中，通过networkanalyzer工具进行拓扑分析，选取degree值大于平均分的基因作为核心靶点；
38.或
39.将已经构建好的ppi网络导入cytoscape中，使用mcode模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。
40.优选地，步骤(6)中，
41.基于r软件使用bioconductor生物信息软件包以pvalue《0.05，qvalue《0.05进行go富集分析与kegg富集分析。
42.优选地，步骤(7)中通过动物实验验证心力衰竭治疗药物的药物-疾病共同靶点或核心靶点。
43.进一步地，上述方法筛选获得的核心靶点可用于心力衰竭治疗药物筛选、分析、验
证。
44.综上所述，本发明分析方法可应用于药物中活性化合物的筛选、整体作用机制阐释、药物组合和方剂配伍规律解析，为心力衰竭治疗药物复杂体系研究提供了新思路，为临床合理用药、疾病治疗靶点的筛选以及新药研发等提供了基础。
附图说明
45.图1所示为药物靶点与心力衰竭作用靶点韦恩图。
46.图2所示为“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图；
47.其中，heart failure，心力衰竭；pollen typhae，蒲黄；lepidium perfoliatum，葶苈子；ramulus cinnamomi，桂枝；astragalus mongholicus，黄芪；atractylodes macrocephala，白术；salviae miltiorrhizae，丹参；res ginseng，红参；polyporus umbellatus，猪苓。
48.图3所示为蛋白相互作用的ppi网络。
49.图4所示为蛋白相互作用的ppi网络。
50.图5所示为基于ppi拓扑分析的核心靶点排序。
51.图6所示为mcode聚类分析基因簇。
52.图7所示为图6中基因簇1。
53.图8所示为图6中基因簇2。
54.图9所示为图6中基因簇3。
55.图10所示为图6中基因簇4。
56.图11所示为图6中基因簇5。
57.图12所示为图6中基因簇6。
58.图13所示为图6中基因簇7。
59.图14所示为图6中基因簇8。
60.图15所示为图6中基因簇9。
61.图16所示为go分析结果(生物过程)。
62.图17所示为go分析结果(生物过程)。
63.图18所示为go分析结果(细胞组分)。
64.图19所示为go分析结果(细胞组分)。
65.图20所示为go分析结果(分子功能)。
66.图21所示为go分析结果(分子功能)。
67.图22所示为kegg分析结果。
68.图23所示为kegg分析结果。
69.图24所示为超声心动图测定健心颗粒对左心室功能的影响。
70.图25所示为健心颗粒对心力衰竭大鼠左心室心肌中几种蛋白表达的影响。
71.*与假手术组比较，p《0.05；#与心力衰竭模型组比较，p《0.05；sham：假手术组；hf model：心衰模型组；high dosejianxin：高剂量健心颗粒组；low dosejianxin:低剂量健心颗粒组。
具体实施方式
72.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
73.实施例中所用数据库及软件如下：
74.tcmsp数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，swiss target prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，genecard s数据库(https://www.genecards.org/)，omim数据库(https://www.omim.org/)，string数据库(https://string-db.org/)，venny2.1在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/to ols/venny/)，cytoscape3.7.2软件，r3.6.1软件等。
75.1.药物靶点的筛选
76.在tcmsp数据库中设定ob≥30％、dl≥0.136，分别对白术、丹参、桂枝、红参、黄芪、蒲黄、葶苈子、猪苓的成分进行检索筛选，结果如表1所示，共得到潜在活性成分122个(去重后)。
77.使用pubchem数据库获得122个潜在活性成分的sdf结构，导入swiss target predictio n数据库，取预测得分大于0的靶标作为药物靶点，共筛选出896个药物靶点(去重后)。
78.表1中药潜在活性成分及药物靶标统计
79.药物名称潜在活性成分数量(个)药物靶点数量(个)白术7102丹参65716桂枝770红参4151黄芪20429蒲黄8287葶苈子12262猪苓11260
80.2.疾病作用靶点的筛选
81.使用omim、genecards数据库以“heart failure”为关键词进行检索，获得疾病作用靶点，去重后共获得疾病作用靶点1216个。
82.3.药物-疾病共同靶点的筛选
83.在venny2.1在线软件作图工具平台上输入896个药物靶点、1216个疾病作用靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点136个(图1)。
84.4.药物-成分-靶点-疾病网络构建及分析
85.(1)网络构建：
86.将122个潜在活性成分与136个药物-疾病共同靶点输入cytoscape 3.7.2软件，删除与药物-疾病共同靶点无交集的孤立的潜在活性成分，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络
图(图2)；图中三角形代表100种潜在活性成分(22种无交集，予删除)，圆圈代表136个共同靶点。
87.(2)核心成分分析：
88.使用network analyzer对构建的网络图进行拓扑分析，degree值表示出该潜在活性成分与药物-疾病共同靶点的关联个数，degree值越大说明该潜在活性成分越重要，可作为核心成分进行分析。
89.表2按degree值大小排列的潜在活性成分
90.91.[0092][0093][0094]
5.ppi网络构建及核心靶点筛选
[0095]
(1)构建蛋白相互作用的ppi网络图：
[0096]
方法1：将上述药物-疾病共同靶点输入到string数据库中进行检索，设置蛋白种
类为“homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用的ppi网络(图3)。
[0097]
方法2：将上述136个药物-疾病共同靶点输入到string数据库中进行检索，设置蛋白种类为“homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，获取靶点相互作用的网络关系数据，将其导入cytoscape3.7.2软件，绘制蛋白相互作用的ppi网络图(图4)，其中，节点的大小、颜色及其深浅变化代表degree值的大小。
[0098]
(2)核心靶点筛选
[0099]
1)基于拓扑分析的核心靶点筛选：
[0100]
将构建好的ppi网络导入cytoscape3.7.2，通过networkanalyzer工具对蛋白相互作用的ppi网络图进行拓扑分析，以degree，betweenness centrality，average shortest path length和closeness centrality这四个参数为参考标准，通过degree排序，选取degree值大于平均分的基因作为核心靶点，将前30个靶点使用r 3.6.1绘制条形图(图5)。
[0101]
2)基于聚类分析的核心靶点筛选：
[0102]
将已经构建好的ppi网络导入cytoscape3.7.2中，使用mcode模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。总共得到9个基因簇(图6-15)和8个核心基因，核心基因为vcam1、ep300、kcne1、cyp17a1、f2、pde5a、cftr、ccr5。
[0103]
6.go富集分析与kegg富集分析
[0104]
基于r软件使用bioconductor生物信息软件包以pvalue《0.05，qvalue《0.05对136个药物-疾病共同靶点进行关键靶基因go与kegg功能富集分析，并将结果以条形图和气泡图形式输出。
[0105]
136个药物-疾病共同靶点经r语言运行后go分析选取生物学过程、细胞组分及分子功能3部分(图16-21)。结果显示，药物-疾病共同靶点基因集合共富集至2252条生物学过程通路中；药物-疾病共同靶点基因集合共富集至64条细胞组分表达过程中；药物-疾病共同靶点基因集合共富集至162个与分子功能相关的过程中。
[0106]
136个药物-疾病共同靶点经r语言运行后共得到151条kegg通路，前20的kegg功能富集结果如图22-23，padjust代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。注：这里展示的所有通路p value＜0.05。
[0107]
7.动物实验研究验证及结果
[0108]
取48只12月龄雄性大鼠，随机分为四组：假手术组、模型组、低剂量健心颗粒(福建省第二人民医院，闽药制字z20100010)组或高剂量健心颗粒组。除假手术组外，其余36只大鼠均结扎左冠状动脉前降支，建立心肌梗死后心力衰竭模型。术后第7天，用超声剔除未达到心衰标准的大鼠，将剩余心衰大鼠随机分组干预。模型组和假手术组2ml蒸馏水灌胃，健心颗粒以高剂量(6.4g/kg)或低剂量(3.2g/kg)，溶解于2ml蒸馏水中灌胃，每天一次，连续干预8周，然后超声评价心功能并左室心肌取材进行关键蛋白分子验证。
[0109]
(1)超声心动图评估心功能
[0110]
最后一次给药后，大鼠禁食12小时并吸入异氟醚麻醉。用超声心动图评估心功能。获得了m型超声的二维图像。测定左室射血分数(ef)、左室舒张内径(lvidd)和左室收缩内径(lvid)等心功能指标。结果如图24所示，模型组左室舒张末期径和收缩末期径高于假手术组(左室舒张末期径：8.76
±
1.04 vs 5.97
±
0.77,p《0.05；左室收缩末期：7.24
±
0.22 vs 4.11
±
0.46,p《0.05)，而左室射血分数(40.81
±
4.51 vs 79.18
±
8.85,p《0.05)和室间
隔增厚率(4.16
±
0.78 vs 51.68
±
4.59,p《0.05)低于假手术组。健心颗粒治疗后，左室舒张末期径和收缩末期径均减小，射血分数和室间隔增厚率显著增加，差异有统计学意义，且高剂量组优于低剂量组。
[0111]
(2)western blot法检测左室心肌il6,vegfa,akt,apelin蛋白表达
[0112]
方法按照常规进行，主要步骤包括：提取左室心肌总蛋白，进行蛋白质浓度定量后，对蛋白样品进行sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭。il6,vegfa,akt,apelin抗体购自abcam公司。以gapdh作为内参，进行半定量分析，用图像分析系统对图片进行灰度扫描，比值表示其相对含量。
[0113]
结果如图25所示，与假手术组相比，模型组大鼠的apelin和akt1水平较低，而il6水平较高，健心颗粒治疗增加apelin和akt1表达，而降低il6表达。与假手术组相比，模型组大鼠的vegfa增加，在健心颗粒治疗后，vegfa进一步增加。高剂量组健心颗粒比低剂量组作用更显著。
[0114]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0115]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。