一种肉制品氯霉素含量的检测方法与流程

1.本发明涉及氯霉素检测技术的技术领域，特别是涉及一种肉制品氯霉素含量的检测方法。


背景技术：

2.氯霉素(cap)是一种广谱抗生素，其可以抑制大多数的厌氧拟杆菌、革兰氏阴、阳性细菌和衣原体等，因而，cap具有良好的抗菌能力。由于cap在临床上对人和动物的细菌性疾病均具有很好的治疗效果，而且，其还同时具有价格低廉、药效稳定和良好的抗菌性等优点。所以，cap在较长的时间中常用于畜牧业的饲料添加剂。但不久即发现cap中带有硝基，从而导致其具有一定的毒性。个别病人因为使用氯霉素导致其人体骨骼的造血功能受损而患上再生障碍性贫血，因此，该因素限制了cap在临床上的继续使用。同时，又发现其可以残留在动物性食品中，以对人体造成一定的伤害。所以，许多国家规定在食品动物饲养中禁止使用cap，并要求对出售的家禽的肉制品进行cap含量的检测。在许多国家的相关规定中，氯霉素的残留量要求控制在0~10ng/g内。美国和芬兰规定氯霉素不得检出，欧共体规定其应低于10ng/g，而我国则规定为2ng/g。基于此，中国专利cn111458438a公开了一种家禽氯霉素含量的检测方法，其通过对肉制品均浆后的提取、净化、衍生化的前处理操作，并在衍生化处理的过程中更改衍生试剂和催化剂，向第二具塞离心管内依次加入正己烷120-150μl、硅烷化试剂120-150μl，并进行均质处理；将均质处理结束后的第二具塞离心管放入干燥箱内反应，反应结束后对第二具塞离心管内的液体进行氮气吹干处理；以减轻气相色谱法在检测之前对检测液的预处理步骤对检测人员的安全造成威胁。
3.然而，上述所公开的一种家禽氯霉素含量的检测方法还存在检出限低、灵敏度低、稳定性差以及回收率低的技术问题。具体的，在上述所公开的一种家禽氯霉素含量的检测方法其主要应用了正己烷；所述正己烷一种低毒的无色液体，而硅烷化试剂又称硅烷保护剂，检测人员做好防护措施，带好口罩穿好防护服即可有效的对上述材料的副作用起到规避作用，因此，减轻了气相色谱法在检测之前需对检测液进行预处理步骤而对检测人员的安全造成威胁的不良情况。此外，上述的检测方法中还使用了铝珠浴，其也能减少微生物对材料的污染。但是，上述所公开的检测方法在实际的应用中，还存在检出限低的、灵敏度低、稳定性差以及回收率低的缺陷，在大规模的批量筛选中容易出现假阳性或假阴性的缺陷，其定量效果不好，从而导致了其检测效率低的情况。


技术实现要素：

4.基于此，有必要针对现有技术中肉制品氯霉素检测方法所存在的检测效率低的技术问题，提供一种肉制品氯霉素含量的检测方法。
5.一种肉制品氯霉素含量的检测方法，其包括如下步骤：s1：分别将5.00g的肉糜样品与以5ml4%氯化钠及20ml乙酸乙酯配成的提取液一并加入到100ml离心管中，再将肉糜样品与提取液充分混合2min后，用离心机对离心管进行离
心处理；然后，再吸取离心管的上层溶液加入到50ml的梨型瓶中；s2：接着，再以10ml的乙酸乙酯重复步骤s1的提取过程；接着，将梨型瓶置于45℃下水浴旋转蒸发至干；然后，再用1ml的乙酸乙酯洗涤梨型瓶；再将梨型瓶中的液体倒入10ml离心管中，接着，再用4ml的4%氯化钠溶液洗涤梨型瓶，也一并将梨型瓶中的液体倒入离心管中；然后，再将离心管置于氮吹仪下维持50℃的温度，直至将乙酸乙酯层吹干；s3：继续向步骤s2中的提取液中加入4ml正己烷后，再使离心机以6000r/min的速度对离心管离心处理5min；然后，再弃掉正己烷相，并重复此过程一次；s4：继续称取c
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填装到6ml固相萃取柱中，然后，用甲醇、三氯甲烷、甲醇以及水各5ml进行活化，提取液每秒一滴过柱；接着，再用5ml的水淋洗c
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柱，真空吹干c
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小柱后，微氮吹干柱内水分；再用2ml甲醇分两次洗脱c
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柱，将洗脱液收集于10ml的离心管中；s5：接着，将洗脱液在干式氮吹仪50℃下吹干；然后，再加入regisbstfa tmcs,99:1100ul；漩涡30s后在70℃烘箱内密封衍生25min；微氮吹至近干，加入1ml正己烷溶解衍生物，漩涡混合30s，待测；s6：最后，将待测液体使用气相色谱法进行检测。
6.具体的，在上述步骤s1中，离心机对离心管以6000r/min的速度处理5min。
7.具体的，在步骤s3中，往提取液中加入4ml的正己烷后，先漩涡混合30s，再使用离心机对离心管进行离心处理。
8.具体的，在步骤s4中，提取液滴过柱后，再用2ml的水洗涤离心管并将管内的液体加入到固相萃取柱中。
9.具体的，在步骤s6中，气相色谱法检测的条件为：进样量：1ul；分流方式：不分流；载气：99.999%纯度的氮气，。
10.进一步的，气相色谱法的进样口温度设置为250℃；检测器温度设置为300℃。
11.进一步的，柱阶段升温程序设置为150℃保持1min，并以25℃/min升温至270℃保持12min；其柱流量设置为1ml/min。
12.综上所述，本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法具有检出限低、回收率高以及稳定性好的优点，其检出限为1.96ng/g，rsd值为1.58%至5.48%，回收率为90.93%至105.25%。具体的，本发明还优化了气相色谱法的前处理过程，并提高了该种方法的检测效果，节省了检测时间，并最终确定以水为加标溶剂、c
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为净化萃取柱、以5ml甲醇、5ml氯仿、5ml甲醇、5ml水为萃取柱活化方法、2
×
2ml甲醇为洗脱剂、烘箱为衍生环境、70℃为衍生温度、25min为衍生时间。本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法解决了现有技术中肉制品氯霉素检测方法所存在的检测效率低的技术问题。
附图说明
13.图1为本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法所使用的固相萃取方法示意图。
具体实施方式
14.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不
违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
15.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
16.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
17.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
18.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
19.需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
20.本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法包括如下步骤：s1：分别将5.00g的肉糜样品与以5ml4%氯化钠及20ml乙酸乙酯配成的提取液一并加入到100ml离心管中，再将肉糜样品与提取液充分混合2min后，用离心机对离心管进行离心处理；然后，再吸取离心管的上层溶液加入到50ml的梨型瓶中；s2：接着，再以10ml的乙酸乙酯重复步骤s1的提取过程；接着，将梨型瓶置于45℃下水浴旋转蒸发至干；然后，再用1ml的乙酸乙酯洗涤梨型瓶；再将梨型瓶中的液体倒入10ml离心管中，接着，再用4ml的4%氯化钠溶液洗涤梨型瓶，也一并将梨型瓶中的液体倒入离心管中；然后，再将离心管置于氮吹仪下维持50℃的温度，直至将乙酸乙酯层吹干；s3：继续向步骤s2中的提取液中加入4ml正己烷后，再使离心机以6000r/min的速度对离心管离心处理5min；然后，再弃掉正己烷相，并重复此过程一次；s4：继续称取c
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填装到6ml固相萃取柱中，然后，用甲醇、三氯甲烷、甲醇以及水各5ml进行活化，提取液每秒一滴过柱；接着，再用5ml的水淋洗c
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柱，真空吹干c
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小柱后，微氮吹干柱内水分；再用2ml甲醇分两次洗脱c
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柱，将洗脱液收集于10ml的离心管中；s5：接着，将洗脱液在干式氮吹仪50℃下吹干；然后，再加入regisbstfa tmcs,99:
1100ul；漩涡30s后在70℃烘箱内密封衍生25min；微氮吹至近干，加入1ml正己烷溶解衍生物，漩涡混合30s，待测；s6：最后，将待测液体使用气相色谱法进行检测。
21.具体的，在上述步骤s1中，离心机对离心管以6000r/min的速度处理5min。此外，在步骤s3中，往提取液中加入4ml的正己烷后，先漩涡混合30s，再使用离心机对离心管进行离心处理。
22.更具体的，在步骤s4中，提取液滴过柱后，再用2ml的水洗涤离心管并将管内的液体加入到固相萃取柱中。此外，在步骤s6中，气相色谱法检测的条件为：进样量：1ul；分流方式：不分流；载气：99.999%的氮气，进样口温度：250℃；检测器温度：300℃；柱阶段升温程序：150℃保持1min，以25℃/min升温至270℃保持12min；柱流量：1ml/min。
23.具体的，在对肉制品进行检测氯霉素时，由于肉制品制成的肉糜样品中含有大量的干扰物质；所以，在检测的前期要做样品的预处理。所述预处理一般包括将待测组分进行提取、净化、浓缩和衍生化的过程。前处理具有消除干扰的基质，从而使检测方法的精确度得到提高的作用，同时又具有保护仪器的作用。
24.更具体的，固相萃取法是使含有目标物的样液在自身重力或外力作用下通过固相萃取装置而被具有吸附作用的固体填料所吸附，从而达到目标物分离的前处理手段。其原理是将样品中的待测物吸附在填料中，经过淋洗除去杂志，在进行洗脱将待测物质回收，从而使待测化合物得到纯化和分离。如图1所示，所述固相萃取顺序为先对萃取柱活化，然后，再使样液过柱；接着，再淋洗除杂；最后，将目标物洗脱。
25.接着，预处理后的肉制品还需要使用合适的方法对其检测；目前氯霉素残留检测方法主要有气相色谱法和液相色谱法；所述气相色谱质谱法长被用于对cap的定量分析，对于大批量筛选则选用酶联免疫吸附法。其中，气相色谱法是一种对受热挥发容易，但挥发后化合物不分解的物质进行分离从而分析的色谱方法。是氯霉素检测的经典方法，由于其具有灵敏度高，检测限低等优点，成为氯霉素类药物残留检测的国标方法之一。但由于氯霉素极性较强，难以挥发，所以在利用气相色谱进行检测时，要进行衍生化，衍生后的产物结构式如下所示，其具有挥发性高以及稳定性高的特点。
26.进一步的，以下继续揭示本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法与现有的两种氯霉素进行实验对比，具体比较三者之间的标准曲线、加标回收率、稳定性以及检出限等参数。
27.具体的，本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法的一种实施例的标准曲线和检出限的具体比对方法为：准确称取0.01g氯霉素标准品，用甲醇溶解定溶，配置成10mg/ml的标准储备液，冷藏保存。将储备液稀释为0.01至1μg/ml的不同浓度的标准溶液，然后，再将上述的标准溶液各取1ml并使用氮气吹干，然后，加入100mlregisbstfa tmcs,99:1硅烷化试剂在70℃烘箱内衍生30min后，氮气吹干后1ml正己烷溶解，气相色谱进行检测。以已知标准品的浓度为横坐标和气相色谱测定的目标峰的峰面积为纵坐标绘制氯霉素的工作曲线。
并将标准溶液最低浓度进行逐级稀释进样，将目标峰周围的噪音峰的峰高高于目标峰3倍峰高的浓度定为最低检出限。其稳定性的比对方法为：分别通过对0.1、0.5以及1μg/ml的标准品进行平行6次的气相色谱检测。通过对平行结果进行相对标准偏差的计算，来评价该方法检测在检测氯霉素时的稳定性效果。其回收率的比对方法为：取肉糜样品5g，再向样品中分别加入0.1、0.5以及1μg/ml浓度的标准溶液1ml，相当于样品添加量对应为0.02、0.1以及0.2μg/g。然后，再对样品按前述步骤s1至s5中的具体方法进行前处理提取，并对提取液进行检测并计算回收率。
28.具体的，其中的对比例一的标准曲线和检出限的具体比对方法为：分别将试剂盒给出的不同浓度氯霉素标准浓缩液各100μl加入到微孔中，同时加入抗体工作液50μl并轻轻震荡。在37℃培养箱中避光放置培养30min后，取出，揭开盖板纸，倒去孔中液体。对每孔进行4次洗板。加100μl酶标二抗，同样在37℃培养箱中避光放置培养30min后，进行洗板。加底物液a50μl和底物液b50μl。在37℃培养箱中放置15min，加入50μl终止液，在波长450nm下利用酶标仪进行吸光值测定。以标品浓度的半对数和其百分吸光率为横纵坐标，绘制线性关系。同时取包被抗体的8个孔，在每个孔中加入0.25ng/ml的标准溶液按上述操作过程进行检测，以3倍标准偏差来测定酶联免疫法检测氯霉素方法的检出限。其稳定性的比对方法为：分别通过对0.25ppb、0.75ppb与2.25ppb这3个浓度水平的标准品进行氯霉素试剂盒检测，并对每个浓度平行测定6次。计算相对标准偏差，来评价对比例一所检测氯霉素方法的稳定性。其回收率为：取肉糜样品，并向样品中分别加入0.25、0.75以及2.25ng/ml浓度的标准溶液1ml,其相当于样品添加量为0.036、0.107以及0.321ng/ml。然后，再按试剂盒的操作过程，进行样品测定。最后，按下列公式计算回收率：上式中， p为加标回收率，单位%；m1为所测得的总氯霉素含量，单位ng/g；m2为样品中的氯霉素含量，单位为ng/g；m3为加标的氯霉素含量，单位为ng/g。
29.具体的，其中的对比例二的标准曲线和检出限的具体比对方法为：准确称取0.01g氯霉素标准品用甲醇溶解后以甲醇：水=35：65的流动相定溶，配制100μg/ml的标准储备液，在用流动相稀释为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.5、7.5、10.0μg/ml的氯霉素标准溶液。分别取1ml上述标准溶液过0.22μm滤膜后，进行hplc分析，以峰面积和浓度作图，得到氯霉素的工作曲线。并将标准溶液最低浓度进行逐级稀释进样，将目标峰周围的噪音峰的峰高高于目标峰3倍峰高的浓度定为最低检出限。其稳定性的比对方法为：通过对1、5、10μg/ml3个浓度水平的标准品进行高效液相色谱检测，并对每个浓度平行测定6次。通过计算相对标准偏差，来评价该方法在检测氯霉素上的稳定性。其回收率的比对方法为：取肉糜样品5g，向样品中加入1、5、10μg/ml浓度的标准溶液1ml，相当于样品添加量为0.2、1、2μg/g。然后，使用液相色谱法对氯霉素的含量进行检测。
30.进一步的，将本发明的实施例、对比例一以及对比例二这3种方法所测得的标准曲线及其最低检出限如下表1所示：表1：标准曲线机检测限结果汇总
由上表的测试结果可知，这3种方法都具有良好的线性关系，其3种方法的相关系数均高于0.99。对比例一的方法在0.05至6.75ng/ml范围内线性相关，对比例二在0.05至10μg/ml范围内线性相关，而本发明的实施例在0.01至1μg/ml内线性相关。其中，对比例二的最低检出限为9.4ng/g，但该方法的检出限仍然较高。上述3种方法的最低检出限的顺序为：对比例二》实施例》对比例一。但是，在现有的实践中发现，对比例一的方法容易出现假阳性的缺陷。所以，本发明的实施例具有相对较佳的检出限。
31.具体的，将本发明的实施例、对比例一以及对比例二这3种方法所测得的稳定性的实验结果汇总如下表2：表2：稳定性实验结果由上表2的实验结果可知，对比例一的rsd值在7.80%至10.06%内，对比例二的rsd值在5.14%至8.25%内，而本发明的实施的rsd值则在1.58%至5.48%的区间内。可见，上述3种检测方法的稳定性顺序为：实施例》对比例二》对比例一，也即，本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法的实施例的检测稳定性最佳。
32.进一步的，向肉糜样品中分别加入上述3种方法的线性范围内的3个浓度，然后，再分别按三种方法的对应前处理步骤进行提取，并以上述的3种方法进行检测，通过实际值与理论值比较，可得到所对应方法的回收率。实验结果如表3所示。由表3的实验数据可以看出，3种方法的样品加标回收率中，本发明的实施例的加标回收率结果在90.93%至105.25%之间，因而，其回收效果最好，其次是对比例一，其所对应的回收率分别为89.06%至89.72%。而对比例二的的回收效果较差，其回收率仅为73.57%至89.67%。可见上述3种检测方法的加标回收率效果顺序为：实施例》对比例一》对比例二。
33.表3：加标回收率的结果
综上所述，本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法具有检出限低、回收率高以及稳定性好的优点，其检出限为1.96ng/g，rsd值为1.58%~5.48%，回收率为90.93%~105.25%。具体的，本发明还优化了气相色谱法的前处理过程，并提高了该种方法的检测效果，节省了检测时间，并最终确定以水为加标溶剂、c
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为净化萃取柱、以5ml甲醇、5ml氯仿、5ml甲醇、5ml水为萃取柱活化方法、2
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2ml甲醇为洗脱剂、烘箱为衍生环境、70℃为衍生温度、25min为衍生时间。本发明一种肉制品氯霉素含量的检测方法解决了现有技术中肉制品氯霉素检测方法所存在的检测效率低的技术问题。
34.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
35.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。