羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的应用的制作方法

1.本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的使用方法。


背景技术：

2.哺乳动物羧酸酯酶(ces)，包括ces1、ces2、ces3和ces5，ces6负责催化大量结构多样的内源性和外源性底物的水解和酯交换反应，包括外源性、药物和脂质[acta pharmaceutica sinica b,2018.8(5):p.699-712；protein and peptideletters,2009.16(10):p.1207-1214.]。作为最丰富的哺乳动物代谢酶之一，ces1a 因以下原因而受到越来越多的关注。首先，ces1a有助于水解许多含酯或酰胺的内源性底物，如胆固醇酯和甘油三酯，并在脂质代谢稳态中起关键作用[annualreview of pharmacology and toxicology,1998.38:p.257-288]。其次，ces1a还参与药物代谢，包括介导许多前药(埃莫卡普利和奥司他韦)的激活或促进酯化药物 (氯吡格雷)的代谢失活[molecules,2008.13(2):p.412-431]。此外，最近的研究表明，ces1a作为一种新的血清学生物标记物，可在损伤后从人类肝细胞释放到细胞外[acs sensors,2020.5(7):p.1987-1995.]。此外，ces1a已被确定为高甘油三酯血症的治疗靶点，因为ces1a负责肝细胞中甘油三酯储存的水解[nature reviewsdrug discovery,2012.11(1):p.52-68]。
[0003]
由于上述ces1a的重要药理和生理功能，动物模型是其进一步研究，特别是新药临床前药代动力学和毒理学研究不可缺少的工具。然而，由于人类和模型动物 (如食蟹猴、狗、小型猪、大鼠和小鼠)之间ces1表达功能的差异，选取动物模型需要明确该酶的活性差异[life sci,2007.81(11):p.924-32.]。然而，以前的策略，包括qrt pcr、western blotting和蛋白质组学技术，只能评估ces1的mrna或蛋白质水平，而不能评估其实际功能[mol phylogenet evol,2010.57(1):p.23-34.]。这大大限制了对ces1在细胞过程和人类疾病中潜在作用的探索，以及ces1调控剂作为候选药物的发展。亟待能快速检测不同动物模型中出现使得评估ces1功能的种间差异成为可能。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种羧酸酯酶1 抑制剂检测试剂盒及其在利用不同种属动物制备物为酶源筛选抑制剂中的使用方法。该检测方法使用4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯，探针经 ces1水解后可生成萤火虫荧光素酶的底物。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。
[0005]
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：1.一种羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒，该试剂盒包括以下四种试剂：i液、ii液、iii液、iv液和质控标准品；
[0006]
其中所述i液为100mm磷酸盐缓冲液，ph＝5.5～8；
[0007]
所述ii液为100mm含有人ces1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；
[0008]
所述iii液体为荧光素检测试剂，含0.5mm的atp，10mm的mg
2
及50g/ml 的荧光素酶；
[0009]
iv液体为10mg/ml的不同种属的重组表达ces1单酶的ph 6.5的磷酸盐溶液，不同种属是人、狗、猪、猴、兔、大鼠或小鼠；
[0010]
所述质控标准品为10mm的羧酸酯酶广谱抑制剂。
[0011]
进一步地，所述人ces1的特异性生物探针底物为4，5-二甲基-2(6-羟基-2
‑ꢀ
苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯，其结构通式如式为：
[0012][0013]
在ph 5.5-8的缓冲体系中，上述化合物的甲酯键可被ces1特异性水解为相应水解产物4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸。
[0014]
本发明还提供一种羧酸酯酶1抑制剂检测试剂盒的应用，将所述的试剂盒用于利用不同种属的哺乳动物样本作为酶源进行该酶抑制剂的快速筛选与评估。
[0015]
进一步地，所述快速筛选与评估为：以ces1的特异性生物探针底物的水解反应作为ces1的特异性探针反应，探针底物4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4
‑ꢀ
羧酸噻唑甲酯被ces1特异性水解为萤火虫荧光素酶的底物；通过定量检测单位时间内样品中目标物的生物发光强度来表征水解产物的生成量，进而测定不同样本中人ces1的活性。
[0016]
进一步地，所述的快速筛选与评估的方法包括以下步骤：
[0017]
(1)预孵育：将待测样品与i液、iv液混匀，20～60度下孵育3～5分钟；
[0018]
(2)起始反应：加入ii液后混匀，20～60度下孵育2～120分钟；
[0019]
(3)检测：加入iii液体，混匀，37℃孵育20-30min，用酶标仪或化学发光分析仪测定样品；
[0020]
(4)通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中ces1的残余活性，进而实现ces1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
[0021]
酶源是：重组表达的哺乳动物中不同种属的ces1、含有ces1的不同种属中哺乳动物细胞/组织制备液、血浆或其他常见生物样本。
[0022]
待测样品为小分子化合物标准品、中药/植物提取物、复方中药制剂。
[0023]
本发明所述筛选ces1抑制剂的应用领域，包括但不限于检测小分子化合物标准品、中药/植物提取物、复方中药制剂对不同种属ces1的抑制额能力评估。
[0024]
本发明提供的检测ces1抑制剂的应用，需注意所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。
[0025]
本发明所提供的检测ces1抑制剂的检测方法，产物4，5-二甲基-2(6-羟基-2
‑ꢀ
苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酸是萤火虫荧光素酶的底物，可采用化学发光检测器实现产物的快速灵敏检测。此外，该特异性探针底物及相应ces1活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于以各种生物体系为酶源进行ces1抑制剂的定量评估。
[0026]
本发明中检测方法可用于利用不同种属的哺乳动物的重组羧酸酯酶、细胞或组织
制备液等多种生物体系为酶源，快速筛选ces1酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0028]
(1)高特异性：4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯可被hces1 高特异性地代谢成一个代谢产物，即甲酯键断裂的水解产物；
[0029]
(2)廉价易得：底物4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；
[0030]
(3)高灵敏度：水解产物为荧光素酶的底物，可用荧光素酶检测试剂进行高灵敏度的检测，最低定量下限为0.1nm。
[0031]
(4)高通量检测：利用该类荧光探针底物可实现96,386孔板的快速检测，可实现每日2万个样品对ces1抑制剂的高通量检测，具有单个测试成本低廉(《0.5 元)的优势。
附图说明
[0032]
图1为ces1生物发光底物在不同种属哺乳动物肝微粒体中的水解活性；
[0033]
图2为ces1生物发光底物在不同种属哺乳动物肝微粒体中酶解动力学曲线；
[0034]
图3为不同阳性抑制剂对不同种属哺乳动物肝微粒体水解ces1生物发光底物的抑制效应评估；
[0035]
图4为广谱抑制剂抑制对不同种属哺乳动物肝微粒体水解ces1生物发光底物的抑制能力随浓度变化的效应图。
具体实施方式
[0036]
下面将结合附图和实施例对本发明进行详细说明。需要指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0037]
ces1检测方法的检测原理反应式如下：
[0038][0039]
检测方法的具体应用如下：其中不同种属动物肝微粒体为：人肝微粒体(hlm), 食蟹猴肝微粒体(cylm),狗微粒体(dlm),小型猪肝微粒体(plm),大鼠肝微粒体(rlm)和小鼠肝微粒体(mlm)。化学品抑制剂为：双(对硝基苯基)磷酸酯 (bis-p-nitrophenyl phosphate，bnpp)、洛派丁胺(loperamide，lpa)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，edta)、加兰他敏(galanthamine， ca)、石杉碱甲(huperzine a，ha)。
[0040]
实施例1
[0041]
不同种属哺乳动物肝微粒体水解代谢4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯能力
[0042]
(1)预先准备20μl ces1代谢反应体系，包括i液、不同种属哺乳动物肝微粒体(5μg/ml)，于37℃条件下震荡预孵5分钟；
[0043]
(2)向反应体系中加入30μl的ii液(终浓度3μm)起始反应；
[0044]
(3)10分钟后，加入50μl的iii液体，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
[0045]
如图1所示为ces1生物发光底物在不同种属哺乳动物肝微粒体中的水解特征，其中cylm表示：食蟹猴肝微粒体
[0046]
dlm表示：比格犬微粒体
[0047]
plm表示：小型猪微粒体
[0048]
rlm表示：大鼠微粒体
[0049]
mlm表示：小鼠微粒体
[0050]
hlm表示：人微粒体
[0051]
control表示：对照组，不加酶源
[0052]
从图1中可以看出，对照组没用产物峰，即没用产物生成，cylm、dlm、 plm、rlm、mlm和hlm实验组均产生了产物峰，即不同种属哺乳动物肝微粒体中ces1可将其水解，证实该化合物具有非常好的反应性。
[0053]
实施例2
[0054]
不同种属动物肝微粒体水解4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯的动力学行为
[0055]
(1)预先准备20μl ces1代谢反应体系，包括i液、不同种属肝脏微粒体，于37℃条件下震荡预孵5分钟；
[0056]
(2)向反应体系中加入含有系列浓度的30μl的探针底物的ii液起始反应；
[0057]
(3)10分钟后，加入50μl的iii液体，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
[0058]
图2为ces1生物发光底物在不同种属哺乳动物肝微粒体中酶解动力学曲线。从图2的各个大图中可以看出4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯在不同种属动物肝微粒中的水解在底物低浓度时呈现浓度依赖增加，高浓度后进入平台期。大图内部的eadie-hofstee作图证明4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4
‑ꢀ
羧酸噻唑甲酯在不同种属动物肝微粒体中的水解遵循米氏动力学。
[0059]
实施例3
[0060]
ces1抑制剂的抑制能力表征
[0061]
(1)准备ces1代谢反应体系，包括i液、不同种属动物肝微粒体、不同酯酶特异性抑制剂(100μm)于37℃条件下震荡预孵10分钟；
[0062]
(2)向反应体系中加入30μl浓度为5μm的ii液起始反应；
[0063]
(3)10分钟后，加入50μl的iii液体，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
[0064]
图3为不同阳性抑制剂对不同种属哺乳动物肝微粒体水解ces1生物发光底物的抑制效应评估；图中，control表示：不加抑制剂的对照组，bnpp表示：加入抑制剂双(对硝基苯基)磷酸酯，cua表示：加入熊果酸，lpa表示：加入抑制剂洛派丁胺，ca表示：加入抑制剂加兰他敏，edta表示：加入抑制剂乙二胺四乙酸。
[0065]
图2a，酯酶广谱抑制剂对比格犬肝微粒体中的出4，5-二甲基-2(6-羟基-2
‑ꢀ
苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解有显著抑制作用，人特异性的ces1抑制剂有一定抑制作用，其他酯
酶特异性抑制剂均无明显抑制作用；
[0066]
图2b，酯酶广谱抑制剂对小型猪肝微粒体中的出4，5-二甲基-2(6-羟基-2
‑ꢀ
苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解有显著抑制作用，其他酯酶特异性抑制剂均无明显抑制作用；
[0067]
图2c，酯酶广谱抑制剂对大鼠肝微粒体中的出4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解有显著抑制作用，人特异性的ces1抑制剂有轻微抑制作用，其他酯酶特异性抑制剂均无明显抑制作用；
[0068]
图2d，酯酶广谱抑制剂对小鼠肝微粒体中的出4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解有显著抑制作用，其他酯酶特异性抑制剂均无明显抑制作用；
[0069]
图2e，酯酶广谱抑制剂对食蟹猴肝微粒体中的出4，5-二甲基-2(6-羟基-2
‑ꢀ
苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解有显著抑制作用，其他酯酶特异性抑制剂均无明显抑制作用；
[0070]
图2f，酯酶广谱抑制剂和人ces1特异性抑制剂对人肝微粒体中的出4，5
‑ꢀ
二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解有显著抑制作用，其他酯酶特异性抑制剂均无明显抑制作用。
[0071]
4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯在肝脏肝微粒体中的水解活性能够被羧酸酯酶特异性抑制剂bnpp显著抑制，而其它酯酶抑制剂对其水解没有显著的抑制活性，证实4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯能够用于不同种属的ces1抑制剂的特异性筛选。
[0072]
实施例4
[0073]
ces1特异性抑制剂对不同种属来源肝微粒体水解ces1的抑制活性定量评估
[0074]
(1)选取不同哺乳动物微粒体，准备ces1代谢反应体系，包括i液、肝微粒体和系列浓度的特异性抑制剂，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
[0075]
(2)向反应体系中加入30μl的ii液(终浓度10μm)起始反应；
[0076]
(3)10分钟后，加入50μl的iii液体，37℃孵育20min后，酶标仪检测发光。
[0077]
图4为广谱抑制剂抑制对不同种属哺乳动物肝微粒体水解ces1生物发光底物的抑制能力随浓度变化的效应图，从图4中可以看出酯酶广谱抑制剂bnpp对人、大鼠、小鼠、比格犬、食蟹猴和小型猪肝微粒中的4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解表现出浓度依赖性的抑制。
[0078]
使用graphpad prism 6.0软件对抑制剂浓度的对数与残余酶活性(％)进行非线性拟合，计算半抑制浓度(ic
50
)，如下表1所示：
[0079]
表1
[0080][0081]
从表1可以看出酯酶广谱抑制剂bnpp对不同种属肝微粒体均表现出强抑制效果，
其中人和比格犬的抑制参数最接近，人特异性抑制剂仅对人和比格犬有强抑制， ces2抑制剂对4，5-二甲基-2(6-羟基-2-苯咪唑)4-羧酸噻唑甲酯水解均无抑制效应。证明该检测方法可用于ces1抑制剂的定量评估。
[0082]
以上所述实验方案仅为本发明的优选实施方案，应当注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或补充，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。