靶向线粒体的异缩酮/ISOLEVUGLANDIN清除剂及其用途

靶向线粒体的异缩酮/isolevuglandin清除剂及其用途
1.政府支持
2.本发明是根据国立卫生研究院所授予的资助号r01hl124116、p01hl129941、k23gm129662、r01gm112871和ro1hl144943的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。
3.发明背景和

技术实现要素：

4.本技术涉及新化合物和组合物及其用途。已发现本发明的化合物可用于治疗疾病和病症，如炎症、败血症、线粒体功能障碍、氧化应激和高血压。
5.炎症是西方社会发病率和死亡率的主要原因。尽管使用多种药物，慢性和急性炎症仍然是主要的健康负担。炎症产生高度反应性二羰基脂质过氧化产物，如isolevuglandin，其通过赖氨酸残基共价修饰和交联蛋白质。线粒体功能障碍也与炎症相关。
6.本发明人发现炎症诱导的isolevuglandin促进线粒体功能障碍和死亡。本发明人已经(a)研究了应答合成的15-e
2-isolevuglandin(isolg)及其加合物的线粒体功能障碍；(b)开发了新的靶向线粒体的isolevuglandin清除剂，其包括通过将2-羟基苄胺缀合至亲脂阳离子三苯基鏻，(4-(4-氨基甲基)-3-羟基苯氧基)丁基)-三苯基鏻(mito2hoba)；(c)使用脂多糖炎症模型发现本发明的化合物，包括mito2hoba，防止线粒体功能障碍和死亡。
7.对于isolg或与赖氨酸、乙醇胺或磷脂酰乙醇胺的isolg加合物的急性暴露抑制线粒体呼吸并减弱复合物i活性。复合物ii功能对isolg的抗性强的多。本发明人证实，本发明的化合物，包括mito2hoba，显著地蓄积在分离的线粒体中，并且它与isolg高度反应。
8.为了测试线粒体isolg的作用，本发明人研究了本发明化合物在脂多糖小鼠败血症模型中的治疗潜力。例如，向脂多糖处理的小鼠的饮用水补充mito2hoba (0.1g/l)将存活率提高3倍，改善了复合物i介导的呼吸，并且组织病理学分析支持mito2hoba介导的防止细胞损伤的肾皮质保护。这些数据支持线粒体isolg在线粒体功能障碍和炎症中的作用。因此，本发明人能够证实减少线粒体isolg是与线粒体氧化应激和功能障碍相关的炎症和病症的治疗目标。
9.因此，本发明的方面包括抑制线粒体呼吸和减弱复合物i活性的isolevuglandin及其加合物；本发明的化合物，包括与三苯基鏻缀合的2-羟基苄胺，mito2hoba，蓄积在线粒体中；饮用水中的mito2hoba改善lps败血症模型中复合物i介导的呼吸；以及靶向线粒体的isolevuglandin清除剂mito2hoba降低lps模型的死亡率。
10.同样，高血压仍然是西方社会的一个主要健康问题，尽管使用了多种药物，但三分之一的患者血压控制不良。线粒体功能障碍与高血压相关，靶向线粒体的药剂可能改善高血压的治疗。本发明人发现线粒体氧化应激产生反应性二羰基脂质过氧化产物isolevuglandin(isolg)，并且线粒体isolg的清除改善血管功能并降低高血压。为了验证这一假说，我们用质谱和western印迹分析方法研究了原发性高血压患者和血管紧张素ii高血压模型中线粒体isolg-蛋白加合物的蓄积。通过靶向线粒体的新isolg清除剂mito2hoba检测了靶向线粒体isolg的治疗潜力。高血压患者小动脉中的线粒体isolg比正
常血压个体小动脉多250％，并且离体mito2hoba治疗高血压个体小动脉增加了关键的线粒体抗氧化剂超氧化物歧化酶2(sod2)的脱乙酰作用。在用血管紧张素ii加tnfα刺激的人主动脉内皮细胞中，mito2hoba降低了线粒体超氧化物和心磷脂氧化，这是线粒体氧化应激的特异性标志。在输注血管紧张素ii的小鼠中，mito2hoba降低线粒体isolg-蛋白加合物，提高sirt3线粒体脱乙酰酶活，降低血管超氧化物，增加内皮一氧化氮，改善内皮依赖性舒张，并减轻高血压。在输注血管紧张素ii的小鼠中，mito2hoba保护线粒体呼吸，保护atp的产生，并减少线粒体通透性孔开放。这些数据支持线粒体isolg在内皮功能障碍和高血压中的作用。本发明人已经发现线粒体isolg的清除在治疗血管功能障碍和高血压方面具有治疗益处。
11.根据最近的指南，几乎一半的成年人患有高血压，并且全球估计有14亿人患有高血压。这种疾病代表中风、心肌梗塞和心力衰竭的主要危险因素。尽管使用多种药物治疗，但三分之一的高血压患者仍然保持高血压，可能是由于目前治疗不影响其机制。长期以来一直需要能够改善高血压治疗的新型抗高血压药。高血压是一种多因素疾病，并且在高血压中多个器官中氧化应激增加。氧化应激通过增加交感神经传出、促进肾脏功能障碍和增加全身血管阻力而导致高血压。同时，常见的抗氧化剂，如抗坏血酸和维生素e，对心血管疾病和高血压的治疗无效，且在一些研究中还恶化了结果。与低分子量抗氧化剂相比，内源性酶促抗氧化剂在抗氧化应激方面更为有效，但这些内源性抗氧化剂在高血压中可能被灭活。原发性高血压与一种关键的线粒体抗氧化剂超氧化物歧化酶2(sod2)通过在催化中心的赖氨酸残基被乙酰化而失活相关，这是由于线粒体脱乙酰酶sirtuin 3(sirt3)活性降低所致，但sirt3失活的确切机制和sod2抑制的分子后果尚不清楚。
12.一个潜在的机制涉及脂质过氧化，特别是线粒体isolevuglandin(isolg)的形成。isolg是高反应性和有害的二羰基脂质过氧化产物。它们是由花生四烯酸被氧化物质过氧化而产生的，所述氧化物质例如是质子化形式的超氧化物、氢过氧基。isolg迅速加合伯胺，例如蛋白质赖氨酸残基，促进细胞功能障碍。在树突状细胞中，isolg促进自身蛋白的修饰，这可以作为新抗原驱动适应性免疫反应。用isolg清除剂2-羟基苄胺(2hoba)进行的治疗减少树突状细胞和t细胞的激活，并减弱血管紧张素ii和doca盐诱导的高血压。值得注意的是，2hoba不是一种抗氧化剂，但它通过清除反应性isolg和降低树突状细胞的活化来减少树突状细胞中超氧化物的产生。然而，isolg的具体来源和靶标仍不明确。isolg的病理生理作用不仅限于树突状细胞，因为isolg可以在血管组织、内皮细胞、上皮细胞和其他细胞中产生。高血压与线粒体氧化应激相关，并且线粒体可能是潜在的isolg来源，但线粒体isolg在高血压中的作用尚未得到研究。本发明人表明，线粒体isolg在高血压中可能促进sirt3失活和线粒体功能障碍。
13.用isolg剂量处理分离的线粒体破坏了线粒体呼吸并促进线粒体通透性转换孔(mptp)开放。为了研究线粒体内isolg在体内的特异性作用，本发明人通过将2hoba缀合至亲脂阳离子三苯基膦，开发了靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba。mito2hoba不清除活性氧。不受理论或机理的约束，它可能与不同的γ-酮醛反应，但与isolg具有特别的反应性。mito2hoba在线粒体中蓄积，并在脂多糖败血症小鼠模型中，补充mito2hoba可使动物存活率增加3倍，增加复合物i介导的呼吸，并防止肾皮质损伤，支持线粒体isolg在线粒体功能障碍中的作用。
14.线粒体功能障碍促进高血压和心血管疾病的发病；然而，尽管线粒体在人类健康和疾病中发挥着核心作用，但目前还没有批准的直接靶向线粒体的药物。线粒体功能障碍的特征在于atp水平降低和氧化应激增加，导致细胞功能障碍和凋亡。线粒体通透性转换孔(mptp)的开放在高血压的线粒体功能障碍和终末器官损伤中起着关键作用。本发明人发现mptp开放的调节亚单位亲环素d(cypd)的消耗或抑制改善血管功能并减轻高血压。有趣的是，赖氨酸166处的cypd乙酰化促进mptp开放，并且线粒体sirt3使cypd-k166脱乙酰。
15.sirt3是线粒体代谢和抗氧化功能调节的关键节点。sirt3消耗促进内皮功能障碍、血管肥厚、血管炎症和终末器官损害。临床研究表明，心血管疾病危险因素与sirt3水平和活性降低相关。本发明人发现sirt3损伤是构成主要心血管危险因素相互作用的基础的新收敛(convergent)机制。本发明人表明线粒体isolg灭活sirt3，并且线粒体isolg的清除保护sirt3活性，改善血管功能并降低高血压。
16.本文使用的缩写包括isolg，isolevuglandin(又名异缩酮(isoketal))；pe，磷脂酰乙醇胺；15-e
2-isolg，isolevuglandin的15-e2立体异构体；15-e
2-isolg-pe，pe与15-e
2-isolg立体异构体的加合物；2hoba，2-羟基苄胺；4hoba，2hoba的非清除剂类似物4-羟基苄胺；mito2hoba，2-羟基苄胺与亲脂阳离子三苯基鏻的缀合物，(4-(4-氨基甲基)-3-羟基苯氧基)丁基)-三苯基鏻；mitotempo，(2-(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基-4-基氨基)-2-氧代乙基)三苯基鏻；mptp，线粒体通透性转换孔；pufa，多不饱和脂肪酸；ros，活性氧；lps，脂多糖；wt，野生型c57bl/6j小鼠；smp，亚线粒体颗粒。
17.附图简要说明
18.图1a-1c显示用isolg或isolg-pe进行的急性处理损害线粒体呼吸。(a)完整的小鼠肾线粒体与作为载剂的乙醇(假手术)、isolg(20μm)或isolg-pe(20μm)一起孵育(5min)，然后用呼吸缓冲液稀释20倍，然后添加谷氨酸和苹果酸、adp(50μm)并测量iii态(state iii)的耗氧量。*p《0.001vs假手术，**p《0.03vs isolg。(b)在呼吸室内经载剂、isolg(1.5μm)或isolg-pe(1.5μm)处理的完整肾线粒体中，在复合物i底物谷氨酸 苹果酸和adp(iii态)存在下的氧消耗和呼吸控制率(iii态/iv态，％)。(c)在呼吸室内加入载剂、isolg(1.5μm)或isolg-pe(1.5μm)后，在复合物ii底物琥珀酸和adp存在下的iii态呼吸和呼吸控制率(iii态/iv态，％)。数据以均值
±
std(n＝4-6)表示。*p《0.01vs载剂。
19.图2显示了isolg和isolg-加合物对复合物i和复合物ii活性的抑制。(a，b)小鼠肾线粒体裂解物与dmso(载剂)或isolg一起孵育5分钟，然后分析复合物i或复合物ii活性，如先前[29,30]所述。*p《0.01vs假手术。**p《0.05vs假手术。(c)小鼠肾线粒体裂解物用dmso(对照)、乙醇胺、精胺、l-赖氨酸、isolg(1.5μm)或isolg修饰的乙醇胺(isolg-etn，1.5μm)、isolg-精胺(isolg-sper，1.5μm)、isolg-l-赖氨酸(isolg-lys，1.5μm)、isolg-磷脂酰乙醇胺(isolg-pe，1.5μm)进行急性处理，然后测量复合物i活性，以对照(100％)的％表示。数据以平均值
±
std(n＝3-6)表示。*p《0.001vs假手术，#p《0.01vs isolg。
[0020]
图3显示了isolg清除剂mito2hoba的线粒体靶向性。由于线粒体的膜电位比细胞内其他细胞器高得多，将2-羟基苄胺与亲脂性阳离子三苯基鏻连接将mito2hoba指引向线粒体，导致在线粒体中的选择性蓄积。炎症和氧化应激将花生四烯酸氧化成反应性isolg，其与蛋白质赖氨酸残基和磷脂酰乙醇胺快速反应，产生细胞毒性的isolg加合物。将mito2hoba(0.1μm)与分离的线粒体(1mg/ml)一起孵育导致线粒体部分中mito2hoba的强烈
蓄积。数据以均值
±
std(n＝4)表示。靶向线粒体的mito2hoba可以通过清除线粒体基质中的isolg来潜在地降低线粒体功能障碍。
[0021]
图4显示了从对照假手术、补充mito2hoba、lps处理和lps加mito2hoba小鼠分离的肾线粒体的呼吸。为了研究线粒体功能，谷氨酸和苹果酸的组合(gm)或琥珀酸用作底物。由于谷氨酸可以通过转胺作用转化为α-酮戊二酸并进一步转化为琥珀酸，本发明人使用复合物ii抑制剂丙二酸来定义特定的复合物i呼吸。在补充了呼吸底物的线粒体中测定基础呼吸(1)。然后加入adp以测定耦合呼吸(2)。加入复合物v抑制剂寡霉素a后测定质子漏(3)。补充cccp后测定解耦合呼吸(4)。最后，加入抗霉素a和鱼藤酮来评估非线粒体呼吸(5)，如先前所述[32]。数据为平均值
±
std(n＝4-6)。*p《0.001vs gm，#p《0.01vs对照，
§
p《0.001vs对照，**p《0.01vs lps。
[0022]
图5显示了对照、补充mito2hoba和lps处理小鼠的动物存活率(a)、复合物i/复合物ii活性比(b)和(c)组织病理学评分。3月龄c57bl/6j小鼠(25-28g)在注射lps(25μg/g)前补充mito2hoba(饮水，0.1g/l)持续72小时。复合物i/复合物ii活性比表示与对照(100％)相比的％。(c)肾损伤的组织病理学评分，如方法部分所述。对细胞损伤的定量分析表明，与单独用lps处理相比，用mito2hoba处理导致细胞损伤的显著减少。数据为平均值
±
std。*p《0.01vs lps(n＝6)，*p《0.01vs lps(n＝10)。
[0023]
图6a-h显示了对照、补充mito2hoba、lps注射和lps mito2hoba处理的小鼠肾脏的细胞损伤的组织学分析。来自对照组小鼠的代表性切片示出了位于皮质(a)和髓质(b)的正常肾小球(g)、近端小管(p)和远端小管(*)。单独用mito2hoba(c&d)处理的小鼠肾脏切片与对照小鼠的非常相似。虽然大多数小管显得正常，但是髓质(d)中有少量近端小管细胞出现轻微的胞质空泡化迹象。皮质(c)没有损伤的迹象。相反，用lps处理的小鼠的肾脏切片显示皮质(e)和髓质(f)空泡化和细胞变性(箭头)。在髓质中，许多近端小管细胞染色呈嗜碱性(三角)，提示细胞内代谢发生改变。远端小管(*)正常。当用lps和mito2hoba处理小鼠时，在髓质(h)中检测到细胞损伤，而皮质(g)显得正常。整体损伤较lps处理的小鼠大大减轻。在髓质内，可见小区域的胞质变性(箭头)和嗜碱性染色(三角)。比例尺＝50μm。
[0024]
图7a和7b显示(a)本发明的线粒体靶向性化合物的实例的合成和(b)该化合物是有效的isolg清除剂。
[0025]
图8a-d显示了来自正常血压和高血压个体(n＝5)的人小动脉中的线粒体isolg的western印迹(a)，(b)靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba的形成和(c、d)分离自血压正常和高血压个体并用mito2hoba(0.5μm，24小时，dmem)离体处理的人小动脉中的sod2乙酰化。数据用复合物i水平归一化(假手术是100％)。数据为平均值
±
sem。*p《0.01vs血压正常假手术，**p《0.01vs高血压(n＝5)。
[0026]
图9a和b显示了mito2hoba对血管紧张素ii加tnfα诱导的人主动脉内皮细胞线粒体超氧化物和心磷脂氧化的作用。(a)通过mitosox-超氧化物的特异性产物mito-2-羟基乙锭(mito-2-hydroxyethidium)(mito-2oh-et )的hplc分析来测定线粒体超氧化物。mito2hoba(50nm)消除线粒体超氧化物的刺激，而相似剂量的非靶向性isolg清除剂2hoba(50nm)或高剂量的对isolg无活性的类似物4hoba(10μm)没有保护性。*p《0.01vs对照，**p《0.001vs血管紧张素ⅱ tnfα。(b)通过lc/ms测定的由血管紧张素ⅱ tnfα诱导的心磷脂氧化。mito2hoba (50nm)显著减弱心磷脂氧化，而非靶向性2hoba(10μm)则无效。补充图s1显
示了典型的色谱图。数据为平均值
±
sem。*p《0.01vs对照，**p《0.01vs血管紧张素ⅱ tnfα(n＝4)。
[0027]
图10a-d显示了mito2hoba对血管紧张素ii诱导的高血压和线粒体isolg蛋白加合物的蓄积的作用。(a)雄性假手术或输注血管紧张素ii并补充在饮用水中的mito2hoba (0.1g/l)或等摩尔量的非靶向性类似物2hoba(0.17mmol/l)的小鼠的血压尾套管(tail-cuff)测量。(b)在输注血管紧张素ii并补充mito2hoba或作为载剂的净水的小鼠中进行的血压遥测研究。(c)isolg-赖氨酰-内酰胺加合物的代表性lc/ms/ms色谱；(d)从假手术或输注血管紧张素ii并补充mito2hoba的小鼠分离的肾线粒体中isolg-lys-内酰胺水平。结果为平均值
±
sem。*p《0.01vs假手术，**p《0.01vs ang ii(n＝8)。
[0028]
图11a-d显示了从假手术和用mito2hoba处理的血管紧张素ii输注的小鼠分离的主动脉中线粒体乙酰化的western印迹分析。(a)isolg蛋白加合物(d11 ab)、sirt3、乙酰赖氨酸、sod2-k68-乙酰化、cypd乙酰化、isolg与复合物i ndufs1 75kda亚基的加合物和线粒体复合物i的典型western印迹；(b)sirt3水平；(c)线粒体蛋白质赖氨酸乙酰化；(d)sod2-k68-乙酰基水平；和(e)cypd-乙酰基水平。提供给小鼠在饮用水中的mito2hoba(m2h)(0.1g/l)和血管紧张素ii(渗透泵，0.7mg/kg/天)，共14天。数据用复合物i水平归一化(假手术为100％)。结果为平均值
±
sem(n＝5)。*p《0.01vs假手术，**p《0.01vs血管紧张素ⅱ(angⅱ)。
[0029]
图12a-d显示了mito2hoba补充对血管紧张素ii输注小鼠的线粒体超氧化物(a)、血管超氧化物(b)、内皮一氧化氮(c)和内皮依赖性舒张(d)的作用。采用hplc，通过靶向线粒体的超氧化物探针mitosox(1μm)或非靶向性超氧化物探针dhe(50μm)测定线粒体和血管o2
·
。
46
用no自旋捕获剂fe(detc)2和esr分析内皮一氧化氮。
47
c57bl/6j小鼠输注ang ii并且在饮用水中提供mito2hoba(0.1g/l)。补充图s2显示了典型的hplc色谱图。补充图s3显示了一氧化氮测量的代表性esr谱。结果为平均值
±
sem。**p《0.01vs假手术，**p《0.01vs ang ii(n＝6)。
[0030]
图13a-b显示mito2hoba减少mptp开放并防止线粒体功能障碍。c57bl/6j小鼠输注angⅱ(0.7mg/kg/ml)并且在饮用水中提供mito2hoba(0.1g/l)。输注ang ii 14天后，处死动物，并分离肾脏以进行线粒体研究。向线粒体中加入cacl2超过ca2 保留能力导致mptp开放和线粒体肿胀。
71
从输注angⅱ的小鼠分离的线粒体由于mptp开放增加而具有ca2 容量的显著降低，并且cypd抑制剂环孢菌素a(csa)挽救了ca2 的保留容量(a)。用谷氨酸和苹果酸测定分离的肾线粒体的呼吸控制率(3态/4态)(b)。对照水平为100％。(c)通过基于荧光素酶的发光测定法，测定新鲜分离组织中的肾atp。
72
结果为平均值
±
sem。*p《0.01vs假手术，**p《0.01vs血管紧张素ii(n＝5)。
[0031]
图14显示高血压与sirt3失活相关，sirt3失活导致线粒体蛋白质如亲环素d(cypd)和线粒体超氧化物歧化酶(sod2)的高度乙酰化。cypd乙酰化促进mptp开放，其增加线粒体超氧化物的产生，而sod2乙酰化则使sod2失活。这导致超氧化物产生增加和超氧化物歧化酶活性降低之间的不平衡，导致线粒体氧化应激和多不饱和脂肪酸(pufa)在线粒体中氧化为反应性γ-酮醛，即isolevuglandin(isolg)。线粒体isolg促进血管和线粒体功能障碍，而用靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba进行的处理减少sirt3失活，改善线粒体和血管功能，并减轻高血压。本发明表明，靶向线粒体isolg防止sirt3失活，并可改善人类个
体的血管功能障碍的治疗。
具体实施方式
[0032]
通过参考以下对本发明的详细描述和其中包括的实施例，可以更容易地理解本发明。
[0033]
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、系统、装置和/或方法之前，应理解，其不限于特定的合成方法，除非另有说明，或不限于特定试剂，除非另有说明，因为其当然可有所变化。还应当理解，本文使用的术语只用于描述特定方面的目的，而不意在限制。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或试验本发明，现在描述示例性方法和材料。
[0034]
如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数个指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“官能团”、“烷基”或“残基”包括两个或更多个这样的官能团、烷基或残基的混合物等。
[0035]
本文可将范围表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一方面。还应理解的是，每个范围的端值不论是与另一个端值相关，还是与另一个端值不相关，都是有意义的。还应该理解，本文公开了许多数值，并且每个数值在本文中也被公开为“约”该特定数值以及该数值本身。例如，如果公开了数值“10”，那么还公开了“约10”。还应理解为特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0036]
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。
[0037]
如本文所用，术语“个体”是指给药对象。本文公开的方法的个体可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的个体可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不指具体的年龄或性别。因此，不论是雄性的还是雌性的成年和新生个体及胎儿都被涵盖。患者是指患有疾病或病症的个体。术语“患者”包括人和兽类个体。
[0038]
如本文所用，术语“治疗”是指患者的医学管理，其旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。该术语包括积极治疗，即特别地旨在改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即旨在消除相关疾病、病理状况或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症形成的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或病症的特定疗法的治疗。
[0039]
如本文所使用的，术语“预防(prevent)”或“防止(preventing)”是指排除、阻止、避免、防止、预防或阻碍某事发生，尤其是通过提前行动。应当理解，除非另有明确说明，在本文使用减少、抑制或预防的情况下，也明确公开了其他两个词的使用。如本文中所见，治疗和预防的定义存在重叠。
[0040]
如本文所用，术语“经诊断的”意指已经由本领域技术人员(例如，医师)进行身体检查，并且发现其具有可被诊断或通过本文所公开的化合物、组合物或方法治疗的病症。如
本文所用，短语“鉴定为需要治疗病症”等是指基于对治疗病症的需要选择个体。例如，基于本领域技术人员的早期诊断可以将个体鉴定为需要治疗病症(例如，与炎症有关的病症)，然后接受该病症的治疗。在一个方面，预期鉴别可以由与进行诊断的人不同的人来执行。在另一方面，还预期可由随后进行给药的人来给药。
[0041]
如本文所用，术语“给予(administering)”和“给药(administration)”是指向个体提供药物制剂的任何方法。这些方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于口服给药、透皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼科给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药和肠胃外给药，包括注射，例如静脉内给药、动脉内给药、肌内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地给药制剂；即给药以治疗现有的疾病或病症。在其他各个方面，可以预防性地给药制剂；即给药以预防疾病或病症。
[0042]
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需结果或对不希望的病症具有效力的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现所需治疗结果或对不希望的症状具有效力，但通常不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平会取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所使用的特定化合物的排泄速度；治疗的持续时间；与所用特定化合物联合或同时使用的药物以及医学领域熟知的相似因素。例如，在本领域的技术范围内是：以低于达到期望的治疗效果所需的剂量的水平开始化合物的剂量，逐步增加剂量，直至达到期望的治疗效果。无需要，可将有效日剂量分为多个剂量用于给药。所以，单剂量组合物可含有这样的量或者其约数以达到每日剂量。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天以一或多次剂量给药施用，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。在其他各个方面，制剂可以“预防有效量”给药；即，有效预防疾病或病症的量。
[0043]
本发明涉及2-羟基苄胺的靶向线粒体的衍生物(所述衍生物是从花生四烯酸和其他多不饱和脂肪酸衍生的高反应性脂质二羰基物
‑‑
isolevuglandin(isolg，也称为异缩酮或γ-酮醛)的清除剂)，包含此类化合物的药物组合物，以及治疗涉及线粒体功能障碍、氧化应激(例如线粒体氧化应激)、高血压和败血症的疾病的方法。
[0044]
在本发明的另一个实施方案中，提供用于治疗、预防和改善个体的线粒体功能障碍的方法，其包括给予有效量的本发明的靶向线粒体的清除剂或其药学上可接受的盐。
[0045]
在本发明的另一个实施方案中，提供用于治疗、预防和改善个体中氧化应激的方法，其包括给予有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
[0046]
在本发明的另一个实施方案中，提供用于治疗、预防和改善个体的高血压的方法，其包括给予有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
[0047]
在本发明的另一个实施方案中，提供用于治疗、预防和改善个体的败血症的方法，其包括给予有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
[0048]
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、系统、装置和/或方法之前，应理解，其不限于特定的合成方法，除非另有说明，或不限于特定试剂，除非另有说明，因为其当然可有所变化。还应当理解，本文使用的术语只用于描述特定方面的目的，而不意在限制。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或试验本发明，现在描述示例性方法和材料。
[0049]
在一个方面，本发明涉及用于治疗本文所描述的适应症的化合物或其药学上可接受的衍生物，所述适应症包括炎症、高血压、线粒体氧化应激和线粒体功能障碍。一般而言，预期每种公开的衍生物可任选地进一步被取代。还预期本发明可以任选地省略任何一种或多种衍生物。应当理解的是，所公开的化合物可以通过所公开的方法提供。还应理解的是，所公开的化合物可用于所公开的使用方法。还应理解的是，所公开的化合物均可用作相应的药物组合物。
[0050]
本发明的一个实施方案是下式的化合物：
[0051][0052]
其中：
[0053]
x是键、烷基、烷氧基、甲氧基、-o-或-ch
2-；
[0054]
每个r是独立的并且选自c
1-c
12
取代或未取代的烷基；及
[0055]
a是a是
[0056]
每个r1是独立的并且选自c
1-c
12
取代或未取代的烷基；和任选的反离子；
[0057]
及其立体异构体和药用盐。
[0058]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0059][0060]
其中：
[0061]
x是键、烷基、-o-或-ch
2-；及
[0062]
r为c
1-c
12
取代或未取代的烷基；
[0063]
及其立体异构体和药用盐。
[0064]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0065][0066]
其中：
[0067]
r为c
1-c
12
取代或未取代的烷基；
[0068]
及其立体异构体和药用盐。
[0069]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0070][0071]
其中：
[0072]
r1是c
1-c
12
取代或未取代的烷基；
[0073]
及其立体异构体和药用盐。
[0074]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0075][0076]
其中：
[0077]
r1是c
1-c
12
取代或未取代的烷基；
[0078]
及其立体异构体和药用盐。
[0079]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0080][0081]
其中：
[0082]
x是键、-o-或-ch
2-；
[0083]
r为c
1-c
12
取代或未取代的烷基；及
[0084]
r1为c
1-c
12
取代或未取代的烷基或乙酰氧基甲基；
[0085]
及其立体异构体和药用盐。
[0086]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0087][0088]
其中：
[0089]
每个r是独立的并且选自c
1-c
12
取代或未取代的烷基；及
[0090]
每个r1是独立的并且选自c
1-c
12
取代或未取代的烷基或乙酰氧基甲基；
[0091]
及其立体异构体和药用盐。
[0092]
在另一个实施方案中，所述靶向线粒体的清除剂是下式的化合物：
[0093][0094]
其中：
[0095]
r为c
1-c
12
取代或未取代的烷基；
[0096]
r2选自-p-ph3；或
[0097]
及其立体异构体和药用盐。
[0098]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0099][0099]
及其药学上可接受的盐。
[0100]
本发明的另一个实施方案是下式的化合物：
[0101][0102]
及其立体异构体和药用盐。
[0103]
一般路线
[0104]
下面描述本发明的靶向线粒体的isolg清除剂的合成。
[0105]
醚键的合成路线
[0106][0107]
将碳酸铯(4.9g，15mmol)加入在乙腈(50ml)中的2,4-二羟基苯甲醛(4.2g，
30mmol)和1,4-二溴丁烷(6.6g，30mmol)中。将混合物在氩气下于80℃加热5h，冷却并在搅拌下加入至1m磷酸盐缓冲液(30ml)，ph值为7，冰和kh2po4(2g)。过滤除去固体，滤液用乙酸乙酯萃取。经柱(二氧化硅，9:1己烷-乙酸乙酯)纯化，得到4-(4-溴丁氧基)2-羟基苯甲醛(4.1g，50％)。将其与三苯基膦(4.2g)在甲苯(75ml)中混合，并在氩气下回流15h。粉红色固体经快速色谱法纯化(0-10％甲醇，在二氯甲烷中)，得到4-(4-甲酰基-3-羟基苯氧基)丁基)三苯基溴化鏻(4.8g，60％)。通过在nh2oh.hcl(0.63g)和ch3co2na(0.74g)的存在下在乙醇(40ml)中搅拌1h，将醛转化为肟。粗产物溶于乙酸(40ml)中并用锌粉(6g)处理。将反应混合物在水浴中缓慢加热至60℃，在该温度下保持20m，冷却并过滤。除去乙酸，并用柱色谱(二氧化硅；5-20％0.1m醋酸铵-乙腈)纯化残留物。使用适当的二溴烷烃类似地制备其他化合物。
[0108]
亚甲基键的路线：
[0109][0110]
5-(氯甲基)-2-羟基苯甲醛(4.5g)与三苯基膦(5.75g)在乙腈中回流5h。冷却后，加合物用柱(二氧化硅；0-15％甲醇，在二氯甲烷中)纯化。将醛转化为肟，在醋酸中用锌还原，并按照关于mito2hoba-c4的描述纯化。烷基链可以延伸。
[0111]
原始mito水杨胺类似物的制备如下所示：
[0112][0113]
酯类和酸类的合成路线：
[0114][0115]
4-羟基苯甲酸甲酯(8.3g)在含有多聚甲醛(8g)、氯化镁(10g)和三乙胺(28ml)的乙腈中回流。30m后，将反应混合物酸化并用乙酸乙酯萃取。粗产物在硅胶柱(5:1己烷-乙酸乙酯)上纯化。将醛转化为肟，并将后者与2当量的lioh在1:1甲醇-水中在75-80℃下加热2h。经冷却和酸化后分离肟酸，为白色固体。将其(2.3g)溶于dmf(25ml)中，冰冷并用khco3和溴甲基乙酸酯(1.7g)处理。将混合物搅拌18h，并将粗产物在硅胶(2:1己烷-乙酸乙酯0；2.1g清液)上纯化。将肟用锌粉(3.2g)和乙酸(30ml)还原得到acmo-2hoba。
[0116]
将第一步得到的3-甲酰基-4-羟基苯甲酸甲酯转化为肟并还原，得到mcm-2hoba。类似地，3-(4-羟基苯基)丙酸乙酯是ece-2hoba的起始化合物。
[0117]
二酯类的合成路线：
[0118]
[0119]
5-(氯甲基)-2-羟基苯甲醛(8g)与亚氨基二乙酸二乙酯(5ml)和三乙胺(5.6ml)一起在thf(40ml)中搅拌2h。粗产物进行快速色谱(二氧化硅；3:1己烷-乙酸乙酯)。经羟胺处理将醛基转化为肟。hcl和乙酸钠的乙醇溶液。用锌和醋酸还原后，在硅胶柱上纯化2hoba-二酯。纯产物用30％甲醇-乙酸乙酯洗脱。
[0120]
本文所用的术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或非环状的。烷基可以是支链或非支链的。烷基也可以是取代的或未取代的。例如，烷基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。“低级烷基”基团是含有1至6个(例如，1至4个)碳原子的烷基。
[0121]
在整个说明书中，“烷基”通常用于表示未取代的烷基和取代的烷基二者；然而，取代的烷基在本文中也通过鉴定该烷基上的特定取代基而被具体提及。例如，术语“卤代烷基”具体是指被一个或多个卤化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个如下所述的烷氧基取代的烷基。术语“烷基氨基”具体是指被一个或多个如下所述的氨基取代的烷基，等等。当在一种情况下使用“烷基”并且在另一种情况下使用例如“烷基醇”的特定术语时，并不表示意指术语“烷基”也不是指例如“烷基醇”之类的特定术语等。
[0122]
本文所用的术语“烷氧基(alkoxy)”和“烷氧基(alkoxyl)”是指通过醚键键合的烷基或环烷基；也就是说，“烷氧基”基团可以定义为-oa1，其中a1是如上定义的烷基或环烷基。“烷氧基”还包括如上所述的烷氧基聚合物；也就是说，烷氧基可以是聚醚，例如-oa
1-oa2或-oa
1-(oa2)
a-oa3，其中“a”是1-200的整数，并且a1、a2和a3是烷基和/或环烷基。
[0123]
本文描述的化合物可以包含一个或多个双键，因此可能产生顺式/反式(e/z)异构体以及其他构象异构体。除非另有相反说明，否则本发明包括所有这些可能的异构体，以及这些异构体的混合物。
[0124]
还应理解，如果需要或必要，本文所述化合物含有任选的反离子。这些任选的反离子的实例包括氯离子、甲磺酸根、碳酸氢根、氟离子、硝酸根、溴离子、硫酸根、柠檬酸根、苯甲酸根、糖精阴离子和乙酸根。例如，如果描述三苯基鏻化合物，可以假定为三苯基溴化鏻。
[0125]
除非另有相反说明，否则化学键仅以实线而不是楔形或虚线表示的式涵盖每种可能的异构体，例如每种对映异构体和非对映异构体，以及异构体的混合物，例如外消旋或非外消旋(scalemic)混合物。本文描述的化合物可以包含一个或多个不对称中心，因此可能产生非对映异构体和光学异构体。除非另有相反说明，否则本发明包括所有这些可能的非对映异构体以及它们的外消旋混合物、它们基本上纯的拆分对映异构体、所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。立体异构体的混合物以及分离的特定立体异构体也包括在内。在用于制备此类化合物的合成方法的过程中，或在使用本领域技术人员已知的消旋化或差向异构化方法中，此类方法的产物可以是立体异构体的混合物。此外，除非明确描述为“未取代”，否则所有取代基都可以被取代或未被取代的。
[0126]
在某些方面，化合物的结构可以用下式表示：
[0127][0128]
其被理解为等同于下式：
[0129][0130]
其中n通常是整数。也就是说，rn被理解为代表五个独立的取代基，r
n(a)
、r
n(b)
、r
n(c)
、r
n(d)
、r
n(e)
。“独立的取代基”是指每个r取代基都可以独立定义。例如，如果在一个例子中r
n(a)
是卤素，那么在那个例子中r
n(b)
不一定是卤素。同样，当基团r被定义为四个取代基时，r被理解为代表四个独立的取代基，ra、rb、rc和rd。除非另有相反的说明，否则取代基不限于任何特定的顺序或排列。
[0131]
在一个方面，本发明涉及包含所公开的化合物的药物组合物。即，可以提供这样的药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种所公开的化合物或所公开的方法的至少一种产物和药学上可接受的载体。
[0132]
在某些方面，所公开的药物组合物包含所公开的作为活性成分的化合物(包括其药学上可接受的盐)、药学上可接受的载体以及任选的其他治疗成分或辅剂。本发明的组合物包括那些适合于口服、直肠、局部和胃肠外(包括皮下、肌肉内和静脉内)给药的组合物，然而在任何给定情况下最合适的途径将取决于特定宿主以及需要给予活性成分的病症的性质和严重程度。所述药物组合物可以方便地以单位剂型提供，并通过药学领域中公知的任何方法制备。
[0133]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。当本发明化合物是酸性的时，其相应的盐可以方便地从药学上可接受的无毒性碱(包括无机碱和有机碱)制备。得自此类无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜(二价和一价)盐、三价铁盐、二价铁盐、锂盐、镁盐、锰(三价和二价)盐、钾盐、钠盐、锌盐等。特别优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。得自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺以及环胺和取代的胺(例如天然存在和合成的取代的胺)的盐。可用来形成盐的其它药学上可接受的无毒有机碱包括离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n`-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
[0134]
如本文所用，术语“药学上可接受的无毒酸”包括无机酸、有机酸和由其制备的盐，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、帕莫酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。优选柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
[0135]
在实践中，可以根据常规制药技术，将本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分与药用载体紧密混合。所述载体可依据给药(例如口服或肠胃外(包括静脉内))
所需的制剂形式有很多种形式。因此，本发明的药物组合物可以以适合口服的分离单元的形式提供，例如各自包含预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂。此外，所述组合物可以作为散剂、颗粒剂、溶液、在水性液体中的混悬剂、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液提供。除了上述常见剂型外，本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐还可以通过控释装置和/或递送装置给药。所述组合物可以通过任何药学方法来制备。通常，此类方法包括将活性成分与构成一种或多种必需成分的载体组合在一起的步骤。通常，通过将活性成分和液体载体或研磨成细粉的固体载体或它们两者均一而紧密地混合在一起，来制备所述组合物。然后，可以方便地将产物的形状制成需要的形式。
[0136]
因此，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体和本发明化合物或本发明化合物的药学上可接受的盐。本发明化合物或其药学上可接受的盐也可以与一种或多种其它的治疗活性化合物组合而被包含在所述药物组合物中。所用的药物载体可以是例如固体、液体或气体。固体载体的实例包括乳糖、白陶土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的实例包括二氧化碳和氮气。
[0137]
在制备用于口服剂型的组合物时，可以使用任何方便的药物基质。例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制剂，例如混悬剂、酏剂和溶液；而诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等载体可用于形成口服固体制剂，例如散剂、胶囊剂和片剂。因为给药方便，所以片剂和胶囊是优选的口服剂量单位，由此使用的载体是固体药用载体。任选地，片剂可通过标准的水性或非水技术包衣。
[0138]
含有本发明组合物的片剂可以任选地与一种或者多种附属组分或者助剂通过压制或者成型来制备。压制片剂可在合适的机器上将以自由流动的形式例如粉末或颗粒存在的活性成分任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合压制而成。铸形片剂可以通过在适宜的机械中，将粉末化的用惰性液体稀释剂湿润后的化合物进行塑形而制得。
[0139]
本发明的药物组合物可利包含作为活性成分的本发明的化合物(或其药学上可接受盐)、药学上可接受的载体和任选存在的一种或多种其它治疗剂或辅剂。本发明的组合物包括适合口服、直肠、局部和胃肠外(包括皮下、肌内和静脉内)给药的组合物，然而在任何既定情况下最适合的途径将取决于特定宿主以及给予活性成分所为的病症的性质和严重程度。所述药物组合物可以方便地以单位剂型的形式存在，并通过药学领域中熟知的任何方法制备。
[0140]
适于胃肠外给药的本发明的药物组合物可以制成活性化合物在水中的溶液或悬浮液。可以包含适合的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。还可以在甘油、液态聚乙二醇和它们在油中的混合物中制备分散液。此外，还可以包含防腐剂以防止微生物的有害生长。
[0141]
适于注射用的本发明的药物组合物包括无菌的水溶液或分散液。此外，所述的组合物可以为用于临时制备这样的无菌可注射溶液或者分散液的无菌粉末的形式。在任何情况下，最终的可注射形式必须无菌且必须实际上为流体，以方便注射。药物组合物在制造和储存条件下必须是稳定的；因此，优选的贮存应防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物。
[0142]
本发明的药物组合物可为适于局部使用的形式，例如气雾剂、乳膏、软膏、洗剂、撒粉、漱口剂、含漱剂等。此外，所述组合物可为适用于透皮装置的形式。这些制剂可以通过常规加工方法，利用本发明的化合物或其药学上可接受的盐制备。举例来讲，乳膏或软膏通过以下方式制备：将亲水性物质和水以及约5％重量至约10％重量的化合物混合以产生具有所需稠度的乳膏或软膏。
[0143]
本发明的药物组合物可以是适于直肠给药的形式，其中载体是固体。优选的是，混合物形成单位剂量栓剂。适合的载体包括可可脂及本领域常用的其它物质。通过首先将组合物和软化或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和成形，可方便地形成栓剂。
[0144]
除了上述的载体成分外，视情况而定，上面描述的药物制剂可以包含一种或者多种另外的载体成分，例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。另外，可以包含其它的辅剂以使所述制剂与目标受体的血液等渗。含有本发明化合物和/或其药学上可接受的盐的组合物也可以制备成粉末或液体浓缩物形式。
[0145]
在需要增强代谢型谷氨酸受体活性的治疗状况下，适当的剂量水平通常为每天每千克患者体重0.01-500mg，并且可以单剂量或多剂量给予。优选地，剂量水平为每天约0.1至约250mg/kg；更优选每天0.5至100mg/kg。适宜的剂量水平可为每天0.01至250mg/kg、每天0.05至100mg/kg或每天0.1至50mg/kg。在此范围内，剂量可为每天0.05至0.5mg/kg、0.5至5.0mg/kg或5.0至50mg/kg。为了口服给药，所述组合物优选以片剂的形式提供，所述片剂含有1.0-1000毫克的活性成分，特别是1.0、5.0、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900和1000毫克的活性成分，以用于对待治疗患者的剂量进行对症调整。所述化合物可以以每天1至4次的方案给药，优选每天一次或两次。这种剂量方案可以调整，以提供最佳的治疗反应。
[0146]
然而，可以理解的是，任何特定患者的特定剂量水平会取决于各种因素。这些因素包括患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食。其他因素包括给药时间和途径、排泄率、药物组合以及正在接受治疗的特定疾病的类型和严重程度。
[0147]
所公开的药物组合物可进一步包含其它治疗活性化合物，其通常应用于上述病理状况的治疗。
[0148]
应当理解，所公开的组合物可以由所公开的化合物制备。还应理解，所公开的组合物可用于所公开的使用方法中。
[0149]
本文还公开了包含一种或多种所公开的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0150]
因此，本发明的药物组合物包括含有除了本发明的化合物之外的一种或多种其他活性成分的药物组合物。
[0151]
上述组合不仅包括所公开的化合物与一种其他活性化合物的组合，还包括所公开的化合物与两种或多种其他活性化合物的组合。同样，所公开的化合物可与用于预防、治疗、控制、改善所公开的化合物对其有用的疾病或病症、或者降低其风险的其他药物组合使用。这些其他药物可以通过其通常使用的途径和量与本发明的化合物同时或顺序给药。当本发明的化合物与一种或多种其它药物同时使用时，优选除本发明的化合物之外还含有此类其它药物的药物组合物。因此，本发明的药物组合物包括含有除了本发明的化合物之外
的一种或多种其他活性成分的药物组合物。
[0152]
本发明化合物与第二活性成分的重量比可以改变，并会取决于每种成分的有效剂量。通常，会使用各自的有效剂量。因此，例如，当本发明的化合物与另一种药剂组合时，本发明的化合物与另一种药剂的重量比通常为约1000:1至约1:1000，优选约200:1至约1:200。本发明的化合物和其他活性成分的组合通常也会在上述范围内，但在每种情况下，应使用每种活性成分的有效剂量。
[0153]
在这样的组合中，本发明的化合物和其它活性剂可以单独或联合给药。此外，一种成分的给药可以在给药其他药剂之前、同时或之后进行。
[0154]
因此，本发明的化合物可以单独使用或与已知在本发明的适应症中有益的其他药剂或影响受体或酶的其他药物组合使用，所述受体或酶增加所公开的化合物的有效性、安全性、方便性或减少其有害的副作用或毒性。本发明的化合物和其他药剂可以同步治疗的形式或以固定组合的形式共同给药。
[0155]
在一个方面，所述化合物可与抗高血压剂、抗炎剂和/或抗氧化应激剂组合使用。因此，所公开的化合物可用于治疗、预防、控制、改善上述疾病、障碍和病症或降低其风险。当所公开的化合物与一种或多种其他药物同时使用时，含有此类药物和所公开的化合物的单位剂型形式的药物组合物是优选的。然而，联合治疗也可以在重叠的时间表上施用。还预期一种或多种活性成分和所公开的化合物的组合会比作为单一药剂的任一种更有效。
[0156]
在一个方面，本发明涉及在哺乳动物中的治疗方法，其包括给予所述哺乳动物至少一种本发明的化合物的步骤，所述化合物的剂量和量有效治疗所述哺乳动物的适应症。在某些实施方案中，所述化合物具有由下式的化合物表示的结构：
[0157][0158]
其中：
[0159]
x是键、烷基、烷氧基、甲氧基、-o-或-ch
2-；
[0160]
每个r是独立的并且选自c
1-c
12
取代或未取代的烷基；及
[0161]
a是a是
[0162]
每个r1是独立的并且选自c
1-c
12
取代或未取代的烷基；和任选的反离子；
[0163]
及其立体异构体和药用盐。
[0164]
在某些方面，个体，例如哺乳动物或人，在给药步骤之前已被诊断出具有该适应症。在进一步的方面中，所公开的方法可以进一步包括鉴定需要治疗本文所述的适应症、疾病、障碍和病症的个体(例如哺乳动物或人)的步骤。在进一步的方面，个体，例如哺乳动物或人，在给药步骤之前已经被诊断为需要治疗。
[0165]
所公开的化合物可作为单一药剂或与一种或多种其他药物组合用于治疗、预防、控制、改善本发明化合物或其他药物对其有用的上述适应症、疾病、障碍和病症或降低其风险，其中药物组合在一起比单独的任一种药物更安全或更有效。所述其他药物可以通过其通常使用的途径和量与所公开的化合物同时或顺序给药。当所公开的化合物与一种或多种其他药物同时使用时，含有此类药物和所述化合物的单位剂型形式的药物组合物是优选的。然而，联合治疗也可以在重叠的时间表上施用。还预期一种或多种活性成分和所公开的化合物的组合可以比作为单一药剂的任一种更有效。
[0166]
本发明的化合物可以与药学上可接受的载体一起给药。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在使用前重建成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或载剂包括水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纤维素和它们合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如，可通过以下方式来维持合适的流动性：使用包衣材料例如卵磷脂，对于分散剂通过维持所需的粒径，以及使用表面活性剂。这些组合物也可以包含辅剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物的作用的预防可通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。也可能需要包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。通过形成药物在生物可降解聚合物(例如聚乳酸-乙醇酸、聚(原酸酯)和聚酸酐)中的微胶囊基质，制成可注射的“储库”形式。取决于药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。通过将药物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中也制得贮库型可注射制剂。例如通过用留住细菌的滤器进行过滤，或在临使用之前通过掺入可以溶于或分散于无菌水或其他的无菌可注射介质的无菌固体组合物形式的灭菌剂，将可注射的制剂灭菌。合适的惰性载体可包括糖，例如乳糖。以重量计，期望的是，至少95重量％的活性成份的颗粒具有0.01至10μm的有效粒径。
[0167]
如本文所使用，术语“取代的”旨在包括有机化合物所有可允许的取代基。在一个概括的方面，可运许的取代基包括有机化合物的非环状的和环状的、支链的或无支链的、碳环的和杂环的、芳香性的和非芳香性的取代基。示例性的取代基包括例如下面所述的那些取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可为一个或多个并其可相同或不同。为了本发明目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的、符合杂原子化合价的、有机化合物的任何可允许的取代基。不欲以任何方式通过有机化合物的可允许的取代基限制本发明。而且，术语“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即此类取代符合被取代的原子及取代基的允许的化合价，并且该取代形成稳定的化合物，例如不会通过诸如重排、环化、消去等自发进行转变的化合物。
[0168]
当然，本发明的一个方面涉及本发明的化合物在治疗本文所讨论的适应症、疾病、障碍和病症中的用途。
[0169]
炎症
[0170]
炎症与许多疾病相关，这些疾病是西方社会发病率和死亡率的主要原因，包括心血管疾病、急性肾损伤、肺和心力衰竭。尽管使用多种药物，慢性和急性炎症仍然是主要的健康负担。近年来，已经清楚的是，氧化应激在许多与炎症相关的疾病(例如心血管疾病和败血症)的病理生理中起着重要作用。使用临床验证的标志物f2-异前列腺素，在高血压、动脉粥样硬化和败血症中已经显示增加的脂质过氧化。通过异前列腺素途径的脂质过氧化产生一系列高反应性γ-酮醛，即isolevuglandin(isolg)，其与伯胺迅速反应并导致细胞功能障碍。isolg通过与蛋白质的赖氨酸残基反应，共价修饰和交联蛋白质，并且这种修饰可以直接抑制酶的功能，诱导炎症和引起细胞毒作用。isolg与高血压中的促炎性树突状细胞和t细胞活化相关。用isolg急性处理分离的线粒体破坏了线粒体呼吸，并促进线粒体通透性转换孔(mptp)开放，然而，线粒体isolg在病理状况中的作用尚未被研究。
[0171]
败血症导致严重的多器官衰竭，如急性肾损伤，其与氧化应激增加和线粒体功能障碍相关。在败血症实验模型中，isolg加合物的水平升高。炎症与线粒体功能障碍相关；但其病理生理作用和分子机制尚不清楚。线粒体是可能产生isolg的自由基的主要来源之一。鉴于isolg具有潜在的高度伤害性，本发明人表明炎症诱导的isolg在线粒体功能障碍中发挥重要作用。
[0172]
虽然氧化应激在多种病理状况中都很常见，但目前还没有抗氧化治疗，并且常见的例如抗坏血酸和维生素e的抗氧化剂在临床研究中无效。这些药物不太可能到达自由基产生的重要部位，如线粒体。此外，抗氧化剂可能干扰氧化还原信号转导，由于产生细胞因子和抑制nrf2信号转导而增加炎症和组织损伤。
[0173]
衰老和炎症中的氧化应激导致对多不饱和脂肪酸(pufa)的过氧化物损伤增加。异前列腺素型脂质过氧化的原因尚不清楚。已经提出pufa的自氧化可以由过氧化羟基自由基(ho2·
)引发，过氧化羟基自由基是在线粒体中产生的质子化形式的超氧自由基。组织的缺氧和酸化增加ho2·
的产生。本发明人表明氧化损伤的线粒体磷脂和isolg加合物的蓄积是线粒体ho2·
氧化pufa的结果。异前列腺素脂质过氧化的ho2·
假说与以下已知的事实相一致：经典抗氧化剂在预防这种类型的氧化应激和衰老方面无效。异前列腺素脂质过氧化产生各种形式异前列腺素和isolevuglandin的外消旋混合物。一些异前列腺素可以直接引起炎症反应，而反应性isolg产生细胞毒性和免疫原性的isolg-内酰胺加合物。
[0174]
isolg是氧化应激的常见下游产物之一，并且用2-羟基苄胺(其不是抗氧化剂)清除isolg减轻了内皮功能障碍，减轻纤维化并减轻高血压。特别靶向线粒体的治疗代表了减少靶器官损伤的有希望的策略。本发明人表明，isolg清除剂2-羟基苄胺通过其与亲脂性阳离子三苯基鏻缀合而靶向线粒体会减少线粒体功能障碍并降低与败血症相关的死亡率。本发明探究了(a)响应于合成的isolg及其加合物的线粒体功能障碍，(b)开发了新的靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba，和(c)测试了mito2hoba是否在脂多糖(lps)败血症模型中防止线粒体功能障碍和死亡。
[0175]
材料和方法
[0176]
试剂
[0177]
lps从sigma(圣路易斯，密苏里州)获得。根据先前所述制备了2-羟基苄胺(2hoba)及其非清除剂类似物4-羟基苄胺(4hoba)。用amarnath等人的方法合成了15-e
2-isolg。并保存在-80℃的dmso储备液中。所有其他试剂来自sigma(圣路易斯，密苏里州)。
[0178]
动物实验
[0179]
所有实验程序都得到了vanderbilt和mercer institutional animal care and use committees的批准。lps的使用是啮齿动物细菌败血症的公认模型(1-3)。可用于诱导小鼠败血症的lps浓度取决于许多因素(lps的来源、年龄/大小、和动物品系、所需反应时间、感兴趣的目标等)，并可能在不同的制造商之间有所不同。为了测试mito2hoba的保护特性，本发明人使用来自大肠杆菌o111:b4(sigma l8274)的lps。初步研究中测试的该批次的lps在注射后24小时的ld
50
为25μg/g。在整个研究中使用了相同批次的lps。
[0180]
将40只3月龄c57bl/6j小鼠平等分为四组：假手术组(对照)、注射lps的小鼠(lps)、饮水中补充mito2hoba(0.1g/升)的小鼠(mito2hoba)和用在饮水中的mito2hoba预处理的注射lps的小鼠(lps mito2hoba)。败血症诱导的动物死亡率用来评价mito2hoba的保护作用。连续三天，每天几次定期评估死亡率。在另外的实验中，lps注射24小时后处死小鼠，以分析线粒体复合物i和复合物ii的活性。
[0181]
线粒体研究
[0182]
线粒体分离、呼吸分析和呼吸链酶学的所有方法已经在前面描述过。如上所述，在lps注射24小时后，评估线粒体复合物i和复合物ii的活性。线粒体分离自12-14周龄雄性c57bl6/6j小鼠肾脏。对于呼吸研究，电子进入复合物i(谷氨酸 苹果酸作为底物)或复合物ii(琥珀酸作为底物)。某些器官如脑中的线粒体通过转胺将高达50％的丙酮酸和谷氨酸氧化为α-酮戊二酸，并进一步转化为琥珀酸。由于对肾线粒体的研究比来自其他器官的线粒体少得多，本发明人使用复合物ii的特异性抑制剂丙二酸盐(5mm)来评估谷氨酸氧化的替代途径。复合物ii介导的呼吸被定义为丙二酸抑制的氧消耗，而复合物i特异性呼吸被定义为丙二酸抗性氧消耗。
[0183]
呼吸速率用荧光寿命微氧监测系统(fluorescence lifetime micro oxygen monitoring system,instech laboratories,inc.)测量。对每种底物进行两次氧消耗速率测量，并且每次运行包括添加0.24mg/ml蛋白质、adp(125μm)以刺激iii态和随后的iv态呼吸。用具有温度控制比色皿座的varian cary 300bio uv/vis分光光度计测定亚线粒体颗粒(smp)中oxphos特异酶活性。简单地说，smp是通过分离细胞器的超声处理制备的。通过15μg线粒体蛋白与40μm nadh，在272nm监测在一式三份的样品中复合物i的活性，表示为对10μm癸基泛醌(decylubiquinone)的还原。用该方法，总复合物i活性的90-100％对鱼藤酮的抑制敏感。通过在2mm kcn、2μg/ml鱼藤酮和抗霉素a存在下，在65μm泛醌氧化作为人工电子受体的50μm dcpip的过程中监测600nm处的吸光度来测定复合物ii的活性。
[0184]
复合物i和复合物ii介导的肾线粒体呼吸的分析
[0185]
为了确定败血症lps模型中线粒体呼吸的特异性变化并测试mito2hoba的潜在保护作用，本发明人采用海马方案(seahorse protocol)，在线粒体底物谷氨酸 苹果酸(gm)或琥珀酸存在下进行线粒体研究。为了确定复合物i介导的呼吸的具体作用，本发明人在复合物ii抑制剂丙二酸盐(5mm)存在下进行了测定。本发明人测定了在线粒体加底物存在下的基础呼吸，添加adp(2mm)后的耦合呼吸，添加寡霉素a(2.5μm)后的质子漏，补充cccp(1μ
m)后的非耦合呼吸，以及抗霉素a和鱼藤酮混合物(1μm)的非线粒体呼吸。线粒体研究在两个实验室使用oroboros o2k高分辨率呼吸测量仪和荧光寿命微氧监测系统(instech laboratories,inc)独立验证。从对照组假手术小鼠、lps注射的小鼠(25μg/g，注射后16h)、补充mito2hoba的小鼠(0.1g/升饮用水，4天)、或mito2hoba加lps(3天0.1g/升mito2hoba加lps注射)中分离肾线粒体。一个肾用于线粒体研究，并且第二个肾用于组织病理学研究。
[0186]
肾脏组织学分析
[0187]
取小鼠肾脏，并立即置于10％福尔马林中。固定后用生理盐水冲洗肾脏，置于70％乙醇中，并按以下顺序处理：70％乙醇；80％乙醇；95％乙醇；100％乙醇；100％二甲苯。然后将肾脏包埋在poly/fin石蜡(thermofisher)中。用leitz 1512切片机切成5μm切片，并安装在载玻片上。切片用苏木精和伊红染色并用olympus ix70显微镜观察。图像由jenoptix progress c12数码相机拍摄。肾脏组织病理学评分如下：(0)无肾小管损伤；(1)小管损伤《10％；(2)肾小管损伤10-25％；(3)肾小管损伤25-50％；(4)肾小管损伤50-75％；(5)肾小管损伤》75％。
[0188]
靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba的合成(见图7)
[0189]
将碳酸铯(4.9g，15mmol)加入在乙腈(50ml)中的2,4-二羟基苯甲醛(4.2g，30mmol)和1,4-二溴丁烷(6.6g，30mmol)中。将混合物在氩气下于80℃加热5h，冷却并在搅拌下加入至ph值为7的1m磷酸盐缓冲液(30ml)，冰和kh2po4(2g)。过滤除去固体，滤液用乙酸乙酯萃取。经柱(二氧化硅，9:1己烷-乙酸乙酯)纯化，得到4-(4-溴丁氧基)-2-羟基苯甲醛(4.1g，50％)。将其与三苯基膦(4.2g)在甲苯(75ml)中混合，并在氩气下回流15h。粉红色固体经快速色谱法纯化(0-10％甲醇，在二氯甲烷中)，得到4-(4-甲酰基-3-羟基苯氧基)丁基)三苯基溴化鏻(4.8g，60％)。通过在nh2oh.hcl(0.63g)和ch3co2na(0.74g)的存在下在乙醇(40ml)中搅拌1小时，将醛转化为肟。粗产物(5.6g)溶于乙酸(60ml)。加入锌粉(6g)，并将悬浮液在水浴(60℃)中加热1h。混合物冷却，通过硅藻土过滤。滤液蒸发并用甲苯(3
×
10ml)和乙醇(15ml)共蒸发。残留物在热2-丙醇(200ml)中加热，过滤并冷却，得到纯的mito2hoba；3.0g；ms m/z 456(m

)。
[0190]
统计学
[0191]
数据采用student-neuman-keuls事后检验及方差分析(anova)进行分析。p值《0.05被认为是显著的。
[0192]
结果
[0193]
isolevuglandin损害线粒体呼吸
[0194]
复合物i是线粒体氧化磷酸化的关键成分。复合物i的失活可导致atp产生减少和组织损伤。向细胞中加入isolg产生蛋白质加合物和isolg-磷脂酰乙醇胺加合物(isolg-pe)，这两种加合物可以独立地导致线粒体功能障碍。本发明人测试了isolg或isolg-pe是否可能导致线粒体功能障碍。用15-e
2-isolg-pe(20μm)处理分离线粒体5分钟抑制41％的3态呼吸，而在复合物i底物谷氨酸 苹果酸存在的情况下，类似剂量的15-e
2-isolg降低74％的3态呼吸(图1a)。这些数据支持了isolg-pe和isolg-蛋白加合物在线粒体功能障碍中的潜在作用。为了进一步确定线粒体中isolg的潜在靶点，本发明人研究了isolg和isolg-pe对复合物i和复合物ii介导的呼吸的影响。急性加入低剂量15-e
2-isolg(0.5μm)显著减弱复合物i介导的呼吸，但复合物ii的呼吸受影响较小(图1b、c)。用低剂量15-e
2-isolg-pe处
理完整线粒体部分降低复合物i呼吸，但不影响复合物ii呼吸。这些数据直接说明了isolg和isolg-pe二者对线粒体呼吸的损害。
[0195]
isolg和isolg加合物抑制复合物i活性
[0196]
本发明人假设isolg可以直接影响复合物i和复合物ii的活性。为了验证这一假设，本发明人研究了在用isolg剂量处理的线粒体裂解物中复合物i和复合物ii的活性。发现isolg导致复合物i发生74％的大量失活，而复合物ii的活性仅抑制了21％(图2a)。这些数据表明，复合物i呼吸对isolg特别敏感。
[0197]
如上所示，isolg和isolg-pe二者都减弱复合物i介导的呼吸作用，因此，复合物i可能直接受到isolg的影响，或者被低分子的isolg加合物所抑制。本发明人通过isolg加合物与isolg剂量比较测试了复合物i的抑制作用。补充isolg修饰的乙醇胺(isolg-etn)、isolg修饰的l-赖氨酸(isolg-lys)或isolg修饰的-pe(isolg-pe)抑制复合物i活性超过80％，类似于isolg剂量的效果(图2b)。有趣的是，isolg修饰的精胺(isolg-精胺)对复合物i没有影响，提示天然多胺可能保护复合物i免受isolg介导的抑制。这些数据表明，复合物i被低分子的isolg加合物如isolg-lys和isolg-pe直接抑制；因此，这些加合物可能介导了isolg直接加合引起的复合物i的损伤。这些数据直接证实了isolg介导的复合物i抑制导致线粒体功能障碍。
[0198]
靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba
[0199]
为了检验线粒体中isolg的特定清除改善线粒体功能的假说，本发明人通过将亲脂性阳离子三苯基鏻与2-羟基苄胺缀合，开发了靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba (图3)。活细胞内线粒体的膜电位为负值(-150mv)。由于这种膜电位比细胞内的其他细胞器高得多，亲脂性阳离子如三苯基鏻选择性地在线粒体内蓄积。因此，与三苯基鏻缀合的分子靶向线粒体。例如，mitotempo在线粒体基质中的浓缩了超过500倍。
[0200]
mito2hoba是一种水溶性化合物，其可以在培养基中提供，并在饮用水中提供给动物。在动物实验中，mito2hoba在0.1-0.3g/l的剂量下耐受性良好。对分离自接受在饮用水中的mito2hoba(0.1g/l)5天的小鼠的肾脏和心脏线粒体的质谱分析证实，mito2hoba主要以μm水平在线粒体级分中蓄积(80％)。同样，将分离的线粒体与mito2hoba(0.1μm)一起孵育导致线粒体颗粒中400至600倍的mito2hoba的强烈蓄积(图3)。
[0201]
为了证实mito2hoba的isolg清除性能，本发明人研究了其与isolg类似物4-氧代戊醛(4-oxopentanal)的反应，如本发明人先前所述。mito2hoba与4-氧代戊醛具有很高的反应性，反应速率常数约为2hoba本身的50％(补充图1s)。反应速率略有降低可能是由于大的三苯基鏻基团的空间位阻所致。在生理条件下，isolg的总清除率取决于速率常数和清除剂的局部浓度(v＝k*[mito2hoba]*[isolg])。值得注意的是，2hoba类似物不清除氧化剂，如o2·
和过氧亚硝酸盐。本发明人研究表明，在低亚微摩尔水平上补充mito2hoba会导致低细胞质水平但显著的线粒体蓄积(图3)，正如本发明人先前对靶向线粒体的mitotempo所描述的那样。这会导致细胞质中mito2hoba水平低，但线粒体蓄积高，从而导致线粒体中isolg的特异性清除(图3)。
[0202]
在lps和mito2hoba处理小鼠中复合物i和复合物ii介导的肾脏呼吸
[0203]
肾脏对能量具有很高的需求，并且肾线粒体可能通过转胺化将谷氨酸氧化为α-酮戊二酸，并进一步转化为琥珀酸。本发明人分析了在谷氨酸 苹果酸(gm)、琥珀酸存在下的
线粒体呼吸，并使用复合物ii抑制剂丙二酸盐来测量复合物i介导的特异性呼吸。丙二酸盐抑制了58％的谷氨酸驱动的呼吸(图4a)，这支持了肾线粒体的代谢可塑性。有趣的是，lps注射减少了gm介导的呼吸和琥珀酸介导的呼吸，并在gm 丙二酸盐存在下大量减少了复合物i特异性氧消耗(图4b)。lps显著增加两种底物的线粒体蛋白漏，表明线粒体呼吸的解耦合。在gm 丙二酸盐存在下，单独的mito2hoba轻微降低了琥珀酸驱动的呼吸，并改善了复合物i特异性氧消耗(图4c)。此外，在gm 丙二酸盐存在下，mito2hoba补充显著防止lps诱导的对gm介导的呼吸和复合物i特异性氧消耗的损伤，但不影响琥珀酸介导的呼吸或线粒体蛋白漏(图4d)。
[0204]
mito2hoba在lps败血症模型中减少线粒体功能障碍并降低死亡率
[0205]
为了测试isolg介导的线粒体功能障碍的作用，本发明人向小鼠补充了新的靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba(0.1g/l)。lps处理(25μg/g体重)导致严重死亡率，但靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba处理将注射后96小时的动物存活率提高3倍(图5a)。另外的研究表明，与载剂处理的小鼠相比，在从lps处理的小鼠肾脏分离的线粒体中，复合物i/复合物ii活性比值显著降低(图5b)。即使在lps处理后，补充mito2hoba的小鼠也完全保持复合物i/ii活性比值。这些数据支持线粒体isolg在与败血症相关的线粒体功能障碍和死亡中的作用。
[0206]
mito2hoba防止lps诱导的肾损伤
[0207]
进行肾脏的组织学分析，以提供mito2hoba保护的直观证据(图6)。对照组肾的皮质和髓质显得正常，无损伤迹象。相比之下，用lps处理的小鼠肾脏显示出明显的细胞损伤。lps注射的小鼠肾脏皮质和髓质中鉴定出许多区域的空泡化和细胞变性(箭头)。在髓质中，许多近端小管染色呈嗜碱性(三角)，提示细胞内代谢过程的改变。与对照小鼠相似，补充mito2hoba的小鼠肾脏显得正常。少量小区域的细胞变性稀疏地散布在髓质中(未拍照)。用lps和mito2hoba处理小鼠时，皮质显得正常，而肾髓质细胞损伤明显。髓质内可见小区域的细胞变性和嗜碱性染色，但损伤的范围和程度均小于单独用lps处理的小鼠肾脏。如图5c所定量显示的，mito2hoba显示对lps诱导的细胞损伤具有保护作用。
[0208]
讨论
[0209]
本发明人表明，isolg或其稳定的加合物isolg-pe损害线粒体呼吸，特别是在苹果酸和谷氨酸存在下复合物i介导的呼吸(图1)。在线粒体裂解物中的实验表明，isolg和isolg加合物特异性地抑制复合物i活性(图2)。此外，本发明人研究表明，靶向线粒体的形式的已知的isolg清除剂2hoba(图3)在lps诱导的败血症模型中对肾损伤和动物死亡具有明显的保护作用(图5、6)。
[0210]
氧化磷酸化受损是败血症器官损害的重要原因。最近发现败血症中线粒体功能障碍与复合物i损伤相关，并提出了靶向保护复合物i作为败血症的治疗方法。先前已经表明败血症增加isolg的产生，并且isolg可诱导线粒体通透性转变。本发明人表明，isolg也可能介导败血症中发现的线粒体功能障碍。实际上，数据表明复合物i活性对isolg和isolg加合物特别敏感，提示败血症诱导的isolg可能抑制复合物i活性，从而促进线粒体功能障碍。因此，这一途径对败血症所致的多器官功能衰竭可能具有重要意义。
[0211]
众所周知，对于nadh和nad依赖性底物，呼吸速率受到复合物i的fad依赖性nadh脱氢酶的限制。因此，呼吸链的所有下游位点仍然被氧化，并且产生很少的活性氧。需要快速
产生atp的器官利用通过丙酮酸或谷氨酸转胺化产生的琥珀酸的氧化，以加快线粒体呼吸和atp产生的速度。本发明人先前已经表明脑线粒体利用这一途径，现在本发明人首次表明肾线粒体也通过将线粒体代谢物通量转移到琥珀酸以供给复合物ii介导的呼吸来适应高能量需求。复合物ii是一种简单得多的蛋白质，并且与复合物i相比，它有更高的丰度。有趣的是，在lps模型中，它似乎对炎症的损伤作用较不敏感(图4、5)。同时，需要注意的是，复合物ii的更高呼吸速率也具有很大的缺陷，因为它通过反向电子传递驱动线粒体活性氧的过量产生。琥珀酸介导的氧化剂产生导致脑和心脏损伤，并且琥珀酸驱动的反向电子传递被认为是一个新的治疗靶点。数据表明，lps引起从复合物i呼吸向复合物ii呼吸的转换，但这种适应不良可促进肾损害和炎症，类似于先前报道的琥珀酸驱动的心脏损伤。特异性底物利用分析显示，在lps诱导的败血症中，肾线粒体中复合物i、ii和iv以及脂肪酸介导的呼吸明显减少。数据表明，mito2hoba保护线粒体并减少细胞损伤；然而，线粒体isolg的具体靶点仍不明确。isolg可降低多种线粒体复合物的功能并降低线粒体对脂肪酸的代谢。需要进一步的研究以阐明线粒体isolg的特定病理生理作用。败血症引起肾脏炎症、肾小管细胞损伤、细胞凋亡和线粒体肿胀，用靶向线粒体的脂质氧化抑制剂ss-31处理可以减轻败血症引起的器官功能障碍。这些数据支持mito2hoba对败血症病理改变的保护作用。
[0212]
最近发现在败血症中线粒体功能障碍与复合物i损伤相关，并提出了在败血症中靶向复合物i。在这项工作中，本发明人证明了isolg和isolg加合物在抑制复合物i中的潜在作用以及mito2hoba对复合物i功能的治疗作用。本发明人表明，靶向线粒体isolg改善了线粒体呼吸，并在与炎症损伤相关的病症中从线粒体功能障碍中拯救出来。
[0213]
为了表明isolg在炎症诱导的线粒体功能障碍中的作用，本发明人开发了靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba。mito2hoba在其亲脂性三苯基鏻部分的驱动下，在例如肾、心、肝的多个器官的线粒体中大量蓄积。小鼠对在饮用水中0.1g/l的mito2hoba耐受性良好。mito2hoba在败血症lps模型中显示明显的保护作用。实际上，mito2hoba的补充将动物的即刻和长期死亡率降低了3倍，并且mito2hoba完全保持了lps处理小鼠的复合物i/ii活性比率。mito2hoba处理也消除了对肾皮质小管的损伤，并显著减少了髓质小管的细胞变性和损伤。mito2hoba的快速效果可能会改善临床环境中的结果，因为它可以给医务人员额外的时间来为败血症患者执行额外的挽救生命的程序。总之，这些数据支持线粒体isolg在线粒体功能障碍中的作用和靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba的治疗潜力。
[0214]
本发明人还表明，靶向线粒体isolg可能比简单地靶向线粒体ros产生更有效。kozlov及其同事们提出线粒体ros加速炎症反应并促进终末器官损伤，因此靶向线粒体ros会是一种有效的治疗炎症的方法。实际上，用靶向线粒体的抗氧化剂mitotempo和skq1治疗lps处理的大鼠，降低了诱导型一氧化氮合酶的表达，并降低了器官损害的标志物。然而，这些靶向线粒体的抗氧化剂也在更早的时间点增加了器官损伤的标志物，这表明抗氧化剂可能干扰激活保护性反应所需的细胞信号传导。此外，最近对盲肠结扎和穿刺败血症模型的研究也表明线粒体抗氧化剂缺乏生存益处。这些先前研究中观察到的明显矛盾的效果是否可以归因于特定的败血症模型、使用的动物物种或败血症损伤的程度尚不清楚。nadph氧化酶是ros的主要非线粒体来源，p47phox缺陷小鼠的nadph氧化酶的基因切除加剧了lps诱导的nf-κb激活，增加了肺内促炎细胞因子的表达，增加了中性粒细胞性肺泡炎，并与野生型小鼠相比维持更大的肺损伤。值得注意的是，2hoba衍生物不清除ros，如o2·
和过氧亚硝酸
盐，因此，mito2hoba不会像先前描述的许多抗氧化剂那样干扰细胞氧化还原信号传导。这些数据提示了ros在败血症中的潜在不同作用，以及靶向特定细胞和亚细胞区室如线粒体的重要性。
[0215]
本发明人使用新的靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba测试了isolg在与败血症相关的线粒体功能障碍和死亡中的潜在作用(见图表摘要和图5路线)。本发明人还表明，isolg可以通过多种酶和非酶途径产生，并且清除线粒体isolg可以特异性地减轻与炎症相关的线粒体功能障碍和细胞损伤。有趣的是，靶向线粒体的抗氧化剂mitoq和mitoe在lps诱导的败血症大鼠模型中减轻了线粒体脂质过氧化，降低白细胞介素-6，改善线粒体功能并降低器官功能障碍标志物，这与在异前列腺素途径中通过脂质过氧化产生的isolg的病理生理作用是一致的。因此，本发明表明了特异性靶向线粒体isolg的潜在治疗益处。
[0216]
高血压
[0217]
为了测试线粒体isolg在高血压中的作用，本发明人使用质谱和western印迹分析在正常血压和高血压人类个体以及血管紧张素ii高血压小鼠模型中研究了线粒体isolg-蛋白加合物的蓄积。用新的靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba测试其靶向线粒体isolg的治疗潜力。结果表明，在高血压中，血管和肾组织中存在线粒体isolg蛋白加合物的大量蓄积。此外，mito2hoba处理来自高血压患者的小动脉增加了sod2脱乙酰化，并降低了人主动脉内皮细胞中线粒体超氧化物。在小鼠中，mito2hoba防止线粒体isolg-蛋白加合物的蓄积，减少sod2和cypd的乙酰化，保护线粒体呼吸，保持atp产生，阻断线粒体通透性孔开放，减少血管超氧化物，保护内皮一氧化氮，改善内皮依赖性舒张，并减轻高血压。这些数据表明，线粒体isolg促进线粒体和内皮功能障碍，清除线粒体isolg可能在治疗血管功能障碍和高血压方面具有治疗潜力。
[0218]
材料和方法
[0219]
试剂
[0220]
二氢乙锭(dhe)和mitosox超氧化物探针由invitrogen(格兰德岛，纽约)提供。sirt3(54905)抗体购自cell signaling。乙酰基-k68-sod2(ab137037)、复合物i ndufs175kda亚基(ab22094)和cypd(ab110324)以及gapdh(ab8245)抗体均购自abcam。sod2(sc30080)抗体购自santa cruz biotechnology。乙酰赖氨酸抗体(ab3839)由millipore-sigma提供。d11是一种isolg-赖氨酰加合物特异性scfv抗体，此前已被表征。所有抗体均以1000倍稀释使用。如先前所述，合成了2-羟基苄胺(2hoba)、靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba和对isolg无活性的类似物4-羟基苄胺(4hoba)。所有其他试剂均购自sigma(圣路易斯，密苏里州)。
[0221]
动物实验
[0222]
如先前所述，用血管紧张素ⅱ(0.7mg/kg/min)诱导高血压。为研究清除线粒体isolg的治疗潜力，野生型c57bl/6j雄性和雌性小鼠(jackson labs)给予生理盐水或放置血管紧张素ii微型泵，并提供净水(载剂)或在饮用水中的mito2hoba(0.1g/升)。血压是通过遥测和尾套管测量来监测的，如前所述。vanderbilt institutional animal care and use committee批准了该程序(protocol m1700207)。采用简单随机化用于选择假手术、血管紧张素ii或mito2hoba组的动物，以得到分配到治疗组的相等机会。
[0223]
肾线粒体分离
[0224]
c57bl/6j小鼠通过二氧化碳处死并取肾脏，清除脂肪组织，置于冰浆冷分离培养基中。在寒冷的室内，将肾脏切碎，用分离培养基洗涤，并用polytron粉碎机以两个各自为2秒的脉冲匀浆。将匀浆稀释7倍(w/v)并通过差速离心分离线粒体，以percoll梯度纯化。分离培养基包含75mm甘露醇、175mm蔗糖、20mm mops(ph 7.2)、1mm egta。用bradford法测定线粒体蛋白浓度。
[0225]
通过质谱法测定线粒体isolg
[0226]
用质谱法测定了从假手术组或输注血管紧张素ii的小鼠肾分离的线粒体中isolg-赖氨酰-内酰胺加合物。线粒体蛋白质经过完全酶解消化成单个氨基酸。加入[
13
c6]内标，通过固相萃取和hplc分离纯化isolg-赖氨酰加合物，然后使用同位素稀释，通过液相色谱-串联质谱(lc/esi/ms/ms)测定法定量，如先前所述。
[0227]
心磷脂氧化测定
[0228]
通过液相色谱-质谱联用(lc/ms)测定人主动脉内皮细胞的心磷脂氧化，如先前所述。
44
提取的脂质组分通过uplc使用waters acquity uplc系统(waters corp.,milford,ma)在线分离。质谱分析在thermo quantum ultra三重四极杆质谱仪(thermo scientific inc.,san jose,ca,usa)上进行。
[0229]
线粒体呼吸测定
[0230]
如先前所述，使用荧光寿命微氧监测系统(instech laboratories,inc.)测量肾线粒体呼吸。使用以下呼吸培养基(mm)：125mm kcl、10mm mops(ph 7.2)、2mm mgcl2、2mm kh2po4、10mm nacl、1mm egta、0.7mm cacl2、10mm谷氨酸和2mm苹果酸。随后向呼吸室内加入肾线粒体(0.2mg/ml)、adp(125μm)和cccp(0.2μm)。呼吸控制率计算为3态与4态的比率，其中4态为adp磷酸化后的比率。
[0231]
肾组织中atp水平
[0232]
通过发光atp检测试剂盒(abcam；cat#ab113849)测定肾组织atp浓度。使用biotek synergy h1酶标仪读取发光信号。根据atp校正曲线和通过bradford法测得的蛋白质浓度计算出发光单位，为μmol/mg蛋白质。
[0233]
钙保留容量的估算
[0234]
钙保留容量(crc)是在通透性转换孔打开以前能够装载到线粒体中的钙的量。crc表示为每毫克肾线粒体蛋白的纳摩尔ca
2
。我们使用了以前描述的ph法。该方法是基于在1mm pi存在下，h

/ca
2
比值相对稳定，ph变化清楚地显示了所添加的ca
2
被消耗的时刻。在含有210mm蔗糖、20mm kcl、3mm甘氨酰-甘氨酸(ph 7.2)、1mm kh2po4和0.5mg/m线粒体、终体积为2.0ml的培养基中估算线粒体crc值。底物为10mm谷氨酸和2mm苹果酸。通过向线粒体中加入5μl等分的10mm cacl2进行cacl2滴定。
[0235]
细胞培养
[0236]
人主动脉内皮细胞(haec)购自lonza(芝加哥，il)，在添加2％fbs但不含抗生素的egm-2培养基中培养。研究前一天，将fbs浓度降至1％。
[0237]
使用hplc测定超氧化物
[0238]
在37℃的组织培养箱中，将dhe(50μm)或在khb缓冲液中的靶向线粒体的mitosox(1μm)负载到小鼠主动脉段，孵育30分钟。然后将主动脉段置于甲醇(300μl)中，用玻璃匀浆器匀浆。组织匀浆通过0.22μm注射器过滤器，并且根据以前出版的方案将甲醇滤液用hplc
进行分析。用c-18反相柱(nucleosil色谱柱250至4.5mm)和含0.1％三氟乙酸和乙腈梯度(37％-47％)的流动相，以0.5ml/min的流速检测超氧化物特异性产物2-羟基乙锭(2-hydroxyethidium)。如先前所述，用荧光检测器定量2-羟基乙锭，所用的发射波长为580nm，激发波长为480nm。
[0239]
通过电子自旋共振(esr)测定一氧化氮
[0240]
如我们先前所描述，通过esr和胶体fe(detc)2对主动脉一氧化氮产生进行定量。所有esr样品置于充满液氮的石英杜瓦瓶中(corning,new york,ny)。esr谱是用emx esr光谱仪(bruker biospin corp.，billerica，ma)和超高q微波腔记录的。esr设置如下：场扫描，160高斯；微波频率，9.42ghz；微波功率，10毫瓦；调制幅度，3高斯；扫描时间，150毫秒；时间常数，5.2秒；和接收增益，60db(n＝4次扫描)。
[0241]
血管舒张研究
[0242]
在从c57b/6j小鼠解剖的不含血管周围脂肪的2mm小鼠主动脉环上进行等长张力研究。在含有生理盐溶液的水平金属丝肌动描记器(dmt，aarhus，denmark，型号610m和620m)中进行研究，所述生理盐溶液的组成为130mm nacl、4.7mm kcl、1.2mm mgso4、1.2mm kh2po4、15mm nahco3、5.5mm葡萄糖和1.6mm cacl2。使用labchart pro v7.3.7(ad instruments,australia)记录各血管的等长张力。主动脉环在2小时内通过加热和拉伸血管达到最佳基线张力36mnewtons来进行平衡，然后用3个循环的60mm kcl生理盐水来使其收缩。用1μm苯肾上腺素预收缩后测试内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张。一旦血管达到稳态收缩，给予浓度逐渐增加的乙酰胆碱，并记录对每一浓度药物的反应。
[0243]
人类研究
[0244]
小动脉(直径100-200μm)取自人纵隔脂肪，该纵隔脂肪在心脏手术过程中得自具有原发性高血压(bp》140/90mmhg)的患者和血压正常的个体，这些患者参加了心脏手术过程中氧气风险(rocs)的随机临床试验，如先前关于sod2和sod2乙酰化的western印迹分析所述。所有组织标本均获得完全知情同意。
[0245]
统计学
[0246]
数据以平均值
±
sem表示。为了比较在有或无mito2hoba的条件下对血管紧张素ii输注的反应，采用双因素方差分析(anova)，然后进行bonferroni事后检验。对于两组以上之间的比较，采用单因素方差分析和bonferroni事后检验。对于随时间的遥测血压测量，使用graphpad prism 7进行重复测量的双因素方差分析。p值《0.05被认为是显著的。
[0247]
结果
[0248]
在来自高血压患者的小动脉线中的粒体isolg蓄积和sod2乙酰化
[0249]
线粒体是超氧自由基的主要来源，并且富含多不饱和脂肪酸。花生四烯酸的过氧化反应可以产生高反应性isolg，其可以迅速与赖氨酸残基形成蛋白质加合物。为了检测线粒体isolg蓄积，我们使用抗体d11进行了western印迹，该抗体检测在从人小动脉分离的线粒体中isolg加合的蛋白，与氨基酸序列无关。我们观察到，与正常血压个体相比，从高血压患者分离的线粒体中，线粒体isolg-赖氨酰-内酰胺蛋白加合物增加250％(图8a)。
[0250]
高血压与线粒体脱乙酰酶sirt3失活以及线粒体超氧化物歧化酶(sod2)高度乙酰化相关。为了研究线粒体isolg在sirt3失活中的潜在作用，我们开发了靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba (图8b)。mito2hoba由于其亲脂性阳离子三苯基鏻而选择性地蓄积在线
粒体中。我们测试了用低剂量的mito2hoba处理在细胞器培养物中的人小动脉是否刺激sod2脱乙酰。实际上，补充mito2hoba(0.5μm，24小时，dmem)显著降低了sod2乙酰化(图8c、d)。由于sod2被sirt3脱乙酰化，这些数据提示线粒体isolg抑制sirt3的功能。此外，由于sod2乙酰化使sod2失活并有助于线粒体氧化应激，清除线粒体isolg可能降低线粒体氧化应激。
[0251]
靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba降低内皮细胞中的氧化应激
[0252]
本发明人先前表明血管紧张素ⅱ(angⅱ)和tnfα促进高血压，并降低内皮sirt3活性。我们测试了mito2hoba是否降低用血管紧张素ii加tnfα刺激4小时的人主动脉内皮细胞(haec)中的线粒体氧化应激(图9)。实际上，给haec补充mito2hoba(50nm)减少了由tnfα和angⅱ刺激的线粒体超氧化物的产生，如通过特异性超氧化物-mitosox产物2-oh-mito-乙锭的蓄积所测量的。重要的是，给细胞补充相同浓度的非靶向性isolg清除剂2hoba (50nm)并不影响线粒体超氧化物水平。使用对isolg无活性的类似物4hoba(由于羟基位点的重排，4hoba不能清除isolg)进行处理不能防止内皮细胞发生线粒体氧化应激。
[0253]
心磷脂选择性地定位于线粒体内膜的基质侧，并且心磷脂氧化是线粒体氧化应激的特异标志。我们检测了mito2hoba是否降低用血管紧张素ii加tnfα刺激的人主动脉内皮细胞中的心磷脂氧化。实际上，给haec补充低剂量mito2hoba (50nm)抑制心磷脂氧化，而非靶向性isolg清除剂2hoba无效。这些数据支持线粒体isolg在与sod2乙酰化相关的线粒体氧化应激形成中的作用。
[0254]
mito2hoba对线粒体isolg蛋白加合物蓄积及高血压的影响
[0255]
为了测试线粒体isolg在高血压中的功能作用，我们使用angⅱ高血压模型，并通过尾套管(图10a)和遥测(图10b)监测血压。单独使用mito2hoba不影响对照组小鼠的血压。野生型c57bl/6j小鼠输注angⅱ(0.7mg/kg/天)使收缩压增至162mm hg。用含有mito2hoba的饮用水(0.1g/l)处理小鼠显著降低angⅱ介导的高血压至140mm hg，如通过尾套管和遥测所测量的。重要的是要注意，给小鼠补充相同摩尔剂量的非靶向性类似物2hoba不减轻angⅱ介导的高血压(图10a)。
[0256]
为了提供清除线粒体isolg的明确证据，我们在蛋白水解消化从分离的线粒体提取的蛋白质之后，通过液相色谱串联质谱(lc/ms)测定了isolg-赖氨酰-内酰胺加合物的蓄积。高血压与线粒体isolg-赖氨酰-内酰胺加合物增加4倍相关，并且mito2hoba使肾线粒体内的isolg-赖氨酰-内酰胺加合物的形成消失(图10c、d)。
[0257]
mito2hoba对血管紧张素ⅱ输注小鼠线粒体cypd和sod2脱乙酰化的影响
[0258]
在另外的实验中，本发明人发现ang ii诱导的高血压与主动脉中线粒体蛋白的显著高度乙酰化(420％)相关，并且通过用mito2hoba共同处理动物而使其正常化(图11a、b)。由于sirt3是线粒体中主要的(如果不是唯一的)脱乙酰酶，这表明线粒体isolg降低sirt3的活性。sirt3通过特定赖氨酸残基的脱乙酰化激活sod2，而高血压与sod2高度乙酰化相关。本发明人测试了清除线粒体isolg是否减少sod2乙酰化。实际上，分离自高血压小鼠的主动脉中sod2乙酰化增加了260％，而补充mito2hoba显著降低了sod2乙酰化(与对照组小鼠相比减少了147％)(图11c、d)。
[0259]
本发明人已经报道了线粒体通透性转换孔(mptp)的调节亚单位亲环素d(cypd)的缺失改善血管功能并减轻高血压。sirt3介导的cypd脱乙酰化减弱mptp开放。本发明人试图
确定ang ii诱导的高血压是否诱导cypd高度乙酰化，以及mito2hoba是否会减弱cypd乙酰化。实际上，在分离自高血压小鼠的主动脉中，cypd乙酰化增加了356％，而mito2hoba的补充显著降低了cypd乙酰化(与对照组相比减少了156％)(图11e)。
[0260]
高血压与主动脉线粒体中的isolg-赖氨酰-内酰胺蛋白加合物的蓄积相关。mito2hoba抑制线粒体isolg加合物的形成并降低isolg-复合物i ndufs1亚单位加合物水平，其伴随着线粒体乙酰化的降低(图11)。
[0261]
mito2hoba对主动脉超氧化物、内皮一氧化氮及内皮依赖性舒张的影响
[0262]
mito2hoba防止sod2的高度乙酰化，提示mito2hoba能减少线粒体超氧化物。实际上，输注ang ii的高血压与主动脉线粒体超氧化物的2倍增加相关，该增加被补充mito2hoba完全阻止(图12a)。高血压与线粒体和细胞质中血管超氧化物的增加相关，线粒体和nadph氧化酶之间的相互干扰促进了这一点。我们用非靶向性细胞超氧化物探针dhe检测了mito2hoba是否降低输注ang ii的小鼠的细胞质超氧化物水平。输注ang ii的高血压与主动脉细胞超氧化物增加217％相关，该增加被补充mito2hoba显著降低(与假手术对照相比为152％，图12b)。
[0263]
在高血压中，血管超氧化物增加导致内皮功能障碍。它降低了内皮一氧化氮水平，促进血管收缩并增加全身血管阻力。因此，一氧化氮生物利用度降低是高血压内皮氧化应激的一个标志。我们测试了用靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba治疗小鼠是否保护内皮一氧化氮以及改善内皮依赖性舒张。通过电子自旋共振和特异一氧化氮自旋捕获剂fe(detc)2定量主动脉一氧化氮的产生。如图12所示，ang ii诱导的高血压与内皮一氧化氮减少2倍和内皮依赖性舒张受损相关。值得注意的是，补充mito2hoba在输注ang ii的小鼠中完全阻止了一氧化氮的下降，并保持了内皮依赖性舒张(图12c、d)。这些数据证明了先前未被认识到的线粒体isolg在内皮功能障碍中的作用。
[0264]
mito2hoba对线粒体呼吸、肾脏atp水平和ca
2
保留容量的影响
[0265]
高血压与特征在于呼吸功能受损和atp产生减少的线粒体功能障碍相关，其可以通过mptp开放介导，并导致高血压的终末器官损害。在目前的研究中，mito2hoba减少了mptp的ca
2
依赖性调节亚基cypd的乙酰化。我们测试了mito2hoba的补充是否降低了mptp开放(如通过线粒体ca
2
保留容量测量的)，改善了线粒体呼吸和atp产生。实际上，ang ii诱导的高血压与肾线粒体ca2 保留容量下降50％相关，并且这通过体外补充cypd抑制剂环孢菌素a而正常化。用mito2hoba治疗输注ang ii的小鼠完全阻止了ca
2
保留容量的下降(图13a)。此外，mito2hoba还保持了受到作为底物的谷氨酸和苹果酸支持的线粒体呼吸(图13b)。angⅱ介导的高血压也与肾脏atp水平降低50％相关，并且这被mito2hoba所阻止(图13c)。这些数据暗示在高血压中cypd依赖性mptp开放中的线粒体isolg可抑制线粒体呼吸，降低atp水平，并促进高血压的终末器官损害。
[0266]
讨论
[0267]
该实施例首次证明了线粒体isolg在具有原发性高血压的患者和具有angⅱ介导的高血压的小鼠的小动脉中蓄积。与血压正常的个体相比，在从高血压患者的小动脉分离的线粒体中线粒体isolg显著增加，并且在ang ii诱导的高血压发作后，在从小鼠的主动脉和肾分离的线粒体中线粒体isolg显著增加。通过d11抗体测定和质谱这两种独立的方法证实了线粒体isolg-赖氨酰-内酰胺蛋白加合物的形成。这些方法先前已被有力地验证，并为
线粒体中isolg-蛋白加合物的蓄积提供了明确的支持。此外，靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba阻止isolg-蛋白加合物在线粒体中的蓄积，并且mito2hoba增加了来自高血压患者的小动脉中sod2脱乙酰化，减少人主动脉内皮细胞中线粒体超氧化物，抑制血管氧化应激，改善内皮功能，以及降低ang ii诱导的高血压。此外，给ang ii诱导的小鼠补充mito2hoba提高肾脏atp水平，保护线粒体呼吸，并减少mptp开放，这支持线粒体isolg蓄积在高血压线粒体功能障碍形成中的作用。western印迹研究揭示了高血压与sirt3脱乙酰酶活性降低和线粒体高度乙酰化相关，而mito2hoba增加了sirt3介导的线粒体蛋白(特别是sod2和cypd)的脱乙酰化。这些发现支持线粒体isolg在sod2失活和cypd依赖性mptp开放中的作用(见图14)。
[0268]
高血压是与线粒体氧化应激相关的多因素疾病；然而，高血压中线粒体氧化应激的精确靶点尚不清楚。我们先前已经表明，在高血压动物模型中，线粒体超氧化物的产生增加，并且线粒体sod2的活性降低。
12
线粒体超氧化物的增加和sod2活性降低之间的失衡导致线粒体氧化应激。线粒体是超氧自由基的主要来源，并且它们富含不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸。花生四烯酸的自由基氧化产生高反应性脂质二羰基物，包括isolg。它们迅速加合到蛋白质赖氨酸残基上，并且可以诱导细胞功能障碍。我们的数据表明，在分离自高血压的血管和肾组织的线粒体中有大量isolg-赖氨酰-内酰胺蛋白加合物蓄积。补充低剂量的靶向线粒体的isolg清除剂mito2hoba(50nm)防止人主动脉内皮细胞中线粒体氧化应激，而非靶向性类似物2hoba无效。重要的是要注意，2hoba和mito2hoba不与超氧化物、过亚硝酸盐或过氧化氢反应，因此不通过ros清除直接发挥作用。相反，在输注ang ii的小鼠和haec中观察到的线粒体、细胞和主动脉超氧化物的mito2hoba介导的减少可能是由于sod2增强了对该自由基的清除。这是对我们的发现的合理解释，因为我们观察到在mito2hoba处理的动物中angⅱ诱导的sod2高度乙酰化显著减少，而sod2是唯一的线粒体超氧化物歧化酶。
[0269]
内皮功能障碍与血管超氧化物增加相关，其导致一氧化氮失活、内皮一氧化氮产生减少和内皮依赖性舒张受损。mito2hoba降低血管超氧化物，保护内皮一氧化氮，改善内皮依赖性舒张。在内皮细胞中，mito2hoba抑制超氧化物产生，减少氧化应激。mito2hoba的这些作用与sirt3介导的sod2和cypd脱乙酰化的增加相关。sirt3损伤导致血管炎症、肥厚和内皮功能障碍。我们的新数据支持线粒体isolg在sirt3失活、内皮和血管功能障碍中的重要作用。
[0270]
线粒体功能障碍导致高血压靶器官损害。高血压是肾脏疾病的主要原因，其与代谢和线粒体功能障碍相关。在本研究中，我们发现ang ii诱导的高血压与肾线粒体isolg增加4倍、mptp开放增加和肾线粒体呼吸受损相关。这些事件与肾脏atp水平下降2倍相关。引人注意的是，mito2hoba补充防止肾线粒体isolg的蓄积，减少mptp的开放，维持线粒体呼吸，并保护肾atp的产生。这些数据有力地支持线粒体isolg在高血压肾损伤中的作用。这些数据与我们先前的发现一致，我们先前的发现表明在脂多糖处理的小鼠中补充mito2hoba改善了肾线粒体的呼吸并保护肾皮质免受细胞损伤。
[0271]
因此，本发明人发现sirt3失活作为一种新的收敛机制，其支持主要心血管危险因素的相互作用。sirt3损伤抑制脂肪代谢并使关键的线粒体抗氧化剂超氧化物歧化酶2(sod2)失活，这是由于特定赖氨酸残基被高度乙酰化。因此，sirt3失活增加了线粒体中多不饱和脂肪酸和超氧化物的水平，这些脂肪酸和超氧化物一起反应产生高反应性isolg。
isolg与赖氨酸残基共价结合，产生细胞毒性和促炎性isolg加合物。我们发现高血压中线粒体isolg增加了4倍。线粒体isolg是线粒体氧化应激和疾病进展之间的一种机制联系。先前的研究已经证实了isolg与复合物v的f1fo亚基的加合物，并且我们报道了isolg与线粒体复合物i的ndufs1亚基的加合物。可以想到线粒体isolg通过直接
64
和间接相互作用导致sirt3失活。同时，线粒体isolg与sirt3失活之间的因果关系尚不明确。显然，isolg暴露抑制sirt3，然而，也可能是sirt3损伤促进线粒体isolg的形成。实际上，对分离自高血压患者的人小动脉进行治疗拯救了sirt3的活性，并增加了sirt3介导的sod2脱乙酰化。我们表明sirt3失活和线粒体isolg之间的前馈循环促进了血管功能障碍，并且清除线粒体isolg会打破这一循环并改善血管功能(见图14)。因此，isolg似乎既是sirt3失活的上游，也是sirt3失活的下游。
[0272]
isolg在例如血管炎症、高血压和心力衰竭的多种病症中的病理生理作用已被报道。补充非靶向性isolg清除剂2hoba减少血管炎症，减少组织纤维化，减少主动脉僵硬，减轻心肌肥厚，减轻高血压和心力衰竭。在这些病症中，刺激nadph氧化酶可促进胞质中isolg的形成，在胞质中它们可被2hoba清除。同时，线粒体既是isolg的来源，又是isolg的潜在靶点，因此，胞质中产生的isolg也可能导致线粒体功能障碍。实际上，我们的实验表明，2hoba部分地减弱培养的人主动脉内皮细胞中线粒体超氧化物的过度产生(图2)，表明线粒体内isolg和线粒体外isolg二者都促进了线粒体氧化应激。
[0273]
因此，本发明表明了mito2hoba在培养的内皮细胞中、在具有人小动脉和全动物补充的细胞器培养物中的作用。需要进一步的研究来确定线粒体isolg在内皮细胞、平滑肌和其他细胞中的特殊作用。我们表明本发明化合物有效阻断线粒体isolg，挽救sirt3脱乙酰酶活性，其恢复线粒体的代谢和抗氧化功能，降低血管氧化应激并改善内皮功能，因此，mito2hoba能够改善血管功能障碍和高血压的治疗。
[0274]
高血压随着年龄的增长而高度流行，并且75％的成年人在70岁及以上时成为高血压。sirt3的功能随年龄下降，并且sirt3的消耗加速血管老化并诱发与线粒体氧化应激相关的年龄依赖性高血压。sirt3的表达与人类的寿命相关，并且sirt3的过度表达可以防止血管功能障碍和高血压。有趣的是，推测sirt3损伤和线粒体isolg可以促进年龄依赖性血管改变和高血压，因此清除线粒体isolg可以减缓和逆转这些年龄相关的改变。实际上，我们的人体组织研究表明，在原发性高血压患者中，mito2hoba部分地挽救sirt3的活性。值得注意的是，大多数氧化剂的寿命很短(秒)，但isolg产生相当稳定的加合物(数天寿命)，其可以随着年龄的增长而蓄积并因此导致与年龄相关的病症的形成。
[0275]
除了高血压，线粒体氧化应激可能导致许多其他病症，包括衰老、动脉粥样硬化、糖尿病、炎症和退行性神经障碍。线粒体isolg的蓄积可以影响这些病症。可以想到在这些病症中使用靶向线粒体的isolg清除剂如mito2hoba会是有益的。与非靶向性药剂如2hoba相比，以相对较低剂量保护线粒体的能力也可能限制潜在的不利影响。
[0276]
本文提及的所有出版物，特别是下文提及的那些，通过援加入本文，以结合这些出版物所引用的方法和/或材料来公开和描述方法和/或材料。本文所讨论的出版物仅为了它们在本技术的申请日之前的公开而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。此外，此处提供的出版日期可能与实际出版日期不同，需要独立确认。
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[0290]
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[0298]
很明显，这样描述的本发明可以许多方式变化。对本领域技术人员来说显而易见的此类变化应被认为是本公开的旁支。
[0299]
除非另有说明，本说明书中所用的表示成分的量、诸如反应条件的性质等的所有数字应理解为在所有情形下都由术语“大约”修饰。因此，除非有相反的指示，说明书和权利要求书中所述的数值参数都是近似值，其可根据本发明寻求确定的所需性能而变化。
[0300]
虽然阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在实验部分或实例部分所给出的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值都固有地包含必然由它们各自的试验测量中存在的标准偏差造成的一定误差。