通过微生物方法产生NMN及其衍生物与流程

通过微生物方法产生nmn及其衍生物
1.相关申请
2.本技术根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2020年5月5日提交且题为“通过微生物方法产生nmn及其衍生物(production of nmn and its derivatives via microbial processes)”的美国临时申请号63/020052的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明领域
3.本发明的领域涉及通过微生物方法产生烟酰胺单核苷酸(nmn)及其衍生物，包括烟酰胺核苷(nr)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)。
4.发明背景
5.近年来，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)已从简单的代谢辅因子演变至医疗保健应用中的治疗剂地位(katsyuba等人2020
–
nad

homeostasis in health and disease.nature metabolism 2:9-31)。类似地，与nad密切相关的两种其他化合物，即烟酰胺单核苷酸(nmn)和烟酰胺核苷(nr)目前被认为是具有抗衰老和长寿应用潜力的保健营养品。nmn和nr目前是使用化学方法在商业上产生的，并且需要开发生物工艺技术来以成本有效的方式在商业规模上制造这些化合物。
6.已发现细菌停滞棒状杆菌(corynebacterium stationis)(atcc 6872和不同描述为产氨短杆菌(brevibacterium ammoniagenes)、产氨棒状杆菌(corynebacterium ammoniagenes)和停滞短杆菌(brevibacterium stationis))在限制性条件下生长时是nmn和相关化合物的多产生产者。典型限制条件包括缺锰、添加特定化学抑制剂以及使用特定的温度敏感性突变体在高温下培养。包括在这种应激诱导的nmn微生物产生中的是烟酸单核苷酸(namn)，其是当细胞在限制性条件下生长并喂食烟酸(na)或烟酰胺(nam)时与nmn相关的化合物。本领域仍然需要增加所产生的nmn的量同时最小化或消除副产物namn的形成的nmn产生方法。


技术实现要素：

7.本发明通过提供对谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)的遗传修饰来解决上述需要，所述遗传修饰能够产生烟酰胺单核苷酸(nmn)而不是烟酸单核苷酸(namn)，以及产生nmn衍生分子如nr和nad。
8.本发明涉及具有能够产生nmn及其衍生物nr和nad的遗传修饰的工程化宿主细胞。本发明中还提供了对微生物宿主细胞进行遗传工程化的方法，所述微生物宿主细胞能够选择性地产生nmn或nr或nad。根据本发明可用于产生nmn、nr和nad的原料包括烟酰胺(nam)和烟酸(na)。在本发明的一个优选的实施方案中，nam用作产生nmn、nar或nad的原料。
9.根据本发明可用于产生nmn、nr和/或nad的微生物宿主细胞包括但不限于易于遗传修饰的微生物细胞，如细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。在本发明的一个方面，谷氨酸棒状杆菌用作优选的微生物宿主细胞。在本发明的一个优选方面，可用于本发明的谷氨酸棒
状杆菌细胞最初进行遗传修饰以改变其限制修饰系统，以使其适合于其他遗传修饰，所述其他遗传修饰使得能够使用这种细菌细胞使用nam或na原料产生nmn、nr和nad。本发明的工程化宿主细胞(包括谷氨酸棒状杆菌)可包含用于引入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性的遗传修饰，例如由nrdhiej操纵子编码的核糖核苷酸还原酶。
10.在本发明的一个方面，适合用于产生nmn、nr和/或nad的遗传修饰包括但不限于引入表达最初不存在于所述微生物宿主细胞中的酶蛋白的外源基因，增加编码酶蛋白的内源基因的相对表达、从而引起相应酶蛋白的活性增加，和/或降低或完全消除编码酶蛋白的内源基因的表达、从而引起相应酶蛋白的活性降低或完全消除。
11.在本发明的一个方面，当工程化微生物宿主细胞缺乏编码能够将nam转化为nmn的酶的内源基因时，将编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的外源基因nadv引入所述工程化微生物宿主细胞中。在本发明的一个示例性实施方案中，编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的nadv基因的来源包括但不限于嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)、紫色色杆菌(chromobacterium violaceum)、耐辐射异常球菌(deinococcus radiodurans)、集胞藻属某种(synechocystis sp.)pcc 6803、嗜二噁烷假诺卡氏菌(pseudonocardia dioxanivorans)cb1190、奥奈达湖希瓦氏菌(shewanella oneidensis)mr-1和青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)gmi1000。在本发明的一个最优选的方面，使用本领域众所周知的一种或多种遗传工程化技术，将来自前述微生物物种中的任一者的nadv基因分离并引入谷氨酸棒状杆菌菌株中。在一个优选的方面，将所述外源基因nadv在其转移到所述工程化微生物宿主细胞之前进行密码子优化，以确保所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶在所述微生物宿主细胞中的最佳表达。所述谷氨酸棒状杆菌细胞内的外源基因可在诸如lacz启动子的诱导型启动子下，并且可使用乳糖或iptg进行诱导。
12.在本发明的另一个方面，将来自杜克雷嗜血杆菌(haemophilus ducreyi)的nampt基因作为烟酰胺磷酸核糖基转移酶活性的来源引入所述工程化微生物宿主细胞中。在此实施方案的另一个方面，在已经具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的内源基因的那些微生物宿主细胞中，这种酶的活性可通过引入外源nadv基因(任选地密码子优化并且从前一段落中列出的任何来源获得)或来自杜克雷嗜血杆菌的任选密码子优化的nampt基因而进一步增强。
13.在本发明实施方案的另一个方面，选择用于使用nam作为原料产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还包含额外的遗传修饰以确保磷酸核糖基焦磷酸(prpp也已知为5-磷酸-核糖1-二磷酸)在导致nam转化为nmn的酶促反应中充当共底物的可用性。所述额外的遗传修饰包括引入编码磷酸核糖基焦磷酸合成酶的外源基因如prsa或通过增加内源prsa基因表达或改善由所述prsa基因编码的磷酸核糖基焦磷酸合成酶prsa的性能来改善所述内源prsa基因的性能。在本发明的一个优选方面，使用编码抗反馈磷酸核糖基焦磷酸合成酶的prsa基因。
14.在本发明的另一个实施方案中，作为在从nam产生nmn中保存充当共底物的prpp的一种方式，在所述细胞内利用prpp池的其他途径被阻断。在本发明的一方面，使pyre基因突变，导致负责催化核糖基磷酸基团从prpp转移至乳清酸的乳清酸磷酸核糖基转移酶失活，从而导致乳清苷的形成。
15.在本发明的另一个实施方案中，选择用于使用nam作为原料产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还包含额外的遗传修饰，所述额外的遗传修饰确保大部分nam转化为nmn产生，而用于nam利用的其他生物化学途径(如nam转化为烟酸)被阻断。在此实施方案的一个方面，使pnca基因突变，使得存在负责将nam脱酰胺成烟酸(na)的烟酰胺酶酶功能的缺失。
16.在本发明的另一个实施方案中，选择用于使用nam作为原料产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还包含额外的遗传修饰以确保使用nam作为原料在所述细胞内产生的nmn的保存，其中所述额外的遗传修饰阻断消耗nmn的其他生物化学途径。在此实施方案的一个方面，编码能够将nmn转化为nr的酶的usha基因缺失。在此实施方案的另一个方面，pncc基因缺失，从而导致能够将nmn转化为烟酸单核苷酸(namn)的烟酰胺-核苷酸酰胺水解酶酶活性的丧失。在本发明的另一个方面，基因cgl1364、cgl1977和cgl2835缺失，从而导致能够将nmn转化为nam和核糖-5磷酸的推定核苷酶的消除。在本发明的另一个方面，对基因nadd进行遗传修饰，使得能够将nmn转化为nad的酶的活性被阻断。
17.在本发明实施方案的另一个方面，选择用于使用nam作为原料产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还包含导致pgi基因的敲除或损伤的额外遗传修饰，从而将d-葡萄糖-6-磷酸从糖酵解重定向至磷酸戊糖途径(ppp)并增加prpp可用性。然而，已发现pgi的缺失导致某些培养基中某些微生物物种的生长迟缓。为了至少部分地恢复正常生长，可对所述微生物宿主细胞进行进一步遗传修饰以表达异源zwf酶，所述异源zwf酶相对于所述微生物宿主细胞的天然zwf具有更高的克服反馈抑制的能力。
18.在非限制性示例性实施方案中，转基因zwf酶可以是(i)抗反馈突变型多肽，所述多肽包含与如seq id no:28中所列的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的氨基酸序列；(ii)肠系膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)突变型多肽，所述多肽包含与如seq id no:30中所列的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的氨基酸序列；或(iii)多肽，所述多肽包含与如seq id no:32中所列的运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)(zmzwf)的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的氨基酸序列。
19.还发现，在缺乏天然吡啶核苷酸转氢酶的微生物物种中，也可通过克服nadph累积来挽救生长。这可通过对宿主细胞进行进一步遗传修饰以包含一种或多种可溶性或膜结合转氢酶来实现。在非限制性实例中，来自大肠埃希氏菌(e.coli)的udha是据报告有利于通过nadph还原nad 的可溶性转氢酶，并且来自大肠埃希氏菌的pntab是据报告有利于通过nadh还原nad 的膜结合转氢酶。
20.在一个代表性实施方案中，重组zwf和转氢酶在cgdvs表达载体中配对。
21.在本发明的各种实施方案中，选择用于使用nam作为原料产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞可包含前述段落中描述的各种遗传修饰的任何组合。因此，根据本发明的微生物宿主细胞可包含例如，如前述段落中描述的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种遗传修饰。
22.在另一实施方案中，本发明提供了一种使用nam作为原料产生nad的方法。在此实施方案的一个方面，选择用于使用nam产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还包含nadd基因中的额外遗传修饰，从而产生上调的nad( )合成酶，所述酶负责将nmn转换为nad。在此实施方案的又一个方面，使基因nudc突变，使得负责将nad转化回nmn的酶被阻断。
23.在又一个实施方案中，本发明提供了使用nam作为原料产生nr的方法。在此实施方案的一个方面，选择用于使用nam产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还包含由usha基因编码的功能活性去磷酸化酶。在本发明的另一个方面，对所述usha基因进行遗传修饰，从而产生具有增强的将nmn转化为nr的活性的去磷酸化酶。在本发明的另一个方面，基因cgl1364、cgl1977和cgl2835缺失，从而导致负责将nr转化为na和核糖的嘌呤核苷酶的消除。
24.因此，在一个方面，本发明提供了产生nmn的方法，其中所述方法包括：将nam供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含选自由以下组成的组的至少一种遗传修饰：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的nadv基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的缺失或修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的缺失或修饰；(h)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的nmn核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(j)它们的任何组合。在各种实施方案中，与没有任何所述修饰的菌株相比，具有所述至少一种修饰的本发明的经遗传修饰的菌株产生增加量的nmn。
25.因此，在另一个方面，本发明提供了产生nr的方法，其中所述方法包括：将nam供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含选自由以下组成的组的至少一种遗传修饰：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的nadv基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因(包括usha基因)的修饰；(d)能够产生磷酸核糖基焦磷酸(prpp)的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的缺失或修饰；(h)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的nmn核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)编码能够将nr转化为nam和核糖-糖的核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(j)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(k)它们的任何组合。在各种实施方案中，与没有任何所述修饰的菌株相比，具有所述至少一种修饰的本发明的经遗传修饰的菌株产生增加量的nr。在一些实施方案中，编码能够将nmn转化为nam和核糖-5磷酸的nmn核苷酶的所述一种或多种基因中的至少一者可以是与编码能够将nr转化为nam和核糖-糖的核苷酶的一种或多种基因中的至少一者相同的基因。
26.因此，在又一个方面，本发明提供了产生nad的方法，其中所述方法包括：将烟酰胺
供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含选自由以下组成的组的至少一种遗传修饰：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的nadv基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的缺失或修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的修饰；(h)能够将nad转化回nmn的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的nmn核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(j)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(k)它们的任何组合。在各种实施方案中，与没有任何所述修饰的菌株相比，具有所述至少一种修饰的本发明的经遗传修饰的菌株产生增加量的nad。在一些实施方案中，编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的nmn核苷酶的所述一种或多种基因中的至少一者可以是与编码能够将nr转化为nam和核糖-糖的核苷酶的一种或多种基因中的至少一者相同的基因。
27.虽然本公开容易有各种修改和替代形式，但其具体实施方案通过举例在附图中示出并且将在本文进行详细描述。然而，应当理解，本文所呈现的附图和详细描述并不意图将将本公开限于所公开的特定实施方案，而是相反，意图涵盖落在如由所附权利要求书限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等效物和替代方案。
28.本发明的其他特征和优点将在参照附图对本发明的优选实施方案的详细描述中变得显而易见。
附图说明
29.图1.所需产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad

)、烟酰胺单核苷酸(nmn)和烟酰胺核苷(nr)的化学结构。此图中还示出副产物即烟酸腺嘌呤二核苷酸(naad)、烟酸单核苷酸(namn)、烟酸核苷(nar)以及底物烟酰胺(nam)和烟酸(na)的化学结构。根据本发明通过遗传修饰消除了所述副产物。na、nar、namn和naad的结构分别与nam、nr、nmn和nad的不同之处在于端基c(o)oh对比c(o)nh2。
30.图2.根据本教导用于增加的nr、nad和nmn产生的某些遗传修饰。此类遗传修饰可包括以下中的一者或多者：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的nadv基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的缺失或修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)负责将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)负责将nmn转化为nad的基因的缺失或修饰；以及(h)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的混杂nmn核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰。
31.图3.在根据本发明的示例性经遗传修饰的微生物宿主细胞中从作为原料的nam产生nmn的途径。
32.图4.本领域已知的嘌呤核苷酶的作用机制和出人意料地观察到作为烟酰胺单核苷酸核苷酶起作用的相同酶。
33.图5.使用自杀性质粒pdel缺失靶基因的方法。如此图所示，使用pcr获得待缺失的
靶基因的上游和下游侧翼区域，并克隆到pdel质粒中。用pdel质粒转化谷氨酸棒状杆菌细胞，所述质粒具有被靶向以进行缺失的基因的上游和下游侧翼区域。转化后，将细胞涂铺于卡那霉素板中以选择转化体。在第二轮筛选中，将转化体涂铺在含有蔗糖的板上，以选择具有靶基因缺失的双重组体。
34.图6.在根据本发明构建的两种不同谷氨酸棒状杆菌菌株中nmn的产生。菌株nmn4具有基因型δcgl1777-8δpncaδpnccδushaδpyre，并且菌株nr5具有基因型δcgl1777-8δpncaδpnccδpnucδcgl1364δcgl1977δcgl2835。
35.图7.在根据本发明构建的四种不同谷氨酸棒状杆菌菌株中nmn的产生。
36.图8.在根据本发明的示例性经遗传修饰的微生物宿主细胞中增强从d-葡萄糖-6-磷酸产生prpp的途径。
37.图9用zwf和转氢酶基因转化的许多谷氨酸棒状杆菌菌株在cgxii培养基中的生长。
38.图10许多含δpgi谷氨酸棒状杆菌菌株的所指示质粒中的nmn产生。
具体实施方式
39.本发明涉及可用于使用nam或na作为原料生物产生nmn、nr和nad的经遗传修饰的宿主细胞的构建以及使用那些经遗传修饰的宿主细胞产生nmn、nr和nad的方法。在一个优选的实施方案中，nam用作产生nmn、nr和nad的原料。
40.可用于本发明的经遗传修饰的宿主细胞可以是微生物细胞，如细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。可用于本发明的细菌细胞包括但不限于埃希氏菌属某些种、链霉菌属某些种、发酵单胞菌属某些种、醋杆菌属某些种、柠檬酸杆菌属某些种、集胞藻属某些种、根瘤菌属某些种、梭菌属某些种、棒状杆菌属某些种、链球菌属某些种、黄单胞菌属某些种、乳杆菌属某些种、乳球菌属某些种、芽孢杆菌属某些种、产碱杆菌属某些种、假单胞菌属某些种、气单胞菌属某些种、固氮菌属某些种、丛毛单胞菌属某些种、分枝杆菌属某些种、红球菌属某些种、葡糖杆菌属某些种、罗尔斯通菌属某些种、硫杆菌属某些种、小月菌属某些种、地杆菌属某些种、地芽孢杆菌属某些种、节杆菌属某些种、黄杆菌属某些种、沙雷氏菌属某些种、糖多孢菌属某些种、栖热菌属某些种、寡养单胞菌属某些种、色杆菌属某些种、中华根瘤菌属某些种、糖多孢菌属某些种、土壤杆菌属某些种、泛菌属某些种以及需钠弧菌。在一个优选的实施方案中，使用谷氨酸棒状杆菌。
41.本公开的酵母细胞包括但不限于工程化的酵母属某些种、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、博伊丁假丝酵母和毕赤酵母属。根据本公开，如本文要求保护的酵母是分类为真菌界的成员的真核单细胞微生物。酵母是从多细胞祖先进化而来的单细胞生物体，但是可用于当前公开的一些物种是能够通过形成称为假菌丝(pseudo hyphae)或假的菌丝(false hyphae)的连接的出芽细胞串来发展多细胞特征的那些。
42.图1示出所需产物nad、nmn和nr的化学结构。此图中还示出副产物即naad、namn、nar以及底物nam和na的化学结构。根据本发明通过遗传修饰消除了所述副产物。na、nar、namn和naad的结构分别与nam、nr、nmn和nad的不同之处在于端基c(o)oh对比c(o)nh2。
43.图2示出与本发明相关的谷氨酸棒状杆菌细胞内的代谢途径的部分。本发明的目
的是使用nam或na作为原料产生nmn、nr和nad，同时消除相关副产物如nar、namn和naad。
44.在一个优选的实施方案中，nam用作原料。如图2所示，从nam至nmn、nr和nad的代谢途径不同于从na至nad、nmn和nr的代谢途径。从na至nad(通过namn和naad)、nmn(通过namn)和nr(通过namn和nmn)的途径与从nam至nmn以及nr和nad(通过nmn)的途径相比涉及显著更多的酶促步骤。因此，nam被认为是产生nmn、nr和nad的优选原料。
45.当使用nam作为优选原料时，通过由pnca基因编码的脱酰胺酶将nam转化为na是有利的。消除nam转化为na的一种方式是使pnca基因失活。pnca基因的失活可使用多种遗传操作技术来完成。pnca基因的优选遗传操作是从微生物宿主细胞的染色体dna中缺失核苷酸序列。
46.使用可用于遗传操作的各种工具，微生物菌株构建领域的技术人员将能够设计用于产生所需化合物即nmn、nr和nda中的每一者的代谢途径。如图2所示，从nam产生nmn是在微生物宿主细胞内的单个酶促步骤中完成的。一旦nmn在微生物宿主细胞内累积，其他两种目标化合物，即nda和nr就可通过随后的酶促反应作为衍生产物从nmn获得。
47.表1-3列出参与图2中所示的生物化学途径的各种基因和酶。表4提供参与图2中所示的生物化学途径的操作的基因和酶的序列信息。
48.为了提供用于产生烟酰胺nmn、nr和nad的更直接的途径，可对谷氨酸棒状杆菌或相关生物体进行许多遗传修饰。在一些实施方案中，此类遗传修饰可包括编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因(nadv)的异源表达。烟酰胺磷酸核糖基转移酶是并不天然地可见于棒状杆菌中的活性。然而，它存在于许多其他细菌和真核微生物中。表2列出这种基因的某些优选来源。在一些实施方案中，遗传修饰可包括能够将烟酰胺转化为烟酸的基因(pnca)的缺失或修饰，从而导致酶活性的丧失或降低。在一些实施方案中，遗传修饰可包括能够产生磷酸核糖基焦磷酸(prpp)(nmn、nr和nad的一种关键前体)的prsa基因的修饰，使得更高水平的prpp可用。此类修饰可包括基因表达的上调和/或导致在产生条件下酶活性水平增加的蛋白质变体的引入。可根据本发明使用对prs基因的修饰，如在marinescu等人,“beta-nicotinamide mononucleotide(nmn)production in escherichia coli,”sci.rep.,8:12278(2018)和zakataeva等人,“wild-type and feedback-resistant phosphoribosyl pyrophosphate synthetases from bacillus amyloliquefaciens:purification,characterization,and application to increase purine nucleoside production,”appl.microbiol.biotechnol.,93:2023-33(2012)中描述的那些。在一些实施方案中，修饰可包括负责将nmn转化为namn的基因(pncc)的缺失或修饰，从而导致酶活性丧失或降低。在一些实施方案中，修饰可包括使用a)蛋白质编码序列中的温度敏感性(ts)突变，b)ts自剪接内含肽，c)配体依赖性基因表达和/或d)配体依赖性酶失活来产生和并入条件活性核糖核苷酸还原酶。修饰的目的是阻断细胞分裂和生物质累积，同时通过抑制dna产生和复制所需的脱氧核糖核苷酸合成来维持蛋白质合成和代谢活性。
49.用于nmn产生的经修饰途径
50.如图2和3所示，来自nam的nmn产生可在工程化宿主细胞内通过单个酶促步骤实现，所述酶促步骤涉及由nadv基因编码的烟酰胺磷酸核糖基转移酶。在缺乏编码磷酸核糖基转移酶的内源基因的那些微生物如谷氨酸棒状杆菌中，有必要使用遗传工程化领域中众所周知的技术引入编码磷酸核糖基转移酶的外源基因。在本发明的一个优选方面，编码烟
酰胺磷酸核糖基转移酶的nadv基因的来源可选自由以下组成的组：嗜麦芽寡养单胞菌、紫色色杆菌、耐辐射异常球菌、集胞藻属某种pcc 6803、嗜二噁烷假诺卡氏菌cb1190、奥奈达湖希瓦氏菌mr-1和青枯雷尔氏菌gmi1000。在本发明的一个示例性实施方案中，使用本领域众所周知的遗传工程化技术，将来自前述微生物物种中的任一者的nadv基因分离并引入谷氨酸棒状杆菌菌株中。在一个优选的方面，将外源基因nadv在其转移到所选微生物宿主细胞中之前进行密码子优化，以确保所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶在所述微生物宿主细胞中的最佳表达。
51.在磷酸核糖基转移酶介导的酶反应中，磷酸核糖基焦磷酸(prpp)充当共底物，并且必须确保细胞内存在足够量的可用prpp以促进磷酸核糖基转移酶介导的反应。可通过增强prpp合成酶活性的表达来增加微生物内prpp的池大小。prpp合成酶活性的增强表达可通过表达外源基因prsa来实现。此外，如果对prsa酶活性存在任何反馈抑制，则优选使用编码prsa酶的抗反馈变体的prsa基因。
52.在本发明的另一个实施方案中，作为在从nam产生nmn中保存充当共底物的prpp池的一种方式，可引入额外的遗传修饰以阻断细胞内利用prpp池的其他途径。在本发明的一方面，使pyre基因突变，从而导致能够催化核糖基磷酸基团从prpp转移至乳清酸的乳清酸磷酸核糖基转移酶失活，其进而导致乳清苷的形成。
53.为了实现nmn产生的生产目标，除了确保存在适当的磷酸核糖基转移酶和磷酸核糖基焦磷酸(prpp)合成酶以及微生物细胞内存在足够量的prpp用于从nam生产nmn之外，阻断或灭活微生物细胞内可能的nmn利用/降解途径是有利的。
54.例如，选择用于使用nam作为原料生产nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还可包含额外的遗传修饰以确保细胞内产生的nmn的保存，其中所述额外的遗传修饰阻断消耗nmn的其他生物化学途径。在此实施方案的一个方面，编码能够将nmn转化为nr的酶的usha基因缺失。在此实施方案的另一个方面，基因pncc缺失，从而导致能够将nmn转化为烟酸单核苷酸(namn)的烟酰胺-核苷酸酰胺水解酶酶活性的丧失。在本发明的另一个方面，基因cgl 1364、cgl 1977和cgl2835缺失，从而导致能够将nmn转化为nam和核糖-5磷酸的推定核苷酶的消除。在本发明的另一个方面，对基因nadd进行遗传修饰，使得能够将nmn转化为nad的酶的活性被阻断。
55.因此，在一个方面，本发明提供了产生nmn的方法，其中所述方法包括：将烟酰胺供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含选自由以下组成的组的至少一种遗传修饰：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的缺失或修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的缺失或修饰；(h)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的混杂核苷酶反应的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(j)它们的任何组合。在各种实施方案中，与没有任何所述修饰的菌株相比，具有所述至少一种修饰的本发明的经遗传修饰的菌株产生增加量的nmn。
56.用于nad产生的经修饰途径
57.在又一个实施方案中，本发明提供了使用nam作为原料产生nad的方法。在此实施方案的一个方面，选择用于使用nam产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还可包含nadd基因中的额外遗传修饰，从而产生上调的nad( )合成酶，所述酶能够将nmn转换为nad。在此实施方案的又一个方面，使基因nudc突变，使得能够将nad转化回nmn的酶被阻断。
58.因此，在又一个方面，本发明提供了产生nad的方法，其中所述方法包括：将烟酰胺供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含选自由以下组成的组的至少一种遗传修饰：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的缺失或修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的修饰；(h)能够将nad转化回至nmn的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(j)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(k)它们的任何组合。在各种实施方案中，与没有任何所述修饰的菌株相比，具有所述至少一种修饰的本发明的经遗传修饰的菌株产生增加量的nmn。
59.用于nr产生的经修饰途径
60.在又一个实施方案中，本发明提供了使用nam作为原料产生nr的方法。在此实施方案的一个方面，选择用于使用nam产生nmn并具有编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的密码子优化的外源基因的微生物宿主细胞还可包含由usha基因编码的功能活性去磷酸化酶。在本发明的另一个方面，对所述usha基因进行遗传修饰，从而产生具有增强的将nmn转化为nr的活性的酶去磷酸化酶。
61.因此，在另一个方面，本发明提供了产生nr的方法，其中所述方法包括：将烟酰胺供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含选自由以下组成的组的至少一种遗传修饰：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的缺失或修饰；(h)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)编码能够将nr转化为nam和核糖-糖的核苷酶的一种或多种基因的缺失或修饰；(j)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(k)它们的任何组合。在各种实施方案中，与没有任何所述修饰的菌株相比，具有所述至少一种修饰的本发明的经遗传修饰的菌株产生增加量的nr。
62.用于增加nmn滴度的经修饰途径
63.如通过nadv酶催化的由nam产生nmn至少部分地取决于微生物宿主细胞产生prpp共底物的速率。图8所示的是磷酸戊糖途径(“ppp”)的氧化分支，其中d-葡萄糖-6-磷酸转化
为d-核酮糖-5-磷酸且然后转化为prpp。用于增加通过ppp的通量的策略需要敲除pgi基因，从而将d-葡萄糖-6-磷酸从糖酵解重定向至ppp并增加prpp的可用性。然而，在谷氨酸棒状杆菌中与这种方法相关的问题是，在诸如cgxii的基本培养基上生长受到很大阻碍。不希望受限于任何特定理论，据信天然zwf蛋白，即催化ppp途径的第一步骤的葡萄糖6-磷酸脱氢酶，在葡萄糖上的生长过程中受到atp和pep(磷酸烯醇丙酮酸)累积的抑制，从而大大减少通过ppp的碳通量。此外，假设可鉴定允许碳通量增加的替代zwf，可能由于氧化还原当量以nadph而不是nadh的形式累积而出现进一步问题，并且野生型棒状杆菌缺乏吡啶核苷酸转氢酶，例如可溶性udha或跨膜pntab来解决这一缺点。
64.因此，在一个方面，本发明提供了谷氨酸棒状杆菌的重组δpgi突变体，其中转基因zwf酶与吡啶核苷酸转氢酶的组合的表达挽救生长，同时提高prpp的产生，如以更高的nmn滴度所反映。因此，在一个相关方面，本发明提供了产生nmn的方法，其中所述方法包括：将烟酰胺供料至经遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养物，其中所述菌株包含遗传修饰，所述遗传修饰包括：(a)编码能够将nam转化为nmn的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因的异源表达；(b)能够将nam酶促转化为na的一种或多种基因的缺失或修饰；(c)能够将nmn酶促转化为nr的一种或多种基因的缺失或修饰；(d)能够产生prpp的一种或多种基因的修饰；(e)除将nam转化为nmn的生物化学途径以外的需要prpp的生物化学途径的修饰或缺失；(f)能够将nmn酶促转化为namn的基因的缺失或修饰；(g)能够将nmn转化为nad的基因的缺失或修饰；(h)编码能够将nmn转化为nam和核糖-5-磷酸的混杂核苷酶反应的一种或多种基因的缺失或修饰；(i)能够将d-葡萄糖-6-磷酸酶促转化为d-果糖-6-磷酸的基因的缺失或修饰；(j)并入重组zwf；(k)并入重组吡啶核苷酸转氢酶，其中重组zwf和重组吡啶核苷酸转氢酶的组合允许补偿与能够将d-葡萄糖6-磷酸酶促转化为d-果糖-6-磷酸的基因的缺失或修饰相关的生长缺陷；(l)并入条件活性核糖核苷酸还原酶以阻断细胞分裂和生物质累积，而不影响蛋白质合成和正常代谢活性；以及(m)它们的任何组合。
65.prpp的产生由此得到改善，如相对于没有此类修饰的菌株更高的nmn滴度所反映。
66.根据本公开产生的烟酰胺化合物(nmn、nr、nad)可用于多种应用中的任一种，例如，利用它们的生物学或治疗性质(例如，控制低密度脂蛋白胆固醇、增加高密度脂蛋白胆固醇等)。例如，根据本公开，烟酰胺核糖可用于药物、食品和膳食补充剂等中。
67.通过本发明中公开的方法产生的烟酰胺单核苷酸(nmn)在改善血浆脂质谱、预防中风、用化学疗法治疗提供神经保护、治疗真菌感染、预防或减轻神经变性或延长健康和福祉方面具有治疗价值。因此，本发明进一步涉及从上述经遗传修饰的细菌细胞获得的烟酰胺核苷化合物，用于通过施用有效量的烟酰胺核苷组合物来治疗与nad 生物合成的烟酰胺核苷激酶途径相关的疾病或疾患。
68.通常具有改变的nad 或nad 前体水平或可能受益于通过用烟酰胺核苷治疗实现的增加的nad 生物合成的疾病或疾患包括但不限于脂质病状(例如，血脂异常、高胆固醇血症或高脂血症)、中风、神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏症、帕金森症和多发性硬化症)、如在化学疗法中观察到的神经毒性、光滑念珠菌感染以及与衰老相关的一般健康状况下降。此类疾病和疾患可通过饮食补充或提供具有烟酰胺核苷组合物的治疗方案来预防或治疗。
69.应当理解，从本发明的经遗传修饰的细菌分离的烟酰胺化合物可重新配制成最终
产品。在本公开的一些其他实施方案中，在宿主细胞的背景下，将由如本文所述的经遗传修饰的宿主细胞产生的烟酰胺核苷化合物并入最终产品(例如，食物或饲料补充剂、药物等)中。例如，可将宿主细胞冻干、冷冻干燥、冷冻或以其他方式灭活，然后可将全细胞并入最终产品中或用作最终产品。宿主细胞也可在并入产品之前进行加工，以增加生物利用度(例如，通过裂解)。
70.在本公开的一些实施方案中，将所产生的烟酰胺核苷化合物并入食物或饲料的组分(例如，食物补充剂)中。可根据本公开并烟酰胺核苷化合物并入其中的实物产品的类型不受特别限制，并且包括饮料，如牛奶、水、软饮料、能量饮料、茶和果汁；甜食，如果冻和饼干；含脂肪食物和饮料，如乳制品；加工实物产品，如大米、面包、早餐谷物食品等。在一些实施方案中，将产生的烟酰胺核苷化合物并入膳食补充剂，例如复合维生素中。
71.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但是以下描述优选的材料和方法。
72.在考虑以下非限制性实施例后将更全面地理解本公开。应当理解，这些实施例尽管指示主题技术的优选实施方案，但是仅以说明的方式给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定主题技术的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对主题技术作出各种变化和修改以便使其适于各种用途和条件。
73.实施例
74.实施例1
75.菌株构建
76.用如表5中所述的一种或多种遗传修饰构建了各种工程化的谷氨酸棒状杆菌菌株。在表5中总结的谷氨酸棒状杆菌中进行遗传缺失时，使用了pdel质粒(一种缺乏谷氨酸棒状杆菌的复制起点的自杀性质粒)。pdel质粒含有被靶向以进行缺失的基因上游和下游的同源区域(各自约500-800bp)。如图5所示，使用pcr获得被靶向以进行缺失的基因侧翼的上游和下游区域，并将其克隆到含有sacb基因和抗生素标记物的pdel质粒中。
77.用此类质粒转化谷氨酸棒状杆菌细胞并涂铺在含有卡那霉素(25ug/ml)的caso培养基中并静置过夜。将所得菌落涂铺在含有6％蔗糖的培养基中，以选择具有靶基因缺失且没有任何pdel质粒部分整合到其染色体dna中的双重组体。
78.使用表6中描述的质粒对上述工程化菌株进行进一步遗传修饰，以引入外源nadv基因和prsa基因变体/突变体。
79.实施例2
80.由nam产生nmn
81.使根据实施例1构建的菌株在含有卡那霉素的bhi培养基中生长过夜。由于谷氨酸棒状杆菌细胞在从一种培养基移至另一种培养基时具有较长的滞后期，因此将细胞沉淀、洗涤并重悬于cgxii培养基中2-3小时以进行恢复。为了开始发酵测定，在30℃下将细胞以0.2od
600
接种在cgxii培养基(表7)中，并保持在旋转振荡器(250rpm)上。当细胞密度达到0.6-0.8od
600
时，用0.4mm iptg诱导细胞。将nam供料至细胞培养物中，并且每24小时收集样品，持续长达72小时，以确认nmn产生。
82.具体而言，从培养上清液获得样品并以.4000x g离心5分钟。将澄清的上清液与等
体积的甲醇混合，涡旋30秒或在板振荡器上以600rpm振荡10分钟，并以》4000x g离心5分钟以除去任何额外的碎片，并使用以hilac模式和最大压力400barr运行的phenomenex luna 3μm nh2 通过hplc方法对所得上清液进行分析。在261nm处监测2μl注射液，使用nam、nr、nmn和nad 的标准物生成标准曲线。水性缓冲液是5mm醋酸铵ph 9.9(a)，而有机缓冲液是乙腈(b)。hplc柱以0.1ml/min使用以下梯度运行：0min-95％b，1min
–
95％b，15min
–
0％b，20min
–
0％b，20.01min
–
95％b，30min
–
95％b。
83.nmn4和nr5菌株(均含有外源基因smaop和prsa l136i)的nmn产生滴度分别如图6所示。
84.含有外源基因cviha和prsa l136i的nmn3菌株、含有外源基因cviha和prsa l136i的nmn4菌株、含有外源基因smaop和prsa l136i的nmn4菌株以及含有外源基因smaop和prsa l136i的nr5菌株的nmn产生滴度分别如图7所示。
85.如图6和图7所示，以编码嘌呤核苷酶iunh3的内源基因cgl1364、编码嘌呤核苷酶iunh2的内源基因cgl1977和编码嘌呤核苷酶iunh1的内源基因cgl2835的缺失为特征的nr5菌株似乎具有最高的nmn产生滴度。不希望受任何特定理论束缚，据信一种或多种上述基因的缺失可导致nmn降解回烟酰胺(nam)和核糖-5p的显著降低。鉴于以前已知缺失cgl1364、cgl1977和cgl2835中的一者或多者仅具有减少nr降解为na和核糖的作用，这一观察结果是高度出人意料的。
86.实施例3
87.ppp途径中的生长挽救和增加
88.如上所预期，pgi基因可被敲除以将d-葡萄糖-6-磷酸从糖酵解重定向至ppp中，从而增加prpp可用性。然而，谷氨酸棒状杆菌的δpgi突变体受到严重受损生长的负面影响。不受限于任何特定理论，据信天然zwf蛋白，即催化ppp途径的第一步骤的酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶，在葡萄糖上的生长过程中受到atp和pep(磷酸烯醇丙酮酸)累积的抑制，从而大大减少通过ppp的碳通量。
89.筛选了三种重组zwf的克服被天然谷氨酸棒状杆菌zwf所表现出的抑制作用的能力：(i)谷氨酸棒状杆菌zwf的抗反馈突变体(a243t)(seq id no:28)；(ii)来自肠系膜明串珠菌的zwf的工程化突变体(r46e/q47e)(lmzwf，seq id no:32)，其具有nadh和nadph的混合使用；以及(iii)来自运动发酵单胞菌的zwf(zmzwf)，其有利于nadh使用。
90.筛选了两种转氢酶的克服nadph累积的能力：(i)来自大肠埃希氏菌的udha是据报告有利于通过nadph还原nad 的可溶性转氢酶；并且(ii)来自大肠埃希氏菌的pntab是据报告有利于通过nadh还原nadp 的膜结合转氢酶。
91.重组zwf和转氢酶在cgdvs表达载体中以组成型表达的或cumate诱导的构型配对，如下所示：
92.组成型表达：
93.(i)cgdvs.psod.lmzwf.pntab(s.lmzwf.pntab)
94.(ii)cgdvs.psod.lmzwf.udha(s.lmzwf.udha)
95.(iii)cgdvs.psod.zmzwf.pntab(s.zmzwf.pntab)
96.(iv)cgdvs.psod.zmzwf.udha(s.zmzwf.udha)
97.cumate诱导型表达：
98.(v)cgdvs.pct5.cgzwf*.udha(s.pct5.cg.udha)
99.上述载体(i)-(v)各自独立地转化为“base”菌株，即先前用cgdvk.ptac.smaop.prsa载体转化的nmn11菌株。base菌株也用两种对照载体cgdvs中的任一者进行转化，所述载体表达来自min3组成型启动子(s.min3.mch)或pct5诱导型启动子(s.pct5.mch)的红色荧光蛋白mcherry。然后使转化的菌株在cgxii培养基上生长，以鉴定成功挽救nmn11中的生长缺陷的实例。
100.如图9所示，在x轴上以小时为单位测量时间，并且在y轴上显示od
600
，如所预期，base菌株min3.mcherry和pct5.mcherry表现出几乎零生长。pct5.mcherry菌株最终以630nm的波长发出信号，但通过目视检查仍然没有显示出明显可见的生长或mcherry浓度，这将解释在630nm处发射的稍后上升，因为mcherry仍在这种波长附近吸收。zmzwf.udha(深蓝色)和lmzwf.pntab(黄色)菌株表现出对生长缺陷的最佳挽救。从lmzwf.udha获得第二最佳结果，而zmzwf.pntab显示出适度的早期生长，然后逐渐减弱。在烧瓶中进行的初始产生测试表明，菌株zmzwf.udha产生了最多nmn。
101.用如所指示的载体转化以下菌株：
102.nmn4：δcgl1777-8δcgl2487δcgl1963δcgl0328δcgl2773
103.(1)无对照：cgdvk.ptac.mcherry(mcherry)
104.(2)生产对照：cgdvk.ptac.smaop.prsa(k.smaop.prs)
105.nmn13：δcgl 1777-8δcgl2487δcgl1963δcgl 0328δcgl 0851
106.(3)cgdvk.ptac.smaop.prsa
107.(4)cgdvk.ptac.smaop.prsa cgdvs.psod.zmzwf.udha(s.zwf.udha)
108.nmn11：δcgl 1777-8δcgl2487δcgl1963δcgl 0328δcgl 0851δcgl2773
109.(5)cgdvk.ptac.smaop.prsa
110.(6)cgdvk.ptac.smaop.prsa cgdvs.psod.zmzwf.udha
111.还使用插入pgi位置中的psod.zmzwf.udha构建体制造了两种菌株，以消除对cgdvs和壮观霉素抗生素的需求：
112.nmn29：δcgl1777-8δcgl2487δcgl1963δcgl0328δcgl0851：psodzmzwf.udha
113.(7)cgdvk.ptac.smaop.prsa
114.nmn30：δcgl1777-8δcgl2487δcgl1963δcgl0328δcgl0851：psodzmzwf.udhaδcgl2773
115.(8)cgdvk.ptac.smaop.prsa
116.分别在细胞培养生长48小时和72小时后评估由每种菌株产生的nmn的量。结果在图10中示出。
[0117][0118][0119]
[0120][0121]
[0122]
[0123][0124]
[0125][0126][0127]
[0128][0129]
目标序列
[0130]
seq id no:1；prt；紫色色杆菌；烟酰胺磷酸核糖基转移酶-cvinadvha(cviha)
[0131]
mtapkaaqdknqlvpfnladfyktghpamyprettrlvanftprsakyaqvlpqlfddkvvwfglqgfiqeylidlfnreffqrpkadavrryqrrmdtalgagavdggrlealhdlghlpleirslpegarvdikvppvtfsnthpdfpwvatyfetlfsceswkpstvatiafefrkllsyfaaltgapqdfvawqghdfsmrgmsgvhdamrcgaghllsftgtdtipaldyledhygadaerelvggsipasehsvmalrilltqqrlarmpahqglddkalrrlaerevvrefvtrdypagmvsivsdtfdfwnvltviarelkddiqarrpdalgnakvvfrpdsgdpvrilagyrddelqfddagnctarddgrpvsaaerkgaveclwdifggtvtergyrvldshvgliygdsitlprardillrlaekgyascnvvfgigsfvygmnsrdtfgyalkavyaevageavdiykdpatddgtkksargllrveeengryalyqqqtpaeaeggalrpvfrdgellvkqtlaeirqrlqaswtcpeagsivwna
[0132]
seq id no:2；prt；嗜麦芽寡养单胞菌；烟酰胺磷酸核糖基转移酶-smanadvop(smaop)
[0133]
mhyldnlllntdsykashwlqyppgtdatffyvesrgglhdrtvffglqailkdalarpvthadiddaaavfaahgepfneagwrdivdrlgghlpvriravpegsvvpthqalmtiestdpaafwvpsyletlllrvwypvtvatiswharqtiaaflqqtsddpqgqlpfklhdfgargvsslesaalggaahlvnflgtdtvsalclarahyhapmagysipaaehstitswgrerevdayrnmlrqfgkpgsivavvsdsydiyraisehwgttlrddviasgatlvirpdsgdpvevvaeslrrldeafghaingkgyrvlnhvrviqgdginpdtirailqritddgyaadnvafgmggallqrldrdtqkfalkcsaarvegewidvykdpvtdagkaskrgrmrllrrlddgslhtvplpangddtlpdgfedamvtvwenghllydqrlddirtraavgh
[0134]
seq id no:3；prt；密码子优化的prpp合酶变体，cyl77_rs04805-prsa(prs)
[0135]
mtahwkqnqknlmlfsgrahpelaeavakeldvnvtpmtardfangeiyvrfeesvrgsdcfvlqshtqplnkwlmeqllmidalkrgsakritailpfypyarqdkkhrgrepisarliadlmltagadrivsvdlhtdqiqgffdgpvdhmhampiltdhikenynldnicvvspdagrvkvaekwantlgdapmafvhktrstevanqvvanrvvgdvdgkdcvllddmidtggtiagavgvlkkagaksvviacthgvfsdparerlsacgaeevittdtlpqstegwsnltvlsiapllartineifengsvttlfegea
[0136]
seq id no:4；prt；抗反馈prpp合酶突变体，prsa l136i(prs l136i)
[0137]
mtahwkqnqknlmlfsgrahpelaeavakeldvnvtpmtardfangeiyvrfeesvrgsdcfvlqshtqplnkwlmeqllmidalkrgsakritailpfypyarqdkkhrgrepisarliadlmltagadrivsvdihtdqiqgffdgpvdhmhampiltdhikenynldnicvvspdagrvkvaekwantlgdapmafvhktrstevanqvvanrvvgdvdgkdcvllddmidtggtiagavgvlkkagaksvviacthgvfsdparerlsacgaeevittdtlpqstegwsnltvlsiapllartineifengsvttlfegea
[0138]
seq id no.:5；dna；烟酰胺酶pnca(cgl_rs12350，ncgl2401，cgl2487)
[0139]
atggcacgcgcactcattctggttgatgttcaaaaagacttctgccccggtggcagcctagccaccgaacgaggcgatgaagtggcgggaaaaatcggtgcctatcagctgtcccacggctcagagtacgacgtcgttgtggcgacccaagattggcacatcgatccaggcgagcacttttcagaaaccccagactttaaaaactcctggccaatccactgcgtcgcggattccgatggtgccgccatgcatgaccgcatcaacaccgattcaatcgatgagttcttccgcaaaggccattacaccgcggcgtattccgggttcgagggaactgcagtcagtgaagaactcctcatgtctccatggctgaagaacaagggagtcactgatgtagacatcgtagggatcgctacggatcactgcgttcgagccacagcacttgatgctctcaaggagggcttcaacgtctccattttgacgtcgatgtgttctgcggtggatttccatgcgggagaccacgctttggaggaactacatgaagccggggcgattctgatttaa
[0140]
seq id no.:6；prt；烟酰胺酶pnca(cgl_rs12350，ncgl2401，cgl2487)
[0141]
maralilvdvqkdfcpggslatergdevagkigayqlshgseydvvvatqdwhidpgehfsetpdfknswpihcvadsdgaamhdrintdsideffrkghytaaysgfegtavseellmspwlknkgvtdvdivgiatdhcvrataldalkegfnvsiltsmcsavdfhagdhaleelheagaili
[0142]
seq id no:7；dna；烟酰胺-核苷酸酰胺水解酶pncc(cgl_rs09770，ncgl 1888，cgl 1963)
[0143]
atgtcggagaatctggcggggcgagtggtggagctgttgaaatcgcgcggtgaaacgctggcgttttgtgaatccctcaccgccggccttgccagtgcgacgatcgcagagatccccggcgcctcagtggtacttaaaggcgggctggtcacctatgccaccgagcttaaggttgcgcttgccggtgtgccgcaggagcttatcgacgcgcacggcgttgtttccccgcagtgcgcccgtgcgatggcaacgggggccgcacacagatgccaggcagattgggcggtttcgctcacgggcgttgctggccccagcaaacaagatggtcatccggtgggggaagtgtggatcggagtggctggtcctgcgcattttggggcgtcgggaacaattgacgcgtatcgtgcgtttgaaagtgaacaacaggtaatattggctgaattgggacggcatcatattagagagtctgctgtgcagcaaagctttcgcctgctgattgaccatattgagtcgcagtga
[0144]
seq id no:8；prt；烟酰胺-核苷酸酰胺水解酶pncc(cgl_rs09770，ncgl 1888，cgl 1963)
[0145]
msenlagrvvellksrgetlafcesltaglasatiaeipgasvvlkgglvtyatelkvalagvpqelidahgvvspqcaramatgaahrcqadwavsltgvagpskqdghpvgevwigvagpahfgasgtidayrafeseqqvilaelgrhhiresavqqsfrllidhiesq
[0146]
seq id no.:9；dna；限制修饰系统；rm＝cgl 1777(cyl77_rs08985)
[0147]
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[0183]
seq id no.28；dna；来自谷氨酸棒状杆菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的cgzwf突变体(a243t)(cg1778，cgl1576，ncgl1514)
[0184]
mstnttpsswtnplrdpqdkrlpriagpsgmvifgvtgdlarkkllpaiydlanrgllppgfslvgygrrewskedfekyvrdaasagartefrenvwerlaegmefvrgnfdddaafdnlaatlkridktrgtagnwayylsippdsftavchqlersgmaesteeawrrviiekpfghnlesahelnqlvnavfpessvfridhylgketvqnilalrfanqlfeplwnsnyvdhvqitmaediglggragyydgigaardviqnhliqllalvameepisfvpaqlqaekikvlsatkpcypldktsargqyaagwqgselvkglreedgfnpesttetfaactleitsrrwagvpfylrtgkrlgrrvteiavvfkdaphqpfdgdmtvslgqnaivirvqpdegvlirf
[0185]
gskvpgsamevrdvnmdfsysesfteespeayerlildalldesslfptneevelswkildpileawdadgepedypagtwgpksademlsrnghtwrrp*
[0186]
seq id no.29；dna；肠系膜明串珠菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，具有登录号m64446.1的基因的密码子优化突变体(r46e/q47e)；lmzwf
[0187]
atggtttccgaaataaagaccctcgttactttctttggcggcaccggtgaccttgcaaaacgcaagctctacccctctgtattcaacctgtacaaaaaagggtatctgcaaaaacacttcgccattgttggtaccgctgaagaggcgctaaacgacgacgagttcaaacagcttgtccgtgattccattaaagacttcaccgatgaccaagcccaggcagaggccttcatcgaacatttttcttatcgagcacacgatgtgaccgatgccgcatcgtatgcagtcctgaaggaagcgatcgaggaggcggccgataagttcgatattgacggtaaccgcatattttacatgtcggtggcaccacgcttcttcggtaccatcgctaaatatctgaagtccgagggtctgcttgctgatactggctacaatcggctgatgattgaaaagccttttggaacctcttatgacacagccgcagaactacagaatgacttggagaacgctttcgatgataatcagcttttccgtatcgatcattatctgggtaaagaaatggtccagaatatcgcagctctgcgcttcggaaaccctatattcgacgctgcgtggaacaaggattacatcaagaacgttcaagttacactctccgaagtgttgggggttgaagagcgagccggctactatgacaccgccggagctctacttgatatgatccagaaccacacgatgcagatcgttggctggctcgccatggaaaaaccagagtccttcaccgataaagacatccgcgcggctaagaacgccgcttttaatgccctgaaaatctacgacgaggctgaagtgaacaaatattttgtgcgtgcccaatatggtgctggagattctgccgatttcaaaccttacttagaggaactcgatgtcccagcagattccaaaaacaacaccttcattgcaggcgaattacagtttgatcttccacgttgggaaggtgtgcctttttacgtgcgcagcggtaaacgactcgcagccaaacagactcgcgtcgatattgttttcaaggctggcacctttaatttcgggtctgaacaggaagctcaagaggccgttctgtccatcatcattgatccgaagggagcaatcgaactgaagctcaatgcaaaatctgtggaagatgctttcaacacccgcactatcgacttgggctggaccgtgagcgatgaggacaagaaaaatacgccagaaccttatgaaaggatgatccacgatacgatgaacggtgacggcagcaacttcgcagattggaatggcgtgagcattgcgtggaagttcgtagatgctatttctgcggtatatacggccgataaggccccgcttgaaacctacaagtcgggctccatgggacccgaagccagcgacaaattgctcgccgcaaacggagatgcatgggtattcaaggggtag
[0188]
seq id no.30；prt；肠系膜明串珠菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的突变体(r46e/q47e)；lmzwf
[0189]
mvseiktlvtffggtgdlakrklypsvfnlykkgylqkhfaivgtaeealnddefkqlvrdsikdftddqaqaeafiehfsyrahdvtdaasyavlkeaieeaadkfdidgnrifymsvaprffgtiakylkseglladtgynrlmiekpfgtsydtaaelqndlenafddnqlfridhylgkemvqniaalrfgnpifdaawnkdyiknvqvtlsevlgveeragyydtagalldmiqnhtmqivgwlamekpesftdkdiraaknaafnalkiydeaevnkyfvraqygagdsadfkpyleeldvpadsknntfiagelqfdlprwegvpfyvrsgkrlaakqtrvdivfkagtfnfgseqeaqeavlsiiidpkgaielklnaksvedafntrtidlgwtvsdedkkntpepyermihdtmngdgsnfadwngvsiawkfvdaisavytadkapletyksgsmgpeasdkllaangdawvfkg
[0190]
seq id no.31；dna；来自运动发酵单胞菌菌株atcc 10988的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的密码子优化变体(zmob_0908)
[0191]
atgactaatactgtttctaccatgatccttttcggcagcaccggagatctctcgcagcgcatgcttcttccctcgctgtacgggctggatgcagacggtctactcgccgacgacctccgcattgtgtgtacctctcgttccgagtacgataccgacggatttcgtgattttgctgagaaggcactggaccgtttcgttgcctccgacagacttaatgatgatgcaaaagcgaagttcctcaacaagcttttctacgcaacggttgacatcaccgatccaacccaatttggaaagctcgcagacctctgcggtccagtcgaaaagggcattgcaatctacctttccacagcaccatccttgttcgaaggcgcaattgctggcttgaaacaggcgggcctggccggcccgacctcccgccttgcattggaaaagcccttgggtcaagatcttgcttcctctgatcacatcaacgacgcagtgctgaaggttttttccgaaaaacaagtataccgtatcgaccactatcttgggaaagaaaccgtccagaatctcctaacactccgctttggaaatgcattgttcgagccgttgtggaactcaaaggggattgaccacgtgcagatctccgtcgctgagacagtgggactcgaaggacgcatcggctactttgacggctccggctccctgcgagacatggtgcagtctcacatcctgcaattggttgcccttgtagctatggagcccccggctcacatggaagcaaacgcggtccgcgacgaaaaggttaaggtgttccgtgcacttcgtcccattaacaacgacactgttttcacacacaccgtgactggccaatacggcgccggcgtgtcggggggaaaggaagttgcaggctacatcgatgagcttggacaaccgagtgatactgaaacctttgttgcaattaaagcacacgtggataactggcgctggcagggagttcccttctacatccgcactggtaaacggctccctgcccgccgttcagagatcgtcgttcagttcaaaccagttccccactccattttttcaagctcaggaggaatccttcagcctaataaattgcgcattgtcctgcaaccagacgaaaccatccaaatctcaatgatggtcaaggaaccaggtcttgacagaaatggtgcacacatgcgtgaggtctggctggatctctctttgaccgacgtgttcaaagatcgaaagcgccggattgcttacgagcgccttatgctcgatctgattgagggtgacgcaaccctcttcgtgcgccgcgacgaggtcgaggcacagtgggtttggatcgacggtatccgggaaggctggaaggctaatagcatgaagcctaaaacctatgtctccggcacctggggaccctccaccgctattgcattggcagagcgcgatggcgtcacctggtacgactaa
[0192]
seq id no.32；prt；来自运动发酵单胞菌菌株atcc 10988的glu6-磷酸脱氢酶的密码子优化变体(ncbi-蛋白质id：aeh62743.1)
[0193]
mtntvstmilfgstgdlsqrmllpslygldadglladdlrivctsrseydtdgfrdfaekaldrfvasdrlnddakakflnklfyatvditdptqfgkladlcgpvekgiaiylstapslfegaiaglkqaglagptsrlalekplgqdlassdhindavlkvfsekqvyridhylgketvqnlltlrfgnalfeplwnskgidhvqisvaetvglegrigyfdgsgslrdmvqshilqlvalvameppahmeanavrdekvkvfralrpinndtvfthtvtgqygagvsggkevagyidelgqpsdtetfvaikahvdnwrwqgvpfyirtgkrlparrseivvqfkpvphsifsssggilqpnklrivlqpdetiqismmvkepgldrngahmrevwldlsltdvfkdrkrriayerlmldliegdatlfvrrdeveaqwvwidgiregwkansmkpktyvsgtwgpstaialaerdgvtwyd*
[0194]
seq id no.33；dna；来自大肠埃希氏菌的可溶性吡啶核苷酸转氢酶；udha(np_418397.2,eg11428)
[0195]
atgccacattcctacgattacgatgccatagtaataggttccggccccggcggcgaaggcgctgcaatgggcctggttaagcaaggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagctctccgtcacgccgtcagccgcattatagaattcaatcaaaacccactttacagcgaccattcccgactgctccgctcttcttttgccgatatccttaaccatgccgataacgtgattaatcaacaaacgcgcatgcgtcagggattttacgaacgtaatcactgtgaaatattgcagggaaacgctcgctttgttgacgagcatacgttggcgctggattgcctggacggcagcgttgaaacactaaccgctgaaaaatttgttattgcctgcggctctcgtccatatc
atccaacagatgttgatttcacccatccacgcatttacgacagcgactcaattctcagcatgcaccacgaaccgcgccatgtacttatctatggtgctggagtgatcggctgtgaatatgcgtcgatcttccgcggtatggatgtaaaagtggatctgatcaacacccgcgatcgcctgctggcatttctcgatcaagagatgtcagattctctctcctatcacttctggaacagtggcgtagtgattcgtcacaacgaagagtacgagaagatcgaaggctgtgacgatggtgtgatcatgcatctgaagtcgggtaaaaaactgaaagctgactgcctgctctatgccaacggtcgcaccggtaataccgattcgctggcgttacagaacattgggctagaaactgacagccgcggacagctgaaggtcaacagcatgtatcagaccgcacagccacacgtttacgcggtgggcgacgtgattggttatccgagcctggcgtcggcggcctatgaccaggggcgcattgccgcgcaggcgctggtaaaaggcgaagccaccgcacatctgattgaagatatccctaccggtatttacaccatcccggaaatcagctctgtgggcaaaaccgaacagcagctgaccgcaatgaaagtgccatatgaagtgggccgcgcccagtttaaacatctggcacgcgcacaaatcgtcggcatgaacgtgggcacgctgaaaattttgttccatcgggaaacaaaagagattctgggtattcactgctttggcgagcgcgctgccgaaattattcatatcggtcaggcgattatggaacagaaaggtggcggcaacactattgagtacttcgtcaacaccacctttaactacccgacgatggcggaagcctatcgggtagctgcgttaaacggtttaaaccgcctgttttaa
[0196]
seq id no.34；prt；来自大肠埃希氏菌的可溶性吡啶核苷酸转氢酶；udha(aac76944)
[0197]
mphsydydaivigsgpggegaamglvkqgarvavieryqnvgggcthwgtipskalrhavsriiefnqnplysdhsrllrssfadilnhadnvinqqtrmrqgfyernhceilqgnarfvdehtlaldcldgsvetltaekfviacgsrpyhptdvdfthpriydsdsilsmhheprhvliygagvigceyasifrgmdvkvdlintrdrllafldqemsdslsyhfwnsgvvirhneeyekiegcddgvimhlksgkklkadcllyangrtgntdslalqnigletdsrgqlkvnsmyqtaqphvyavgdvigypslasaaydqgriaaqalvkgeatahliediptgiytipeissvgkteqqltamkvpyevgraqfkhlaraqivgmnvgtlkilfhretkeilgihcfgeraaeiihigqaimeqkgggntieyfvnttfnyptmaeayrvaalnglnrlf
[0198]
seq id no.35；dna；来自大肠埃希氏菌mg1655的膜结合吡啶核苷酸转氢酶(pnt)的“a”亚基；eck1598(变体g1342a，np_416120.1)
[0199]
atgccacattcctacgattacgatgccatagtaataggttccggccccggcggcgaaggcgctgcaatgggcctggttaagcaaggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagctctccgtcacgccgtcagccgcattatagaattcaatcaaaacccactttacagcgaccattcccgactgctccgctcttcttttgccgatatccttaaccatgccgataacgtgattaatcaacaaacgcgcatgcgtcagggattttacgaacgtaatcactgtgaaatattgcagggaaacgctcgctttgttgacgagcatacgttggcgctggattgcctggacggcagcgttgaaacactaaccgctgaaaaatttgttattgcctgcggctctcgtccatatcatccaacagatgttgatttcacccatccacgcatttacgacagcgactcaattctcagcatgcaccacgaaccgcgccatgtacttatctatggtgctggagtgatcggctgtgaatatgcgtcgatcttccgcggtatggatgtaaaagtggatctgatcaacacccgcgatcgcctgctggcatttctcgatcaagagatgtcagattctctctcctatcacttctggaacagtggcgtagtgattcgtcacaacgaagagtacgagaagatcgaaggctgtgacgatggtgtgatcatgcatctgaagtcgggtaaaaaactgaaagctgactgcctgctctatgccaacggtcgcaccggtaataccgattcgctggcgttacagaacattgggctagaaactgacagccgcggacagctgaaggtcaacagcatgtatcagaccgcacagccacacgtttacgcggtgggcgacgtgattggttatccgagcctggcgtcggcggcctatgaccaggggcgcattgccgcgcaggcgctggtaaaaggcgaagccaccgcacatctgattgaagatatccctaccggtatttacaccatcccggaaatcagctctgtgggcaaaaccgaacagcagctgaccgcaatgaaagtgccatatgaagtgggccgcgcccagtttaaacatc
tggcacgcgcacaaatcgtcggcatgaacgtgggcacgctgaaaattttgttccatcgggaaacaaaagagattctgggtattcactgctttggcgagcgcgctgccgaaattattcatatcggtcaggcgattatggaacagaaaggtggcggcaacactattgagtacttcgtcaacaccacctttaactacccgacgatggcggaagcctatcgggtagctgcgttaaacggtttaaaccgcctgttttaa
[0200]
seq id no.36；prt；来自大肠埃希氏菌的膜结合吡啶核苷酸转氢酶(pnt)的“a”亚基；p07001.2(a434t变体)
[0201]
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[0202]
seq id no.37；dna；来自大肠埃希氏菌的膜结合吡啶核苷酸转氢酶(pntb)的“b”亚基(mg1655；eck1597；np_416119.1)
[0203]
atgtctggaggattagttacagctgcatacattgttgccgcgatcctgtttatcttcagtctggccggtctttcgaaacatgaaacgtctcgccagggtaacaacttcggtatcgccgggatggcgattgcgttaatcgcaaccatttttggaccggatacgggtaatgttggctggatcttgctggcgatggtcattggtggggcaattggtatccgtctggcgaagaaagttgaaatgaccgaaatgccagaactggtggcgatcctgcatagcttcgtgggtctggcggcagtgctggttggctttaacagctatctgcatcatgacgcgggaatggcaccgattctggtcaatattcacctgacggaagtgttcctcggtatcttcatcggggcggtaacgttcacgggttcggtggtggcgttcggcaaactgtgtggcaagatttcgtctaaaccattgatgctgccaaaccgtcacaaaatgaacctggcggctctggtcgtttccttcctgctgctgattgtatttgttcgcacggacagcgtcggcctgcaagtgctggcattgctgataatgaccgcaattgcgctggtattcggctggcatttagtcgcctccatcggtggtgcagatatgccagtggtggtgtcgatgctgaactcgtactccggctgggcggctgcggctgcgggctttatgctcagcaacgacctgctgattgtgaccggtgcgctggtcggttcttcgggggctatcctttcttacattatgtgtaaggcgatgaaccgttcctttatcagcgttattgcgggtggtttcggcaccgacggctcttctactggcgatgatcaggaagtgggtgagcaccgcgaaatcaccgcagaagagacagcggaactgctgaaaaactcccattcagtgatcattactccggggtacggcatggcagtcgcgcaggcgcaatatcctgtcgctgaaattactgagaaattgcgcgctcgtggtattaatgtgcgtttcggtatccacccggtcgcggggcgtttgcctggacatatgaacgtattgctggctgaagcaaaagtaccgtatgacatcgtgctggaaatggacgagatcaatgatgactttgctgataccgataccgtactggtgattggtgctaacgatacggttaacccggcggcgcaggatgatccgaagagtccgattgctggtatgcctgtgctggaagtgtggaaagcgcagaacgtgattgtctttaaacgttcgatgaacactggctatgctggtgtgcaaaacccgctgttcttcaaggaaaacacccacatgctgtttggtgacgccaaagccagcgtggatgcaatcctgaaagctctgtaa
[0204]
seq id no.38；来自大肠埃希氏菌的膜结合吡啶核苷酸转氢酶(pntb)的“b”亚基；p0ab69.1
[0205]
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