一种TPGS修饰的多功能磁性纳米粒子及其制备方法与应用与流程

一种tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于抗肿瘤药物载体领域，特别涉及一种tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子及其制备方法与应用。


背景技术：

2.四氧化三铁纳米粒子(ionp)以其超顺磁特性在磁共振成像(mri)中显示出独特的功能，并具有良好的生物安全性和表面可修饰性等诸多优点，在生物医学上展现出巨大的应用价值。然而，ionp存在水分散性差、易聚集等问题，造成体内使用的生物安全隐患。如何获得水分散性好的四氧化三铁纳米粒子，仍是有待解决的技术问题。现有技术是针对于本发明所解决的技术问题指出现有技术的不足，因此关于本发明的内容不宜在现有技术出现


技术实现要素：

3.本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子的制备方法。
4.本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制得的tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子。
5.本发明的再一目的在于提供所述tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子的应用。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.一种tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将疏水性fe3o4纳米颗粒的己烷分散体加入11-氨基十一烷酸四甲基铵盐的二氯甲烷混悬液中，振摇，期间使用磁铁沉淀得到沉淀物；
9.(2)倒出溶剂和非磁性混悬液，清洗步骤(1)得到的沉淀物，用磁铁分离得到清洗后的沉淀物，在氮气下干燥；
10.(3)将步骤(2)得到的产物分散在水或中性ph值的缓冲液中，得到亲水性磁性纳米粒子；
11.(4)将亲水性磁性纳米粒子、tpgs(聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯)和药物混合、溶解并震荡，得到tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子。
12.优选地，步骤(1)在室温条件下进行。
13.步骤(1)中所述的疏水性fe3o4纳米颗粒的己烷分散体通过以下步骤制得：
14.s1、将乙酰丙酮铁(fe(acac)3)、1,2-十六烷二醇、油酸和油胺溶解在有机溶剂中，在惰性气体气流下搅拌，得到混合物；
15.s2、将步骤s1中得到的混合物加热，在惰性气体覆盖下，再加热回流，得到黑褐色混合物；或是将步骤s1中得到的混合物和较小粒径的疏水性fe3o4纳米颗粒的己烷分散体混合，除去己烷后加热，在惰性气体覆盖下，再加热回流，得到黑褐色混合物；
16.s3、去除热源，将黑褐色混合物冷却，接着加入乙醇沉淀黑色物质，进行固液分离，得到黑色产物；
17.s4、将黑色产物溶解于含油酸和油胺的己烷中，离心除去任何不分散的残留物，得到己烷混合物；
18.s5、在己烷混合物中加入乙醇，沉淀产物fe3o4纳米颗粒，离心除去溶剂，再将fe3o4纳米颗粒分散于己烷中，得到疏水性fe3o4纳米颗粒的己烷分散体。
19.优选地，步骤s1中乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇、油酸和油胺的摩尔比为1：5：(1～3)：(1～3)。
20.步骤s1中所述的有机溶剂优选为醚类有机溶剂；更优选为苯基醚或苄基醚。
21.所述的苄基醚为苄基甲醚和苄基乙醚中的至少一种。
22.步骤s1中所述的有机溶剂的用量为能充分溶解乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇、油酸和油胺的量，优选按其与乙酰丙酮铁为15ml～25ml：1mmol计算；更优选为20ml：1mmol计算。
23.步骤s1和步骤s2中所述的惰性气体是不参与反应的气体，优选为氮气。
24.步骤s1中所述的搅拌优选为磁力搅拌。
25.步骤s2中所述的加热的条件优选为于200℃加热30min～2h。
26.步骤s2中所述的加热回流优选为加热至265～300℃，回流30min～1h。
27.步骤s2中所述的较小粒径的疏水性fe3o4纳米颗粒指的是比最后得到的的疏水性fe3o4纳米颗粒小的疏水性fe3o4纳米颗粒。
28.步骤s2中所述的除去己烷优选为通过加热的方式除去己烷；更优选为于100℃加热30min，除去己烷。
29.步骤s3中所述的冷却优选为冷却至室温。
30.本发明中的室温指的是5～40℃；优选为10～35℃；更优选为20～30℃。
31.步骤s3中所述的乙醇的添加量为能使黑色物质充分沉淀的量；优选按乙酰丙酮铁：乙醇＝1mmol：15～25ml计；更优选按乙酰丙酮铁：乙醇＝1mmol：20ml计。
32.步骤s3中所述的固液分离的方式优选为离心。
33.所述的离心的条件优选为于6000rpm的转速离心10min。
34.步骤s4中油酸和油胺按体积比1:1配比使用。
35.步骤s4中所述的离心的条件优选为于6000rpm的转速离心10min。
36.步骤s5中所述的fe3o4纳米颗粒优选是粒径为4～8nm的fe3o4纳米颗粒。
37.步骤s5中所述的离心的条件优选为于6000rpm的转速离心10min。
38.步骤(1)中所述的疏水性fe3o4纳米颗粒的己烷分散体中疏水性fe3o4纳米颗粒的浓度优选为90～110mg/ml；更优选为100mg/ml。
39.步骤(1)中所述的混悬液中11-氨基十一烷酸四甲基铵盐的浓度优选为9～11mg/ml；更优选为10mg/ml。
40.步骤(1)中所述的11-氨基十一烷酸四甲基铵盐的用量为过量，其用量优选按其与疏水性fe3o4纳米颗粒为质量比1：1配比。
41.步骤(1)中的振摇的时间优选为15～25min；更优选为20min。
42.步骤(2)中所述的清洗的溶液优选为二氯甲烷。
43.所述的清洗的次数优选为至少一次。
44.步骤(2)中所述的分离的目的为除去过量的表面活性剂。
45.步骤(3)中所述的水优选为去离子水、蒸馏水和纯化水中的至少一种。
46.步骤(3)中所述的缓冲液优选为磷酸盐缓冲液；更优选为浓度为1mm的磷酸盐缓冲液。
47.步骤(3)中所述的中性ph值指的是ph值为6.8～7.2；更优选为7.0。
48.步骤(4)中亲水性磁性纳米粒子、tpgs和药物优选按质量比1∶15～25∶1配比；更优选按质量比1∶20∶1配比。
49.步骤(4)中所述的药物优选为抗癌药物；更优选为多烯紫杉醇(doc)。
50.步骤(4)中所述的震荡的时间优选为10～15小时；更优选为12小时。
51.一种tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子，通过上述方法制备得到。
52.上述tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子在制备具有磁共振成像和治疗用途的药物中的应用。
53.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
54.(1)tpgs是一种聚乙二醇化的维生素e，可作为乳化剂、增溶剂以及药物载体的修饰剂。tpgs与磁性纳米粒子相结合，可促进磁性纳米粒子包裹肿瘤药物的包封率和载药量，提高药物的溶解度和稳定性，并有效提高逆转抗肿瘤药物的多耐药性。利用tpgs修饰、优化的磁性纳米药物载体系统，具有较好的生物相容性，能同时实现药物靶向释放、核磁共振成像，达到诊断和治疗一体化，避免肿瘤患者因诊断而错过最佳治疗时间。
55.(2)经tpgs修饰的磁性纳米载体可有效负载药物、血液循环时间长、毒性低且可靶向传递药物。在胶束的epr效应和外部磁场双重作用下，靶向运输药物至病变部位，经肿瘤弱酸性环境的降解释放药物，提高药物的生物利用度。
56.(3)本发明合成的磁性纳米载体可用于肿瘤的磁共振成像，该载药系统可在肿瘤部位聚集，被磁共振成像设备良好地检测，得到清晰的信号图像，实现诊断、治疗、逆转多耐性的多功能一体化，具有良好的临床应用价值。
附图说明
57.图1为所制备的fe3o4的磁滞曲线图。
58.图2为fe3o4的热失重曲线图。
59.图3为fe3o4的xrd衍射图谱图；其中，从上至下分别是曲线1、曲线2、曲线3。
60.图4为fe3o4的透射电镜照片图。
61.图5为空白tpgs/fe3o4载体、doc、tpgs/fe3o
4-doc对hne-1细胞活性的影响结果图。
62.图6为空白tpgs/fe3o4载体、doc、tpgs/fe3o
4-doc对hne-1细胞凋亡率的影响结果图。
63.图7为采用空白tpgs/fe3o4载体、doc、tpgs/fe3o
4-doc与hne-1细胞共孵育后释放的ros荧光强度结果图。
64.图8为磁性纳米粒子在裸鼠体内的分布结果图。
65.图9为不同时间的磁共振t2成像对比图。
具体实施方式
66.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限
于此。
67.实施例1
68.4nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体的制备，制备步骤如下：
69.s1、2mmol乙酰丙酮铁、10mmol 1,2-十六烷二醇、6mmol油酸和6mmol油胺溶解在20ml苯基醚中，在氮气流下磁力搅拌，得到混合物。
70.s2、将步骤s1中得到的混合物加热至200℃，加热30分钟，在氮气覆盖下，再加热回流(265℃)30分钟，得到黑褐色混合物。
71.s3、去除热源，将步骤s2中得到的黑褐色混合物冷却至室温，向混合物中加入乙醇(40ml)，沉淀黑色物质，并离心分离，得到黑色产物。
72.s4、将步骤s3中得到的黑色产物溶解于含油酸(0.05ml)和油胺(0.05ml)的己烷(10ml)中，离心(6000rpm，10min)除去任何不分散的残留物，得到己烷混合物。
73.s5、在步骤s4得到的己烷混合物中加入乙醇(10ml)，沉淀产物4nm fe3o4纳米颗粒，离心(6000rpm，10min)除去溶剂，再将4nm fe3o4纳米颗粒分散于己烷中，得到4nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体。
74.tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子的制备，制备步骤如下：
75.(1)将疏水性4nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体(0.2ml中约20mg)加入11-氨基十一烷酸四甲基铵的二氯甲烷混悬液(2ml中约20mg)中，振摇20min，期间使用磁铁沉淀得到沉淀物。
76.(2)倒出溶剂和非磁性混悬液，用二氯甲烷清洗步骤(1)得到的沉淀物一次，并在氮气下干燥前使用磁铁再次分离以除去过量的表面活性剂，得到清洗后的沉淀物。
77.(3)将步骤(2)得到的清洗后的沉淀物约20mg分散在2ml去离子水中，即得到亲水性磁性纳米粒子。
78.(4)按照质量比为亲水性磁性纳米粒子∶tpgs∶doc＝5∶100∶5混合溶解并震荡12小时，得到tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子。
79.实施例2
80.6nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体的制备，制备步骤如下：
81.s1、2mmol乙酰丙酮铁、10mmol 1,2-十六烷二醇、6mmol油酸和6mmol油胺溶解在20ml苄基乙醚中，在氮气流下磁力搅拌，得到混合物。
82.s2、将步骤s1中得到的混合物加热至200℃，加热2小时后，在氮气覆盖下，再加热回流(300℃)1小时，得到黑褐色混合物。
83.s3、去除热源，将步骤s2中得到的黑褐色混合物冷却至室温，向混合物中加入乙醇(40ml)，沉淀黑色物质，并离心分离，得到黑色产物。
84.s4、将步骤s3中得到的黑色产物溶解于含油酸(0.05ml)和油胺(0.05ml)的己烷(10ml)中，离心(6000rpm，10min)除去任何不分散的残留物，得到己烷混合物。
85.s5、在步骤s4得到的己烷混合物中加入乙醇(10ml)，沉淀产物6nm fe3o4纳米颗粒，离心(6000rpm，10min)除去溶剂，再将6nm fe3o4纳米颗粒分散于己烷中，得到6nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体。
86.tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子的制备，制备步骤如下：
87.(1)将疏水性6nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体(0.2ml中约20mg)加入11-氨基十一
酸四甲基铵的二氯甲烷混悬液(2ml中约20mg)中，振摇20min，期间使用磁铁沉淀得到沉淀物。
88.(2)倒出溶剂和非磁性混悬液，用二氯甲烷清洗步骤(1)得到的沉淀物一次，并在氮气下干燥前使用磁铁再次分离以除去过量的表面活性剂，得到清洗后的沉淀物。
89.(3)将步骤(2)得到的清洗后的沉淀物约20mg分散在2ml中性ph值(ph＝7)的1mm磷酸盐缓冲液中，即得到亲水性磁性纳米粒子。
90.(4)按照质量比亲水性磁性纳米粒子∶tpgs∶doc＝5∶100∶5混合，溶解并震荡12小时，得到tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子。
91.实施例3
92.8nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体的制备，制备步骤如下：
93.s1、2mmol乙酰丙酮铁、10mmol 1,2-十六烷二醇、2mmol油酸和2mmol油胺溶解在20ml苄基乙醚中，在氮气流下磁力搅拌，得到混合物。
94.s2、在步骤s1的混合物中加入分散在己烷(4ml)中的84mg 6nm fe3o4纳米颗粒样品(实施例2制备得到)，将得到的混合液加热至100℃，加热30分钟，除去己烷，再加热至200℃，加热一小时，在氮气覆盖下，再加热回流(300℃)30分钟，得到黑褐色混合物。
95.s3、去除热源，将步骤s2中得到的黑褐色混合物冷却至室温，向混合物中加入乙醇(40ml)，沉淀黑色物质，并离心分离，得到黑色产物。
96.s4、将步骤s3中得到的黑色产物溶解于含油酸(0.05ml)和油胺(0.05ml)的己烷(10ml)中，离心(6000rpm，10min)除去任何不分散的残留物，得到己烷混合物。
97.s5、在步骤s4得到的己烷混合物中加入乙醇(10ml)，沉淀产物8nm fe3o4纳米颗粒，离心(6000rpm，10min)除去溶剂，再将8nm fe3o4纳米颗粒分散于己烷中，得到8nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体。
98.tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子的制备，制备步骤如下：
99.(1)将疏水性8nm fe3o4纳米颗粒的己烷分散体(0.2ml中约20mg)加入11-氨基十一酸四甲基铵的二氯甲烷混悬液(2ml中约20mg)中，振摇20min，期间使用磁铁沉淀得到沉淀物。
100.(2)倒出溶剂和非磁性混悬液，用二氯甲烷清洗步骤(1)得到的沉淀物一次，并在氮气下干燥前使用磁铁再次分离以除去过量的表面活性剂，得到清洗后的沉淀物。
101.(3)将步骤(2)得到的清洗后的沉淀物分散在去离子水中，即得到亲水性磁性纳米粒子。
102.(4)按照质量比为亲水性磁性纳米粒子∶tpgs∶doc＝5∶100∶5混合溶解并震荡12小时，得到tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子。
103.实施例4
104.对实施例1制备好的tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子进行以下几项检测以确定其理化性质：
105.(1)磁化曲线(vsm)：检测磁性纳米颗粒的磁学性质。取少量冻干的fe3o4粉末(为b纳米粒)和tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子(为f纳米粒)，用振动样品磁强计(vsm)进行检测，并绘制磁化曲线，记录其剩磁和矫顽力，结果如图1所示：b和f纳米粒微球的磁滞曲线，随着外加磁场的强度增大，b和f纳米粒微球的磁化强度明显增大；当磁场强度增大至一定
程度时，多烯紫杉醇/四氧化三铁纳米粒微球的磁化强度至最大值并逐渐稳定，b和f纳米颗粒的饱和磁化强度分别为4.6和8.0emu/g；与b相比，f的磁化值稍低是由于抗磁性的tpgs有机层；去除外磁场后，剩余磁力强度为零，磁滞曲线形状紧密，磁滞损失不明显，说明微球仍然具有超顺磁性。
106.(2)热失重：采用差示扫描量热法分析载药磁性纳米复合植入剂的热稳定性。将约20mg质量的样品密封在标准的铝坩埚内，以空坩埚为对照。在20℃-200℃的温度区间内对样品的相变过程进行测定，升温速率为10℃/min n2保护，气流量为30ml/min。热重分析结果(图2)显示，各组分的实际比例与制备时加入的区别不大，在制备过程中无损失。
107.(3)x射线衍射光谱分析(xrd)：检测磁性纳米颗粒的晶核结构，鉴定其是否为fe3o4。取少量冻干的粉末，用射线衍射光谱分析仪进行分析，衍射角度范围为0
°
～90
°
，结果如图3所示，样品3纳米颗粒粉末的x射线衍射(xrd)分析在30.2℃、36.7℃、43.4℃、53.8℃、57.2℃和62.3℃均有可测峰，而其他样品则没有可测峰，这些可测峰与fe3o4纳米粒子的可测峰特征相似。
108.(4)透射电子显微镜(tem)：将制备的tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子样品粉末分散在乙醇中，取适量滴加到铜网上，透射电镜观察纳米粒子形态。从电镜照片中可以看出，纳米载体的粒径在小于100nm，中间为中空结构，外壳为实心壳。粒径分布均匀，结构稳定，结果如图4所示。
109.实施例5
110.通过以下体内外实验探究实施例1制备的tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子载体的应用：
111.(1)通过细胞毒性实验检测载药系统对人鼻咽癌细胞hne1存活率的影响。hne-1细胞以1
×
104/孔密度种于96孔板内，培养24小时后，弃去培养基，加入含有空白tpgs/fe3o4载体(即按实施例1的步骤，区别仅在于步骤(4)为按照质量比为亲水性磁性纳米粒子∶tpgs＝5∶100混合溶解并震荡12小时得到)、doc、tpgs/fe3o
4-doc的培养液(以doc为准确定摩尔量)，分别作用hne-1，24小时后用mtt法检测细胞的生长抑制率。结果如图5(横坐标为不同物质同一浓度)所示。从结果可以看出，空白tpgs/fe3o4载体浓度低于100μmol/l时对细胞无毒性作用；tpgs/fe3o
4-doc载药纳米粒子与单纯doc相比，对细胞的杀伤作用更强。
112.(2)通过流式细胞术测定所制备的载药纳米粒子对hne1细胞凋亡率的影响结果。hne-1细胞以2
×
105/孔密度种于6孔板内，培养24小时后，弃去培养基，将含tpgs/fe3o4载体、doc、tpgs/fe3o
4-doc(溶于dmso中)的培养液分别加入各孔中，37℃、5％co2环境下培养24h，然后采用流式细胞仪定量检测hne-1细胞凋亡。结果如图6(图中的tpgs相当于tpgs/fe3o4载体，tpgs doc是相当于tpgs/fe3o
4-doc)所示，该纳米载体负载多烯紫杉醇后，能提高肿瘤细胞的凋亡率，且空白载体不会显著引起细胞凋亡，证明了所设计纳米载体的有效性及安全性。
113.(3)通过荧光显微镜观察制备的纳米载药系统在hne1细胞内释放活性氧ros的结果。将hne1细胞种植于6孔板(5
×
104/孔)，培养24小时后弃去培养基，分别加入含空白tpgs/fe3o4载体、doc、tpgs/fe3o
4-doc的培养液，继续培养6小时。去除培养基，通过活性氧试剂盒检测hne1细胞中的ros含量，于荧光倒置显微镜下拍照，结果如图7(图中的tpgs相当于tpgs/fe3o4载体，tpgs doc相当于tpgs/fe3o
4-doc)所示。从结果可以得知，空白tpgs/
fe3o4载体仅发出微弱的荧光，doc发出较强的荧光，而tpgs/fe3o
4-doc荧光强度最大，表明doc、tpgs/fe3o
4-doc可刺激肿瘤细胞产生ros，发挥抗肿瘤效应，且tpgs/fe3o
4-doc的抗肿瘤效应更强。
114.(4)通过动物体内成像观察磁性纳米粒子的核磁共振成像作用。建立鼻咽癌细胞hne1荷瘤小鼠模型。鼻咽癌hne1细胞常规培养于37℃、5％co2培养箱中，细胞汇合约80％后，用0.25％胰蛋白酶消化2～5min后，含10％胎牛血清培养液终止消化后，1000rpm离心5min，弃上清，用pbs按上述方法洗涤1次，自动细胞计数仪计数，pbs重悬制备浓度为5
×
105个/ml的细胞悬液，无菌注射器注射于裸鼠(balb/c(nu-nu)雌性裸鼠，6-8周，体重18-20g，spf级，由湖南斯莱克景达动物有限公司提供)右下肢皮下，每只0.2ml/l。待肿瘤体积为8mm2(长
×
宽)大小时，将tpgs/fe3o
4-doc纳米制剂(即实施例1直接制备得到的tpgs修饰的多功能磁性纳米粒子，注射量为100μl)以尾静脉注射注入小鼠体内。注射4h后，腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，小鼠麻醉后，置于3.0t磁共振扫描床上进行t2信号扫描，并记录分析结果。结果如图8所示，尾静脉注射4h后，肿瘤感兴趣区信号强度为明显高于空白小鼠肿瘤(p《0.05)。说明tpgs/fe3o
4-doc纳米制剂在肿瘤部位降解后可以进行t2加权成像。
115.(5)当肿瘤体积增长到10mm2(长
×
宽)时，将fe3o
4-tpgs-doc纳米颗粒(0.2ml)通过尾静脉注射入1只荷瘤小鼠体内。在一定的时间段用水合氯醛气体深度麻醉荷瘤小鼠，后将小鼠取俯卧位并对荷瘤小鼠进行t2加权成像。第一次扫描(t0)在尾静脉给药之前进行。尾静脉注射药物后，将磁铁安装在肿瘤位点上，目的是将含有磁性纳米粒子的载体集中并保留在肿瘤部位。注射药物后4小时(t1)和24小时(t2)进行磁共振扫描。获得冠状位t2加权像，观察肿瘤的影像学表现。结果如图9所示，可以看出随着给药时间的延长，t2信号逐渐加强，说明tpgs/fe3o
4-doc纳米制剂在肿瘤部位有效聚集。
116.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。