ACSS2抑制剂在制备抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用

acss2抑制剂在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及acss2抑制剂在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.ac-coa synthase inhibitor1是一种有效的，可逆的醋酸盐依赖性乙酰辅酶a 合成酶2(acss2)抑制剂，能抑制呼吸道合胞病毒(rsv)，但迄今尚未有关于 ac-coa synthase inhibitor1用于预防或治疗h1n1亚型猪流感病毒的报道。
4.

技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供 acss2抑制剂即ac-coa synthase inhibitor1在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用。本发明通过研究首次发现并证实，ac-coa synthase inhibitor1能够有效抑制h1n1亚型猪流感病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成抗h1n1亚型猪流感病毒药物的前景。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供acss2抑制剂即ac-coa synthase inhibitor1在制备抗h1n1亚型猪流感病毒产品中的应用。并因此，ac-coa synthaseinhibitor1在对于预防和/或治疗与h1n1亚型猪流感病毒相关的疾病是有效的。
8.所述抗h1n1亚型猪流感病毒包括以下一种或多种作用：
9.(a)抑制h1n1亚型猪流感病毒增殖；
10.(b)灭活h1n1亚型猪流感病毒；
11.(c)阻止h1n1亚型猪流感病毒对细胞的吸附作用；
12.(d)阻断h1n1亚型猪流感病毒在细胞内的复制。
13.所述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用，从而可用于构建相关细胞或动物模型。
14.所述抗h1n1亚型猪流感病毒药物中，ac-coa synthase inhibitor1的药物浓度不低于1.5625μm。
15.本发明的第二个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物由ac-coasynthase inhibitor1与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
16.所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭h1n1亚型猪流感病毒或者协助抑制和/或杀灭h1n1亚型猪流感病毒的物质。
17.所述非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
18.本发明的第三个方面，提供一种用于预防和/或治疗与h1n1亚型猪流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用上述ac-coa synthase inhibitor1 或上述药物组合物。
19.与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：
20.上述技术方案首次发现化合物ac-coa synthase inhibitor1能够有效抑制 h1n1亚型猪流感病毒的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，ac-coasynthase inhibitor1对pk15细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)是50μm，而对 h1n1亚型猪流感病毒的半数有效浓度(ec50)为1.5625μm；ac-coa synthaseinhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的治疗指数为32，表明其具有开发成抗h1n1 亚型猪流感病毒药物的前景，为ac-coa synthase inhibitor1开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗h1n1亚型猪流感病毒药物奠定实验基础并提供新的视野，因此具有重要的临床意义和社会效益。
附图说明
21.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
22.图1为本发明实施例1中ac-coa synthase inhibitor1抗h1n1亚型猪流感病毒损伤细胞的作用图；
23.其中：a为病毒对照组；b为pk15正常细胞组；c为感染细胞药物试验组 (使用3.125μm ac-coa synthase inhibitor1)；
24.图2为本发明实施例2中ac-coa synthase inhibitor1对pk15细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)图；
25.图3为本发明实施例3中ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的半数有效浓度(ec50)图；
26.图4为本发明实施例4中ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒直接杀伤作用效果图；
27.图5为本发明实施例4中ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒吸附的阻断作用效果图；
28.图6为本发明实施例4中ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
29.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
30.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
31.如前所述，ac-coa synthase inhibitor1是一种有效的，可逆的醋酸盐依赖性乙酰辅酶a合成酶2(acss2)抑制剂，能抑制呼吸道合胞病毒(rsv)，但迄今尚未有关于ac-coa synthase inhibitor1用于预防或治疗h1n1亚型猪流感病毒的报道。
32.有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，acss2抑制剂即ac-coasynthase inhibitor1在制备抗h1n1亚型猪流感病毒产品中的应用。并因此， ac-coa synthase inhibitor1对于预防和/或治疗h1n1亚型猪流感病毒相关的疾病是有效的。
33.需要说明的是，该应用是首次公开，与其已知的临床用药用途并不相同， ac-coa synthase inhibitor1结构式如下：
[0034][0035]
所述抗h1n1亚型猪流感病毒包括以下一种或多种作用：
[0036]
(a)抑制h1n1亚型猪流感病毒增殖；
[0037]
(b)灭活h1n1亚型猪流感病毒；
[0038]
(c)阻止h1n1亚型猪流感病毒对细胞的吸附作用；
[0039]
(d)阻断h1n1亚型猪流感病毒在细胞内的复制。
[0040]
所述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用，从而可用于构建相关细胞或动物模型。
[0041]
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供：
[0042]
(a)ac-coa synthase inhibitor1在制备抑制h1n1亚型猪流感病毒增殖产品中的应用；
[0043]
(b)ac-coa synthase inhibitor1在制备灭活h1n1亚型猪流感病毒产品中的应用；
[0044]
(c)ac-coa synthase inhibitor1在制备阻止h1n1亚型猪流感病毒对细胞的吸附作用产品中的应用；
[0045]
(d)ac-coa synthase inhibitor1在制备阻断h1n1亚型猪流感病毒在细胞内的复制产品中的应用。
[0046]
其中，抗h1n1亚型猪流感病毒药物中，ac-coa synthase inhibitor1取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，ac-coa synthase inhibitor1对h1n1 亚型猪流感病毒的半数有效浓度(ec50)为1.5625μm。
[0047]
根据本发明，不仅公开了ac-coa synthase inhibitor1在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用，而且还公开了施用ac-coa synthase inhibitor1与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，ac-coa synthase inhibitor1还可以与其它非药物活性成分组合使用。
[0048]
本发明又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，所述药物组合物由 ac-coa synthase inhibitor1与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
[0049]
其中，ac-coa synthase inhibitor1取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的半数有效浓度 (ec50)为1.5625μm；ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的治疗指数为32。当然，当ac-coa synthase inhibitor1与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭h1n1亚型猪流感病毒等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
[0050]
所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭h1n1亚型猪流感病毒或者协助抑制和/或杀灭h1n1亚型猪流感病毒的物质。
[0051]
所述非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0052]
本发明的又一具体实施方式中，所述非药物活性成分包括：
[0053]
药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质；
[0054]
药理上无害的盐(优选氯化钠)、调味剂、维生素(优选维生素a或维生素e、生育酚或维生素原)、抗氧化剂(优选抗坏血酸)，以及稳定剂和/或防腐剂。
[0055]
所述药物制剂的给药剂型包括：液体剂型、固体剂型、外用制剂和喷剂；
[0056]
本发明又一具体实施方式中，包括以下剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂。
[0057]
本发明又一具体实施方式中，提供一种用于预防和/或治疗与h1n1亚型猪流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用上述ac-coa synthaseinhibitor1或上述药物组合物。
[0058]
以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。本发明实施例中选用的h1n1亚型猪流感病毒由山东省农业科学家禽研究所保藏。
[0059]
实施例1病毒tcid
50
的测定
[0060]
将pk15细胞消化后以每孔1
×
105个/ml的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％co2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将h1n1亚型猪流感病毒连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为 10-1
～10-10
)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μl，放入37℃、5％co2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的cpe情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设3个重复，待不再继续发生细胞病变时，用96孔v型板做血凝试验，每孔加入50微升细胞液，然后加入50 微升0.75％鸡红细胞，室温静置20分钟，看鸡血是否凝集，读取血凝结果并记录，按karber法计算病毒tcid
50
。
[0061]
表1 tcid
50 of h1n1亚型猪流感病毒
[0062][0063][0064]
注：tcid
50
，tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称 50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡 (cytopathic effect,cpe)所需的病毒量。
[0065]
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的血凝孔数，并计算出不同浓度的血凝比率，并按 karber法计算h1n1亚型猪流感病毒的tcid
50
值：
[0066]
lgtcid
50
＝l-d(s-0.5)
[0067]
(l:最高稀释度的对数；d:稀释度对数之间的差；s阳性孔比率总和)
[0068]
lgtcid
50
＝l-d(s-0.5)＝-1-1
×
(5.3-0.5)＝-5.8
[0069]
tcid
50
＝10-5.8
/0.1ml
[0070]
即将该病毒稀释10
5.8
接种100μl可使50％的细胞发生病变。
[0071]
实施例2ac-coa synthase inhibitor1对pk15细胞的毒性实验：
[0072]
pk15细胞是h1n1亚型猪流感病毒的易感细胞。因此，首先检测ac-coa synthase inhibitor1对pk15细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
[0073]
(1)在96孔板内接种100μl细胞(pk15 1
×
104个/孔)。
[0074]
(2)培养至pk15单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl 含不同药物浓度的无血清dmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100 μl无血清dmem培养基。调零孔：不铺细胞。
[0075]
(3)在37℃，5％co2条件下培养72h后，按cck-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值。
[0076]
(4)37℃，5％co2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的od450nm设为100％细胞对照。
[0077]
(5)分析数据，利用graphpad prism5计算ac-coa synthase inhibitor1的半数细
胞毒性浓度(cc50)值。其结果如图2所示。
[0078]
结果：ac-coa synthase inhibitor1出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定ac-coa synthaseinhibitor1半数中毒浓度为50μm。
[0079]
实施例3ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的抑制实验：
[0080]
(1)在96孔板的每个孔中接种1
×
104个pk15细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养；
[0081]
(2)弃去培养基，每孔加入100μl 10000tcid
50
的h1n1亚型猪流感病毒稀释液(用无血清dmem细胞长满后加入病毒稀释液，按照50μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；
[0082]
(3)72h后，用96孔v型板做血凝试验，每孔加入50微升细胞液，然后加入50微升0.75％鸡红细胞，室温静置20分钟，看鸡血是否凝集，读取血凝结果并记录。
[0083]
(4)分析数据，其结果如图3所示。然后按公式ti＝cc50/ec50，计算相应的治疗指数ti值。
[0084]
结果：通过血凝检测结果，可以计算出药物对h1n1亚型猪流感病毒的有效抑制率。从结果可以看出，ac-coa synthase inhibitor1在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对h1n1亚型猪流感病毒的半数有效浓度(ec50)为1.5625μm。ac-coa synthaseinhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的治疗指数为32。
[0085]
实施例4化合物不同时间加入对h1n1亚型猪流感病毒复制的影响
[0086]
将ac-coa synthase inhibitor1分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
[0087]
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
[0088]
将等量的10000tcid
50
病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于 37℃、5％co2培养箱中预先作用2h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μl/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设 3个重复，72h后进行血凝试验检测结果，用graphpad prism5软件得化合物的ec50。
[0089]
结果：ac-coa synthase inhibitor1与h1n1亚型猪流感病毒预先作用的给药方式下，通过分析软件，ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的作用效果如图4所示。从图4中可以看出，在这种作用式下，ac-coasynthase inhibitor1在安全浓度范围内大于3.125μm对h1n1亚型猪流感病毒表现出100％的完全抑制作用，1.5625μm对h1n1亚型猪流感病毒表现出66.7％的抑制作用，表明ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒具有一定的直接灭活的作用。
[0090]
(2)药物对h1n1亚型猪流感病毒吸附的阻断作用
[0091]
按每孔1
×
104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μl/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用2h后，弃去上清液，用pbs洗两遍，加入等量的10000tcid50病毒液置于37℃、5％co2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行血凝试验检测结果，并计算该作用方式下不同浓度药
物的抗病毒有效率。
[0092]
结果：通过分析软件，ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内，3.125μm及以上浓度对h1n1亚型猪流感病毒的有效抑制率能达到100％，1.5625μm对h1n1亚型猪流感病毒表现出33.3％的抑制作用，表明ac-coa synthase inhibitor1能阻止h1n1亚型猪流感病毒对细胞的吸附作用。
[0093]
(3)药物对h1n1亚型猪流感病毒复制的阻断作用
[0094]
按每孔1
×
104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的10000tcid50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中预先作用1h后，然后弃去上清液，pbs 将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μl/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％co2培养箱中培养，72h后进行血凝试验检测结果，分析数据，得出结论。
[0095]
结果：通过分析软件，ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的复制阻断作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，1.5625μm 及以上浓度ac-coa synthase inhibitor1对h1n1亚型猪流感病毒的有效抑制率为100％，表明ac-coa synthase inhibitor1能有效阻断h1n1亚型猪流感病毒在pk15细胞内的复制。
[0096]
本发明应用实施例以pk15细胞为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现ac-coa synthase inhibitor1的新型抗病毒作用，对h1n1亚型猪流感病毒有一定的抑制作用。
[0097]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。